KR102078567B1 - 이미지 인식 기술을 적용한 비접촉식 마이크로어레이어 - Google Patents

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이치범
전석천
심현민
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영 이
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주식회사 이바이오젠
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Abstract

본 발명은 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카메라 등의 이미지 인식 장비와 이미지 인식 프로그램을 마이크로어레이어를 결합하여 특정 모양으로 패턴화되어 있는 기판 위에 생체물질을 일정량 정확하게 분주하는 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어, 및 상기 마이크로어레이어를 이용하여 바이오 칩을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이미지 인식 기술을 적용한 비접촉식 마이크로어레이어{Non-contact microarrayer using image recognition technology}
본 발명은 비접촉식 마이크로어레이어 및 이를 이용한 마이크로어레이 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 이미지 인식 프로그램과 마이크로어레이어를 결합하여 특정 모양으로 패턴화되어 있는 기판 위에 생체물질을 일정량 정확하게 분주하는 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어, 및 상기 마이크로어레이어를 이용하여 마이크로어레이를 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
바이오 칩은 생물학적 배열(biological array)로서 핵산 등의 생물학적 물질이 기판 상에 고정되어 있는 것으로, 예를 들면, 기판 상에 단백질, DNA, RNA 등의 생물학적 시료(생체물질)가 고정된 것을 의미한다. 바이오 칩의 기본 원리는 기판에 고정된 고정 분자와 표적(target) 분자의 상호 작용에 기초한다. 예를 들면, DNA 칩의 경우 기판에 고정된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)와 시료 속에 존재하는 DNA 염기 사이의 상보적인 결합에 그 원리를 두고 있다. 단백질 칩의 경우 항원-항체 결합 또는 리간드-수용체 결합과 같은 단백질 분자 사이의 상호 작용에 그 원리를 두고 있다.
마이크로어레이어(microarrayer)는 유전자 연구를 위한 DNA 칩과 RNA 칩 등의 제조, 또는 질병 진단 시스템 구성을 위한 단백질 칩 제조 등을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 마이크로어레이어는 생물학적 시료(생체물질)를 고체 기판 상에 고정시키는 방법에 따라 스폿팅 핀을 이용하여 생물학적 시료(생체물질)를 기판 상에 고정시키는 핀 방식(접촉 방식)과, 디스펜싱 노즐을 이용하여 생물학적 시료(생체물질)를 기판 상에 토출하는 잉크젯 방식(비접촉 방식)과, 감광성 물질을 이용하여 기판 상에 직접 생물학적 시료(생체물질)를 합성하는 포토리소그래피 방식과, 기판 상의 특정 위치에 양전하를 띠는 물질을 도포하고 음전하를 띠는 생물학적 시료(생체물질)를 부착시키는 방식 등으로 구분될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제7,335,338호에는 복수의 핀을 이용하는 마이크로어레이 스폿팅 장치가 개시되어 있고, 미국특허 제7,736,591호에는 복수의 마이크로 디스펜서를 이용하는 잉크젯 방식의 어레이 장치가 개시되어 있다.
단백질 칩 제조의 경우, 항원과 1차 항체의 반응, 1차 항체와 2차 항체의 반응 등과 같이 다단계의 반응을 요구하며, 아울러 항체와의 결합을 위해 항원성을 나타내는 부위의 구조가 변형되지 않는 상태로 기판에 고정되어야 하는 등의 이유로 디스펜싱 노즐을 이용하여 단백질 시료를 액적 형태로 기판 상에 토출하는 잉크젯 방식의 마이크로어레이어가 주로 사용되고 있다.
마이크로어레이 바이오 칩의 분석 시, 종래에는 평판 형태의 기판에 생물학적 시료(생체물질) 수용기를 부착하고 형광물질이 표지된 생물학적 시료(생체물질)를 투입한 후, 분석 작업이 이루어졌다. 이때, 평판 형태의 기판은 표면적이 제한되므로 기판 상에 부착되는 생물학적 시료(생체물질) 수용기의 양이 제한되고, 이에 따라 발광되는 형광 신호도 제한되므로, 낮은 농도의 시료에 대해서는 분석의 신뢰성이 낮은 문제점이 있었다. 특히, 강한 백그라운드(background) 신호로 인하여 포워드(forward) 신호의 검출정확도가 떨어져 정확한 생체물질 발현에 정보를 얻는데 어려움이 있었다.
이를 개선하기 위해, 기존의 단순한 평면의 기판을 사용하지 아니하고 생체물질이 고정되는 영역만이 도출되어 나타나는 패턴이 있는 기판을 이용하여 백그라운드(background) 신호를 제거할 수 있다.
그러나 기존 마이크로어레이어는 표면에 패턴이 존재하는 기판에 사용하는데 어려움이 있다. 기존 마이크로어레이어들은 offset 값을 기준으로 프로그램에 의하여 기판의 위치와 상관없이 주어진 위치 값에 따라 정해진 간격과 패턴으로 생체물질들을 분주하기에 표면에 패턴이 존재하는 기판에서는 기존의 마이크로어레이어를 사용하기 어렵고 spot 이외의 영역에는 바이오파울링(biofouling)이 쉽게 발생하며 이는 강한 백그라운드(background) 신호를 발생시켜 검출하고자 하는 포워드(forward) 신호의 검출 정확도를 떨어뜨리게 된다.
이에 대해, 표면에 패턴이 존재하는 기판에서 패턴을 인식함으로 정확하고 적절한 위치에 생체물질을 분주하는 마이크로어레이어 개발이 필요한 실정이다.
특히, 기판 위의 패턴의 크기(size)가 수십에서 수백 마이크로미터의 작은 모양이기에 미세한 모양을 감지하고 인식하는 고성능의 이미지 인식 기술과 계산된 위치에 정확히 분주할 수 있는 수십 μm 정도의 기계적 정확도가 요구된다.
