KR102076769B1 - Hyaluronic acid-flavonoid conjugate, nanoparticle comprising same and manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 구체예는 저분자량 히알루론산과 플라보노이드를 결합함으로써 컨쥬게이션된 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따른에 따른 저분자량 히알루론산과 7,8-디하이드로플라본의 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 나노입자는 두 성분이 갖는 생물학적 특성을 동시에 가지면서도 체내 흡수성 및 친화성이 높은 장점이 있다. 또한, 상기 컨쥬게이트 및 나노입자는 우수한 항암 효과 및 콜라겐 합성 증진 효과 등을 갖는바, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물에 적용할 수 있다.One embodiment of the present invention relates to a hyaluronic acid-flavonoid conjugate conjugated by combining low molecular weight hyaluronic acid with a flavonoid and a nanoparticle comprising the same. Conjugates of low molecular weight hyaluronic acid and 7,8-dihydroflavone and nanoparticles comprising the same according to an embodiment of the present invention have the advantages of high biological absorption and affinity while simultaneously having the biological properties of the two components There is this. In addition, the conjugate and the nanoparticles have an excellent anticancer effect and collagen synthesis enhancing effect, and can be applied to a pharmaceutical composition or cosmetic composition for cancer prevention or treatment.
Description
본 발명은 히알루론산의 카르복실기와 플라보노이드의 하이드록시기가 에스테르 결합함으로써 컨쥬게이션된 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트, 이의 응집체인 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a hyaluronic acid-flavonoid conjugate conjugated by ester bonding of a carboxyl group of hyaluronic acid and a hydroxy group of a flavonoid, a nanoparticle which is an aggregate thereof, a method for preparing the same, and a composition comprising the same.
히알루론산은 N-아세틸글루코사민과 글루쿠론산이 번갈아 결합되어 있는 당과립이다. 이는 β-1,4 그리고 β-1,3이 글리코시딕 결합으로 이루어진 글리코사민-글리칸(GAG)를 포함하고 있는 다당류의 일종이다. 또한, 히알루론산은 고점도성, 보습성, 생체적합성, 생분해성, 비독성 그리고 면역 반응성이 없는 특징이 있다. 또한, 히알루론산은 작용기로써 카르복실기와 하이드록시기와 같이, 히알루론산은 화학적인 변형이 가능한 작용기를 가지고 있기 때문에, 히알루론산에 다른 약물 또는 고분자를 컨쥬게이션하여 여러 활성 타겟팅이 가능한 생체 재료로 사용될 수 있다. 특히, 저분자량 히알루론산은 피부 투과성이 뛰어나, 피부세포의 콜라겐 합성을 증진시키고 염증반응을 효과적으로 억제한다는 것이 알려져 있다. Hyaluronic acid is a sugar granule in which N-acetylglucosamine and glucuronic acid are alternately bonded. It is a type of polysaccharide in which β-1,4 and β-1,3 contain glycosamine-glycans (GAG) consisting of glycosidic bonds. In addition, hyaluronic acid is characterized by high viscosity, moisturizing properties, biocompatibility, biodegradability, non-toxicity and no immune reactivity. In addition, since hyaluronic acid has a functional group capable of chemical modification, such as a carboxyl group and a hydroxy group as a functional group, the hyaluronic acid may be used as a biomaterial capable of conjugating other drugs or polymers to hyaluronic acid to enable various active targeting. . In particular, it is known that low molecular weight hyaluronic acid has excellent skin permeability, enhances collagen synthesis of skin cells and effectively inhibits inflammatory reactions.
또한, 플라보노이드이드는 식물의 잎, 꽃, 뿌리, 열매, 줄기 등에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소로, 항알레르기, 항염증, 항산화, 항우울 그리고 항암 효과와 같은 생물학적으로 놀라운 스펙트럼을 갖는 화합물이다. 플라보노이드 중 7,8-디하이드록시플라본은 인간 피부세포에서 콜라겐 합성을 증진시키고 콜라게네이즈의 발현을 억제하며, 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)과 이와 관련된 염증 신호(MAPKs 및 Akt) 및 항산화 효소(카탈라아제, Mn-SOD 및 HO-1)를 조절함으로써 피부노화 예방 및 피부주름 개선활성이 우수한 화장원료라는 것이 알려져 있다(대한민국 특허 공개공보 제10-2017-0023910호). 또한, 7,8-다하이드록시플라본이 우수한 항산화 효과 및 항염증 효과를 갖는다는 것이 보고되었다(Park et al. "7, 8-Dihydroxyflavone exhibits anti-inflammatory properties by downregulating the NF-κB and MAPK signaling pathways in lipopolysaccharide-treated RAW264. 7 cells." International journal of molecular medicine 29.6 (2012): 1146-1152). Flavonoids are also yellow pigments widely distributed in plant leaves, flowers, roots, fruits, stems, etc., and have biologically surprising spectra such as anti-allergic, anti-inflammatory, antioxidant, antidepressant and anticancer effects. 7,8-dihydroxyflavones among the flavonoids enhance collagen synthesis and inhibit the expression of collagenase in human skin cells, reactive oxygen species (ROS) and their associated inflammatory signals (MAPKs and Akt) and It is known that cosmetic ingredients are excellent in preventing skin aging and improving wrinkle wrinkles by regulating antioxidant enzymes (catalase, Mn-SOD and HO-1) (Korean Patent Publication No. 10-2017-0023910). In addition, it has been reported that 7,8-dihydroxyflavones have excellent antioxidant and anti-inflammatory effects (Park et al. "7, 8-Dihydroxyflavone exhibits anti-inflammatory properties by downregulating the NF-κB and MAPK signaling pathways in lipopolysaccharide-treated RAW264. 7 cells. "International journal of molecular medicine 29.6 (2012): 1146-1152).
그러나 7,8-디하이드록시플라본은 지방 친화성 구조로 물에 대한 낮은 용해도 때문에 활용이 어려운 문제가 있다(Jang, Sung-Wuk,et al. "A selective TrkB agonist with potent neurotrophic activities by 7, 8-dihydroxyflavone." Proceedings of the National Academy of Sciences 107.6 (2010): 2687-2692). 이에, 본 발명자들은 물에 난용성인 플라보노이드를 효과적으로 활용하기 위한 방안을 연구하던 중 저분자량 히알루론산과 컨쥬게이션시킴으로써, 체내 흡수도 및 친화성을 증진된 컨쥬게이트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.However, 7,8-dihydroxyflavones are difficult to utilize due to their low solubility in water due to their fat affinity structure (Jang, Sung-Wuk, et al. "A selective TrkB agonist with potent neurotrophic activities by 7, 8 -dihydroxyflavone. "Proceedings of the National Academy of Sciences 107.6 (2010): 2687-2692). Accordingly, the present inventors completed the present invention by conjugating with low molecular weight hyaluronic acid while contemplating a method for effectively utilizing a poorly soluble flavonoid in water, thereby developing a conjugate having enhanced body absorption and affinity.
