KR102080107B1 - 순환되는 종양세포를 바이오마커로 사용하여 암 치료요법의 효율을 모니터링 하는 방법 - Google Patents

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Abstract

예측마커로써 순환하는 종양세포 동력학(circulating tumor cell kinetics)을 이용하여 암 치료요법, 예를 들어 방사선요법의 효율을 모니터링하는 방법들이 서술된다.

Description

순환되는 종양세포를 바이오마커로 사용하여 암 치료요법의 효율을 모니터링 하는 방법{METHOD FOR MONITORING EFFICACY OF A CANCER THERAPY USING CIRCULATING TUMOR CELLS AS A BIOMARKER}
이 출원은 2015년 5월 14일에 출원된 U.S. Provisional Patent Application Serial No. 62/161,595 에 대한 우선권(benefit of priority)을 주장하며, 그 내용 전부가 여기에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 계약번호 R01-CA182528로 국립보건원 (National Institutes of Health)지원 및 계약번호 DMR-1409161로 국가과학재단(National Science Foundation)의 지원하에 정부로부터 후원을 받아 만들었다. 정부는 본 발명에서 일정한 권한을 갖는다.
순환하는 종양세포는 (circulating tumor cells)(CTC) 암의 관리에 중요한 바이오마커이다. 이의 확립된 임상적용에는 종양의 비-침습적인 "액체 부검 (liquid biopsy)"로서 및 유방암, 전립선암 및 직장암들의 예후 바이오마커 (prognostic biomarker)로 뿐만 아니라((Cohen, et al. (2008) J. Clin . Oncol . 26:3213-3221; Cristofanilli, et al. (2004) N. Engl . J. Med . 351:781-791; de Bono, et al. (2008) Clin . Cancer Res. 14:6302-6309), 전립선암의 효율성 마커 (efficacy marker)로서(de Bono, et al. (2008) Clin . Cancer Res. 14:6302-6309; Goldkorn, et al. (2014) J. Clin . Oncol . 32:1136-1142; Sher, et al. (2011) J. Clin . Oncol . 29 (suppl; abstract LBA4517):293s; Lowes, et al. (2012) Clin . Transl . Oncol . 14:150-156) 사용하는 것을 포함한다. 그러나 기존의 CTC 에세이가 상대적으로 민감도가 낮아 이의 광범한 임상 적용에는 한계를 가진다. CTC 는 매우 드물어, 피 내의 10억 개 혈액 세포 중 1개 일 정도로 매우 적은 양으로 구성되어 있다. 게다가, 혈류 내에 있는 대부분의 CTC 들은 순환되는 동안 세포사멸 또는 세포 괴사 과정하에 있어, 말초 혈액에서 검출될 만한 CTC의 수는 더 적은 결과를 가져온다. 바이오마커로서 이들을 사용하는 데 CTC 가 거의 적다는 점을 극복하기 위해, 높은 민감도 및 특이성을 갖고 CTC를 검출하고 포획할 수 있는 기기를 개발하는 것은 CTC 연구 및 임상적 적용에 아주 결정적이다.
수 많은 CTC 검출 방법들이 개발되었다. 지금까지 FDA-허가된 유일한 것인 CELLSEARCH™는, 현재 가장 가능한 CTC 검출 기술은 상피세포 접착 분자 (epithelial cell adhesion molecule) (EpCAM)와 같은 종양 상피조직 마커의 발현에 의한 면역친화력-기반한(immunoaffinity-based) 강화법을 사용한다. 그러나 대부분 상피조직-중간엽 전이(epithelial mesenchymal transition) (EMT) 때문에, 많은 CTC들이 세포 표면에 감소적으로 조절된 상피조직 마커를 보이므로, EpCAM-기반한 CTC 검출은 민감도가 낮은 것으로 나타났다. 게다가, 기존에 존재하는 검출 방법들을 사용하여 전형적으로 낮은 순도의 세포가 포획된다는 보고는 (포획된 세포들 모두 중에서 CTC의 퍼센트가 낮음) CTC들의 포획-후 분석을 방해한다.
CTC 검출을 향상시키기 위한 몇 가지 전략들이 보여준다. 첫 번째로, aEpCAM 및 E-셀렉틴(-selectin)으로 표면을 기능화시키면 aEpCAM 단독만을 가진 표면보다 더 좋은 포획효율을 (3.2--배까지) 보여 준다. 이 증강은 E-선택적으로-유도된 (E-selected-induced) 세포가 효율적으로 구르면서 흐름 챔버 (flow chamber)에 있는 빨리-흐르는 세포를 포획 표면으로 영입하기 때문이다 (Myung, et al. (2010) Langmuir 26:8589-96). 더 나아가, 다가 결합(multivalent binding )은 표면의 포획 능력을 증강 시킬 수 있는 것으로 알려졌다. 표면의 포획 능력은 해리 상수 100만-배 이상 증강 및 포획 효율 7-배 이상 증가로 보여준 것과 같이 G7 폴리(아미도아민)(PAMAM)덴드리머-매개한((G7 poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimer-mediated)) 다가 결합효과의 사용으로 상당히 개선된다 (Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72). 추가로, 세포 구르기 및 다가 결합의 조합 효과를 aEpCAM, 항-인간 표피성장인자 수용체-2(anti-human epidermal growth factor receptor-2)(aHER-2), 및 항-표피성장인자 수용체(anti-epidermal growth factor receptor)(aEGFR)와 같은 복합 암-특이 항체들 함께 적용할 수 있는 것으로 나타났다(Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72). 이런 전략들을 사용하여, 이런 관찰된 증강이 임상적인 CTC에도 적용가능 하다는(WO 2010/124227 and WO 2015/134972) 가설하에 CTC 들을 효과적으로 포획하기 위한 UICHIP™로 지정한 CTC 장치가 개발되었다.
본 발명은 (a) 암치료하기 전에 한 개체의 생물학적 샘플에서 (예; 말초 혈액) 순환하는 종양세포 (circulating tumor cells) (CTCs) 수들을 측정하고 및 (b) (a) 에서 측정한 CTC 수들을 같은 개체에서 암치료 동안 또는 암치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 생물학적 샘플에서 측정한 CTC 수들과 비교하여 암치료 효율을 모니티링 하는 방법이다, 여기서 CTC 수들은 적어도 고정 시킨 세포-회전 제제 (cell-rolling agent)(예, E-셀렉틴) 및 하나 또는 그 이상의 고정 시킨 CTC-특이적 포획제 ((예, 상피세포 접착 분자 (epithelial cell adhesion molecule)(EpCAM), 상피성장인자 수용체-2 (epidermal growth factor receptor-2) (HER-2), 및 상피성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor)(EGFR))들에 결합하는 항체들))를 포함하는 하나의 챔버를 가진 유동 기반한 장치(flow-based device)를 사용하여 측정된다. 한 예시에서, 암 치료 동안 또는 치료 후에 CTC들의 수의 변화는(예, 감소 또는 증가) 암 치료에 대한 개체의 반응의 표시이다. 다른 예시들에서는 하나 또는 그 이상의 CTC-특이적 포획제들을 폴리에틸렌 글라이콜에 공유결합적으로 붙여진 수정된 폴리(아미도아민) 덴드리머를 통해 고정 시켰다. 더 나아간 예시들에서는, 암 치료는 두경부암, 폐암, 직장암, 식도암 또는 자궁암의 치료를 위해서이다. 특별한 예시에서는, 암 치료는 방사성 치료이며 및 방법에는 만약 방사선 치료하는 동안 또는 치료 후에 CTC 수가 변화한다면 (c) 방사성 치료법을 수정하는 단계를 추가적으로 포함한다((예, 이온화되는 방사성 용량을 증가 또는 감소, 방사선을 저분할(hypofractionation) 또는 고분할(hyperfractionation), 로 투여, 또는 화학요법제 투여, 유전자 치료, 면역 치료, 표적 치료, 호르몬 치료, 방사선감수성증강물질, 또는 이들의 조합)). 특별한 예시들에서는, 유동 기반한 장치는 ml 당 약 2.1 개 세포의 검출 한계를 가지며 약 49%의 CTC 순도 수준을 제공한다.
도 1A-1C는 UICHIP™-S 에서 덴드리머 및 복합 항체의 조합을 통해 증강된 CTC 포획 민감도를 보여준다. 도 1A, UICHIP™-S를 사용하여 얻은 모든 환자들 (01-21)로부터의 혈액 1ml 당 CTC의 의미 있는 수. 도 1B. 포획된 7.5ml의 환자들의 혈액 당 CTC 수가, 문헌 (5±2, n=19, CELLSEARCH™ vs. 1663±389, n=20)으로 부터의 CELLSEARCH™ 의 결과에 비해, UICHIP™-S에서 유의성 있게 더 높다. 평균 라인들은 평균 (mean)± SE를 표시한다. 도 1C. aEpCAM 으로 만 코팅된 대조군 표면에 포획된 CTC 수에 대비하여 (점선), 항체 혼합물(ABMIX), G7 덴드리머 (G7), 및 이들 두 개의 조합의 증강 배수. 평균 라인은 평균 (mean)± SE를 표시한다.