이에, 본 발명자들은 상기의 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 노력한 결과, CMOS 이미지 센서와 같은 카메라를 이용하여 25 mm X 75 mm 크기의 기판 전체에서 수십에서 수백 마이크로미터의 패턴을 감지 및 인식하는 이미지 인식 장비 및 프로그램을 마이크로어레이어에 결합하여 특정 모양(주로 원형)으로 패턴화되어 있는 기판에 대해 기판의 패턴을 인식함으로 정확하고 적절한 위치에 단백질 등의 적으로 각종 바이오 효율적으로 제작할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 CMOS 이미지 센서와 같은 카메라 및 이미지 인식 프로그램을 마이크로어레이어(microarrayer)에 결합하여 특정 모양(주로 원형)으로 패턴화되어 있는 기판 위에 특정 패턴 모양의 정확한 위치에 생체물질(단백질 등)을 일정량 정확하게 분주할 수 있는 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 본 발명에 따른 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어를 이용하여, 기판의 패턴을 인식함으로 정확하고 적절한 위치에 생체물질을 정확하게 분주할 수 있어 각종 바이오 칩을 효율적으로 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
웰 플레이트(Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)을 각각 고정시키기 위한 홀더(holder);
상기 바이오칩 상에 생물학적 시료를 액적 형태로 비접촉으로 토출하기 위한 디스펜서(dispenser);
상기 바이오칩 상의 패턴에 대한 이미지를 인식하기 위한 카메라(camera);
상기 디스펜서 및 카메라가 결합되고, 3축(X, Y, Z) 방향으로 이동되어 상기 디스펜서 및 카메라의 위치를 제어하기 위한 3축(X, Y, Z) 스테이지(stage);
상기 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(cleaning chamber);
상기 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프(pump); 및
오염 방지를 위한 바닥판, 프레임 및 커버로 구성된 공정 챔버;를 포함하는 마이크로어레이어(microarrayer)를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 웰 플레이트(Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)을 각각 고정시키기 위한 홀더(holder);
상기 바이오칩 상에 생물학적 시료를 액적 형태로 비접촉으로 토출하기 위한 디스펜서(dispenser);
상기 바이오칩 상의 패턴에 대한 이미지를 인식하기 위한 카메라(camera);
상기 디스펜서 및 카메라가 결합되고, 3축(X, Y, Z) 방향으로 이동되어 상기 디스펜서 및 카메라의 위치를 제어하기 위한 3축(X, Y, Z) 스테이지(stage);
상기 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(cleaning chamber);
상기 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프(pump); 및
오염 방지를 위한 바닥판, 프레임 및 커버로 구성된 공정 챔버;를 각각 준비하는 단계;
2) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에 상기 3축(X, Y, Z) 스테이지를 고정시키는 단계;
3) 상기 3축(X, Y, Z) 스테이지 중에서 Z 스테이지에 상기 디스펜서 및 카메라를 부착시키는 단계;
4) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에서 X 스테이지와 Y 스테이지 사이 공간에 상기 홀더를 고정시키는 단계;
5) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에서 3축(X, Y, Z) 스테이지 주변에 세척 챔버 및 펌프를 설치하는 단계; 및
6) 상기 공정 챔버의 바닥판에 프레임 및 커버를 설치하는 단계;를 포함하는, 마이크로어레이어의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 마이크로어레이어의 홀더에 웰 플레이트 및 바이오칩을 고정시키는 단계;
2) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 웰플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계;
3) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 카메라가 바이오칩의 패턴을 이미지 처리하여 중심점을 인식하되,
여기서,
이미지 처리는
i) 카메라에서 사진을 캡처하기;
ii)캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및
iii) 그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 인식하는 단계;
4) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 카메라에서 인식한 패턴의 중심에 디스펜싱을 실시하는 단계; 및
5) 시료 변경시 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 세척 챔버에서 세척하는 단계;를 포함하는, 마이크로어레이어를 이용한 바이오칩 제조 방법을 제공한다.
기존의 마이크로어레이어는 패턴 감지 및 인식 기능 없어서, 패턴이 있는 기판에 분주를 할 수 없다.
이에 대해, 본 발명에 따른 마이크로어레이어는 패턴이 있는 기판을 사용할 수 있는 구성으로서 카메라 및 프로그램을 갖춘 마이크로어레이어이다.
구체적으로, 본 발명에 따른 마이크로어레이어는 CMOS 이미지 센서와 같은 카메라를 이용하여 25 mm X 75 mm 크기의 기판 전체에서 수십에서 수백 마이크로미터의 패턴을 감지 및 인식하는 이미지 인식 장비 및 프로그램과 마이크로어레이어를 결합시켜 특정 모양으로 패턴화되어 있는 기판 위에 계산된 위치에 정확히 생체물질을 일정량 분주할 수 있으며, 정밀도가 단지 10마이크로미터 이하의 오차를 나타내는 특징을 가지고 있다.
도 1은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어 장비의 구성을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어 장비의 구동 시나리오를 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 크기 및 작동 범위를 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 바이오칩 패턴 치수 및 출력 크기를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 패턴 중심부 이미지 인식 오차 설정 한계를 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 사용된 Gantry 타입의 위치결정 시스템을 보여주는 그림이다.
도 7은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 사용된 WIKAN 모션컨트롤러를 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 사용된 Piezo 방식의 디스펜서의 구조를 보여주는 그림이다.
도 9는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 사용된 PipeJet NanoDispenser 제품을 보여주는 그림이다.
도 10은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 프레임 크기를 보여주는 그림이다.
도 11은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 문짝 설계를 보여주는 그림이다.
도 12는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 하단 (전원공급장치 및 제어기 배치 포함)을 보여주는 저면도(Bottom view)이다.
도 13은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 상단 (스테이지 및 홀더 배치 포함)을 보여주는 상평면도(Top view)이다.
도 14는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 슬라이더 글라스 홀더를 보여주는 그림이다.
도 15는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 96 웰 플레이트 홀더를 보여주는 그림이다.
도 16은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 슬라이더 글라스 홀더의 제작 사진을 보여주는 그림이다.
도 17은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 96 웰 플레이트 홀더의 제작 사진을 보여주는 그림이다.
도 18은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 XY 스테이지 구조를 보여주는 그림이다.
도 19는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 XY 스테이지에 사용된 리니어 스테이지 (LS1004)를 보여주는 그림이다.
도 20은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 XY 스테이지 제작 사진을 보여주는 그림이다.
도 21은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 Z 스테이지 구조를 보여주는 그림이다.
도 22는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 있어서, Z 스테이지에 카메라 및 디스펜서가 부착되고 X 스테이지 위에 장착된 구성을 보여주는 그림이다.
도 23은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 XYZ 스테이지 제작 사진을 보여주는 그림이다.
도 24는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어 장비에 부착된 카메라를 보여주는 그림이다.
도 25는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 디스펜싱 시험 장비 구성을 보여주는 그림이다.
도 26은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 디스펜싱으로 채택한 Pipe Jet 노즐에 대해 디스펜싱 확인 시험을 보여주는 그림이다.
도 27은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 디스펜싱에 있어서 액적(droplet)을 측정하는 실험 장비를 보여주는 그림이다.
도 28은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 디스펜싱에 있어서 액적(droplet)을 측정하기 위한 격자 슬라이드를 보여주는 그림이다.
도 29는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에 있어서 격자에 디스펜싱한 액적(droplet)을 측정한 결과를 보여주는 그림이다.
도 30은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리 카메라에서 캡처한 사진을 그레이 스케일로의 변환을 보여주는 그림이다.