본 발명의 목적은 저분자량 히알루론산과 플라보노이드가 결합된 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a conjugate in which low molecular weight hyaluronic acid and a flavonoid are combined.
본 발명의 다른 목적은 상기 컨쥬게이트로 이루어진 나노입자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a nanoparticle consisting of the conjugate.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 컨쥬게이트 및 상기 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising at least one of the conjugate and the nanoparticle as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 상기 컨쥬게이트 및 상기 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition comprising at least one of the conjugate and the nanoparticles as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 컨쥬게이트의 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing the conjugate.
상기 목적을 달성하기 위해, In order to achieve the above object,
본 발명의 일 구현예는 저분자량 히알루론산과 하기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)가 결합된, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트를 제공한다:One embodiment of the present invention provides a hyaluronic acid-flavonoid conjugate in which a low molecular weight hyaluronic acid is combined with a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the following formula (1):
[화학식 1][Formula 1]
본 발명의 다른 구현예는 저분자량 히알루론산과 하기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)가 결합된 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트를 포함하는 나노입자를 제공한다. Another embodiment of the present invention provides a nanoparticle comprising a hyaluronic acid-flavonoid conjugate to which a low molecular weight hyaluronic acid and a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the formula (1) are combined.
본 발명의 또 다른 구현예는 상기 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 또는 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising at least one of the hyaluronic acid-flavonoid conjugate or nanoparticles as an active ingredient.
본 발명의 다른 구현예는 상기 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 또는 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.Another embodiment of the present invention provides a cosmetic composition comprising at least one of the hyaluronic acid-flavonoid conjugate or nanoparticles as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 구현예는 저분자량 히알루론산을 물에 용해시켜 제1 조성물을 준비하는 단계, 상기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)를 유기용매에 용해시켜 제2 조성물을 준비하는 단계, 상기 제1 조성물에 디엠티엠엠(DMTMM)을 투입하고 교반시키는 단계 및 상기 교반된 제1 조성물에 제2 조성물을 투입하여 히알루론산과 플라보노이드를 컨쥬게이션시키는 단계를 포함하는 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법을 제공한다.Another embodiment of the present invention to prepare a first composition by dissolving the low molecular weight hyaluronic acid in water, the second composition by dissolving a flavonoid (7,8-dihydroxy flavone) having the formula (1) in an organic solvent Preparing a hyaluronic acid comprising the steps of: injecting and stirring DMTMM into the first composition, and incorporating a second composition into the stirred first composition to conjugate hyaluronic acid with a flavonoid. Provided are methods of making flavonoid conjugates.
본 발명에 따른 저분자량 히알루론산과 7,8-디하이드로플라본의 컨쥬게이트는 두 성분이 갖는 생물학적 특성을 동시에 가지면서도 체내 흡수성 및 친화성이 높은 장점이 있다. 또한, 상기 컨쥬게이트의 응집체인 나노입자는 콜로이드 안정성과 분산성이 높고, 일반 혈관보다 더 미세한 종양의 혈관에도 적용 가능한 크기를 갖는다. 또한, 상기 컨쥬게이트는 우수한 항암 효과 및 콜라겐 합성 증진 효과 등을 갖는바, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 화장료 조성물에 적용하기에 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 저분자량 히알루론산과 7,8-디하이드로플라본의 컨쥬게이트의 제조방법은 두 성분의 생물학적 특성을 해치지 않으면서도 입도의 크기가 균일한 컨쥬게이트 나노입자를 구현할 수 있으므로 다양한 제형 제조에 관한 산업 분야에 유용하게 이용될 수 있다.The conjugate of the low molecular weight hyaluronic acid and 7,8-dihydroflavone according to the present invention has the advantages of having high biological absorption and affinity while simultaneously having the biological properties of the two components. In addition, nanoparticles, which are aggregates of the conjugate, have high colloidal stability and dispersibility, and have sizes that are applicable to blood vessels of tumors that are finer than general blood vessels. In addition, the conjugate has an excellent anti-cancer effect and collagen synthesis enhancing effect, etc., it is useful to apply to a pharmaceutical composition or cosmetic composition for preventing or treating cancer. In addition, the preparation method of the conjugate of the low molecular weight hyaluronic acid and 7,8-dihydroflavone according to the present invention can realize conjugate nanoparticles of uniform particle size without compromising the biological properties of the two components, so that various formulations It can be usefully used in the industrial field related to manufacturing.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트를 제조할 때 이용되는 화학 반응식을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 평균 입경을 나타낸 것이다(용매에 대한 전체 용질의 농도 조건 비교).
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 제타 전위를 나타낸 것이다(용매에 대한 전체 용질의 농도 조건 비교).
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 평균 입경을 나타낸 것이다(DMTMM의 농도 비교).
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 제타 전위를 나타낸 것이다(DMTMM의 농도 비교).
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 현미경(SAM) 사진을 나타낸 것이다(DMTMM의 농도 비교).
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트를 NMR 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 평균 입경을 나타낸 것이다(반응 시간 비교).
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 평균 입경을 나타낸 것이다(동결건조 전과 후 비교).
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 제타전위를 나타낸 것이다(동결건조 전과 후 비교).
도 11은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 분산성을 나타낸 것이다(동결건조 전과 후 비교).
도 12 및 도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 자궁암 세포에서의 항암 효과를 분석한 결과이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 간암 세포에서의 항암 효과를 분석한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 나노입자의 콜라겐 합성 효과를 분석한 결과이다.Figure 1 shows the chemical reaction scheme used when preparing the conjugate according to one embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the average particle diameter of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention (compare the concentration conditions of the total solute to the solvent).
Figure 3 shows the zeta potential of the conjugate nanoparticles according to one embodiment of the present invention (compare the concentration conditions of the total solute to solvent).
Figure 4 shows the average particle diameter of the conjugate nanoparticles according to one embodiment of the present invention (compare concentration of DMTMM).
Figure 5 shows the zeta potential of the conjugate nanoparticles according to one embodiment of the present invention (compare concentration of DMTMM).
Figure 6 shows a micrograph (SAM) of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention (compare concentration of DMTMM).