도 2A-2C는 UICHIP™-D에 E-셀렉틴-매개 (E-selectin-mediated)하는 세포 구르기를 첨가하여 CTC 포획 특이성이 증강됨을 보여준다. 도 2A, UICHIP™-D를 사용하여 얻은 환자들(UNC 02-21) 혈액 1ml당 의미 있는 CTC 수. 환자 01의 혈액은 헤파린 대신, EDTA로 처리되어 세포의 구그기 반응을 불안정화시키므로, 포함 시키지 않았음을 주지하시오. 도 2B, UICHIP™-D 및 UICHIP™-S을 사용하여 측정된 CTC 수의 비교. 도 2C, 건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 사용하여 얻은 CTC 수. UICHIP™-D 및 UICHIP™-S을 사용한 베이스라인 CTC 수는 각각 1ml 당 7.7±1.1 및 2.1±0.3 세포에서 측정되었다. 도 2D, UICHIP™-S를 사용한 것과 비교하여, UICHIP™-D를 사용하여 포획한 모든 세포들 중 의미 있게 증강된 CTC 포획의 순도 (%). 이 결과는 UICHIP™-D의 포획 특이성이 E-셀렉틴-매개 세포 구르기를 통해 획기적으로 증강되었음을 제시한다.
도 3A 및 3B는 UICHIP™-D를 사용한 방사선치료(RT) 모니터링의 치료적 효과를 보여준다. 도 3A, CELLSEARCH™를 사용하여 HNSCC 암환자에서 보고된 CTC 수 ((Grobe, et al. (2014) Clin . Cancer Res. 20:525-33; Bozec, et al. (2013) Eur. Arch. Otorhinolaryngol . 270:2745-9; Grisanti, et al. (2014) PLoS ONE 9(8):e103918; Nichols, et al. (2012) Head Neck 34:1440-4))에 비교해, UICHIP™-D를 사용하여 의미 있게 높은 수의 CTC가 포획되었다.(1663.3±389.2 세포/7.5 mL 혈액, 평균 ± 표준편차 (SE))이 검출 되었다. 도 3B, RT 과정 동안에 완전한 CTC 측정을 한 16명의 환자에서, Pre-RT (중앙값 152 세포/mL, 43 에서 849 세포/mL의 범위)에서의 CTC 수는 RT (End-RT에서 중앙값 29 세포/mL, 2 에서 150 세포/mL 범위, p = 0.001) 에 반응하여 통계적으로 의미 있게 감소 되었다.
순환하는 종양세포(irculating tumor cells)(CTCs)는 암 케어(cancer care)에서중요한 바이오마커이다. 그러나 CTC의 임상적인 사용은 현존하는 CTC 포획 에세이(capture assays)의 민감도가 낮아 한계를 가진다. UICHIP™ CTC 포획 플렛홈을 사용하여 흘러다니는 세포를 E-셀렉틴-매개한 (E-selectin-mediated) 세포 구르기 (cell rolling)로 표면으로 효과적인 유인, 폴리 (아미도아민)(PAMAM) 덴드리머-매개한 ((poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimer-mediated)) 복합(다가)결합 효과에 의한 종양세포의 강한 표면 결합, 및 aEpCAM, aHER-2, 및 aEGFR 와 같은 복합 암세포-특이 항체들 혼합물의 조합을 통해 여러 가지 종양세포의 포획 효율이 상당히 개선되었음이 지금 발견되었다. 특히, 주로 복합 항체 혼합물의 덴드리머-매개한 복합 결합 효과 때문에 의한 UICHIP™ 의 높은 민감도가 CTC 포획을 ml 당 18.5 에서 662 CTCs의 범위에 있게 함이 관찰되었다. UICHIP™-D에의 세포 구르기 유도는 CTC 특이성을 의미 있게 개선 시켰다(48.6% 순도까지). 중요하게는, 방사선치료 전 (Pre-radiotheraphy) 및 방사선치료 끝 (End-radiotheraphy) 사이에 CTC 수의 변화에 근거하여, UICHIP™-D는 CTC가 치료 반응의 예측 바이오마커로서 사용될 수 있음을 보여주었다. 따라서, UICHIP™-D의 CTC 포획은 치료 효과 및 암의 진행을 모니터링하고, 분리된 CTC의 포획-후 분석에 유용하다. 예를 들어, UICHIP™-D를 사용하여 분리된 환자-유래 CTC에서 암 발생과 관계있는 유전자 서열들 (예, KRAS 및 EGFR)이 평가될 수 있으며 이로써 새로운 암 바이오마커의 발견과 궁극적으로는 개인맞춤 의학에의 응용을 촉진 시킨다.
그러므로, 본 발명은 일반적으로 암을 검출하고 및 암치료와 연관되어 암의 진행을 예측하는 에세이들에 관련된다. 어떤 경우들에서는, 즉 환자들이 암의 위험이 의심되는 경우에는, 예방적 치료들이 적용될 수 있다. 다른 암 대상자들에서는, 진단으로 조기 치료적 개입을 가능하게 할 수 있다. 다른 경우들에서 또한, 여기서 서술된 에세이들의 결과가 반복적인 치료가 필요한지에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 최종적으로, 본 발명은 치료적 효율을, 즉 치료를 모니터링 하고 어떤 치료가 특정 환자에게 유익한지 아닌지를 평가, 제시하는데 유용하다.
이 발명의 방법에 따라, 한 개체로부터의 생물학적 샘플에서 암치료 시작 전에 CTC의 수를 측정하고, 및 치료하는 동안 또는 치료 후의 하나 또는 그 이상의 시점에서 같은 개체로부터 얻은 비슷한 생물학적 샘플에서의 CTC의 수와 비교하였다. 특별한 예시들에서는, 방법에는 더 나아가 CTC 수준이 높은가에 근거하여 암을 치료하는 것도 포함할 수 있다. 암의 성공적인 치료는 암치료로부터 치료적으로 혜택을 받았을 때 분명하다. 그러한 혜택에는 치료법으로 치료하기 전과 비교하여 치료한 후에 생물학적 샘플에 존재하는 CTC 수가 감소하는 것을 포함한다. 성공적인 치료의 추가적인 표시들에는 개체의 암의 징후나 증상들의 횟수나 심각성의 감소, 행복감/웰빙(well-being)의 개선 및/또는 생존력증가가 포함될 수 있다.
"순환하는 종양 세포 (circulating tumor cell)" 또는 "CTC"라는 용어는 한 개체로부터 얻은 샘플에서 발견된 순환하는 암세포 어느 것도 다 의미하려는 의도가 있다. 전형적으로, CTCs 고형 종양으로부터 떨어져 나온다. 그러므로 CTCs 는 종종 고형 종양으로부터 떨어진 상피세포들이며 암을 지닌 환자의 순환계에서 매우 적은 농도로 발견된다. CTCs는 또한 육종(사르코마)으로부터의 중피세포(mesothelial cells) 또는 흑색종으로부터의 멜라노사이트일 수 있다.
여기서 사용된 대로, "생물학적 샘플 (biological sample)" 이란 용어는 CTC를 포함하는 어떤 샘플을 의미한다. 샘플의 소스로는 전 혈액(whole blood), 골수, 흉수, 복강액, 중추척수액, 전이, 바로 생검한 샘플 (예, 신선한 전립선 생검 샘플), 뇨, 타액 및 기관지 세척액이 포함된다. 특히, 샘플은 예를 들어 전 혈액 또는 이의 어떤 부분 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용되는데 적절한 혈액 샘플은 정맥 혈액, 동맥 혈액, 말초 혈액, 조직, 제대혈 및 이와 비슷한 것과 같은 혈액 세포 또는 이들의 성분을 포함하는 어떤 어느 소스로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 잘 알려지고 일상적인 임상적 방법들을(예, 전 혈액을 뽑고 가공하는 과정) 사용하여 얻고 가공될 수 있다. 한 특별한 예시에서는, 샘플은 암을 가진 개체로부터 뽑은 말초 혈액일 수 있다.
암을 가진 개체란 CTC (또는 CTC를 포함하는 샘플)가 얻어지거나 또는 주제의 방법들이 수행된 어느 각 개인 또는 환자를 의미하고자 한다. 일반적으로 그 개체는 인간이다, 그러나 그 개체는 설치류 (생쥐, 쥐, 햄스터 및 기니픽을 포함하는), 고양이, 개, 토끼, 소, 말, 산양, 양, 돼지 등을 포함하는 농경용 가축, 및 영장류 (원숭이, 침판지, 오랑우탄 밀 고릴라를 포함하는)와 같은 포유류를 포함하는 동물일 수도 있다.