도 31은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리 카메라에서 그레이 스케일로의 변환된 패턴을 이진화에 의한 패턴 인식을 보여주는 그림이다.
도 32는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리의 알고리즘을 보여주는 그림이다.
도 33은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리 과정에서 모폴로지(Morphology) 실험 결과를 보여주는 그림이다.
도 34는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리 과정에서 원의 중복 검출을 해결한 결과를 보여주는 그림이다.
도 35는 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 영상처리 과정에서 프레임당 원의 검출 확률을 향상시킨 결과를 보여주는 그림이다.
도 36은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 전체적인 모식도이다.
도 37은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어에서 카메라를 이용하여 스테이지에 놓여진 기판의 패턴을 인식하고 정해진 패턴의 좌표를 인식하여 해당하는 곳에 생체물질을 분주하는 과정을 보여주는 그림이다.
도 38은 본 발명의 한가지 실시예에 따른 마이크로어레이어의 전체적인 개념도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 카메라 및 이미지 인식 프로그램을 마이크로어레이어(microarrayer)에 결합하여 특정 모양으로 패턴화되어 있는 기판 위에 특정 패턴 모양의 정확한 위치에 생체물질을 일정량 분주할 수 있는 이미지 인식 기술을 이용한 비접촉식 마이크로어레이어를 제공한다.
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 유전자 연구 및 질병 진단 시스템을 위한 DNA 칩, RNA 칩, 단백질 칩 등과 같은 바이오 칩을 효율적으로 제작하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 도 1에 나타낸 바와 같은 구성을 가지고 있다. 구체적으로, 디스펜서의 위치 제어을 위한 3축(X,Y,Z), 웰 플레이트(Well plate) 및 바이오 칩(Bio chip)의 위치를 고정시키기 위한 홀더, 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(Cleaning chamber), 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프, 이미지 인식을 위해 디스펜서 옆 카메라, 및 오염 방지를 위한 커버로 구성될 수 있다(도 1 참조).
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 도 2에 나타낸 바와 같은 순서로 작동을 수행할 수 있다. 구체적으로, 웰 플레이트(Well plate)에서 생물학적 시료를 흡수하는 시료 흡수 단계, 카메라가 이동하면서 단백질 칩의 원형 등의 패턴을 이미지 처리하여 패턴의 중심점을 인식하는 이미지 처리 단계, 카메라에서 인식한 중심에 디스펜서를 통해 생물학적 시료를 디스펜싱을 실시하는 디스펜싱 단계, 및 시료 변경시 디스펜서내 잔여물이 전재하므로 클리닝을 수행하는 클리닝 단계로 구동한다(도 2 참조).
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 한가지 바람직한 실시예로서 도 3에 나타낸 바와 같은 크기, 작동범위 및 반복 정밀도를 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(도 3 참조).
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 한가지 바람직한 실시예로서 도 4에 나타낸 바와 같은 바이오칩 패턴의 크기, 간격 및 디스펜싱 출력 지름을 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(도 4 참조).
본 발명에 따른 마이크로어레이어는 도 36 내지 도 38에 나타낸 바와 같이, 카메라를 통한 기판 전체에서 수십에서 수백 마이크로미터의 패턴을 감지 및 인식하는 이미지 인식 장비 및 프로그램을 이용함으로써, 상기 이미지 인식 프로그램을 마이크로어레이어에 결합하여 제조할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 마이크로어레이어는 x, y, z축으로 움직이는 헤드(head)에 카메라와 노즐이 결합되도록 구성되고, 카메라로 바닥면에 놓인 기판의 이미지를 인식한 후, 인식된 이미지를 기반으로 특정 패턴의 좌표를 인식하고 노즐을 이용하여 해당 좌표에 생체물질을 분주함으로써, 원형 등의 특정 모양으로 패턴화되어 있는 기판 위에 상기 패턴의 중심점 위치에 생체물질을 일정량 분주할 수 있다(도 36 내지 도 38 참조).
구체적으로, 본 발명은
웰 플레이트(Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)을 각각 고정시키기 위한 홀더(holder);
상기 바이오칩 상에 생물학적 시료를 액적 형태로 비접촉으로 토출하기 위한 디스펜서(dispenser);
상기 바이오칩 상의 패턴에 대한 이미지를 인식하기 위한 카메라(camera);
상기 디스펜서 및 카메라가 결합되고, 3축(X, Y, Z) 방향으로 이동되어 상기 디스펜서 및 카메라의 위치를 제어하기 위한 3축(X, Y, Z) 스테이지(stage);
상기 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(cleaning chamber);
상기 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프(pump); 및
오염 방지를 위한 바닥판, 프레임 및 커버로 구성된 공정 챔버;를 포함하는 마이크로어레이어(microarrayer)를 제공한다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 상기 홀더는 웰 플레이트 또는 바이오칩을 상부에 적재하기 위한 밑판; 상기 웰 플레이 또는 바이오칩을 상기 밑판에 고정하기 위한 고정핀; 및, 상기 웰 플레이 또는 바이오칩을 상기 밑판에 장착하기 위한 판스프링;을 포함하고 있고, 상기 밑판에서 고정핀 및 판스프링을 체결하는 원형 또는 사각형의 체결구를 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 상기 웰 플레이트는 6 내지 96 웰 프레이트가 모두 사용가능하나 96 웰 프레이트가 바람직하다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 상기 생물학적 시료는 단백질, DNA 또는 RNA가 모두 사용가능하며, 항원 또는 항체 등의 단백질 시료인 것이 바람직하다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 상기 디스펜서는 피에조(Piezo) 방식의 디스펜서인 것이 바람직하고, 2 ~ 70 nl 범위의 단일 액적을 비접촉으로 디스펜싱하는 파이프 젯(PipeJet) 디스펜서인 것이 바람직하다. 상기 디스펜서는 압전 세라믹 튜브와 연결된 유리 모세관을 포함할 수 있으며, 상기 압전 세라믹 튜브는 전기적인 펄스 신호가 인가되는 전극들을 구비할 수 있다. 또한, 상기 압전 세라믹 튜브는 연성 배관을 통해 펌프, 예를 들면, 시린지 펌프와 연결될 수 있으며, 상기 펌프는 상기 유리 모세관에 상기 시료를 흡입하거나 배출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 디스펜서는 스포팅 유닛과 디스펜싱 유닛을 포함하고, 상기 스포팅 유닛은 복수의 스폿팅 핀들을 포함하고, 상기 스폿팅 핀들 내에는 관통홀이 구비되어 있으며, 상기 스폿팅 핀들 각각은 상부 헤드를 포함하고 있으며, 상기 디스펜싱 유닛은 복수의 디스펜싱 노즐, 및 상기 디스펜싱 노즐들이 장착된 바디를 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 상기 카메라는 산업용 카메라 또는 USB 현미경 카메라를 사용할 수 있다. 