Figure 7 shows the results of NMR analysis of the conjugate according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the average particle diameter of the conjugate nanoparticles according to one embodiment of the present invention (reaction time comparison).
Figure 9 shows the average particle diameter of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention (comparison before and after freeze drying).
Figure 10 shows the zeta potential of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention (comparison before and after freezing).
Figure 11 shows the dispersibility of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention (comparison before and after freeze drying).
12 and 13 are the results of analyzing the anticancer effect of the cervical cancer cells of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
14 and 15 are the results of analyzing the anticancer effect of the liver cancer cells of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
16 is a result of analyzing the collagen synthesis effect of the conjugate nanoparticles according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 일 측면은, 저분자량 히알루론산과 하기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)가 결합된 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트를 제공할 수 있다.One aspect of the present invention may provide a hyaluronic acid-flavonoid conjugate in which a low molecular weight hyaluronic acid and a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the formula (1) are combined.
[화학식 1][Formula 1]
본원에서 사용된 용어 "컨쥬게이트"란, 히알루론산과 플라보노이드가 공유적으로 부착된 것으로, 본 명세서에 기재된 화합물 혹은 그의 유도체를 의미한다. As used herein, the term “conjugate” refers to a covalently attached hyaluronic acid and a flavonoid, and refers to a compound or derivative thereof described herein.
본원에서 사용된 용어 "저분자량 히알루론산"은 히알루론산 중에서도 종래의 고분자량의 것에 비해 증가된 용해도를 갖는 100kDa 이하의 분자량을 갖는 것을 의미한다. 이때, 고분자량 히알루론산은 점성과 탄성이 높아지나 피부의 진피층이나 혈관을 통과하지 못하는 문제가 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 저분자량을 갖는 저분자량 히알루론산을 이용함으로써, 체내 흡수율 및 혈관 통과율이 우수하여 약학적 조성물이나 화장료 조성물에 적용되기에 적합한 나노입자를 제공한다.As used herein, the term "low molecular weight hyaluronic acid" is meant to have a molecular weight of 100 kDa or less, with increased solubility in hyaluronic acid compared to that of conventional high molecular weight. At this time, the high molecular weight hyaluronic acid has a problem that the viscosity and elasticity is high but does not pass through the dermal layer or blood vessels of the skin. Therefore, one embodiment of the present invention by using a low molecular weight hyaluronic acid having a low molecular weight, excellent in body absorption rate and blood vessel passage rate to provide a nanoparticle suitable for application to pharmaceutical compositions or cosmetic compositions.
또한, 본원에서 사용된 용어 "7,8-디하이드록시플라본"은 상기 화학식 1을 갖는 플라보노이드로, 비타민 A, C, E, 베타카로틴 등과 함께 항산화 효능을 갖는다고 알려진 물질이다. 나아가 항염증, 항암, 콜라겐 합성 증진 및 콜라게네이즈 발현을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다. 이러한 우수한 생물학적 효능에도 불구하고, 지방 친화성 구조로 인해 물에 대해 낮은 용해도를 갖기 때문에 사용이 제한되는 문제가 있었다. 이에, 본 발명의 일 구체예는 난용성인 7,8-디하이드록시플라본을 저분자량 히알루론산과 컨쥬게이션시킴으로써, 두 물질의 체내 흡수도 및 친화성이 향상시켰다.In addition, as used herein, the term "7,8-dihydroxyflavone" is a flavonoid having the above formula (1), and is a substance known to have antioxidant potency with vitamins A, C, E, beta carotene and the like. Furthermore, it has been reported to be able to inhibit anti-inflammatory, anti-cancer, enhance collagen synthesis and inhibit collagenase expression. In spite of this good biological efficacy, there is a problem that the use is limited because of the low solubility in water due to the fat affinity structure. Thus, one embodiment of the present invention by conjugating poorly soluble 7,8-dihydroxyflavone with low molecular weight hyaluronic acid, thereby improving the absorption and affinity of the two substances in the body.
구체적으로, 상기 저분자량 히알루론산의 분자량이 1kDa 내지 100kDa일 수 있다. 또한, 상기 저분자량 히알루론산의 분자량이 1kDa 내지 100kDa, 20kDa 내지 80kDa, 30kDa 내지 60kDa, 30kDa 내지 55kDa 또는 45kDa 내지 55kDa일 수 있다. Specifically, the molecular weight of the low molecular weight hyaluronic acid may be 1kDa to 100kDa. In addition, the molecular weight of the low molecular weight hyaluronic acid may be 1kDa to 100kDa, 20kDa to 80kDa, 30kDa to 60kDa, 30kDa to 55kDa or 45kDa to 55kDa.
상기 저분자량 히알루론산은 하기 화학식 2를 갖는 화합물일 수 있다.The low molecular weight hyaluronic acid may be a compound having the formula (2).
[화학식 2][Formula 2]
상기 히알루론산의 카르복실기와 상기 플라보노이드의 하이드록실기가 에스테르 결합을 형성함으로써 컨쥬게이션됨으로써, 본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 3을 갖는 화합물일 수 있다. 상기 컨쥬게이트가 제조되는 반응 메커니즘은 도 1에 개략적으로 나타내었다.The carboxyl group of the hyaluronic acid and the hydroxyl group of the flavonoid are conjugated by forming an ester bond, so that one embodiment of the present invention may be a compound having the formula (3). The reaction mechanism by which the conjugate is prepared is shown schematically in FIG. 1.
[화학식 3][Formula 3]
또한, 본 발명의 다른 구체예는 하기 화학식 4를 갖는 화합물일 수 있다.In addition, another embodiment of the present invention may be a compound having the formula (4).
[화학식 4][Formula 4]
본 발명의 다른 구체예는, 전술한 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트를 포함하는 나노입자를 제공할 수 있다. 상기 나노입자는 복수의 상기 컨쥬게이트가 특정 용매 또는 온도 처리를 통하여 응집된 형태로 구현될 수 있다.Another embodiment of the present invention may provide a nanoparticle comprising the hyaluronic acid-flavonoid conjugate described above. The nanoparticles may be implemented in a form in which a plurality of the conjugates are aggregated through a specific solvent or temperature treatment.
