KR102094845B1

KR102094845B1 - 신규 미세조류 배양 방법

Info

Publication number: KR102094845B1
Application number: KR1020190086192A
Authority: KR
Inventors: 이철균; 김기현; 임상민; 박한울; 강성모; 이윤우; 조용희; 전상현; 김준호; 김광민
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2020-03-31

Abstract

본 발명은 신규 미세조류 배양방법에 관한 것으로 더 상세하게는 미세조류를 해양 배양장에서 배양하는 1차 배양 단계; 상기 1차 배양 단계의 미세조류를 광생물반응기로 옮긴 후 이산화탄소(CO₂)를 공급하여 바이오매스 내의 회분 함량이 감소된 미세조류를 수득하는 회분 감량 단계; 및 상기 회분 함량이 감소된 미세조류를 배양 배지에 접종한 후 육상 개방형 경주로 배양장에서 이산화탄소를 공급하면서 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는, 미세조류의 배양방법이 제공된다.

Description

신규 미세조류 배양 방법{Novel microalgae culture method}

본 발명은 신규 미세조류 배양방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 이산화탄소 공급 방식을 이용한 신규 미세조류 배양방법에 관한 것이다.

미세조류(microalgae)는 클로로필(chlorophyll)과 같은 광합성 색소를 가지고 있는 광합성 미생물을 말하며, 빛 에너지를 이용하여 무기탄소인 이산화탄소를 유기탄소로 고정시키는 광합성을 통해 성장하는 마이크로 크기의 수중 미생물을 말한다. 미세조류는 배양액에 녹아있는 이산화탄소를 탄소원으로 바로 이용하는 것이 아니라 이산화탄소와 물이 반응하여 생성된 탄산(H₂CO₃)의 완충작용에 의해 수소 이온(H⁺)과 탄산수소염(HCO₃ ^-)으로 분해되는데, 이때 생성되는 탄산수소염(HCO₃ ^-)을 세포 내로 흡수하여 탄산탈수효소(carbonic anhydrase)의 작용을 통해 이산화탄소와 수산화 이온(OH^-)을 생성하고, 이 중 이산화탄소를 무기탄소원으로 사용한다. 미세조류는 세포 내 생성된 수산화 이온(OH^-)을 중화시키기 위해 배양액 내 존재하는 수소 이온(H⁺)을 세포 내로 흡수함에 따라 수소 이온이 감소하여 배양액 내 pH는 증가하게 된다. 배양액 내 pH가 증가하게 되면, 음전하를 띄던 세포 표면이 중성으로 바뀌어 세포들의 응집이 일어나게 되고, 응집된 세포들은 세포 간 상호 차광(mutual shading)에 의해 빛 에너지를 받지 못하여 세포 성장이 감소하고, 나아가 바이오매스 생산성이 감소하게 된다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2015-0120843호는 환경수의 추가적인 공급에 의한 광합성 미세조류의 대량 배양방법에 대해 개시하고 있다.