어떤 예시들에서는, "개체가 암을 가지고 있다(the subject has cancer)", 는 암을 가지고 있을 것으로 의심되거나 또는 암을 가질 위험성이 (예, 가족력, 질병 소질, 또는 발암물질에 노출에 근거하여)있는 것이다. 그러한 암은 폐, 유방, 대장, 전립선, 췌장, 식도의 암, 모든 위장관 종양들, 비뇨 생식기 종양들, 신장암, 멜라노마, 내분비 종양들, 육종(사르코마) 등을 포함한다. 특정한 예시들에서, 암은 유방, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 폐, 췌장, 간, 위장관, 직장 또는 두경부암이다. 특별한 예시들에서, 개체는 고형암을 지닌다. 한 예시에서, 암은 두경부암이다. 다른 예시에는, 암은 폐암 (소세포 및 비소세포)이다. 더 다른 예시에서, 암은 직장암이다. 또 다른 예시에서, 암은 식도암이다. 아직 더 다른 예시에서 암은 자궁경부암이다.
이 발명의 방법을 사용하여 모니터 될 수 있는 암치료요법 또는 처치들에는, 이것에만 국한하지는 않으나, 화학요법, 방사선요법, 수술, 유전자 치료, 면역요법, 표적요법, 호르몬 요법 또는 이들의 조합이 포함된다. 어떤 특정 예시들에서는 모니터링 되는 암치료 요법은 방사선요법이다. 어떤 예시들에서, 방사선요법은 화학요법과 함께 사용된다.
화학요법 (Chemotherapy) . 여러 다양한 화학요법 제제들이 본 발명에 따라 사용될수 있다. "화학요법(Chemotherapy)"이라는 용어는 암을 치료하기 위해 약물을 사용함을 의미한다. "화학요법 제제(Chemotherapy agent)"는 암을 치료하는데 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하는데 사용된다. 이러한 제제들 또는 약물들은 세포 내에서 이들의 작용 방식, 예를 들어, 세포주기에 영향을 주는지 및 어느 단계에서 영향을 주는지, 에 따라 분류된다. 다른 한편으로는, 제제는 직접적으로 DNA에 크로스-링킹(cross-link)하는 능력, DNA에 끼어들어 가는 능력, 또는 핵산합성에 영향을 주어 염색체 이상 및 마이토틱 이상(mitotic aberrations)을 유도하는 능력에 근거하여 특징지어질 수 있다. 화학요법 제제들에는, 이것에만 국한 하지 않으나, 다음을 포함한다; 파크리탁셀(탁솔)((paclitaxel)(taxol)); 도세탁셀(docetaxel); 게르미시티빈 (germicitibine); 알데스루킨(Aldesleukin); 알램투쯔맵 (Alemtㅇzumab); 알리트레티노인(alitretinoin); 알로프리놀(allopurinol); 알트레타민(altretamine); 아미포스틴(amifostine); 아나스트로졸(anastrozole); 아르제닉 트리옥사이드 (arsenic trioxide); 아스파라기네이즈 (Asparaginase); BCG 라이브(BCG Live); 벡사로텐 캡슐(bexarotene capsules); 벡사로텐 젤(bexarotene gel); 블레오마이신 (bleomycin); 부설판 정맥주사(busulfan intravenous); 부설파노랄 (busulfanoral); 칼루스테론 (calusterone); 카페시타빈(capecitabine); 카보플라틴 (carboplatin); 카르뮤스틴(carmustine); 폴리페프로산 임플란드와 함께한 카르뮤스틴 (carmustine with Polifeprosan Implant); 셀레콕시브(celecoxib); 클로람부실 (chlorambucil); 시스플라틴 (cisplatin); 클라드리빈 (cladribine); 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide); 시타라빈 (cytarabine); 시타라빈 리포조말 (cytarabine liposomal); 다카르바진 (dacarbazine); 다티노마이신 (dactinomycin); 액티노마이신 D (actinomycin D); 다르베포에틴 알파 (Darbepoetin alfa); 다우노루비신 리포조말(daunorubicin liposomal); 다우노루비신 (daunorubicin), 다우노마이신 (daunomycin); 데니루킨 디프티톡스(Denileukin diftitox), 덱스라조산 (dexrazoxane); 도데탁셀 (docetaxel); 독소루비신 (doxorubicin); 독소루비신 리포조말 (doxorubicin liposomal); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (Dromostanolone propionate); 엘리오츠 B 용액 (Elliott's B Solution); 에피루비신 (epirubicin); 이포에틴 알파 에스트라뮤스틴 (Epoetin alfa estramustine); 에토포사이드 포스페이트 (etoposide phosphate); 에토포사이드(VP-16) ((etoposide (VP-16)); 엑세메스탄 (exemestane); 필그라스팀 (Filgrastim); 플록스유리딘 (동맥내의) ((floxuridine (intraarterial)); 플루다라빈 (fludarabine); 플로로유라실 (5-FU)((fluorouracil (5-FU));풀베스트란트 (fulvestrant); 겜투쭈맵 오조가미신 (gemtuzumab ozogamicin); 고세레린 아세테이트 (goserelin acetate);하이드록시우레아 ( hydroxyurea); 이브리투모맵 티우세탄(Ibritumomab Tiuxetan); 이다루비신(idarubicin); 이포스파미드(ifosfamide); 이마타닙 메시레이트 (imatinib mesylate); 인터페론 알파-2a (Interferon alfa-2a); 인터페론 알파-2b(Interferon alfa-2b); 이리노테칸(irinotecan); 레트로졸(letrozole); 루코보린 (leucovorin); 레바미솔(levamisole); 로무스틴(CCNU) ((lomustine (CCNU)); 메클로르에타민 (나이트로젠머스타드) ((mechlorethamine (nitrogenmustard)); 메게스트롤 아세테이트( megestrol acetate); 멜파란 (L-PAM) ((melphalan (L-PAM)); 머르캅토퓨린 (6-MP)((mercaptopurine (6-MP)); 메스나 (mesna); 메토트렉세에이트 (methotrexate); 메톡살렌 (methoxsalen); 마이토마이신 C (mitomycin C); 미토텐 (mitotane);미톡산트론 (mitoxantrone); 난드롤론 펜푸로피오네이트 (nandrolone phenpropionate);노페투모맵 (Nofetumomab); LOddC; 오프렐베킨 (Oprelvekin); 옥살리프라틴( oxaliplatin); 파미드로네이트 (pamidronate); 페가데마세(pegademase); 페그아스파르가제(Pegaspargase); 페그필그라스팀(Pegfilgrastim); 펜토스타틴( pentostatin); 피포브로맨 (pipobroman); 프리카마이신 (plicamycin); 미트라마이신 (mithramycin); 포르피머 소듐 (porfimer sodium); 프로카바진 (procarbazine); 퀴나크린(quinacrine); 라스부리케이즈(Rasburicase); 리툭시맵 (Rituximab); 사르그라모스팀 (Sargramostim); 스트랩토조신 (streptozocin); 탈부비딘 (LDT)((talbuvidine (LDT)); 탈크 (talc); 타목시펜 (tamoxifen); 테모졸로미드( temozolomide); 테니포사이드 (VM-26) ((teniposide (VM-26)); 테스토락톤(testolactone); 티오구아닌(6- TG) ((thioguanine (6- TG)); 티오테파 (thiotepa); 토포테칸 (topotecan); 토레미펜 (toremifene); 토시투모맵 (Tositumomab); 트라쭈주맵 (Trastuzumab); 트래티노인 (ATRA)((tretinoin (ATRA)); 우라실 머스타드 (Uracil Mustard); 발루비신 (valrubicin);발토르시타빈 (모노발 LDC) ((valtorcitabine (monoval LDC)); 빈부라스틴 (vinblastine);비노렐빈 (vinorelbine); 졸래드로네이트 (zoledronate); 및 이들의 어떤 혼합물.
방사선요법 (Radiotherapy). 방사선요법은, 방사선 치료라고도 또한 불린다, 암 또는 다른 질병을 이온화된 방사선으로 치료하는 것이다. 이온화된 방사선은 에너지를 저장하여 치료되는 부분에 유전 물질을 손상케 함으로서 세포를 상하게 하거나 파괴 시켜 이들 세포들의 계속 성장을 불가능하게 한다. 방사선은 암세포 및 정상세포 둘 다를 손상시키지만, 후자는 수선되어 기능을 적절히 할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 방사선요법은, 이것에만 국한하지 않고, γ-레이, X-레이, 및/또는 방사성동위원소를 종양세포에 직접 전달하는 방법의 사용이 포함될 수 있다. DNA 손상 인자들의 다른 형태로 마이크로웨이브 및 UV-조사와 같은 것도 역시 생각된다. X-레이의 용량 범위는 매일 용량 50에서 200 렌트겐으로 오랜 기간 동안 (3 에서 4주)에서부터 단일 용량으로 2000에서 6000 렌트겐까지다. 방사성 동위원소의 용량범위는 널리 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 타입, 및 신생 종양 세포에 의한 흡수 (uptake)에 의존한다. 이는 더 나아가, 방사선요법은 암 부위에 직접 방사선 용량을 전달하기 위해 방사성 표지된 항체들을 사용(radioimmunotherapy)하는 것을 포함할 수 있고 및/또는 방사성 감수성증강물질 사용을 포함할 수 있다고 생각된다.