상기 카메라는 PC와 인터페이스(interface)되고, CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 센서이며, 최대 200 내지 1000배 배율 조정이 가능하며, 초점 범위(Focus range)는 5 내지 50 mm이고, 프레임 속도(Frame rate)는 최대 30 내지 100 frames/sec인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 위치를 제어하기 위한 위치 제어 시스템(Positioning system)은 디스펜서가 부착된 헤드가 3축(X,Y,Z)로 움직이고, 출력되는 부분인 베드는 고정되어 있는 갠트리(Gantry) 타입 시스템인 것이 바람직하다. 상기 위치 제어 시스템은 모터를 통해 작동하는 것으로, 일반적인 모터가 모두 사용가능하나 스테핑 모터는 펄스당 일정한 각도로 동작하므로 추가적인 구성품 필요 없이 위치 제어가 가능하기 때문에 바람직하다. 상기 위치 제어 시스템은 모션컨트롤러를 통해 제어할 수 있으며, 상기 모션컨트롤러는 스텝모터 드라이버가 내장되어 있어 시스템 단순화가 가능하고, I/O 핀, ADC 등 필요기능들이 구성되어 있으며, 코딩을 통해 추가적인 기능 생성 가능한 모션컨트롤러가 바람직하다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 3축(X, Y, Z) 스테이지는 Y축 방향으로 이동하는 Y 스테이지; 상기 Y 스테이지 상부에 결합되고, X축 방향으로 이동하는 X 스테이지; 및, 상기 X 스테이지 상부에 결합되고, Z축 방향으로 이동하는 Z 스테이지;로 구성된다. 여기서, 상기 X 스테이지, Y 스테이지 및 Z 스테이지는 각각 움직이지 않는 외부 가이드(guide)와 상기 가이드 내부에서 가이드와 분리되지 않고 슬라이딩되어 움직이는 샤프트(shaft)를 포함할 수 있다. 한편, Z 스테이지가 작아야 프레임의 높이가 작아지며, XY 스테이지에 걸리는 부하가 줄어들기 때문에 컴팩트한 것이 바람직하고, 가이드, 볼 스크류(ball screw) 및 서포트로 구성되어 모터에 의해 구동되는 것이 바람직하다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 공정 챔버는 600 ~ 700 x 450 ~ 550 x 350 ~ 450 mm 크기의 프레임으로 구성되는 것이 바람직하고, 630 ~ 650 x 480 ~ 500 x 390 ~ 410 mm 크기의 프레임으로 구성되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 프레임에 부착되는 커버는 적어도 한면 이상의 커버에 손잡이를 가지고 경첩 및 자석을 통해 여닫이가 가능한 것으로 구성될 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 구동은 i) 디스펜서를 통해 웰 플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계; ii) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 카메라가 이동하면서 바이오칩 패턴의 중심점을 인식하여 이미지를 처리하는 단계; iii) 카메라에서 인식한 바이오칩 패턴의 중심점에 디스펜서를 통해 디스펜싱을 실시하는 단계; 및, iv) 디스펜서 내 잔여물을 제거하기 위해 세척하는 단계;로 구동될 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 이미지 처리는 카메라에서 사진을 캡처하기; 캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및, 그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 바이오칩 패턴을 인식할 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 세척 챔버는 상기 홀더 또는 3축(X, Y, Z) 스테이지의 일측에 배치될 수 있으며, 사각 블록 형태를 가질 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 세척 챔버는 상기 디스펜서의 스폿팅 핀들과 디스펜싱 노즐들의 세정을 위한 워셔액이 공급되는 세정조; 상기 스폿팅 핀들에 잔류하는 상기 시료를 제거하기 위한 진공 포트들; 및 상기 디스펜싱 노즐들 내에 잔류하는 상기 시료를 배출하기 위한 배수조;를 포함할 수 있다. 상기 세정조는 상기 워셔액을 공급하기 위한 워셔액 공급부와 연결될 수 있으며, 상기 워셔액 공급부는 펌프를 포함하고, 상기 워셔액으로는 3차 증류수가 사용될 수 있다. 상기 세정조는 세척 챔버의 상부에 형성될 수 있으며 상기 배수조는 상기 세정조의 일측에 형성될 수 있다. 특히, 상기 세정조와 배수조 사이에는 상기 세정조로 공급된 워셔액을 상기 배수조로 오버플로우 시키기 위한 채널이 구비될 수 있으며, 상기 배수조 내의 워셔액은 배관을 통해 배출 용기로 배출될 수 있다.
상기 마이크로어레이어에 있어서, 공정 챔버내 습도를 조절하기 위한 가습기 및 상기 공정 챔버 내부의 습도를 측정하기 위한 습도 센서를 더 포함할 수 있다. 상기 공정 챔버 내부의 습도는 상기 기습기 및 습도 센서에 의해 대략 75% ±3 정도로 조절될 수 있다. 특히, 상기 공정 챔버(104) 내부에서의 결로 현상이 방지될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 웰 플레이트(Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)을 각각 고정시키기 위한 홀더(holder);
상기 바이오칩 상에 생물학적 시료를 액적 형태로 비접촉으로 토출하기 위한 디스펜서(dispenser);
상기 바이오칩 상의 패턴에 대한 이미지를 인식하기 위한 카메라(camera);
상기 디스펜서 및 카메라가 결합되고, 3축(X, Y, Z) 방향으로 이동되어 상기 디스펜서 및 카메라의 위치를 제어하기 위한 3축(X, Y, Z) 스테이지(stage);
상기 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(cleaning chamber);
상기 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프(pump); 및
오염 방지를 위한 바닥판, 프레임 및 커버로 구성된 공정 챔버;를 각각 준비하는 단계;
2) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에 상기 3축(X, Y, Z) 스테이지를 고정시키는 단계;
3) 상기 3축(X, Y, Z) 스테이지 중에서 Z 스테이지에 상기 디스펜서 및 카메라를 부착시키는 단계;
4) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에서 X 스테이지와 Y 스테이지 사이 공간에 상기 홀더를 고정시키는 단계;
5) 상기 공정 챔버의 바닥판 상에서 3축(X, Y, Z) 스테이지 주변에 세척 챔버 및 펌프를 설치하는 단계; 및