상기 나노입자의 평균 직경은 100nm 내지 800nm, 200nm 내지 500nm, 100nm 내지 200nm, 100nm 내지 160nm, 또는 70nm 내지 100nm 일 수 있다. 나노입자의 경우, 생체 내에서의 성능과 약물의 역할에 있어서 입자의 크기가 매우 중요한 요소로 알려져 있다. 또한, 종양의 혈관은 일반 체내의 혈관보다 더 미세한바, 상기 범위의 크기를 갖는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자는 약학적 조성물 또는 화장료 조성물에 적용되기 적합하다.The average diameter of the nanoparticles may be 100nm to 800nm, 200nm to 500nm, 100nm to 200nm, 100nm to 160nm, or 70nm to 100nm. In the case of nanoparticles, the particle size is known to be a very important factor in the performance in vivo and the role of the drug. In addition, the blood vessel of the tumor is finer than the blood vessels in the general body, the nanoparticles according to an embodiment of the present invention having a size in the above range is suitable for application to a pharmaceutical composition or cosmetic composition.
또한, 상기 나노입자의 제타전위는 -20mV 내지 -40mV일 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트의 나노입자는 체내에서 흡수성 및 분산 안정성이 뛰어나다.In addition, the zeta potential of the nanoparticles may be -20mV to -40mV. Therefore, the nanoparticles of the conjugate according to one embodiment of the present invention are excellent in absorbency and dispersion stability in the body.
본 발명의 또 다른 구체예에 따르면, 전술한 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, it is possible to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising at least one of the hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles described above as an active ingredient.
상기 암은 대장암, 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 중추신경계 종양 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.The cancer may include colon cancer, liver cancer, stomach cancer, breast cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, anal muscle cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma Can be at least one selected from the group consisting of vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma central nervous system tumor and leukemia.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 전술한 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 상기 간질환은 간암, 간섬유증, 간경화증 및 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.According to another embodiment of the present invention, it is possible to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease comprising at least one of the aforementioned hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles as an active ingredient. The liver disease may be at least one selected from the group consisting of liver cancer, liver fibrosis, cirrhosis of the liver and hepatitis.
히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 이의 나노입자는 전체 약학적 조성물 중량 대비 0.005 내지 0.5 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 0.01 중량%로 포함될 수 있다. 만약, 상기 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 이의 나노입자의 함량이 제한 범위 미만일 경우 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 반대로 제한 범위를 초과하는 경우 함량의 증가에 비해 효과의 증가가 미치지 못하며 약간의 세포 독성을 야기할 수 있다.The hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles thereof may be included in an amount of 0.005 to 0.5% by weight, and preferably 0.05 to 0.01% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition. If the content of the hyaluronic acid-flavonoid conjugate and its nanoparticles is less than the limit range, a clear effect cannot be expected. On the contrary, if the content exceeds the limit, the effect of the hyaluronic acid-flavonoid conjugate and its nanoparticles are not increased. Can cause.
상기 약학 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 본 발명의 조성물은 고형 제제, 반고형제제 또는 액상 제제일 수 있다. 이때 각 제형의 조성물에 있어서, 상기한 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 이의 나노입자 이외의 다른 성분들은 기타 약학 조성물의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.The pharmaceutical composition is not particularly limited in its formulation, and the composition of the present invention may be a solid preparation, a semisolid preparation or a liquid preparation. At this time, in the composition of each formulation, other components other than the hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles thereof may be appropriately selected by those skilled in the art according to the formulation or purpose of use of other pharmaceutical compositions.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 전술한 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 나노입자 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다.According to another embodiment of the present invention, a cosmetic composition comprising at least one of the aforementioned hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles as an active ingredient can be provided.
상기 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트 및 이의 나노입자는 전체 화장료 조성물 중량 대비 0.1 내지 5.0 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 중량%로 포함될 수 있다. 만약, 상기 화합물의 함량이 제안 범위 미만일 경우 뚜렷한 효과를 기대할 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하는 경우 포함량의 증가에 비해 효과의 증가가 미치지 못하며 약간의 세포 독성을 나타낼 수 있다.The hyaluronic acid-flavonoid conjugate and nanoparticles thereof may be included in an amount of 0.1 to 5.0% by weight, preferably 0.5 to 1.0% by weight, based on the total weight of the cosmetic composition. If the content of the compound is less than the proposed range, it is not expected to have a distinct effect, on the contrary, if the content exceeds the above range, the effect may not be increased compared to the increase in the amount of inclusion, and may exhibit some cytotoxicity.
상기 화장료 조성물은 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들어 화장수, 유액, 크림, 폼, 에센스, 세럼, 유연수, 유액, 파운데이션, 메이크업 베이스, 비누, 선 스크린크림 및 선 오일 등의 제형으로 제조할 수 있다.The cosmetic composition is not particularly limited in the formulation thereof, for example, lotion, milky lotion, cream, foam, essence, serum, softening water, milky lotion, foundation, makeup base, soap, sunscreen cream and sun oil It may be prepared in a dosage form.
또한, 각 제형의 조성들은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 그 효과를 떨어트리지 않는 범위 내에서 비이온 계면활성제, 실리콘 폴리머, 체질안료, 향료, 방부제, 살균제, 산화 안정화제, 유기 용매, 이온성 또는 비이온성 증점제, 유연화제, 산화방지제, 자유 라디칼파괴제, 불투명화제, 안정화제, 에몰리언트(emollient), 실리콘, α-히드록시산, 소포제, 보습제, 비타민, 곤충 기피제, 향료, 보존제, 계면활성제, 소염제, 물질 P 길항제, 충전제, 중합체, 추진제, 염기성화 또는 산성화제, 또는 착색제 등 공지의 화합물을 포함하여 제조될 수 있다.In addition, the compositions of each formulation may contain various bases and additives necessary and appropriate for the formulation of the formulation, and nonionic surfactants, silicone polymers, extender pigments, fragrances, preservatives, Fungicides, oxidation stabilizers, organic solvents, ionic or nonionic thickeners, softeners, antioxidants, free radical destroyers, opacifiers, stabilizers, emollients, silicones, α-hydroxy acids, antifoams, humectants, Known compounds such as vitamins, insect repellents, fragrances, preservatives, surfactants, anti-inflammatory agents, substance P antagonists, fillers, polymers, propellants, basicizing or acidifying agents, or coloring agents.