면역요법 ( Immunotherapy ). 암 치료 맥락에서, 면역치료요법은, 일반적으로 암세포를 타겟으로 하여 암세포를 파괴 시키는 면역 작동체세포(immune effector cells)들에 의존한다. 트라쭈주맵 ((Trastuzumab (HERCEPTIN™))이 그러한 예이다. 예를 들어, 면역 작동체는 종양세포 표면에 있는 어느 마커에 특이적인 항체가 될 수 있다. 항체 단독으로 치료요법의 작동체로 작용할 수 있거나 또는 이는 세포를 죽이는데 실제로 영향을 주기 위해 다른 세포를 유인할 수도 있다. 항체는 또한 약물 또는 톡신에((화학요법제, 방사성핵(radionuclide), 리신 A 체인 (ricin A chain), 콜레라 톡신 (cholera toxin), 퍼투시스 톡신(pertussis toxin),등)) 융합될 수도 있으며 단지 타겟팅 제제로 만으로 작동할 수 있다. 다른 한편으로, 작동체는 직접 또는 간접적으로 종양 세포 타겟과 상호작용하는 표면 분자를 가지는 림포사이트(lymphocyte)가 될 수 있다. 여러 가지 작동체세포들에는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cells) 및 NK 세포가 포함된다. 치료양식들의 조합, 즉 직접적인 세포독성 활성 및 억제 또는 ErbB2 의 감소는, ErbB2를 과다 발현하는 암들의 치료에 치료적으로 유익함을 제공한다.
현재 조사되고 있거나 사용되고 있는 면역요법의 예들에는 면역 아주벤트 (adjuvants), 예, Mycobacterium bovis , Plasmodium falciparum , 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물 (US 5,801,005 and US 5,739,169); 사이토카인 요법, 예, 인터페론 α,ß, 및 γ; IL-1, GM-CSF 및 TNF; 유전자 치료요법, 예, TNF, IL-1, IL-2, p53 (US 5,830,880 및 US 5,846,945); 및 모노클로날 항체들, 예, 항-강글리오사이드 GM2 (anti-ganglioside GM2), 항-HER-2, 항-p185 (US 5,824,311) 가 있다.
수술 (Surgery). 암을 가진 사람들의 약 60%가 예방적, 진단적 또는 단계조사적, 치료적 및 완화적 수술을 포함하는 어떤 수술을 거친다. 치료적 수술은, 본 발명의 치료, 화합요법, 방사성요법, 호르몬요법, 유전자 치료요법, 면역요법, 및/또는 대체 치료요법들과 같은, 다른 치료요법들과 함께 사용될 수 있다.
치료적 수술에는 암과 같은 조직 모두 또는 일부를 물리적으로 제거, 잘라내고, 및/또는 파괴 시키는 절제를 포함한다. 종양절제는 적어도 종양의 일부를 물리적으로 제거하는 것을 의미한다. 종양 절제 이외에, 수술에 의한 치료에는 레이저 수술(laser surgery), 냉동수술(cryosurgery), 전기수술 (electrosurgery), 및 현미경적으로 조절되는 수술 ((Mohs' surgery)이 포함된다. 더 나아가, 본 발명은 표피상의 암들. 전암들, 또는 수반하는 양의 정상 조직 제거에 함께 사용될 수 있을 것으로 생각 할수 있다.
암과 같은 세포들, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부가 제거되면, 신체에 구멍이 생길 수도 있다. 이 부분에 살포, 직접주사 또는 국부적인 적용을 통해 추가적인 항암요법으로 치료가 달성될 수도 있다. 그러한 치료는, 예를 들어, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5주 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이 치료들은 용량도 마찬가지로 다를 수 있다.
다른 제제들 (Other Agents). 화학요법, 방사선요법 또는 생물학적 요법과 함께 사용되는 다른 형태의 치료요법에는 온열치료(hyperthermia)가 포함되며, 이는 환자의 조직을 고온(106°F 까지)에 노출 시키는 과정이다. 외부적 또는 내부적 열 장치가 국소적, 부분적 또는 몸 전체에 고온으로 적용하는 것이 관여될 수 있다. 국소적 고열은 종양과 같은 작은 부위에 열을 적용하는 것이 관여된다. 열은 신체 밖에 있는 장치로부터 종양을 타겟으로 고주파로 외부적으로 발생시킬 수 있다. 내부적인 열은 주석 (thin), 가열 와이어 또는 따듯한 물로 채운 구멍 난 튜브, 심은 마이크로웨이브 안테나, 또는 고주파 전극을 포함하는 멸균된 프로브가 관여될 수 있다.
호르몬 요법도 사용될 수 있다. 유방암, 전립선암, 난소암, 또는 자궁경부암과 같은 어떤 암들의 치료에 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 어떤 호르몬들의 효과의 수준을 낮추거나 또는 차단하기 위해 호르몬들의 사용이 적용될 수 있다. 이 치료는 선택적 치료로서 또는 전이(metastases) 위험성을 감소시키기 위해 적어도 하나의 암치료 요법과 조합하여 자주 사용된다.
여기서 정해진 방법에서 적용될 치료제제의 양은 약학적으로 효과 있는 어떠한 양일 것이고 및 선택된 치료제제의 유사성 및 효능을 포함하는 여러 가지 인자들에 의존될 것이다. 이 분야에 익숙한 일반 사람은 특정한 제제의 치료적으로 효과적인 용량을 결정하는데 관여하는 인자들에 대해 익숙할 것이다. 치료 제제는 한 번 또는 한 번 이상 적용될 수 있다. 제한적이지 않은 예들에서, 치료 제제는 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번, 하루에 네 번, 하루에 여섯 번, 깨어 있을 때 매 2시간 마다, 매 4시간 마다, 매 이틀에 한번, 일주에 한 번 및 이와 같이 적용된다. 치료는 이 분야에 익숙한 일반 사람들에 의해 정해진 대로 어떤 기간 동안 계속될 수 있다.
여기서 제시된 결과들은 CTCs가 암 치료요법을 위한 단정적인 바이오마커임을 보여 준다. 좀 더 특별하게는, CTC 키네틱스(CTC kinetics)가, 즉, 암 치료요법 치료 계획에 따른 CTC 수의 변화가, 암 치료요법의 완전한 또는 불완전한 반응인지를 평가하는데 사용된다. 이 발명의 방법에 따라, CTCs 수는 치료 전 및 치료 후 모두에서 측정되며 및 암 치료요법 계획, 예, 시기 및/또는 용량, 의 효율성을 평가하기 위해, 선택적으로 치료 중에도 평가될 수 있다. CTC 수의 변화 또는 CTC 키네틱스는 치료 전의 CTC의 수를 치료 동안 및/또는 치료 후의 CTC 수와 비교하여 평가될 수 있다. 한 예시에서, 치료 코스 동안에 걸쳐 CTC가 일정하게 감소하는 것은 치료(예, 화학요법과 함께 또는 없이 방사선치료)에 대한 완전한 종양 반응을 예측하게 한다. 다른 예시에서는, CTC 수가 만약 증가하면, 최종 CTC 수와 관계없이, 이때는 CTC 키네틱스/바이오마커는 치료에 대응하는 불완전한 반응을 예측한다.