6) 상기 공정 챔버의 바닥판에 프레임 및 커버를 설치하는 단계;를 포함하는, 마이크로어레이어의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에 있어서, 상기 홀더는 웰 플레이트 또는 바이오칩을 상부에 적재하기 위한 밑판; 상기 웰 플레이 또는 바이오칩을 상기 밑판에 고정하기 위한 고정핀; 및, 상기 웰 플레이 또는 바이오칩을 상기 밑판에 장착하기 위한 판스프링;을 포함하고 있고, 상기 밑판에서 고정핀 및 판스프링을 체결하는 원형 또는 사각형의 체결구를 포함할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 상기 디스펜서는 피에조(Piezo) 방식의 디스펜서인 것이 바람직하고, 2 ~ 70 nl 범위의 단일 액적을 비접촉으로 디스펜싱하는 파이프 젯(PipeJet) 디스펜서인 것이 바람직하다. 상기 디스펜서는 압전 세라믹 튜브와 연결된 유리 모세관을 포함할 수 있으며, 상기 압전 세라믹 튜브는 전기적인 펄스 신호가 인가되는 전극들을 구비할 수 있다. 또한, 상기 압전 세라믹 튜브는 연성 배관을 통해 펌프, 예를 들면, 시린지 펌프와 연결될 수 있으며, 상기 펌프는 상기 유리 모세관에 상기 시료를 흡입하거나 배출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 디스펜서는 스포팅 유닛과 디스펜싱 유닛을 포함하고, 상기 스포팅 유닛은 복수의 스폿팅 핀들을 포함하고, 상기 스폿팅 핀들 내에는 관통홀이 구비되어 있으며, 상기 스폿팅 핀들 각각은 상부 헤드를 포함하고 있으며, 상기 디스펜싱 유닛은 복수의 디스펜싱 노즐, 및 상기 디스펜싱 노즐들이 장착된 바디를 포함할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 상기 카메라는 산업용 카메라 또는 USB 현미경 카메라를 사용할 수 있다. 상기 카메라는 PC와 인터페이스(interface)되고, CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 센서이며, 최대 200 내지 1000배 배율 조정이 가능하며, 초점 범위(Focus range)는 5 내지 50 mm이고, 프레임 속도(Frame rate)는 최대 30 내지 100 frames/sec인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 위치를 제어하기 위한 위치 제어 시스템(Positioning system)은 디스펜서가 부착된 헤드가 3축(X,Y,Z)로 움직이고, 출력되는 부분인 베드는 고정되어 있는 갠트리(Gantry) 타입 시스템인 것이 바람직하다. 상기 위치 제어 시스템은 모터를 통해 작동하는 것으로, 일반적인 모터가 모두 사용가능하나 스테핑 모터는 펄스당 일정한 각도로 동작하므로 추가적인 구성품 필요 없이 위치 제어가 가능하기 때문에 바람직하다. 상기 위치 제어 시스템은 모션컨트롤러를 통해 제어할 수 있으며, 상기 모션컨트롤러는 스텝모터 드라이버가 내장되어 있어 시스템 단순화가 가능하고, I/O 핀, ADC 등 필요기능들이 구성되어 있으며, 코딩을 통해 추가적인 기능 생성 가능한 모션컨트롤러가 바람직하다.
상기 제조 방법에 있어서, 3축(X, Y, Z) 스테이지는 Y축 방향으로 이동하는 Y 스테이지; 상기 Y 스테이지 상부에 결합되고, X축 방향으로 이동하는 X 스테이지; 및, 상기 X 스테이지 상부에 결합되고, Z축 방향으로 이동하는 Z 스테이지;로 구성된다. 여기서, 상기 X 스테이지, Y 스테이지 및 Z 스테이지는 각각 움직이지 않는 외부 가이드(guide)와 상기 가이드 내부에서 가이드와 분리되지 않고 슬라이딩되어 움직이는 샤프트(shaft)를 포함할 수 있다. 한편, Z 스테이지가 작아야 프레임의 높이가 작아지며, XY 스테이지에 걸리는 부하가 줄어들기 때문에 컴팩트한 것이 바람직하고, 가이드, 볼 스크류(ball screw) 및 서포트로 구성되어 모터에 의해 구동되는 것이 바람직하다.
상기 제조 방법에 있어서, 공정 챔버는 600 ~ 700 x 450 ~ 550 x 350 ~ 450 mm 크기의 프레임으로 구성되는 것이 바람직하고, 630 ~ 650 x 480 ~ 500 x 390 ~ 410 mm 크기의 프레임으로 구성되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 프레임에 부착되는 커버는 적어도 한면 이상의 커버에 손잡이를 가지고 경첩 및 자석을 통해 여닫이가 가능한 것으로 구성될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 마이크로어레이어의 구동은 i) 디스펜서를 통해 웰 플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계; ii) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 카메라가 이동하면서 바이오칩 패턴의 중심점을 인식하여 이미지를 처리하는 단계; iii) 카메라에서 인식한 바이오칩 패턴의 중심점에 디스펜서를 통해 디스펜싱을 실시하는 단계; 및, iv) 디스펜서 내 잔여물을 제거하기 위해 세척하는 단계;로 구동될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 마이크로어레이어의 이미지 처리는 카메라에서 사진을 캡처하기; 캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및, 그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 바이오칩 패턴을 인식할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 세척 챔버는 상기 홀더 또는 3축(X, Y, Z) 스테이지의 일측에 배치될 수 있으며, 사각 블록 형태를 가질 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 세척 챔버는 상기 디스펜서의 스폿팅 핀들과 디스펜싱 노즐들의 세정을 위한 워셔액이 공급되는 세정조; 상기 스폿팅 핀들에 잔류하는 상기 시료를 제거하기 위한 진공 포트들; 및 상기 디스펜싱 노즐들 내에 잔류하는 상기 시료를 배출하기 위한 배수조;를 포함할 수 있다. 상기 세정조는 상기 워셔액을 공급하기 위한 워셔액 공급부와 연결될 수 있으며, 상기 워셔액 공급부는 펌프를 포함하고, 상기 워셔액으로는 3차 증류수가 사용될 수 있다. 상기 세정조는 세척 챔버의 상부에 형성될 수 있으며 상기 배수조는 상기 세정조의 일측에 형성될 수 있다. 특히, 상기 세정조와 배수조 사이에는 상기 세정조로 공급된 워셔액을 상기 배수조로 오버플로우 시키기 위한 채널이 구비될 수 있으며, 상기 배수조 내의 워셔액은 배관을 통해 배출 용기로 배출될 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 공정 챔버내 습도를 조절하기 위한 가습기 및 상기 공정 챔버 내부의 습도를 측정하기 위한 습도 센서를 더 포함할 수 있다. 상기 공정 챔버 내부의 습도는 상기 기습기 및 습도 센서에 의해 대략 75% ±3 정도로 조절될 수 있다. 특히, 상기 공정 챔버(104) 내부에서의 결로 현상이 방지될 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 본 발명에 따른 마이크로어레이어의 홀더에 웰 플레이트 및 바이오칩을 고정시키는 단계;
2) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 웰플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계;
3) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 카메라가 바이오칩의 패턴을 이미지 처리하여 중심점을 인식하되,
여기서,
이미지 처리는
i) 카메라에서 사진을 캡처하기;
ii)캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및
iii) 그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 인식하는 단계;
4) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 카메라에서 인식한 패턴의 중심에 디스펜싱을 실시하는 단계; 및
5) 시료 변경시 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 세척 챔버에서 세척하는 단계;를 포함하는, 마이크로어레이어를 이용한 바이오칩 제조 방법을 제공한다.