또한, 본 발명의 다른 구체예는, 저분자량 히알루론산을 물에 용해시켜 제1 조성물을 준비하는 단계; 하기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)를 유기용매에 용해시켜 제2 조성물을 준비하는 단계; 상기 제1 조성물에 디엠티엠엠(DMTMM)을 투입하고 교반시키는 단계; 및 상기 교반된 제1 조성물에 제2 조성물을 투입하여 히알루론산과 플라보노이드를 컨쥬게이션시키는 단계를 포함하는 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법을 제공할 수 있다.In addition, another embodiment of the present invention, the step of dissolving the low molecular weight hyaluronic acid in water to prepare a first composition; Preparing a second composition by dissolving a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having
[화학식 1][Formula 1]
상기 제1 조성물을 준비하는 단계에서, 물은 수돗물, 탈이온수, 정제수 또는 증류수일 수 있고 바람직하게는 증류수이다. 이때, 물에 대하여 저분자량 히알루론산은 약 0.01 내지 2.0 중량% 또는 0.015 내지 1.5 중량%로 포함되는 것이 가장 바람직하다.In the step of preparing the first composition, water may be tap water, deionized water, purified water or distilled water, preferably distilled water. At this time, it is most preferable that the low molecular weight hyaluronic acid is contained in about 0.01 to 2.0% by weight or 0.015 to 1.5% by weight relative to water.
상기 저분자량 히알루론산의 분자량이 1kDa 내지 100kDa일 수 있다. 또한, 상기 저분자량 히알루론산의 분자량이 1kDa 내지 100kDa, 20kDa 내지 80kDa, 30kDa 내지 60kDa, 30kDa 내지 55kDa 또는 45kDa 내지 55kDa일 수 있다. The low molecular weight hyaluronic acid may have a molecular weight of 1 kDa to 100 kDa. In addition, the molecular weight of the low molecular weight hyaluronic acid may be 1kDa to 100kDa, 20kDa to 80kDa, 30kDa to 60kDa, 30kDa to 55kDa or 45kDa to 55kDa.
구체적으로, 상기 저분자량 히알루론산은 하기 화학식 2를 갖는 화합물일 수 있다.Specifically, the low molecular weight hyaluronic acid may be a compound having the formula (2).
[화학식 2][Formula 2]
상기 제2 조성물을 준비하는 단계에서, 유기용매는 메탄올, 아세트산, 아세톤, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭사이드일 수 있고 바람직하게는 메탄올이다. 이때, 유기용매에 대하여 플라보노이드는 약 0.01 내지 2.0 중량% 또는 0.1 내지 1.0 중량%로 포함되는 것이 가장 바람직하다.In preparing the second composition, the organic solvent may be methanol, acetic acid, acetone, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, and preferably methanol. In this case, the flavonoid is most preferably contained in about 0.01 to 2.0% by weight or 0.1 to 1.0% by weight relative to the organic solvent.
또한, 상기 제1 조성물에 케플링 시약인 디엠티엠엠(DMTMM; 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리니움 클로라이드)을 투입하고 교반시키는 단계에서, 제1 조성물에 포함된 히알루론산의 카르복실기가 활성화되어 추후 플라보노이드와 히알루론산이 효과적으로 결합될 수 있다. 이때, 상기 디엠티엠엠은 상기 제1 조성물에 대하여 0.0025 내지 0.2 g/L 또는 0.05 내지 0.1 g/L 농도가 되도록 투입되는 것이 가장 바람직하다.In addition, the first composition was added to DMMP (DMTMM; 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride) In the step of adding and stirring, the carboxyl group of the hyaluronic acid contained in the first composition is activated, and later flavonoids and hyaluronic acid can be effectively combined. In this case, the DMTE is most preferably added to the concentration of 0.0025 to 0.2 g / L or 0.05 to 0.1 g / L with respect to the first composition.
상기 교반된 제1 조성물에 제2 조성물을 투입하는 단계에서, 히알루론산과 플라보노이드를 컨쥬게이션되어 본 발명의 일 구체예에 따른 컨쥬게이트 및 나노입자가 제조될 수 있다. 이때, 상기 히알루론산의 카르복실기와 상기 플라보노이드의 하이드록실기가 에스테르 결합을 형성함으로써 컨쥬게이션될 수 있다. 한편, 제1 조성물과 제2 조성물에 각각 포함된 히알루론산 및 플라보노이드의 양에 비추에, 본 단계에서 전체 반응시 히알루론산과 플라보노이드의 중량비는 2 : 1 또는 1.5 : 1인 것이 바람직하다. In the step of injecting the second composition into the stirred first composition, the hyaluronic acid and the flavonoids may be conjugated to prepare conjugates and nanoparticles according to an embodiment of the present invention. At this time, the carboxyl group of the hyaluronic acid and the hydroxyl group of the flavonoid can be conjugated by forming an ester bond. On the other hand, in view of the amount of hyaluronic acid and flavonoids contained in the first composition and the second composition, respectively, the weight ratio of hyaluronic acid and flavonoids in the total reaction in this step is preferably 2: 1 or 1.5: 1.
상기 제조방법을 통해 수득된 컨쥬게이트의 일 구체예는 하기 화학식 3을 갖는 화합물일 수 있다.One embodiment of the conjugate obtained through the preparation method may be a compound having the formula (3).
[화학식 3][Formula 3]
또한, 상기 제조방법을 통해 수득된 컨쥬게이트의 다른 구체예는 하기 화학식 4를 갖는 화합물일 수 있다.In addition, another embodiment of the conjugate obtained through the production method may be a compound having the formula (4).
[화학식 4] [Formula 4]
또한, 상기 단계에서 수득된 컨쥬게이트를 동결 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 후술하는 실시예에서 확인한 바와 같이, 동결 건조시 나노입자의 입경이 살짝 증가하지만 일정한 크기를 유지하며, 제타 전위값도 콜로이드 안정성이 우수하다고 판단할 수 있는 범위 내인 것을 확인하였다.In addition, the conjugate obtained in the step may further comprise the step of freeze drying. As confirmed in the examples described below, the particle size of the nanoparticles slightly increased during freeze-drying, but maintained a constant size, zeta potential value was confirmed to be within the range that can be determined to be excellent colloidal stability.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1. 히알루론산의 함량에 따른 1. According to the content of hyaluronic acid 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본의Dihydroxyflavones 컨쥬게이트 제조 Conjugate manufacturing
실시예Example 1.1. 고농도 히알루론산을 이용한 제조 1.1. Manufacture using high concentration hyaluronic acid
1.0L의 증류수에 분자량이 50kDa인 히알루론산 20g을 마그네틱 바를 이용하여 용해시켜 제1 조성물을 준비하였다. 또한, 1.0L의 메탄올에 50.0g의 7,8-디하이드록시플라본을 용해시켜 제2 조성물을 준비하였다. 제1 조성물에 DMTMM을 5g을 투입하여, 10분간 저분자량 히알루론산의 카르복실기를 활성화시키기 위해 교반하였다. 교반 중인 제1 용액에 연동 펌프를 이용하여, 앞서 준비한 제2 조성물 1.0L를 200 rpm으로 주입하였다. 상온에서 48시간 교반 후, 이를 분자량 12,000-14,000의 투석막에 넣고 증류수에서 24시간 투석하였다. 24시간 후, 4,000 rpm으로 3분간 원심분리기를 이용하여 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본의 컨쥬게이트를 수득하였다. 수득한 컨쥬게이트를 동결 건조(Freeze drying)하여 파우더 형태의 나노입자를 제조하였다.A first composition was prepared by dissolving 20 g of hyaluronic acid having a molecular weight of 50 kDa in 1.0 L of distilled water using a magnetic bar. Further, a second composition was prepared by dissolving 50.0 g of 7,8-dihydroxyflavone in 1.0 L of methanol. 5 g of DMTMM was added to the first composition, followed by stirring for 10 minutes to activate the carboxyl group of low molecular weight hyaluronic acid. 1.0 L of the second composition prepared above was injected at 200 rpm into the first solution under stirring using a peristaltic pump. After 48 hours of stirring at room temperature, it was placed in a dialysis membrane having a molecular weight of 12,000-14,000 and dialyzed in distilled water for 24 hours. After 24 hours, a conjugate of low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavones was obtained using a centrifuge at 4,000 rpm for 3 minutes. The obtained conjugate was freeze dried to prepare nanoparticles in powder form.