여기서 보여준 대로, 생체모방 플렛폼(biomimetic platform), UICHIPTM은, CTC릎 측정하는데 매우 높은 정도의 민감성과 특이성을 제공한다. 실제로, 암의 단계, 환자의 의학적 역사, 또는 암의 타입과 상관없이, UICHIP™-D는 말초 혈액 1 ml 당 평균 및 중앙값 각각 222 및 101의 CTC 를 포획할 수 있다. 이는 건강한 자원자로부터 공여된 혈액 1ml 당 7.5 CTCs (UICHIP™-S) 및 2.1 CTCs (UICHIP™-D)의 컷오프 값(cutoff values)보다 상당히 높다. 따라서, 이 발명의 방법에서 CTC의 수는 UICHIPTM를 사용하여 측정하며, 이 UICHIPTM는 세포 구르기-유도제 및 기질에 붙어 있는 적어도 하나의 CTC-특이적 포획제를 가지고 있다. WO 2010/124227 및 WO 2015/134972 를 보시오. 특히, 이 발명의 방법은 유동 기반한 장치를 사용하며, 이 장치에서는 적어도 하나의 고정된 세포-구르기 제제를 가진 챔버 및 적어도 하나의 고정돤 CTC-특이적 포획제를 포함한 장치이다. 어떤 예시들에서는, 포획 제제는 항체, 항체 조각, 만들어진 항체 (engineered antibody), 엽산 (folic acid), 트랜스페린(transferrin), 펩타이드, 및 CTC 표면의 잔기에 결합하는 앱타머 (aptamer)이다. 특별한 예사들에서는, 유동 기반한 장치는 하나 또는 그 이상의 상피세포 부착분자(epithelial cell adhesion molecule) (EpCAM), 인간 상피성장인자 수용체-2 (human epidermal growth factor receptor-2)(HER-2), 상피성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) (EGFR), 암배아항원 (carcinoembryonic antigen)(CEA), 전립선 특이 항원 (Prostate specific antigen) (PSA), CD24, 및 엽산결합 수용체(folate binding receptor) (FAR) 에 결합하는 포획제제들을 포함한다. CTC 포획을 촉진 시키기 위해, 포획 제제들은 폴리에틸렌 글라이콜에 공유 결합적으로 결합 된 수정된 폴리(아미도아민) 덴드리머를 통해 장치의 표면 붙여 고정 시킨다. 다른 예시들에서는, 세포 구르기-유도 제제는 셀렉틴 (selectin) 또는 셀렉틴의 CTC 결합 단편이다. 더 특별하게는, 셀렉틴은 E-셀렉틴, P-셀렉틴, 또는 L-셀렉틴이다. 유리하게는, 이 발명의 방법에서 사용된 유동 기반한 장치는 셀렉틴-매개하는 세포 구르기; 폴리(아미도아민) 덴드리머-매개하는 복합 (다가)(multivalent) 결합 효과에 의한 종양 세포의 강한 표면 결합; 및 복합 암세포-특이 항체들, 예, aEpCAM, aHER-2, 및 aEGFR의 사용을 통해 흐르고 있는 세포들을 표면으로 효율적으로 유인되게 한다. 게다가, 유동 기반한 장치를 사용하여, 검출한계는 1ml당 약 2.1 세포에 도달될 수 있으며 CTC의 순도는 세포-구르기 제제 없는 장치에 (전형적으로, 0.04% - 10.7%) 비해 약 49%이다. 따라서, 또한 이 발명의 방법은 검출 한계 1ml당 약 2.0 세포 및 적어도 CTC 순도수준 약 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45% 또는 50%를 제공한다. 이 발명의 방법을 사용하여 얻은 검출한계 및 높은 수준의 순도를 보았을 때, 암 치료요법 동안 또는 치료 후에 CTC 수 또는 CTC 키네틱스의 어떤 변화들은 쉽게 측정될 수 있다.
따라서, 현 방법은 치료 후 CTC 수의 변화 (즉, 증가 또는 감소)에 근거하여 암 치료요법 수정도 또한 제공한다. 특히, 암 치료요법이 방사선 치료요법 일때, 상기 치료요법은 CTC 수가 증가 (즉, 불완전한 반응) 또는 감소 (즉 완전한 반응)할 때 이온화 방사선의 용량을 각각 증가 또는 감소시켜 수정할 수 있다. 다른 예시들에서는, 이온화 방사선의 용량을 소분할(hypofractionation) 또는 과분할 (hyperfractionation)로 종양에 투여한다. 더 다른 예시들에서는, 방사선 치료요법은 화학요법, 유전자 치료요법, 면역치료요법, 표적 치료요법, 호르몬 치료요법, 방사선감수성 증강물질, 또는 이들의 조합을 투여하여 수정한다.
현 발명의 특별한 특징으로서는 (a) 방사선치료의 한 용량을 투여하기 전의 생물학적 샘플에 있는 순환하는 종양세포 (CTCs)수를 측정하고, 및 (b) (a) 에서 측정된 CTC의 수를 방사선 치료 동안 또는 치료 후 한 번 또는 그 이상의 시점에 얻은 같은 개체의 생물학적 샘플에 있는 CTC 수를 비교하여 방사선 치료요법의 효율을 모니터링 하는 방법이다, 여기서 CTC 수는 고정 시킨 하나의 세포-구르기 제제 및 하나 또는 그 이상의 고정된 CTC-특이적 포획제들을 포함하는 적어도 하나의 챔버를 가진 유동 기반한 장치를 사용하여 측정한다. 한 예시에서, 이 방법은 더 나아가, 개체에 방사선의 용량을 증가하여 투여하는 단계를 포함하며, 이때 방사선의 용량은 방사선 치료 시작 때 반응하여 말초 혈액 내에 증가 된 수준의 CTC를 갖고 있지 않은 개체에 투여된 용량과 비교하여 증가 된다. 이 예시에 따라, 증가분의 방사선 용량은 소분할 또는 과분할로 투여될 수 있다. 다른 예시에서, 이 방법은 더 나아가 개체에게 방사선의 용량을 감소하여 투여하는 단계를 포함하며, 이때는 방사선 치료 시작시 말초 혈액 내에 있는 증가 된 CTC 수준을 가진 개체에 투여된 용량과 비교하여 방사선 투여 용량이 감소 된다. 그러나 또 다른 예시에서, 이 방법은 약학적으로 효과적인 양의 화학요법, 유전자 치료요법, 면역치료요법, 표적 치료요법, 호르몬 치료요법, 방사선감수성 증강물질, 또는 이들의 조합과 병행하여 말초 혈액 내에서 CTC 수준이 증가 되지 않은 개체에 투여한 용량과 비슷한 용량의 방사선 용량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다음의 제한적이지 않은 예들이 현 발명을 더 나아가 보여주기 위해 제공된다.
재료들 및 방법들
재료들 . 항-인간 상피-세포-부착-분자 (epithelial-cell-adhesion-molecule) ((EpCAM)/TROP1 항체 (aEpCAM)), 항-인간 상피성장인자 수용체-2 (anti-human epidermal growth factor receptor-2) ((HER-2)/TROP1 항체 (aHER-2)), 및 재조합 인간 E-셀렉틴(E-selectin) 들은 R&D systems (Minneapolis, MN)으로부터 구입했다. 항-인간 상피성장인자 수용체 (EGFR) 항체(aEGFR, N-20) 는 Santa Cruz Biotech (Dallas, TX)로부터 얻었다. 에폭시로 기능화시킨 유리 표면 (Epoxy-functionalized glass surfaces)(SUPEREPOXY2®)은 TeleChem International, Inc. (Sunnyvale, CA)로부터 구입했다. PAMAM 덴드리머 7 세대 (PAMAM dendrimers (generation 7), 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin) (BSA), 및 모든 다른 화학품들은, 달리 기록되지 않는 한, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO)로부터 얻었으며, 특별히 언급되지 않는 한 더 이상의 정제 없이 그대로 사용되었다.
포획 제제 고정화에 의한 표면 기능화. 표면 기능화는 확립된 방법들을 사용하여 수행되었다 (Myung, et al. (2014) Anal. Chem. 86(12):6088-94; Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72). 간략하게, 에폭시로- 기능화시킨 유리 슬라이드를 첫 번째로 다른 제제들을 고정 시키는 부분을 지정한 패턴으로 폴리디메틸실록산 (polydimethylsiloxane) (PDMS) 가스켓에 맞추어 넣었다. 이 표면은 그 후 EDC/NHS 화학을 사용하여 이종두기능 (heterobifunctional)PEG (NH2-PEG-COOH), 7세대 부분적으로 카복실화된 PAMAM 덴드리머, 및 항체들을 연속적인 고정화로 기능화시켰다 (Myung, et al. (2011) Angew Chem. Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72). 항체 접합을 위해, aEpCAM, aHER-2, aEGFR 의 모든 항체 용액들은 최종농도 5μg/ml 로 사용되었다. 각 시약용액의 부피는 UICHIP™-S (즉, E-셀렉틴 없는 장치)는 250μL, 및 UICHIP™-D (즉, 즉, E-셀렉틴 있는 장치)는 200μL로 고정되었다. UICHIP™-D의 경우, 전체 항체가-고정된 표면들은 인산-버퍼된 생리식염수(phosphate-buffered saline)(PBS)에 5μg/ml 농도로 있는 E-셀렉틴 0.4ml로 4시간 동안 처리되었다. 모든 표면 반응들은 상온에서 일정하게 살짝 흔들면서 수행되었으며, 모든 제조 단계 사이에는 잔류 시약들을 제거하기 위해 표면은 증류된 탈 이온화된 물(distilled de-ionized) (DDI)및 PBS로 세 번 세척되었다. 단백질-코팅된 및 코딩 안 된 부분에 잠재적인 비-특이적 결합은 최종으로 1μg/ml의 메톡시 PEG-NH2 (methoxy PEG-NH2) (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) 용액으로 배양하여 차단하였다. 기능화된 표면은 4°C에 보관되었으며, 이 표면을 사용하는 실험은 표면 제조 후 일주일 이내에 수행되었다.
