KR102096630B1 - Specific primer set for detecting Banana streak virus, quarantine plant virus and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 검역 식물바이러스인 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 4개의 프라이머 세트는 BSV를 특이적으로 검출할 수 있으므로, BSV의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.The present invention relates to a primer set for specific detection of a quarantine plant virus, Banana streak virus , and its use, and the four primer sets of the present invention can specifically detect BSV, thus, BSV It is thought that it will be able to effectively prevent the introduction of the drug into Korea.
Description
본 발명은 검역 식물바이러스인 바나나 줄무늬 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a primer set and its use for specifically detecting a banana striped virus, a quarantine plant virus.
기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 또한, 평균 기온의 지속적 증가에 따라 바이러스를 매개하는 곤충이 늘어나고, 식물바이러스 병이 확산되고 있는 추세이다. 특히, 자유무역의 영향으로 다양한 종류의 식물들이 국내로 수입되고 있으며, 그에 따라 잠재적인 또는 동정되지 않은 병원성 식물바이러스들이 농작물, 사료, 견목, 종자, 야채, 과일 및 한약재를 통해서 함께 수입될 가능성이 높아지고 있다. 검역병원체의 지정은 식물을 자연 기주로 하는 병원체로, 국내에 분포하지 않는 병원체 중 검역적 위험도가 높은 병원체를 매년 위험도평가를 거쳐 정도에 따라 '금지급, '관리급' 및 '규제비검역'으로 구분하여 총 100종으로 관리하고 있다(Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, 2013).The emergence and risk of outbreak viruses and new viral diseases are gradually increasing as ecosystem changes due to climate warming, the evolution and transformation of plants and viruses, and the expansion of agricultural products trade. In addition, as the average temperature continues to increase, insects mediated by viruses increase, and plant virus diseases are spreading. In particular, under the influence of free trade, various kinds of plants are imported into Korea, and thus, potential or unidentified pathogenic plant viruses are likely to be imported together through crops, feed, hardwood, seeds, vegetables, fruits, and herbal medicines. It is increasing. The designation of quarantine pathogens is a plant-based pathogen. Among pathogens that are not distributed in Korea, pathogens with high quarantine risks are assessed annually and subject to 'prohibited payment,' management level ', and' regulated quarantine ' It is divided into 100 categories (Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, 2013).
이에 새로운 병해충이 유입되었을 때 일어날 수 있는 국가적인 재앙을 사전에 방지하여 농림업 생산의 안정화를 이룩하고 생태계를 보호하고, 인간생활을 쾌적하게 하기 위해, 세계 각국이 정부 차원에서 정책적으로 식물검역을 점차 강화하고 있는 추세이다. 또한, 식물검역의 근본적인 이유는 새로운 병해충의 침입을 막는 데 소요되는 경비와 불편이, 침입된 병해충을 방제(防除)하는 데 소비되는 비용이나 피해액에 비하면 매우 경제적이기 때문이다.Accordingly, in order to prevent national disasters that may occur when new pests are introduced, to stabilize the production of agricultural and forestry industries, protect ecosystems, and make human life comfortable, governments around the world are gradually conducting plant quarantine policies at the government level. The trend is strengthening. In addition, the basic reason for plant quarantine is that the expense and inconvenience required to prevent the invasion of new pests are very economical compared to the cost or damages spent in controlling the infested pest.
현재, 바이러스의 검출에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있고, 병원체의 PCR 검출을 위해서는 종 특이적인 프라이머의 개발이 가장 중요하다. 또한, PCR 검사법으로 검출할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비한 검사시스템이 필요한 실정이다. 더욱이, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 검출에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구된다.Currently, in the detection of viruses, a PCR method having high detection sensitivity and convenience is most commonly used, and development of a species-specific primer is most important for PCR detection of pathogens. In addition, when detecting by the PCR test method, a test system is required to prepare for a case in which it is difficult to discriminate because the specific reaction intensity is low or to cause a non-specific reaction with another nucleic acid. Moreover, development of species-specific primers capable of detecting all isolates present in a virus species is required because detection may fail when using isolate-specific primers.