실시예 1.2. 저농도 히알루론산을 이용한 제조Example 1.2. Manufacture using low concentration hyaluronic acid
1.0L의 증류수에 분자량이 50kDa인 히알루론산 0.2g을 마그네틱 바를 이용하여 용해시켜 제1 조성물을 준비하였다. 또한, 1.0L의 메탄올에 0.5g의 7,8-디하이드록시플라본을 용해시켜 제2 조성물을 준비하였다. 제1 조성물에 DMTMM을 0.05g을 투입하여, 10분간 저분자량 히알루론산의 카르복실기를 활성화시키기 위해 교반하였다. 교반 중인 제1 용액에 연동 펌프를 이용하여, 앞서 준비한 제2 조성물 1.0L를 200rpm으로 주입하였다. 상온에서 48시간 교반 후, 이를 분자량 12,000-14,000의 투석막에 넣고 증류수에서 24시간 투석하였다. 24시간 후, 4000rpm으로 3분간 원심분리기를 이용하여 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본의 컨쥬게이트를 수득하였다. 수득한 컨쥬게이트를 동결 건조하여 파우더 형태의 나노입자를 제조하였다.0.2 g of hyaluronic acid having a molecular weight of 50 kDa was dissolved in 1.0 L of distilled water using a magnetic bar to prepare a first composition. Further, 0.5 g of 7,8-dihydroxyflavone was dissolved in 1.0 L of methanol to prepare a second composition. 0.05 g of DMTMM was added to the first composition, followed by stirring for 10 minutes to activate the carboxyl group of low molecular weight hyaluronic acid. 1.0 L of the second composition prepared above was injected at 200 rpm into the first solution under stirring using a peristaltic pump. After 48 hours of stirring at room temperature, it was placed in a dialysis membrane having a molecular weight of 12,000-14,000 and dialyzed in distilled water for 24 hours. After 24 hours, a conjugate of low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavones was obtained using a centrifuge at 4000 rpm for 3 minutes. The obtained conjugate was freeze-dried to prepare nanoparticles in powder form.
실시예Example 2. 2. DMTMM의DMTMM 농도에 따른 According to concentration 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트Conjugate 제조 Produce
DMTMM의 농도를 0.0025mg/mL, 0.05mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL 의 농도로 각각 처리한 것을 제외하고는 실시예 2과 동일한 방법으로 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트 나노입자를 제조하였다.Low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydride in the same manner as in Example 2 except that the concentration of DMTMM was treated at concentrations of 0.0025 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.1 mg / mL and 0.2 mg / mL, respectively. Oxyflavone conjugated nanoparticles were prepared.
실험예Experimental Example 1. One. 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트Conjugate 물성 분석 Physical property analysis
실험예Experimental Example 1.1 히알루론산의 함량에 따른 나노입자의 크기와 1.1 Size and Size of Nanoparticles According to Hyaluronic Acid Content 제타전위Zeta potential 분석 analysis
실시예 1.1 및 실시예 1.2 에서 제조한 나노입자에 대하여, Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom)을 사용하여 평균 입경(동적광산란법(Dynamic Light Scattering : DLS))과 제타전위를 측정하였다. 측정은 25℃에서 진행되었으며, 자는 모두 증류수에 분산되어 있는 상태로 측정하였다. 그 결과를 표 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.For the nanoparticles prepared in Examples 1.1 and 1.2, the average particle diameter (Dynamic Light Scattering (DLS)) and zeta potential were measured using Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, United Kingdom). . The measurement was performed at 25 ° C., and all the pores were measured while being dispersed in distilled water. The results are shown in Table 1, FIG. 2 and FIG.
실험 결과, 고농도 조건에서 제조시 평균 입경이 커지는 양상을 보였으며(표 1 및 도 2를 참고), 두 나노입자 모두 히알루론산의 카르복실그룹으로 인한 음전하를 띄며 ±20mV 이상의 제타 전위 값을 가지므로(도 3 참고), 콜로이드 안정성과 분산성이 우수한 것을 확인하였다.As a result of the experiment, the average particle diameter was increased when manufactured under high concentration conditions (see Tables 1 and 2), and both nanoparticles have a negative charge due to the carboxyl group of hyaluronic acid and have a zeta potential value of ± 20 mV or more. (See FIG. 3), it was confirmed that the colloidal stability and dispersibility is excellent.
실험예Experimental Example 1.2 1.2 DMTMM의DMTMM 농도에 따른 나노입자의 크기와 Nanoparticle size and concentration 제타전위Zeta potential 분석 analysis
실시예 2 에서 제조한 각각의 나노입자에 대하여, 평균 입경과 제타전위를 측정하여 표 1, 도 4 및 도 5에 나타내었다. 그리고 도 6에서와 같이 전자현마경(SAM)으로 나노입자를 촬영하였다.For each of the nanoparticles prepared in Example 2, average particle diameters and zeta potentials were measured and shown in Tables 1, 4 and 5. And nanoparticles were taken by electron microscope (SAM) as shown in FIG.