연구 디자인 . 이 연구는 노스 캘로라이나 -채플 힐 대학교 ((University of North Carolina-Chapel Hill (UNC))의 리네베르거 컴프리핸시브 암센타 (Lineberger Comprehensive Cancer Center) 단일 기관에서 수행된 예측 연구였다.조직학적으로 증명된 암을 가진 환자가 해당한다. 방사선적으로 확인된 단계 (stage)II, III, 또는 IV 의 질병이 요구되며, 환자들은 화학요법과 함께 또는 화학요법 없이 표준 방사선 치료요법(RT) 프로토콜로 치료를 시작한다. 모든 환자들은 IRB-승인된 연구 프로토콜에 안내된 동의서를 써서 낸다. 연령, 인종, 조직 학적 아부류(subtype), 흡연 상태, 전이 부위, 받은 RT, 생존, 및 RT 반응들에 대한 데이타들이 수집되었다.
혈액 샘플. 대략 12ml의 전 말초 혈액을 건강한 공여자 또는 암환자로부터 뽑았다. 혈액은 EDTA-처리한 BD VACUTAINER 튜브에 베이스라인 시료 (baseline specimen)로 모은 첫 번째 등록한 환자를 제외하고는 응고를 방지하기 위하여 헤파린-처리된 BD VACUTAINER 튜브에 모았다. 혈액 시료들은 암 환자들로부터 뽑았으며, 상온에 보관되었고, 및 혈액 수집 후 24시간 이내에 분석되었다. 버피코트 (buffy coat)에 있는 CTC를 포함하는 단핵세포 (Mononuclear cells)는 이전에 서술된 논문 (Myung, et al. (2014) Anal. Chem. 86(12):6088-94) 대로 피콜-파큐 플러스 (FICOLL-PAQUE Plus) (Stemcell Technologies Inc., Vancouver, Canada) 를 사용하여 전 혈액으로부터 분리되었다. 2% FBS-포함하는 PBS로 2번 버피코트를 세척한 후, 수집된 세포들은 0.2 ml의 완전 DMEM 배지에 현탁 시키고 다음 실험에 사용되었다.
CTC 포획 에세이 . 혈액 시료로부터 CTC를 포획하기 위해, UICHIP™-S 플렛폼을 버피코트에 있는 단핵세포 (mononuclear cells) 현탁액과 함께 배양기에서 배양하였다. 수집된 버피코트 현탁액을 둘로 나누었다: 첫 번째 반은 UICHIP™-S를 위하여 650μL의 완전 DMEM 배지와 혼합하였고, 다른 반은 직접 UICHIP™-D를 위해 사용되었다. 표면들은 250μL의 세포 현탁액과 2 시간동안 배양되었다.
UICHIP™-D을 위해, 흐름 챔버(flow chamber) 실험은 이전에 보고된 대로 (Myung, et al. (2010) Langmuir 26:8589-96) 수행되었다. 분리된 버피코트 현탁액을 주사기 펌프 (New Era pump Systems Inc., Farmingdale, NY)를 사용하여 흐름 챔버에 주입시켰다. 두 개의 채널 ((각 채널은 60 mm (L) x 10 mm (W) x 0.125 mm (D))로 구성된 흐름 챔버는 혈액 샘플들을 주입하기 위해 튜브로 연결되었다. The UICHIP™-D의 세포 포획은 0.22 dyn/cm2 의 전단변형력 (shear stress)에 해당하는 25μL/min의 흐름 속도하에서 연속적으로 모니터 되었다. 표면은 그 후 완전 DMEM 배지를 사용하여 20분 동안 세척하고 PBS로 15분 동안 100μL/min (0.88 dyn/cm2)로 세척하였다. 전 포획과정은 OLYMPUS IX70 인버티드 현미경(Olympus America, Inc., Center Valley, PA), 10x 대물렌즈 및 CCD 카메라(QImaging Retiga 1300B, Olympus America, Inc.)를 사용하여 모니터 되었다.
표면-포획된 세포 중에서 CTC를 동정하기 위해, 연속적인 면역염색 에세이들을 수행하였다. 4% 파라포름알데하이드로 15분 동안 고정 시킨 후, 포획된 모든 세포들은 항체 침투를 증강 시키기 위해 0.2 w/v% TRITON X-100 (침투버퍼)로 5-10분 동안 처리되었다. 비-특이적 결합을 방지하기 위해, 면역염색 하기 전에 전체 슬라이드를 2 w/v% BSA 용액으로 30분 동안 처리하였다. 그 후 세포들은 다음의 항체들로 순차적으로 염색되었다:(1)인간 사이토케라틴 (human cytokeratin)(CK; 1:50, abcam)에 대한 토끼 항체, (2) 항-CK (1:100, Invitrogen)에 대한 ALEXAFLUOR 594-접합 된 2차 항체, (3) 인간 CD45 (1:500, BD bioscience)에 대한 토끼 항체, 및 (4) 항-CD45(1:100, Invitrogen)에 대한 ALEXAFLUOR 488-접합 된 2차 항체. 단핵세포 (mononuclear cells)의 핵을 염색하고 분석하는 동안 광-퇴색(photo-bleaching)을 방지하기 위해 API-포함된 마운팅 배지 (mounting media) (VectaShield Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 도 또한 사용되었다. 그 후 슬라이드들은 커버 글라스 및 메니큐어(nail polish)로 봉인하고, 4°C에 두었다. 면역염색 된 플렛폼들은 모터화된 스테이지 (motorized stage)와 20X 대물렌즈, 및 CCD 카메라를 갖춘 ZEISS 701 공촛점 현미경 (confocal microscope)을 사용하여 스캔 되었다, ImageJ (NIH)를 사용하여 독립적인 관찰/측정으로부터 얻어진 이미지들을 근거로, 표면에 있는 CK+/CD45-/DAPI+ CTCs의 수를 세었다.
통계분석(Statistical Analysis). 통계분석은 SPSS 버젼 21.0 WINDOWS 용(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행되었다, 모든 환자들의 RT-전 (Pre-RT) 및 RT-종료 (End-RT) 사이에서의 CTC 수의 절대적인 차이는 윌콕슨 싸인된-랭크 테스트(Wilcoxon signed-rank test)를 사용하여 계산되었다, 평가된 (도 1C에 보여준 데이타) 세 가지 다른 CTC 포획 플렛폼(PEG-aEpCAM, PEG-ABmix, 및 G7-ABmix)들에 의해 얻어진 절대적 CTC 수준의 통계적 차이를 결정하기 위해 푸리드만 테스트 (Friedman test)가 사용되었다. RT-전 및 RT-종료 사이에서의 CTC 수의 절대적인 차이는 윌콕슨 싸인된-랭크 테스트 (Figure 3B에 보여준 데이타)로 비교되었다. 모든 통계적 테스트들은 유의성 수준 P < 0.05 (두개-테일)에서 수행되었다.
표면 제조 및 UICHIP ™ 제작
G7 PAMAM 덴드리머(G7 PAMAM dendrimers), E-셀렉틴 (E-selectin), 및 항체혼합물이 병합된 UICHIP™이 이전에 서술된 표면 화학((Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72))을 사용하여 제작되었다. 간단하게, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드/N-하이드록시설포석신이미드) ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysulfosuccinimide) (EDC/NHS)-기반한 아미노-커플링 화학((Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72))을 사용한 이종두기능 폴리에틸렌글라이콜 (heterobifunctional polyethyleneglycol) (PEG, COOH-PEG-NH2) 링커를 통하여 부분적으로 카볼실화 된 G7 PAMAM 덴드리머들을 에폭시로 기능화시킨 유리 슬라이드에 고정시켰다. aEpCAM, aHER-2, 및 aEGFR의 항체 혼합물 (ABmix)을 EDC/NHS 커플링((Myung, et al. (2011) Angew Chem . Int . Ed. Engl . 50(49):11769-72; Myung, et al. (2014) Anal. Chem. 86(12):6088-94))을 통하여 카복실화된 G7 PAMAM 덴드리머 말단에 접합시켰다. 이 단계가 덴드리머 표면에 가능한 1차 아민 그룹을 대부분 소모하게 함으로, 양성 전기적 성질을 갖는 PAMAM 덴드리머 아미노 말단과 음성 전기적 성질을 가진 세포 멤브레인들 사이의 비-특이적, 정전기적 상호작용을 최소화하는 것을 도와준다. 덴드리머가 없는 표면들과 비교하여, PAMAM 덴드리머-고정된 표면들은 이들의 데드릭 나노구조 때문에 더 많은 양의 항체들을 고정 시킬 수 있으며, 종양세포 결합을 의미 있게 증강 시키는 복합 (다가) 결합 효과를 매개한다. E-셀랙틴의 아민 그룹과 유리 슬라이드 위의 에폭시 그룹 사이에 공유결합 형성을 통하여 흐르는 세포들을 포획 표면에 효과적으로 유인하기 위하여 인간 재조합 E-셀랙틴 분자를 추가로 고정 시킨다. 마지막으로, 비-특이적 결합을 최소화하기 위하여, 표면에 잔존하는 에폭시 그룹을 소모시키기 위해 기능화된 표면들을 메톡시-PEG-NH2 와 배양시켰다. 표면 기능화가 성공적인지를 확인하기 위해 X-레이 광전자 스펙트로스코피(photoelectron spectroscopy) 및 형광 현미경(fluorescence microscopy)을 사용하여 이 표면들의 성질이 규명되었다.