바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)는 카울리모바이러스과(Caulimoviridae)의 바드나바이러스속(Badnavirus)에 속하는 파라레트로바이러스(pararetrovirus)로, 평균적으로 30 x 150 nm 사이즈의 간균형 입자로 되어 있으며 7.0~7.8 kb 원형 이중가닥 DNA(circular double stranded DNA)로 이루어진 게놈을 가지고 있다. 바나나 줄무늬 바이러스가 일으키는 병징으로는, 바나나 잎에 밝은 색의 줄무늬가 생겨 그 부분이 괴사되거나 바나나의 위경(pseudostem) 부분이 갈라질 수 있으며, 이는 식물의 생장을 저해하여 바나나의 생산량의 감소에 가장 큰 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Banana streak virus is a pararetrovirus belonging to the Badnavirus family of the Caulimoviridae family, and it is composed of 30 x 150 nm average hepatic particles with an average size of 7.0 to 7.8 It has a genome consisting of kb circular double stranded DNA. As a disease caused by the banana streak virus, brightly colored streaks may form on the banana leaves, resulting in necrosis or cracking of the part of the banana (pseudostem). It is known to influence.
한편, 중국공개특허 제104805221호에는 '바나나 바이러스 검출을 위한 RT-LAMP 방법'이 개시되어 있고, 유럽공개특허 제1056879호에는 '바나나 줄무늬 바이러스 프로모터 및 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 검역 식물바이러스인 바나나 줄무늬 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.On the other hand, Chinese Patent Publication No. 104805221 discloses a 'RT-LAMP method for detecting banana virus', and European Patent No. 1056879 discloses a 'banana striped virus promoter and detection method', but the quarantine of the present invention A primer set for specifically detecting the plant virus banana striped virus and its use have not been described.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)의 다단백질(polyprotein, PP) 염기서열을 이용하여 프라이머를 제작하였고, 제작된 프라이머 세트 중, 바나나 줄무늬 바이러스의 게노믹 DNA에는 특이적으로 결합하며, 유연관계의 바이러스 및 기주 유사관계 바이러스에는 결합하지 않으며, 기주 식물의 게노믹 DNA에도 결합하지 않는 바나나 줄무늬 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention has been derived by the above-mentioned needs, the present inventors of the banana striped virus ( Banana streak virus ) polyprotein (polyprotein, PP) base sequence was produced using the base sequence, and among the prepared primer sets, it specifically binds to the genomic DNA of the banana-striped virus, and the related virus and host-like virus The present invention was completed by identifying a set of primers specific to the banana striped virus that does not bind and does not bind to the genomic DNA of the host plant.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 4 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 2 and 16; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 15; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 4 and 15; And at least one oligonucleotide primer set selected from the group consisting of the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 15 to provide a primer set for specifically detecting Banana streak virus .
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 바나나 줄무늬 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for specifically detecting a banana striped virus containing the primer set.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 바나나 줄무늬 바이러스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for specifically detecting banana striped virus using the primer set.
본 발명의 최종선발된 총 4개의 프라이머 세트는 검역 식물바이러스인 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 검역 대상인 바나나 줄무늬 바이러스에 대한 검출이 쉽고 빠르게 수행될 수 있으므로, 바나나 줄무늬 바이러스의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.Final selection, a total of four primer sets of the present invention can be detected in banana stripe virus (Banana streak virus) quarantine plant viruses specifically, since the detection of the banana stripe virus inspection target can be carried out easily and quickly, banana It is thought that the introduction of the striped virus into Korea can be effectively prevented.
도 1은 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus, BSV) 검출용 프라이머 세트의 1차 선발 결과를 나타낸 것이다. M: DNA 크기 마커, N: 음성 대조군.