표 2를 참고하면, DMTMM의 농도가 낮을수록 컨쥬케이트량이 감소하였다. 또한, 도 4를 참고하면, 평균 입경도 감소되었다. 이를 통해, 실시예에서 DMTMM의 농도를 조절함으로써 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 약학적 조성물은 암 예방 또는 치료용으로 적합한 것을 확인하였다.Referring to Table 2, the lower the concentration of DMTMM decreased the amount of conjugate. 4, the average particle diameter was also reduced. Through this, by adjusting the concentration of DMTMM in the embodiment it was confirmed that the pharmaceutical composition comprising the nanoparticles according to the present invention is suitable for the prevention or treatment of cancer.
또한, 모든 종류의 나노입자가 ±20mV 이상의 제타 전위 값을 가지므로(도 5 참고), 실시예에 따른 나노입자는 매우 우수한 콜로이드 안정성을 갖는 것을 알 수 있다.In addition, since all kinds of nanoparticles have a zeta potential value of ± 20 mV or more (see FIG. 5), it can be seen that the nanoparticles according to the embodiment have very excellent colloidal stability.
실험예Experimental Example 2. 2. 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트의Conjugate NMR 분석 NMR analysis
실시예 1.2에서 제조된 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트에 대하여, 300 MHz NMR (Avance IIII 300 MHz, Bruker, USA)을 사용하여 분석하였다. 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 화학적 분석을 위해 H-NMR 스펙트럼을 분석하였다. 7,8-디하이드록시플라본과 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트 모두 6.89, 6.96, 7.41, 7.57, 7.58, 8.15 ppm에서 피크를 나타낸다(도 7a 참고). 이는 7,8-디하이드록시플라본이 가지는 방향족 고리을 나타내는 피크이다. 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 H-NMR 스펙트럼에서 저분자량 히알루론산의 2.1 ppm은 카르복실기를 나타내고 약 3.0 ppm부터 약 4.5 ppm 까지는 히알루론산의 백본을 나타내는 피크이다. (도 7b 참고) 그리고 7,8-디하이드록시플라본의 3.3 ppm은 하이드록시기를 나타낸다. 이 두 개의 반응기가 컨쥬게이션되어 에스터 결합을 형성하는데 이 에스터 피크는 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 H-NMR 스펙트럼에서 2.2 ppm과 4.1 ppm에서 확인 할 수 있다(도 7c 참고). 두 개의 피크를 통해 에스터 결합이 형성된 것을 확인하였다.The low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugates prepared in Example 1.2 were analyzed using 300 MHz NMR (Avance IIII 300 MHz, Bruker, USA). H-NMR spectra were analyzed for chemical analysis of low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugates. Both 7,8-dihydroxyflavones and low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugates show peaks at 6.89, 6.96, 7.41, 7.57, 7.58, 8.15 ppm (see FIG. 7A). This is the peak representing the aromatic ring of 7,8-dihydroxyflavone. In the H-NMR spectrum of the low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugate, 2.1 ppm of the low molecular weight hyaluronic acid represents a carboxyl group and from about 3.0 ppm to about 4.5 ppm is the peak representing the backbone of hyaluronic acid. (See FIG. 7B) And 3.3 ppm of 7,8-dihydroxyflavone represents a hydroxyl group. These two reactors are conjugated to form ester bonds, which can be seen at 2.2 ppm and 4.1 ppm in the H-NMR spectrum of the low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugate (FIG. 7C). Reference). It was confirmed that the ester bond was formed through two peaks.
실험예Experimental Example 3. 3. 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트Conjugate 나노입자의 안정성 확인 Check the stability of nanoparticles
증류수 10 mL에 실시예 1.2에 따른 50 kDa의 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 나노입자 0.01 g을 녹이고 1, 3, 5, 7일차로 총 일주일 동안 나노입자의 크기 변화와 안정성을 확인하였다. Change in the size of nanoparticles for a total of one week on
먼저, 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 나노입자를 희석배수에 따라 크기를 조절한 이후, 반응시간에 따른 입자 크기의 변화를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 24시간 반응을 진행하였을 때, 시간이 지남에 따라 입자의 크기가 커지는 것을 확인하였다. 이는 충분하지 못한 반응 시간으로 인하여 나타나는 이온의 상호작용에 의한 것이다. 이에, 나노입자 크기를 감소시키기 위하여 반응시간을 48시간으로 늘려서 나노입자를 제조하였다. 48시간으로 제조한 컨쥬게이트의 나노입자의 크기는 107.0±19.8 nm로 24시간 반응시킨 컨쥬게이트의 나노 입자의 크기인 138.0±23.6 nm보다 크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 8 참고). First, after adjusting the size of the nanoparticles of the low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxy flavone conjugate according to the dilution factor, the experiment was carried out to check the change in particle size with the reaction time. When the reaction proceeded for 24 hours, it was confirmed that the size of the particles increases with time. This is due to the interaction of ions due to insufficient reaction time. Thus, the nanoparticles were prepared by increasing the reaction time to 48 hours to reduce the nanoparticle size. It was confirmed that the size of the nanoparticles of the conjugate prepared in 48 hours was reduced in size from 138.0 ± 23.6 nm, the size of the nanoparticles of the conjugate reacted for 24 hours at 107.0 ± 19.8 nm (see Figure 8).
또한, 동결 건조에 따른 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 나노입자의 크기 변화를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 동결 건조 후, 제조된 50kDa의 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트의 나노입자는 응집(Aggregation)으로 인하여 크기가 증가하였다(도 9 참고). 1일차에서는 8 nm, 3일차는 1.75 nm, 5일차는 4 nm 그리고 7일차에서는 2 nm로 모두 평균 10 nm 이하의 크기의 증가를 보였다. 동결 건조한 입자를 재분산하여 동결 건조 하지 않은 입자와 크기를 비교하였을 때, 오차범위 이내로 일정한 크기를 유지한다. 또한 동결 건조 전후의 제타 전위도 비교하였다(도 10 참고).In addition, an experiment was conducted to confirm the change in the size of the nanoparticles of low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugates by freeze drying. After freeze drying, the nanoparticles of the prepared 50 kDa low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugate increased in size due to aggregation (see FIG. 9).
동결 건조 전의 제타 전위는 1일차 -19.1±2.4 mV, 3일차 -21.0±2.3 mV, 5일차 -22.1±2.4 mV 그리고 7일차 -20.0±3.6 mV이고 동결 건조 후의 제타 전위는 1일차 -20.1±1.2 mV, 3일차 -21.0±4.3 mV, 5일차 -20.0±4.9 mV 그리고 7일차는 -20.7±3.3 mV이다. 따라서, 장기보관이 용이하도록 동결 건조를 진행하고, 이후 건조 후에 재분산하여도 콜로이드 안정성과 분산성이 일정한 것을 확인하였다(도 11 참고).Zeta potential before lyophilization is -19.1 ± 2.4 mV for
실험예Experimental Example 4. 4. 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트의Conjugate 항암성 시험 Anticancer test
실시예 2에 따른 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트에 대하여, 엠티티 리덕션 에세이(MTT reduction assay)로 아래와 같이 측정하여 항암성을 시험하였다.The low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugates according to Example 2 were tested as follows by an MTT reduction assay to test anticancer properties.