환자 통계 (Patient Demographics)
암 관리를 위해 RT를 받은 조직학적으로 확인된 1차 카르시노마 (primary carcinoma)를 지닌 환자들이 이 연구에 등록되었다. 총 21명의 환자, 직장암 (n=1), 자궁경부암 (n=1), 전립성암 (n=1), 구강암 (oral cavity) (n=2), 부비강암 (paranasal sinus) (n=3), 또는 인두중앙부(oropharynx) (n=13)암 환자들이 6개월에 걸쳐 모집되었다. 환자 통계적 및 임상 정보가 표 1에 요약되어 있다. 기준 혈액 시료들 (Pre-RT)은 RT 시작 일주일 이내에 수집되었다. 전형적으로 RT 계획을 위한 CT 자극하는 날 또는 전-치료 환자 셋-업 하는 날에 수집되었다. RT 하는 동안, 시료들은 RT 첫 번째 주(1W-RT), RT 중간 시점 (Mid-RT), 및 RT 마지막 주 (End-RT)동안을 포함하는 3번의 시점까지 수집되었다. 마지막 시료는 RT 마지막 주(Post-RT)보다 적어도 4주 후에 수집되었다.
평가 가능한 환지(Evaluable Patients)(N = 21)
No. %
기준 나이, 년 (Age at baseline, years
중앙 값 (Median)
범위 (Range)
57
42-84
성 (Gender)
여자 (Female)
남자 (Male)
7
14
33
67
인종 (Race)
코가시안 (Caucasian)
아프리칸 아메리칸 (African American)
18
3
86
14
암 타입(Cancer Type)
머리 및 목 (Head and Neck)
인두중앙부 (Oropharynx)
구강 (Oral Cavity)
부비강 (Paranasal)
직장 (Rectal)
자궁경부 (Cervical)
전립선 (Prostate)
18
13
2
3
1
1
1
86
62
10
14
5
5
5
진단시 종양단계(Tumor Stage at Diagnosis)
II
III
IV
3
1
17
14
5
81
조직학적 아류형(Histological Subtype)
스콰모스 셀 카르시노마 (Squamous Cell Carcinoma)
HPV/P16 양성
HPV/P16 음성
HPV/P16 미지
아데노카르시노마(Adenocarcinoma)
비부비동 (Sinonasal)
18

9
4
2
1
2
86

43
19
10
5
10
흡여 상태(Smoking Status)
현재 흡연자(Current Smoker)
이전 흡여자 (Former Smoker)
비흡연자 (Never Smoker)
4
8
9
19
38
43
등록한 21명 환자 중 총 19 (90%)명이 기준 측정 ((Pre-RT) 후, 후속적인 CTC 분석을 위해 적어도 하나의 치료 중 시료 (on-treatment speciment)를 가지고 있으며, 17명의 환자들에서는 (81%) RT 종료 (End-RT)하기 전에 마지막 혈액을 뽑았다. RT-후(Post-RT) 시료들은 총 13명의 환자 (62%)들로부터 수집되었다.
덴드리머 ( Dendrimers) 및 복합 항체들을 사용한 증강된 CTC 검출 민감도(Detection Sensitivity).
암환자들로부터의 임상 혈액 샘플을 사용하여 G7 PAMAM 덴드리머로 기능화된 표면에 고정된 복합 항체를 가진 표면의 CTC 검출 민감도가 측정되었다. 정적조건에서 (흐름이 없는 상태) CTC를 검출하기 위해 G7 덴드리머 및 ABmix (항체혼합물)를 적용한 장치는 UICHIP™-S로 표시됨을 인지하라. 표면에 포획된 세포들 중 CK+/CD45-/DAPI+ CTCs를 동정하기 위해 사이토케라틴 (cytokeratin)(CK, 표피마커), CD45 ((류코사이트 마커 (eukocyte)), 및 핵 (DAPI) 에 대한 표준 면역염색이 수행되었다. 도 1A에서 보여준 대로, CTC를 가진 모든 환자들로부터의 UICHIP™-S 표면 포획 CTC들의 수는 4 에서 1,134 cells/mL 범위이다. 머리 및 목 스콰모스 셀 카르시노마 (head and neck squamous cell cancinoma) (HNSCC) 환자들에서의 CTC 수는 그 후 CELLSEARCH™ ((Grㅇbe, et al. (2014) Clin . Cancer Res. 20:525-33; Bozec, et al. (2013) Eur . Arch. Otorhinolaryngol . 270:2745-9; Grisanti, et al. (2014) PLoS ONE 9(8):e103918; Nichols, et al. (2012) Head Neck 34:1440-4))를 사용하여 얻은 보고된 수와 비교되었다, 왜냐하면, HNSCC 환자들이 본 연구에서 주된 암환자들 집단이었기 때문이다. 결과들에서 1ml 당 CTC 수는 UICHIP™-S에서 사용된 혈액의 부피와 맞추기 위해 7.5를 곱했다는 것을 주지하라. 도 1B는 7.5 ml에 단지 몇 개의 CTC 만 검출된 것으로 보고된 SEARCH™ 결과에 비해, 현재의 표면을 사용하여 포획한 CTC 수(2,448 ± 569.4 세포/7.5 ml 혈액, 평균 ± 표준편차 (SE))가 의미 있게 높은 것을 보여준다. 또한 (1) PEG-aEpCAM; (2) PEG-ABmix; 및 (3) G7-ABmix 접합체 (UICHIP™-S)를 가진 표면을 사용하여 CTC 수를 별도로 세어 각개별 성분들의 포획 효율에 대한 효과가 조사되었다. 각 처치를 쌍으로 (pair-wise) 비교하여 각 표면 성분이 CTC 포획 민감도의 전반적인 증강 기여도에 대한 견해를 갖는다: ABmix 효과에 대한 (1) 및 (2)쌍: G7 PAMAM 덴드리머 효과에 대한 다른 쌍 (2) 및 (3): 및 ABmix 및 G7 PAMAM 덴드리머 의 혼합 효과에 대한 세번째 쌍 (1) 및 (3). 도 1C에서 보여준 대로, 이러한 비교의 결과들은, 각 >1 배-증가, 각 특정한 표면 성분들에 의해 양성적인 기여가 있음을 암시한다. 세 개의 비교((ABmix, G7 덴드리머, 및 이의 조합)를 통해 양성적인 기여도를(≥1 배-증가) 보여주는 샘플들의 퍼센트는 각각 57.1%, 81.0%, 및 76.2% 이었다 (도 1C).
UICHIP ™-D를 사용한 증가된 CTC 검출
CTC 검출 특이성은 흐름 하 에서(under flow) E-셀렉틴-매개 세포 유인에 의해 상당히 증강되었다. ABmix, G7 덴드리머, 및 E-셀렉틴이 통합된 UICHIP™ (UICHIP™-D로 표시)는 맞춤-제조된 흐름 챔버에 있는 20 환자로부터의 혈액 샘플들에서 CTC를 성공적으로 포획하였으며, CTC 수는 1ml당 19 에서 662 세포의 범위로 다양하다 (도 2A). EDTA (Ca++ 킬레이팅 제제) 존재하에서는 UICHIP™-D에 있는 E-셀렉틴에 과 Ca++- 의존적인 세포 구르기는 일어나지 않는 사실 때문에, EDTA-처리한 환자 샘플의 CTC 수 세기는 UICHIP™-D를 사용한 분석에서는 제외되었다. UICHIP™-D를 사용하여 얻은 CTC 수들은 UICHIP™-S (R2 = 0.9676, 도 2B)를 사용한 CTC 수들과 비슷하였으며, 이는 UICHIP™의 검출 민감도는 세포 구르기에 의해 의미 있게 영향을 받지는 않음을 제시한다. 암을 가진 적이 없는 세 건강한 참여자들로부터 얻은 혈액 시료들을 사용하여, UICHIP™-S 및 UICHIP™-D의 CTC 수들은 각각 1ml당 7.7 ± 1.1 및 2.1 ± 0.3 세포였으며, 검출 한계점을 설정하는데 사용되었다 (도 2C). 민감도에서는 의미 있는 개선은 없었지만, UICHIP™-D의 E-셀렉틴에 의해 유도된 세포 구르기는 UICHIP™-S에 비해 포획 순도를 뚜렷하게 증가시켰다 (도 2D). 포획 순도 (특이성)는 백혈구(leukocytes) 및 CTC 포함하는 총 DAPI+ 세포 당 CK+/CD45-/DAPI+ CTC 의 비율로 계산되었다. 포획된 세포들 중 CTC 순도 (48.6%까지) 측면에서는 UICHIP™-D의 특이성은 UICHIP™-S의 특이성에 비해 (전형적으로 0.04% - 10.7%) 93.5-배까지 획기적으로 개선되었다. 면역 염색 후 형광 이미지는 E-셀렉틴 없는 것 (UICHIP™-S)과 있는 것 (UICHIP™-D) 사이의 차이를 명확하게 보여 주었다, 즉 백혈구의 비-특이적 포획을 의미 있게 감소시켰다.