그러나 상기 선행기술의 경우, 광생물반응기 내부에 추가적인 환경수를 공급해야 하므로 생산 비용이 증가하는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 이산화탄소를 공급하는 배양 시스템을 이용하여 경제적이면서 효과적으로 미세조류의 지질 함량을 증가시킬 수 있는 신규 미세조류 배양방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 미세조류를 해양 배양장에서 배양하는 1차 배양 단계; 상기 1차 배양 단계의 미세조류를 광생물반응기로 옮긴 후 이산화탄소(CO₂)를 공급하여 바이오매스 내의 회분 함량이 감소된 미세조류를 수득하는 회분 감량 단계; 및 상기 회분 함량이 감소된 미세조류를 배양 배지에 접종한 후 육상 개방형 경주로 배양장에서 이산화탄소를 공급하면서 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는, 미세조류의 배양방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미세조류 균주를 해양 배양장에서 배양하여 미세조류 바이오매스를 제조하는 1차 바이오매스 제조단계; 상기 1차 바이오매스를 광생물반응기로 옮긴 후 이산화탄소(CO₂)를 공급하여 바이오매스 내의 회분 함량이 감소된 2차 바이오매스를 제조하는 2차 바이오매스 제조단계; 및 상기 2차 바이오매스를 배양 배지에 접종한 후 이산화탄소 공급하에 배양하는 3차 바이오매스 제조단계를 포함하는, 지질 생산량이 증대된 미세조류의 배양방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 신규 미세조류 배양방법인 이산화탄소 공급 방식을 통한 미세조류 2차 배양 시스템을 이용하여 미세조류의 지질 함량을 경제적이면서 효과적으로 증대시킬 수 있어 바이오매스 생산성을 획기적으로 향상시킬 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 이산화탄소 공급 방식을 이용한 미세조류 2차 배양 시스템의 개략적인 공정을 나타내는 공정도이다.
도 2는 본 발명의 연못형 해양 배양기를 이용하여 1차 미세조류 배양을 수행하는 사진이다.
도 3은 본 발명의 배양 시스템에서 미세조류 2차 배양 시 사용되는 육상 광생물반응기(open raceway pond, 10 kL)의 구조를 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 4는 2차 미세조류 배양을 위해 CO₂를 공급하는 수직 컬럼 광생물반응기(vertical column photobioreactor)의 모습을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 5는 2차 미세조류 배양을 수행하는 육상 광생물반응기의 모습을 나타내는 사진이다.
도 6은 이산화탄소 공급에 따른 미세조류 배양액 내 미세조류 농도 및 회분(ash) 함량 변화를 분석한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 이산화탄소 공급에 따른 미세조류 배양액 내 무 회분(ash-free) 바이오매스 농도 및 바이오디젤 함량 변화를 분석한 그래프이다.
도 8은 2차 미세조류 배양 동안 바이오매스 농도와 회분 함량의 변화를 분석한 그래프이다.
도 9는 2차 미세조류 배양 동안 회분을 제외한 바이오매스 농도와 지방산 농도의 변화를 분석한 그래프이다.
도 10은 2차 미세조류 배양 동안 바이오매스의 지방산 함량의 변화를 분석한 그래프이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "미세조류(microalgae)"는 바다에 서식하는 식물성 플랑크톤으로, 흔히 적조를 일으키는 코클로디니움 같은 플랑크톤 역시 미세조류에 속한다. 해양 바이오에너지 연구가 주목하는 미세조류는 특히 지질, 즉 기름 성분이 풍부한 미세조류 종(種)이다. 크기는 10μm(미크론, 1m의 100만분의 1)정도, 머리카락 굵기의 10분의 1 안팎이다.

본 문서에서 사용되는 용어 "광합성 미생물"는 광합성을 할 수 있는 녹조류, 홍조류 및 남조류를 의미하며, 일반적으로 클로렐라, 클라디도모나스(Chlamydomonas), 해마토코커스(Haematococous), 보트리오 코커스(Botryococcus), 세네데스무스(Scenedesmus), 스피룰리나(Spirulina) 테트라셀미스(Tetraselmis) 및 두날리엘라(Dunaliella)등을 배양한다. 상기 미세조류는 배양용기 내에서 카로테노이드, 균체, 파이코빌리프로테인, 지질, 탄수화물, 불포화지방산 및 단백질 등을 생산한다.

발명의 상세한 설명:

상기 미세조류의 배양방법에 있어서, 상기 회분 함량이 감소된 미세조류를 배양 배지에 접종 시 접종농도는 0.06 내지 0.08 gAFDW/L일 수 있고 상기 회분 감량 단계에서의 이산화탄소 공급은 1 내지 10% 이산화탄소가 포함된 공기를 0.005 내지 0.05 vvm의 조건으로 2 내지 10시간 동안 공급함으로써 수행될 수 있으며 상기 미세조류는 Tetraselmis sp. KCTC12429BP일 수 있다.

상기 지질 생산량이 증대된 미세조류의 배양방법에 있어서, 상기 3차 바이오매스 제조단계는 육상 개방형 경주로 배양장에서 수행될 수 있다.

미세조류의 배양은 배양액 내 존재하는 수소 이온(H⁺)을 세포 내로 흡수함에 따라 수소 이온이 감소하여 배양액 내 pH는 증가에 따른 세포 응집으로 생산성이 감소하고 미세조류의 탄소원인 탄산수소염(HCO_3-)은 pH가 증가함에 따라 완충작용에 의해 수소 이온(H⁺)과 탄산염(CO₃ ^2-)으로 분해되어 미세조류가 이용할 탄소원이 감소하여 더 낮은 성장 속도를 나타내게 된다. 아울러, 배양액 내 pH 증가로 인해 마그네슘(Mg²⁺) 또는 칼슘 이온(Ca²⁺)과 같은 2가 양이온의 용해도가 감소하게 되고, 수산화 이온(OH^-) 또는 탄산염(CO₃ ^2-)과 반응하여 침전되는 수산화마그네슘(Mg(OH)₂), 탄산마그네슘(MgCO₃), 수산화칼슘(Ca(OH)₂) 및 탄산칼슘(CaCO₃) 등을 생성하여 배양액 내 회분 함량을 증가시키게 된다.