상기 바이오칩 제조 방법에 있어서, 상기 웰 플레이트는 6 내지 96 웰 프레이트가 모두 사용가능하나 96 웰 프레이트가 바람직하다.
상기 바이오칩 제조 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 단백질, DNA 또는 RNA가 모두 사용가능하며, 항원 또는 항체 등의 단백질 시료인 것이 바람직하다.
상기 바이오칩 제조 방법에 있어서, 본 발명에 따른 마이크로어레이어는 도 2, 도 37 및 도 38에 나타낸 바와 같이 작동을 수행할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 마이크로어레이어는 웰 플레이트(Well plate)에서 생물학적 시료를 흡수하는 시료 흡수 단계, 카메라가 이동하면서 단백질 칩의 원형 등의 패턴을 이미지 처리하여 패턴의 중심점을 인식하는 이미지 처리 단계, 카메라에서 인식한 중심에 디스펜서를 통해 생물학적 시료를 디스펜싱을 실시하는 디스펜싱 단계, 및 시료 변경시 디스펜서내 잔여물이 전재하므로 클리닝을 수행하는 클리닝 단계로 구동한다(도 2, 도 37 및 도 38 참조).
이하, 본 발명의 실시예들은 첨부 도면들을 참조하여 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 하기에서 설명되는 실시예들에 한정된 바와 같이 구성되어야만 하는 것은 아니며 이와 다른 여러 가지 형태로 구체화될 수 있을 것이다.
하기의 실시예들은 본 발명이 온전히 완성될 수 있도록 하기 위하여 제공된다기보다는 본 발명의 기술 분야에서 숙련된 당업자들에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하기 위하여 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 마이크로어레이어의 설계
<1-1> 마이크로어레이어 장비의 구성
마이크로어레이어는 디스펜서의 위치 제어을 위한 3축(X, Y, Z), 96 웰 플레이트(96 Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)의 위치를 고정시키기 위한 홀더, 디스펜서 세척을 위한 클리닝 챔버(Cleaning chamber), 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프, 이미지 인식을 위해 디스펜서 옆 카메라, 및 오염 방지를 위한 커버로 구성되도록 설계하였다. 이런 마이크로어레이어 장비의 구성도는 도 1에 나타내었다(도 1).
<1-2> 마이크로어레이어 장비의 구동 시나리오
마이크로어레이어는 1) 시료 흡수, 2) 이미지 처리, 3) 디스펜싱, 및 4) 클리닝으로 구동하도록 설계하였다. 구체적으로, 시료 흡수로는 96 웰 플레이트(96 Well plate)에서 검사물질을 흡수하고, 이미지 처리로는 카메라가 이동하면서 단백질 칩 원형 패턴의 중심점을 인식하며, 디스펜싱으로는 카메라에서 인식한 중심에 디스펜싱을 실시하고, 클리닝으로 시료 변경 시, 잔여물이 존재하므로 2~3번 헹굼 반복하여 세척하는 것으로 구동하도록 하였다. 이런 마이크로어레이어의 구동 시나리오는 도 2에 나타내었다(도 2).
<1-3> 마이크로어레이어 장비의 크기 및 작동 범위 설정
마이크로어레이 장비의 크기는 500 x 450 x 300 (mm), 작동 범위는 300 x 220 x 60 (mm), 반복 정밀도는 10 μm로 설정하였다(도 3).
<1-4> 마이크로어레이어 장비의 출력 설정
바이오칩(Biochip) 패턴은 500 μm 간격, 패턴 크기는 250 μm, 디스펜싱 출력 지름은 200 μm로 설정하였으며(도 4), 패턴 크기 및 출력 크기를 고려하여 이미지 처리 후 중심과 실제 중심의 차이가 10 μm 이하로 설정하였다(도 5).
<1-5> 마이크로어레이어 장비의 구성품 선정
위치결정 시스템(Positioning system)은 Gantry 타입으로 선정하였다(도 6). Gantry 타입은 디스펜서가 부착된 헤드가 3축(X, Y, Z)로 움직이며, 출력되는 부분인 베드는 고정되어 있는 시스템이다. 마이크로어레이어의 베드에는 출력, 재료변경, 클리닝 시스템이 부착되어 있다.
모터는 스테핑 모터로 선정하였다. 스테핑 모터는 펄스당 일정한 각도로 동작하므로 추가적인 구성품 필요 없이 위치 제어가 가능하고, 다른 모터는 엔코더 및 기어가 필요한 반면, 추가적인 구성품이 필요 없으므로 크기가 작고, 적은 비용으로 시스템 구축이 가능하다.
모션컨트롤러는 스텝모터 드라이버가 내장되어 있어 시스템 단순화가 가능하고, I/O 핀, ADC 등 필요기능들이 구성되어 있으며, 코딩을 통해 추가적인 기능 생성 가능한 WIKAN 모션컨트롤러를 선정하였다(도 7).
<1-6> 디스펜서 선정
디스펜서는 Piezo 방식의 디스펜서를 선정하였다(도 8). Piezo 방식은 전기가 흐르면 모양이 변형되는 압전소자를 이용하여 피스톤으로 튜브를 밀어 출력하는 방식으로서, 사용된 제품은 Piezo 방식의 2 ~ 70 nl의 범위의 단일 액적을 비접촉으로 디스펜싱 가능한 PipeJet NanoDispenser를 선정하였다(도 9).