CTC 검출을 위한 UICHIP ™-D의 분석적 중요성
CTC 검출을 위한 표면들은 더 나아가 Pre-RT에 측정된 20 환자들의 혈액 샘플들에 있는 CTC 수 측면에서 End-RT에 측정된 16 환자들로부터의 혈액 샘플에 있는 그것들과 비교되었다. Pre-RT 에서는, PEG-aEpCAM (p = 0.043) 및 PEG-ABmix (p < 0.001) 표면 플렛폼들에 비해 G7-ABmix 표면으로는 CTC 수가 의미 있게 증가 되었다. 다른 표면 제제들 사이에서 CTC 수의 차이는 CTC 수준이 End-RT에서 측정되었을 때도 지속 되었다 (G7-ABmix 대비 PEG-aEpCAM, p = 0.006; G7-ABmix 대비 PEG-ABmix, p = 0.001). 그러나, Pre-RT (p = 0.906) 및 End-RT (p = 0.076)에서 PEG-aEpCAM 및 the PEG-ABmix 방법을 비교하였을 때는 CTC 수에서 통계적으로 의미 있는 차이는 없었다. 세 가지 방법들 모두에 의해 얻어진 절대적인 CTC 수들의 비교에서는 PEG-aEpCAM 및 PEG-ABmix 표면들에 비해 (p < 0.001), G7-ABmix 플렛폼 UICHIP™-D에서 의미 있게 높은 CTC 포획을 보여주었다. G7-ABmix 및 E-셀렉틴을 가진 UICHIP™-D는 Pre-RT에서 평균 222 CTCs/mL (19 - 849 범위), 및 End-RT에서 평균 44 CTCs/mL (2 - 150 범위)을 포획한다. 이는 Pre-RT에서 187 CTCs/mL (9 - 814 범위) 및 161 CTCs/mL (16 - 511 범위 ) 및 End-RT에서 32 CTCs/mL (2 - 201 범위) 및 33 CTCs/mL (1 - 131 범위)로 각각 수집된 PEG-aEpCAM 및 PEG-ABmix 두 방법들 모두와 비교 했을 때 의미있게 더 CTC가 포획된 것이다.
UiChip ™-D 사용한 CTC 카운트의 임상적 중요성
총 집단 중, UICHIP™-D으로 검사한 20 환자 모두 (100%) Pre-RT에서는 이들의 혈액 1ml당 검출될 만한 CTC는 평균 222이며 중앙값은 1ml당 101(1ml당 19 에서 662 세포 범위)이다. 이는 세 명의 건강한 공여자들로부터의 샘플 혈액 1.0 ml에서 발견된 2.1 ± 0.3 (평균 ± S.E., 도 2C) CTC 보다 의미 있게 높다(p = 0.0091). 중요하게는, 도 3A에서 보여준 대로 UICHIP™-D를 사용하여 측정한 CTC 수는 보고된 CELLSEARCH™ 를 사용하여 HNSCC 환자에서 측정한 CTC 수(139 - 6364 세포/7.5 mL 혈액)((Grobe, et al. (2014) Clin . Cancer Res. 20:525-33; Bozec, et al. (2013) Eur . Arch. Otorhinolaryngol . 270:2745-9; Grisanti, et al. (2014) PLoS ONE 9(8):e103918; Nichols, et al. (2012) Head Neck 34:1440-4)) 보다 의미 있게 높다. 재미있게는, RT 코스 동안 완전한 CTC 측정을 한 17명의 환자로부터, RT 하면 CTC 수가 통계적으로 의미 있게 감소함이 관찰되었다. 평균 CTC 수는 Pre-RT에서 222 세포/ml (19에서 849 세포/ml 범위)에서 End-RT에는 44 세포/mL (2 에서 150 세포/mL 범위)) 로 감소했다(p = 0.001, 도 3B).

Claims (20)

  1. (a) 암 치료(cancer therapy) 전에 개체의 생물학적 샘플에서 순환하는 종양세포(circulating tumor cells; CTCs)의 수를 측정하는 단계, 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 측정한 CTC 수를 같은 개체에서 암 치료 동안 또는 암 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 유사한 생물학적 샘플에서 측정한 CTC 수와 비교하는 단계를 포함하는 암 치료의 효능을 모니터링하는 방법으로,
    상기 CTC 수는 세포-롤링제(cell-rolling agent)로서 고정화된 E-셀렉틴(E-selectin) 및, CTC-특이적 포획제(capturing agent)로서 상피세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)에 결합하는 항체, 상피 성장인자 수용체-2(epidermal growth factor receptor-2; HER-2)에 결합하는 항체 및 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)에 결합하는 항체를 포함하는 적어도 하나의 챔버를 갖는 유동 기반 장치(flow-based device)를 사용하여 측정되고 상기 항체는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)에 공유결합된 변형된 폴리(아미도아민) 덴드리머(poly(amidoamine) dendrimer) G7을 통해 고정화된 것이고, 상기 유동 기반 장치는 2.1 세포/ml의 검출한계를 포함하는 것인, 암 치료의 효능을 모니터링하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 암 치료 동안 또는 치료 후의 CTC 수 변화가 암 치료에 대한 개체의 반응을 나타내는 것인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 변화가 증가하는 것인 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 변화가 감소하는 것인 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 말초 혈액(peripheral blood)인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 암 치료는 고형 종양(solid tumor)의 치료를 위한 것인 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 암 치료는 두경부암(head and neck cancer), 폐암(lung cancer), 직장암(rectal cancer), 식도암(esophageal cancer) 또는 자궁경부암(cervical cancer) 치료를 위한 것인 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 암 치료는 방사선 치료(radiation therapy)를 포함하는 것인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, (c) 방사선 치료 동안 또는 치료 후 CTC 수가 변화하는 경우 방사선 치료를 변형하는 단계(modifying)를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 방사선 치료는 이온화 방사선 용량(ionizing radiation dose)을 증가시킴으로써 변형되는 것인 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 방사선 치료는 이온화되는 방사선 용량을 감소시킴으로써 변형되는 것인 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 방사선 치료는 소분할조사법(hypofractionation)에 의해 변형되는 것인 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 방사선 치료는 과분할조사법(hyperfractionation)에 의해 변형되는 것인 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 방사선 치료는 화학요법(chemotherapy), 유전자 치료(gene therapy), 면역요법(immunotherapy), 표적 치료(targeted therapy), 호르몬 치료(hormonal therapy), 방사선 감수성 증강물질(radiosensitizer) 또는 이들의 조합을 투여함으로써 변형되는 것인 방법.
  18. 삭제
  19. 제 1항에 있어서, 상기 CTC의 순도는 49%인 방법.
  20. (a) 방사선 치료 전에 개체의 생물학적 샘플에서 순환하는 종양세포(CTC)의 수를 측정하는 단계, 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 측정한 CTC 수를 같은 개체에서 방사선 치료 동안 또는 방사선 치료 후의 한 번 또는 그 이상의 시점에서 얻은 유사한 생물학적 샘플에서 측정한 CTC 수와 비교하는 단계를 포함하는 방사선 치료의 효능을 모니터링하는 방법으로,
    상기 CTC 수는 세포-롤링제(cell-rolling agent)로서 고정화된 E-셀렉틴(E-selectin) 및, CTC-특이적 포획제(capturing agent)로서 상피세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM)에 결합하는 항체, 상피 성장인자 수용체-2(epidermal growth factor receptor-2; HER-2)에 결합하는 항체 및 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR)에 결합하는 항체를 포함하는 적어도 하나의 챔버를 갖는 유동 기반 장치(flow-based device)를 사용하여 측정되고 상기 항체는 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)에 공유결합된 변형된 폴리(아미도아민) 덴드리머(poly(amidoamine) dendrimer) G7을 통해 고정화된 것이고, 상기 유동 기반 장치는 2.1 세포/ml의 검출한계를 포함하는 것인, 방사선 치료의 효능을 모니터링하는 방법.
KR1020177035887A 2015-05-14 2016-05-12 순환되는 종양세포를 바이오마커로 사용하여 암 치료요법의 효율을 모니터링 하는 방법 KR102080107B1 (ko)

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