이에 본 발명자들은 미세조류 1차 배양 시 높아지는 pH에 의해 양이온의 용해도가 낮아짐으로 회분(ash) 함량이 증가하고 세포 응집에 의한 바이오매스 생산이 감소하는 문제를 해결하고자 예의노력한 결과 미세조류를 해양 배양장에서 1차 배양을 수행하고 이를 광생물반응기로 옮긴 후 이산화탄소(CO₂)를 공급하여 바이오매스 내의 회분(ash) 함량을 감소시킨 다음 배양 배지에 접종 후 육상 개방형 경주로 배양장에서 이산화탄소를 공급하면서 2차 배양을 수행한 결과 배양액의 pH가 조절됨에 따라 세포 응집이 억제되고 회분 함량이 감소하여 최종적으로 미세조류의 지질 함량이 증대되어 바이오매스 생산성도 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다(도 1).

도 1을 참고하면 1차 배양 후 많은 양의 배양액을 농축시키고자 침전지를 이용 1차 해양 배양 시, 1 batch 당 평균 84 kL의 세포 배양액을 회수하나, 육상에서 진행하게 되는 2차 배양의 최대 수용량이 20 kL이기 때문에, 상기 84 kL의 배양액을 40 kL로 약 2배 농축한 뒤에 20 kL의 배양액은 10 kL conical tank 2대를 이용하여 바이오매스를 수확하고, 나머지 20 kL를 2차 배양을 통해 바이오매스 및 지질 생산을 높이는 미세조류 배양방법을 수행하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 미세조류 1차 배양

본 발명자들은 본 발명의 이산화탄소 공급 방식을 이용한 미세조류 2차 배양시스템의 바이오매스 생산성을 비교하기 위하여 먼저 연못형 해양 미세조류 배양기를 이용하여 1차 배양을 수행하였다.

구체적으로 연못형 해양 미세조류 배양기는 평면적이 36 m²(9 m X 4 m)인 정사각형 형태의 PVC 타포린(tarpaulin)으로 제작하였고 균주는 Tetraselmis sp. KCTC12429BP 종을 사용하였다. 또한 해수에 질산염(nitrate)과 인산염(phosphate)을 추가한 배지를 사용하였으며 인천광역시 영흥도 연안에 설치한 후 5일 동안 미세조류 세포 배양을 진행하였다(도 2).

실시예 2: 미세조류 2차 배양

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 수행한 1차 배양 후 배양액 내 존재하는 수소 이온(H⁺)을 세포 내로 흡수함에 따라 pH가 상승하여 회분(ash) 함량이 증가한 바이오매스에 CO₂를 공급을 통해 pH를 조절하여 회분 함량이 감소된 바이오매스를 추가 공급하여 2차 배양을 수행하였다.

구체적으로 1차 배양 후 약 9 내지 10 수준의 높은 pH에 의해 양이온의 용해도가 낮아져 세포 응집에 의한 바이오매스 생산 감소와 회분 함량이 증가한 천연 해수 배양액을 육상 Open raceway pond(OPR, 10 KL)에 옮긴 후 배양액에 질소(nitrogen, 33 mg/L) 및 인(phosphorus, 15 mg/L)을 첨가하였으며 상기 배지를 온도 25℃ 및 초기 세포 농도 0.09 gDCW/L로 유지함으로써 2차 배양을 수행하였다(도 3). 한편, 1차 배양 후 회분(ash) 함량이 증가한 바이오매스 700 g에 2% 이산화탄소(CO₂)가 포함된 공기를 0.01 vvm의 속도 조건으로 공급하여 200 L급 원통형 광생물반응기에서 18시간 동안 배양함으로써, 바이오매스 내의 회분함량을 감소시키는 중간배양을 수행하여 회분이 감소된 바이오매스를 생산한 후, 400 g을 상기 2차 배양 시작 4시간 경과 후 육상 개방형 경주로 배양장(open raceway pond)에 추가로 공급하여 3일 동안 배양하였다(도 4 및 5).