<1-7> 스테이지 및 프레임 상세 설계
프레임 크기는 640 x 490 x 400 (mm)로 설계하였다(도 10). 설정한 제품 크기는 카메라 부착 및 기타 부가 시스템(펌프 및 가습기 등)을 위한 여유 공간을 고려하였다. 경첩, 손잡이, 자석을 이용하여 문짝을 설계하였고(도 11), 마이크로어레이어 하단에는 전원공급 장치 및 제어기를 위치시켜 별도의 제어기 공간이 없도록 공간을 줄이도록 설계하였으며(도 12), 상단에는 스테이지 및 홀더가 위치하도록 설계하였다. X-스테이지부터 벽면까지 떨어져 있는 공간은 추가적인 구성품(펌프 및 가습기 등)을 위치시킬 수 있는 공간을 확보하도록 설계하였다(도 13)
< 실시예 2> 마이크로어레이어의 구성품 가공 및 제작
<2-1> 홀더 상세 설계 및 제작
슬라이드 글라스 홀더(Slide glass holder)(도 14)와 96 웰 플레이트 홀더(96 Well plate holder)(도 15)를 각각 제작하였다. 각각의 홀더는 밑판, 고정핀, 판스프링으로 구성된다. 슬라이드 글라스 홀더에는 총 14개의 슬라이드 글라스가 장착될 수 있도록 하였다. 판스프링과 고정핀 체결 부분은 가공성이 용이하도록 원형으로 설계 제작하였다(도 16 및 도 17). 슬라이드 글라스 홀더에서 슬라이드 글라스 장착시 체결의 용이성 및 파손 우려를 고려하여 판스프링과 고정핀 체결 부분을 원형에서 사각형으로 변경하여 제작하였다.
<2-2> XY 스테이지 상세 설계 및 제작
XY 스테이지는 기존 기성품을 구매해서 사용하였다. 리니어 스테이지인 LS1004 2개로 구성된다(도 18 및 도 19). 길이 350(Y축), 430(X축) (mm), 리드 4 (mm), 스트로크 220(Y축), 300(X축) (mm)이며, 추가적으로 샤프트, 샤프트 홀더, 리니어 부싱을 사용하였다.
모터 부하 계산 시, 이송무게 4 (kg), 효율 0.9, 리드 4 (mm), 마찰계수 0.006으로 가정하였다.
[일반식 1]
Figure 112018096493150-pat00001
모터 요구 부하가 크지 않으므로, 42각 스텝모터 NK243-01AT-RB 선정하였다(스텝 각 1.8°, 전압 6 V, 전류 1.22 A, 홀딩 토크 0.28 Nm).
<2-3> XY 스테이지 해석
스테이지의 선정을 확인하기 위하여 X-Stage 및 Y-Stage에 대해 정적 해석을 수행하였다.
해석조건은 다음과 같이 수행하였다.
1. Geometry: Guide / Shaft 두 파트로 분할
2. Connections: No-Separation 기능, 분리되지 않고 슬라이딩이 가능하도록 설정
3. Meshing: Auto
4. Static Structural: Gravity, Fixed Support(Base Plate 밑면), Moment(Guide Block 내벽)
해석결과는 다음과 같이 나타났다.
1. Total Deformation : Max Value = 5.5 X 10-7 m.
2. Stress : Max Value = 2.7 X 10-5 Pa.
3. Strain : Max Value = 1.83 x 10-6.
4. Safety Factor : 적정 안전계수는 15로 매우 안전함 확인.
스테이지를 제작하여 테스트한 과정은 도 20에 나타내었다(도 20).
<2-4> Z 스테이지 상세 설계 및 제작
Z 스테이지는 이송거리가 짧고 복잡하지 않은 작업을 수행하므로 컴팩트한 설계가 필요하였다. Z 스테이지가 작아야 프레임의 높이가 작아지며, XY 스테이지에 걸리는 부하가 줄어든다. Z 스테이지는 직접 가공하여 제작하였다. 알루미늄 가공을 통해 ㄷ형상의 프레임을 제작하였다. LM 가이드, Ball Screw, 서포트를 이용하여 Z 스테이지 제작하였다(도 21).
모터 부하 계산 시, 이송무게 1 (kg), 효율 0.9, 리드 2 (mm), 마찰계수 0.006으로 가정하였다.
[일반식 2]
Figure 112018096493150-pat00002
모터 요구 부하가 크지 않으므로, 28각 스텝모터 28HS4-12C-05를 선정하였다(스텝 각 1.8°, 전압 4.5 V, 전류 0.75 A, 홀딩 토크 0.05 Nm). Z 스테이지에는 카메라 및 디스펜서가 부착되며, X 스테이지 위에 장착하였다(도 22).
최종적으로 제작된 XYZ 축 스테이지는 도 23에 나타내었다(도 23). 스테이지 구동시험 결과, 각 방향 의도한 대로 포토커플러 및 스테이지의 정상적인 동작을 확인하였다.
< 실시예 3> 영상수집장치 제작
영상수집장치는 동작중에 샘플 시편의 위치를 확인하고 이에 따라 분사 위치를 조정하도록 설계하였다. 이를 위하여 산업용 카메라와 USB 현미경 카메라를 각각 이용하여 테스트하였다. 산업용 카메라와 렌즈, 조명의 조합은 부착시 공간을 많이 차지하는 단점이 있으나, 영상의 왜곡이 작고, 빠른 영상 획득으로 고속 동작시 유리한 반면, USB 현미경 카메라는 조명, 렌즈, 영상이 compact하게 결합되어 있어서 크기가 작고 부착에 용이하였다.
스테이지 동작시 고속 분사를 하지 않으므로 USB 카메라를 이용하였다. 선정한 카메라는 Andonstar사의 'Digital Microscope A1'로 사양은 다음과 같다.
PC와의 Interface: USB 2.0을 이용.
Hardware: 카메라는 Cylinder Type이며 렌즈의 직경은 12 mm.
Sensor: 내부의 이미지 센서는 CMOS 센서, 2M Pixel(No Interpolation) 성능.
Magnification: 최대 500배까지의 배율 조정 가능.
Focus range: Manual focus from 5-30mm.
Frame rate: resolution이 640 x 480일 때 30 frames/sec이고, 1600 x 1200 일 때 5 frames/sec.
LED: 8개의 LED 제공되고, Control Wheel에 의해 밝기 조정 가능.
Stage 제작이 완성되기 전에 별도로 부착지그를 만들어서 카메라의 위치와 노즐의 위치를 평가하였고, 노즐 교체에 간섭을 회피하여 제작하였다(도 24).
< 실시예 4> 디스펜싱 확인 및 테스트
디스펜싱으로 채택한 Pipe Jet 노즐에 대해 디스펜싱을 확인하였다.
시험 장비를 도 25와 같이 구성하여 테스트 시편을 장착하고 분사 정밀도를 측정하였다. 카메라 2개를 설치하여 확인하도록 구성하고, Pipejet Dispenser와 카메라 Trigger 동기화시켜 확인하였다(도 25 및 도 26).
기본적인 디스펜싱 테스트를 확인한 후, 실제 장비와 동일한 세팅 상황에서 디스펜싱시에 표면에 떨어지는 위치를 제대로 측정하는지 확인하기 위해, 격자무늬 슬라이들 이용하여 droplet을 측정하는 실험을 수행하였다. 스테이지의 이동은 GCODE 만들어서 Wikan으로 실행하였다. 디스펜싱 시간 간격은 5초이며, 위치점 확인은 격자무늬 슬라이드를 이용하였다(도 27 및 도 28).