도 2는 BSV 검출용 프라이머의 2차 선발 결과를 나타낸 것으로, 유연관계 및 기주 유사관계의 바이러스에 대한 결과이다. CMV: Cucumber mosaic virus, DaMV: Dahlia mosaic virus, BBTV: Banana bunchy top virus, BBrMV: Banana bract mosaic virus.
도 3은 BSV 검출용 프라이머의 3차 선발 결과를 나타낸 것으로, 기주식물의 게노믹 DNA를 대상으로 검출을 수행한 결과이다.
도 4는 선발된 BSV 검출용 프라이머의 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다. 10-1: BSV 게노믹 DNA 원액 10-1 희석, 10-2: BSV 게노믹 DNA 원액 10-2 희석, 10-3: BSV 게노믹 DNA 원액 10-3 희석, 10-4: BSV 게노믹 DNA 원액 10-4 희석, 10-5: BSV 게노믹 DNA 원액 10-5 희석, 10-6: BSV 게노믹 DNA 원액 10-6 희석.Figure 1 shows the results of the primary selection of a primer set for the detection of banana streak virus ( Banana streak virus , BSV). M: DNA size marker, N: negative control.
Figure 2 shows the results of the secondary selection of the primer for BSV detection, the results for the virus in a flexible relationship and host-like relationship. CMV: Cucumber mosaic virus , DaMV: Dahlia mosaic virus , BBTV: Banana bunchy top virus , BBrMV: Banana bract mosaic virus .
3 shows the results of the third selection of the primers for BSV detection, and is a result of detecting the genomic DNA of host plants.
4 shows the end-point PCR results of the selected primers for BSV detection. 10 -1 : BSV genomic
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 4 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 2 and 16; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 15; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 4 and 15; And at least one oligonucleotide primer set selected from the group consisting of the oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 15 to provide a primer set for specifically detecting Banana streak virus .
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 4개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 바람직하게는 4개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 2 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 4 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.The primer set of the present invention preferably includes one or more, two or more, three or more primer sets selected from the group consisting of the four primer sets, preferably four primer sets, that is, SEQ ID NO: 2 And 16 oligonucleotide primer sets; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 15; Oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 4 and 15; And oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 15.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2, 3, 4, 5, 15 및 16의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2, 3, 4, 5, 15 및 16의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 서열번호 2, 3, 4 및 5의 올리고뉴클레오티드는 정방향 프라이머(forward primer)이고, 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머(backward primer)이다.The primers are fragments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more, 20 or more consecutive nucleotides in the sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 15 and 16, depending on the sequence length of each primer. It may include an oligonucleotide consisting of. For example, the primer of SEQ ID NO: 2 (20 oligonucleotides) may include an oligonucleotide consisting of fragments of 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 2. . In addition, the primer may also include addition, deletion or substituted sequences of the base sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 15 and 16. The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 2, 3, 4 and 5 are forward primers, and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 15 and 16 are backward primers.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primer should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primers will depend on the desired DNA or RNA target complexity, as well as the conditions of primer use, such as temperature and ionic strength.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.As used herein, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogs, such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate or peptide nucleic acid, or It may include an intercalating agent.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides an oligonucleotide primer set according to the present invention; And a reagent for performing an amplification reaction, to provide a kit for specifically detecting Banana streak virus .
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In the kit of the present invention, reagents for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffers, and the like. In addition, the kit of the present invention may further include a user guide describing optimal conditions for performing the reaction. The handbook is a printout that explains how to use the kit, for example, how to make PCR buffers, and the reaction conditions presented. The handbook includes a brochure in the form of a brochure or leaflet, a label attached to the kit and a description on the surface of the package containing the kit. In addition, the handbook includes information that is disclosed or provided through electrical media, such as the Internet.