실시예 3: 바이오매스 생산성 분석

본 발명자들은 미세조류 2차 배양 시 이산화탄소 공급 조건을 추가하여 pH의 조절 및 회분 함량 변화에 따른 바이오매스 생산성, 지질 생산량을 비교 분석하였다. 구체적으로 해양에서 1차 배양 후 pH 상승에 의해 회분 함량이 높은 Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 육상 OPR로 옮긴 후 CO₂ 공급을 통해 2차 배양을 수행한 결과 대조군과 비교하여 바이오매스 생산량은 증가한데 반해 회분 함량은 약 22% 수준으로 감소된 것을 확인하였다(도 6).

또한, 1차 배양 바이오매스를 수직 컬럼 광생물반응기(vertical column photobioreactor) 내에서 CO₂를 공급하여 pH 조절 및 회분 함량이 감소된 바이오매스 400 g을 육상 OPR에 추가 공급하여 배양한 결과, 대조군과 비교하여 회분 함량은 약 33% 수준으로 감소하였고, 바이오디젤 생산량은 약 65% 수준으로 증가한 것으로 나타났다(도 7).

실시예 4: 바이오매스 농도 및 회분 함량 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 수행한 1차 배양 후 배양액 내 존재하는 수소 이온(H⁺)을 세포 내로 흡수함에 따라 pH가 상승하여 회분(ash) 함량이 증가한 바이오매스를 수득한 후, 이를 육상 개방형 경주로 배양장의 배양 배지에 접종하였는데 접종농도를 0.1 g/L의 농도로 접종한 대조군 1, 0.15 g/L의 농도로 접종한 대조군 2, 및 CO₂공급을 통해 pH를 조절하여 회분 함량이 감소된 바이오매스를 0.1 g/L의 농도로 접종한 실험군으로 분류하였다. 대조군 1과 실험군은 동일한 농도로 접종이 되었으나, 실험군의 경우 회분 함량이 49%에서 31%로 감소되어 회분을 제외한 세포의 농도는 대조군 1 보다 더 높게 나타났다. 한편, 대조군 2는 대조군 1과 실험군보다 접종농도가 50% 높았지만, 회분 함량이 48%로 실험군보다 14% 높은 수준으로 나타났다. 상기 접종 농도에 따른 회분 함량 결과를 하기 표 1에 요약하였다.

그룹	접종농도(gDW/L)	회분 함량(%)	접종 농도(gAFDW/L)
대조군 1	0.10	49	0.05
대조군 2	0.15	48	0.08
실험군	0.10	31	0.07

*DW(dry weight): 배양액 내 고형분의 농도

*AFDW(ash-free dry weight): 회분을 제외한 순수 바이오매스의 농도

상기 분류한 실험군, 대조군 1 및 2를 이용하여 2차 배양 후 바이오매스 농도 및 회분 함량을 분석하였다. 구체적으로 1차 배양 후 약 9 내지 10 수준의 높은 pH에 의해 양이온의 용해도가 낮아져 세포 응집에 의한 바이오매스 생산 감소와 회분 함량이 증가한 세포 배양액을 육상의 침전조로 끌어올린 뒤, 각각 0.10 g/L, 0.15 g/L의 농도를 맞추기 위해 천연 해수를 첨가하여 육상 경주로 배양장(10 kL)의 배양 배지에 접종하였고, 실험군은 1차 배양 후 침전되어 농축된 미세조류 바이오매스를 200 L급 원통형 광생물반응기로 이동시킨 다음, 2% CO₂가 포함된 공기를 0.1 vvm 조건으로 16시간 동안 공급하여 pH를 6.5 내지 7.0으로 감소시킴에 따라 회분 함량을 31%까지 낮춘 후, 천연 해수를 첨가하여 0.10 g/L의 농도로 맞추어 육상 개방형 경주로 배양장의 배양배지에 접종하였다. 상기 모든 경주로 배양장에는 접종 시 배양액에 질소(nitrogen, 33 mg/L) 및 인(phosphorus, 5 mg/L)을 첨가하였으며, 배양액의 pH가 7.0 내지 8.0으로 유지되도록 이산화탄소 가스를 6일 동안 공급하면서 2차 배양을 수행하였다.