실험 결과, 일정한 위치에 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 영상 기반제어를 이용하면 원하는 위치에 분사됨을 확인하였다(도 29).
< 실시예 5> 영상처리 알고리즘 개발
카메라에서 캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray scale)로 변환하여 이진화를 시켰다(도 30). Biochip 패턴 인식 시, Biochip과 배경의 색 차이가 명확하여 이진화를 시키는 것이 빛의 영향을 최소로 받았다. 엣지 디텍션(Sobel, Laplace 등)은 사용 시 결과가 좋지 않았다. 패턴 인식은 원형을 인식해야 하므로 Hough circle transform 알고리즘을 이용하였다(도 31 및 도 32). 원형을 인식하면 원의 중심을 알 수 있다.
< 실시예 6> 마이크로어레이어에 영상처리 적용
영상처리를 수행하기 위해 'OpenCV' 라이브러리를 이용하였다. Gray Scale로 변환하기 전에 영상의 노이즈를 제거하기 위해 Blurring 과정을 거쳤다. Blurring 방식은 Median Filter 사용하였다. 그런 다음, Gray Scale 변환과정을 거치며 Hough Circle Transform을 수행하였다. 중간 과정에서 후처리(Post-Processing) (이진화(binarization), 캐니 에지 검출(Canny Edge Detection), 모폴로지(Morphology))을 거치지 않은 것은 OpenCV의 'HoughCircles' 함수 안에 이와 관련된 과정을 수행하는 함수가 내장되어 있으며, 실제 실험 결과 이 방법이 가장 높은 정확도를 보였다(도 33)
원 검출(Circle Detection) 이후 원(Circle)의 중심점(Center Point)을 출력하는 과정이 필요하였다. 'HoughCircles' 함수 내에 Class의 형태로 원(Circle)의 중심점(Center Point)과 반경(Radius) 데이터를 저장해놓아 Window 창에 출력하면 CPU가 검출한 원(Circle)의 정보를 사용자(User)가 쉽게 파악 가능하였다.
동일한 원을 다른 원으로 검출하여 중복된 결과 발생하는 문제에 대해, 함수 내의 검출할 원의 변수를 조작하여 해결하였다(도 34).
카메라의 영상을 프레임(Frame)으로 분리하여 연속적으로 받아오기 때문에 원(Circle)의 중심점(Center Point)값이 실시간으로 바뀌는 것을 확인하였다.
1 프레임(Frame)당 검출의 정확도를 파악하기 어려워 1 프레임당 검출의 정확도를 파악하기 위해 검출과정을 거친 후 검출한 원의 개수를 출력하였다.
1 프레임(Frame)에서 검출한 원(Circle)의 확률이 낮아 케니 에지 한계값(Canny Edge Threshold) 변수와 어큐물레이터(Accumulator) 변수를 조작하여 1 프레임의 검출 확률을 향상시켰다(도 35).
카메라와 BioChip의 거리는 12 mm를 유지한 상태에서 실험 진행하였다. 20 프레임을 받아와 1 프레임의 검출 확률 측정 결과, 20개의 프레임에서 19개의 프레임이 카메라 시야 내의 모든 원을 검출하였다.
본 발명의 마이크로어레이어는 기판의 패턴을 인식함으로써 정확하고 적절한 위치에 생체물질을 분주할 수 있으므로, 패턴이 있는 다양한 기판 위의 특정 위치에 생체물질을 정확하게 분주할 수 있어 다양한 바이오칩 및 센서부 제작에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 웰 플레이트(Well plate) 및 바이오칩(Bio chip)을 각각 고정시키기 위한 홀더(holder);
    상기 바이오칩 상에 생물학적 시료를 액적 형태로 비접촉으로 토출하기 위한 디스펜서(dispenser);
    상기 바이오칩 상의 패턴에 대한 이미지를 인식하기 위한 카메라(camera);
    상기 디스펜서 및 카메라가 결합되고, 3축(X, Y, Z) 방향으로 이동되어 상기 디스펜서 및 카메라의 위치를 제어하기 위한 3축(X, Y, Z) 스테이지(stage);
    상기 디스펜서 세척을 위한 세척 챔버(cleaning chamber);
    상기 디스펜서 세척용 액체 유동을 위한 펌프(pump); 및
    오염 방지를 위한 바닥판, 프레임 및 커버로 구성된 공정 챔버;를 포함하는 마이크로어레이어로서,
    상기 마이크로어레이어는
    i) 디스펜서를 통해 웰 플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계;
    ii) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 카메라가 이동하면서 바이오칩 패턴의 중심점을 인식하여 이미지를 처리하는 단계;
    iii) 카메라에서 인식한 바이오칩 패턴의 중심점에 디스펜서를 통해 디스펜싱을 실시하는 단계; 및
    iv) 디스펜서 내 잔여물을 제거하기 위해 세척하는 단계;로 구동하며,
    이미지 처리는
    카메라에서 사진을 캡처하기;
    캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및
    그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 바이오칩 패턴을 인식하는 것을 특징으로 하는,
    마이크로어레이어(microarrayer).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 카메라는 산업용 카메라 또는 USB 현미경 카메라인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이어.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 카메라는 PC와 인터페이스(interface)되고, CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 센서이며, 최대 200 내지 1000배 배율 조정이 가능하며, 초점 범위(Focus range)는 5 내지 50 mm이고, 프레임 속도(Frame rate)는 최대 30 내지 100 frames/sec인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이어.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 1) 제 1항의 마이크로어레이어의 홀더에 웰 플레이트 및 바이오칩을 고정시키는 단계;
    2) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 웰플레이트에서 생물학적 시료를 흡수하는 단계;
    3) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 카메라가 바이오칩의 패턴을 이미지 처리하여 중심점을 인식하되,
    여기서,
    이미지 처리는
    i) 카메라에서 사진을 캡처하기;
    ii)캡처한 사진을 그레이 스케일(Gray Scale)로 변환하기; 및
    iii) 그레이 스케일로 변환된 사진으로부터 허프 원형 변환(Hough Circle Transform)으로 원형 인식하기;를 포함하는 영상처리 알고리즘을 사용하여 인식하는 단계;
    4) 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 카메라에서 인식한 패턴의 중심에 디스펜싱을 실시하는 단계; 및
    5) 시료 변경시 3축(X, Y, Z) 스테이지를 통해 이동되는 디스펜서가 세척 챔버에서 세척하는 단계;를 포함하는,
    마이크로어레이어를 이용한 바이오칩 제조 방법.



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