또한, 본 발명은In addition, the present invention
식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;Isolating genomic DNA from plant samples;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.Provided is a method for specifically detecting a banana streak virus , comprising the step of detecting the amplification product.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.The method of the present invention includes isolating genomic DNA from a plant sample. As a method for separating genomic DNA from the plant sample, a method known in the art may be used, for example, a CTAB method may be used, or a Wizard prep kit (Promega) may be used. Using the isolated genomic DNA as a template, an amplification reaction may be performed using a primer set according to an embodiment of the present invention to amplify a target sequence.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 바나나, 플랜틴(plantain)에 제한되지 않고, 바나나 줄무늬 바이러스에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.In a method according to an embodiment of the present invention, the plant is not limited to bananas and plantains, and may be included within the scope of the present invention as long as it is a plant capable of being infected with a banana striped virus.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.In one embodiment of the invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling material may be a material emitting fluorescence, phosphorescence or radioactivity, but is not limited thereto. Preferably, the labeling material is Cy-5 or Cy-3. When PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer when amplifying the target sequence, the target sequence may be labeled with a detectable fluorescent labeling material. In addition, a label using a radioactive material, when a radioactive isotope, such as 32 P or 35 S, is added to the PCR reaction solution during PCR, the amplification product is synthesized and radioactive is incorporated into the amplification product, so that the amplification product can be radioactively labeled. Combinations of one or more oligonucleotide primers used to amplify the target sequence are as described above.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 바나나 줄무늬 바이러스를 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method for detecting the banana-striped virus comprises detecting the amplification product, and the detection of the amplification product is DNA chip, gel electrophoresis, capillary electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence It may be performed through measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of the methods for detecting amplification products, capillary electrophoresis can be performed. For capillary electrophoresis, for example, an ABi Sequencer can be used. In addition, gel electrophoresis can be performed, and the gel electrophoresis may use agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In addition, in the fluorescence measurement method, when PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer, the target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the fluorescence thus labeled is measured using a fluorescence meter. can do. In addition, in the radioactive measurement method, when performing PCR, a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to label the amplification product, and then a radioactive measuring instrument, for example, a Geiger counter or liquid flash. Radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example 1. BSV 특이 1. BSV specific 프라이머의Primer 설계 및 조합 Design and combination
바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus, BSV) 검출용 프라이머의 설계를 위하여, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록되어 있는 BSV의 다단백질 염기서열들(KP877622, KT895258, DQ859899, DQ451009, DQ092436, AY493509, AY750155, NC_007002, NC_007003, NC_003381, NC_008018)을 다운받았다. 다운로드한 염기서열은 Multalign 프로그램을 이용하여 다중정렬하였고, BSV의 공통적인 서열을 탐색하였다. BSV 검출용 프라이머의 설계는 Primer 3과 NCBI primer-Blast 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 1).For the design of primers for the detection of Banana streak virus (BSV), polyprotein sequences of BSV registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (KP877622, KT895258, DQ859899, DQ451009, DQ092436, AY493509, AY750155, NC_007002, NC_007003, NC_003381, NC_008018) were downloaded. The downloaded sequences were multi-sorted using the Multalign program, and common sequences of BSV were searched. The primer design for BSV detection was designed using
이후, 이들 정방향 및 역방향 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 63가지 세트를 조합하였다(표 2).Thereafter, 63 sets capable of PCR amplification were combined by combining these forward and reverse primers (Table 2).
실시예 2. BSV 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 선발Example 2. Selection of the optimal primer set for BSV detection
실시예 1에서 제작한 프라이머 세트 63개의 조합으로 BSV 검출을 위한 최적의 프라이머를 선발하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 하기 표 3과 같다.Polymerase chain reaction (PCR) was performed to select the optimal primer for BSV detection with a combination of 63 primer sets prepared in Example 1. PCR conditions are shown in Table 3 below.