그 결과, 6일간의 2차 배양 후, 대조군 1의 바이오매스 농도는 0.14 g/L, 대조군 2는 0.16 g/L, 실험군은 0.2 g/L로 증가하였다. 실험군에서는 회분 함량이 배양 후 하루만에 21%로 감소하여 24% 이하로 유지되었지만, 대조군에서는 회분 함량이 서서히 감소하여 2일차부터 30%이하로 감소하였다(도 8).

또한 회분을 제외한 바이오매스 농도 및 지방산 농도를 분석한 결과, 실험군과 대조군 2는 같은 수준의 AFDW 농도로 2차 배양이 시작되었지만 처음부터 회분 함량이 낮았던 실험군에서 더 빠르게, 더 높은 농도로 실질적인 바이오매스 농도가 증가하여 배양 시작 시에는 대조군 2의 AFDW 농도가 14% 높았지만, 배양 종료 후에는 실험군의 AFDW 농도가 22% 더 높게 나타났다. 모든 그룹에서 회분 함량이 30%이하로 낮아진 2차 배양의 3일차부터 6일차까지의 평균 지방산 함량은 대조군 1에서 8.9%, 대조군 2에서 8.5%, 실험군에서 10.2%로 회분 함량이 서서히 감소한 대조군들보다 중간 배양을 통해 회분 함량이 낮아진 상태로 배양을 시작한 실험군에서 지방산 함량이 14% 내지 20% 더 증가한 것으로 나타났다. 아울러, 지방산 함량 및 세포 생장에 비례한 2차 배양 종료 후 최종 지방산 농도는 대조군 1에서 13.0 mg/L, 대조군 2에서 13.9 mg/L로 나타났으나 실험군에서 20.8 mg/L로 대조군 대비 49% 내지 60% 더 증가하였다. 또한 배양액 내의 최종 및 초기 지방산 농도의 차이를 배양기간으로 나눈 지방산 생산성을 분석한 결과, 대조군 1은 1.14 mg/L/d, 대조군 2는 0.75 mg/L/d과 비교하여 실험군에서 2.37 mg/L/d로 가장 높은 값을 나타내었다(도 9 및 10).

결론적으로, 본 발명의 이산화탄소 공급 방식의 배양 시스템을 이용한 신규 미세조류 배양방법은 미세조류 1차 배양 시 높아지는 배양액의 pH를 고려하여 이산화탄소를 공급하는 2차 배양을 통해 pH 조절하고 세포 응집 억제 및 회분 함량이 감소함에 따라 미세조류 바이오매스 및 지질 생산이 매우 증대되는 것을 확인하였으므로 상기 배양방법은 해양 미세조류 대량생산에 활용가능하다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 해양 배양장에서 배양하는 1차 배양 단계;
상기 1차 배양 단계의 Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 광생물반응기로 옮긴 후 1 내지 10% 이산화탄소(CO₂)를 0.005 내지 0.05 vvm의 조건으로 2 내지 10시간 동안 공급하여 바이오매스 내의 회분 함량이 감소된 Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 수득하는 회분 감량 단계; 및
상기 회분 함량이 감소된 Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 배양 배지에 접종한 후 육상 개방형 경주로 배양장에서 이산화탄소를 공급하면서 배양하는 2차 배양 단계를 포함하는, Tetraselmis sp. KCTC12429BP의 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 회분 함량이 감소된 Tetraselmis sp. KCTC12429BP를 배양 배지에 접종 시 접종농도는 0.06 내지 0.08 gAFDW/L인, Tetraselmis sp. KCTC12429BP의 배양방법.
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Tetraselmis sp. KCTC12429BP 균주를 해양 배양장에서 배양하여 Tetraselmis sp. KCTC12429BP 바이오매스를 제조하는 1차 바이오매스 제조단계;
상기 1차 바이오매스를 광생물반응기로 옮긴 후 1 내지 10% 이산화탄소(CO₂)를 0.005 내지 0.05 vvm의 조건으로 2 내지 10시간 동안 공급하여 바이오매스 내의 회분 함량이 감소된 2차 바이오매스를 제조하는 2차 바이오매스 제조단계; 및
상기 2차 바이오매스를 배양 배지에 접종한 후 육상 개방형 경주로 배양장에서 이산화탄소 공급하에 배양하는 3차 바이오매스 제조단계를 포함하는, 지질 생산량이 증대된 Tetraselmis sp. KCTC12429BP의 배양방법.
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