먼저, 프라이머 개발대상인 BSV 유전자를 이용한 1차 선발을 수행하였고(도 1), 이 중 PCR 증폭 산물의 크기가 각각 778 bp, 769 bp, 701 bp, 652 bp, 609 bp, 506 bp로 예측되는 6, 18, 26, 35, 44, 53 조합의 6개 프라이머 세트 를 선발하였다.First, primary selection using BSV gene, which is the target of primer development, was performed (FIG. 1), of which the PCR amplification products were predicted to be 778 bp, 769 bp, 701 bp, 652 bp, 609 bp, and 506 bp, respectively. Six primer sets of 18, 26, 35, 44, and 53 combinations were selected.
1차 선발에서 선택된 6개의 프라이머 세트을 이용하여 BSV와 유연관계 및 기주 유사관계에 있는 CMV(Cucumber mosaic virus), DaMV(Dahlia mosaic virus), BBTV(Banana bunchy top virus), BBrMV(Banana bract mosaic virus)와의 교차반응성 유무를 확인하기 위한 2차 선발을 실시하였다(도 2). 또한, 상기 6개의 프라이머 세트가 기주식물의 게노믹 DNA에 반응하는지 알아보기 위해 PCR을 수행하였다(도 3).CMV (Cumcumber mosaic virus ), DaMV ( Dahlia mosaic virus ), BBTV ( Banaana bunchy top virus ), BBrMV ( Banaana bract mosaic virus ) in flexible and host-like relationship with BSV using six primer sets selected from the primary selection Secondary selection was conducted to confirm the presence or absence of cross-reactivity with (FIG. 2). In addition, PCR was performed to determine whether the six primer sets respond to the genomic DNA of the host plant (FIG. 3).
상기 결과를 통해, 유연관계 및 기주 유사관계에 있는 바이러스, 그리고 기주식물의 게노믹 DNA에는 반응하지 않으면서, BSV를 효과적으로 검출할 수 있는, 4가지 프라이머 세트(조합 18, 26, 35 및 44)를 선발하였고, 선발된 프라이머 세트를 이용하여 end-point PCR(희석한계 실험)을 실시한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 선발된 4개의 프라이머 세트는 BSV의 게노믹 DNA에 대해 10-4까지 검출 가능함을 보여주어, 본 발명의 상기 4개의 프라이머 세트는 검출 대상 바이러스인 BSV에 대해 높은 민감도를 가진 프라이머임을 확인할 수 있었다.Through the above results, four primer sets (
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Banana streak virus, quarantine plant virus and uses thereof <130> PN17273 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttctttctgg aaaatcctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcccagcaat ctacagatac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acttccatct atcagccaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccaaggaat tctttaccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagttgaaaa ggcattcaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agtattccaa agccaactga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccaactgaac agattggatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cttgaatgcc ttttcaactc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccttcaggta gtttctggtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcagttggct ttggaatact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actctgtgca tcagcttctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgtcatccag gtctagagag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tagtttcttg gctcatccat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggggtttcta cgaggtagtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtgactttca tcgcagttct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aaagttccat gtgtgtaggc 20 <110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting Banana streak virus, quarantine plant virus and uses thereof <130> PN17273 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttctttctgg aaaatcctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcccagcaat ctacagatac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 acttccatct atcagccaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccaaggaat tctttaccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagttgaaaa ggcattcaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agtattccaa agccaactga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccaactgaac agattggatt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cttgaatgcc ttttcaactc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccttcaggta gtttctggtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcagttggct ttggaatact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 actctgtgca tcagcttctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgtcatccag gtctagagag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tagtttcttg gctcatccat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggggtttcta cgaggtagtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtgactttca tcgcagttct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aaagttccat gtgtgtaggc 20
Claims (6)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 바나나 줄무늬 바이러스(Banana streak virus)를 특이적으로 검출하는 방법.Isolating genomic DNA from plant samples;
Amplifying a target sequence by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set of claim 1; And
A method for specifically detecting a banana streak virus , comprising detecting the amplification product.
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Liu 등, J. Phytopathol, Vol. 160, No. 11-12, 페이지 622-627(2012.10.29)* |
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