측정하고자 하는 96 웰 플레이트에 10 ml의 MTT 용액을 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 배양시킨 후 formazan위로 100 ml의 DMSO를 첨가한 후, Microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.10 ml of MTT solution was added to the 96 well plate to be measured, incubated for 1 hour at 37 ° C., and 100 ml of DMSO was added onto formazan, and the absorbance was measured at 450 nm with a microplate reader.
<계산식><Calculation Formula>
% 저해율 = 1-(시료의 흡광도- 대조군 흡광도)/표준 흡광도 ×100% Inhibition = 1- (sample absorbance-control absorbance) / standard absorbance × 100
실험예 4.1. 자궁암 세포에 대한 효과 및 흡수율 분석Experimental Example 4.1. Analysis of effect and absorption rate on uterine cancer cells
세포주로 자궁암 세포주인 헬라(humancervix adenocarcinoma cell line; HeLa), 배지는 RPMI1640 medium, 실험 방법은 Cell line: HT29 (0.5×105 cells/mL, 100 ml/96 well plate)/24시간 배양한 후 컨쥬게이트 제조시 DMTMM의 농도에 따른 시료(실시예 2의 DMTMM control, DMTMM 1/2, DMTMM 1/4, DMTMM 1/8)를 각각 SF media에 5mg/mL의 농도를 준비하여 분주하였다. 컨쥬게이트를 처리한 후 0h, 6h, 12h, 24h, 48h후에 상등액을 버리고, DPBS로 2회 세척한 다음, cck-8 (Dojindo co.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 확인하였고(40), uptake는 세척한 후, 1M HCl을 100배 희석하여 각 well 당 100 ul 처리 후, 270 nm에서 흡광도 측정하여 생존율을 확인하였다.Cell line: HeLa (humancervix adenocarcinoma cell line; HeLa), the medium is RPMI1640 medium, the experimental method Cell line: HT29 (0.5 × 10 5 cells / mL, 100 ml / 96 well plate) / conjugate after 24 hours Samples prepared according to the concentration of DMTMM (DMTM control of Example 2,
그 결과 도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이, DMTMM 3.125 umol(DMTMM 1/8)을 처리하여 제조된 컨쥬게이트는 자궁암 세포를 60% 이하로 사멸시켰으며, 24시간에 세포 당 1.8 ng 정도로 흡수도가 제일 높았다.As a result, as shown in Figs. 12 and 13, the conjugate prepared by treatment with 3.125 umol DMTMM (
실험예Experimental Example 4.1. 간암 세포에 대한 효과 및 흡수율 분석 4.1. Analysis of effect and absorption rate on liver cancer cells
세포주로 간암 세포주인 헵지2(liver hepatocellular carcinoma), 배지는 RPMI1640 medium, 실험 방법은 Cell line: HepG2 (0.5×105 cells/mL, 100 ml/96 웰 플레이트)/24시간 배양한 후 컨쥬게이트 제조시 DMTMM의 농도에 따른 시료(실시예 2의 DMTMM control, DMTMM 1/2, DMTMM 1/4, DMTMM 1/8)를 SF media에 5mg/mL의 농도를 준비하여 분주하였다.Hepatocellular carcinoma (liver hepatocellular carcinoma) as a cell line, RPMI1640 medium as a medium, Experimental method Cell line: HepG2 (0.5 × 10 5 cells / mL, 100 ml / 96 well plate) / conjugate preparation after 24 hours Samples according to the concentration of DMTMM (DMTMM control of Example 2,
컨쥬게이트를 처리한 후 0h, 6h, 12h, 24h, 48h후에 상등액을 버리고, DPBS로 2회 세척한 다음, cck-8(Dojindo co.,)를 이용하여 450 nm에서 흡광도 확인하였고, uptake는 세척한 후, 1M HCl을 100배 희석하여 각 웰 당 100 ul처리 후, 270 nm에서 흡광도 측정하여 생존율을 확인하였다.After treatment with the conjugate, the supernatant was discarded after 0h, 6h, 12h, 24h, and 48h, washed twice with DPBS, and then absorbed at 450 nm using cck-8 (Dojindo co.,). After that, 1 M HCl was diluted 100-fold and treated with 100 ul of each well, followed by absorbance measurement at 270 nm to confirm survival rate.
그 결과 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, DMTMM 3.125umol(DMTMM 1/8)을 처리하여 제조된 컨쥬게이트는 간암세포를 60% 이하로 사멸시켰으며, 24시간에 세포 당 1.6ng 정도로 흡수도가 제일 높았다.As a result, as shown in Figure 14 and 15, the conjugate prepared by treatment with DMTMM 3.125umol (
실험예Experimental Example 5. 5. 저분자량Low molecular weight 히알루론산-7,8 Hyaluronic acid-7,8 디하이드록시플라본Dihydroxyflavones 컨쥬게이트의Conjugate 콜라겐 합성 시험 Collagen Synthesis Test
콜라겐(type I, II, III, IV 및 V)들은 프로콜라겐이라는 전구물질의 형태로 합성된다. 프로콜라겐은 아미노 말단과 카복시 말단에 프로펩티드라는 펩티드 염기서열을 포함한다. 프로펩타이드의 기능은 소포체 내에서 프로콜라겐 분자의 접힘을 도와줌과 동시에 콜라겐 중합반응이 일어날 때 콜라겐 분자로부터 절단, 분리된다고 알려져 있다. 따라서 이에, 본 실험예에서는 실시예 2에 따른 컨쥬게이트에 대하여 프로펩타이드의 양을 측정함으로써, 세포 내에서의 콜라겐 생합성 정도를 파악하였다.Collagen (types I, II, III, IV and V) are synthesized in the form of precursors called procollagens. Procollagen includes peptide sequences called propeptides at the amino and carboxy termini. The function of the propeptide is known to assist in the folding of procollagen molecules in the endoplasmic reticulum and to be cleaved and separated from collagen molecules when collagen polymerization occurs. Therefore, in this experimental example, the degree of collagen biosynthesis in the cell was determined by measuring the amount of propeptide for the conjugate according to Example 2.
세포 타입은 에이치에스68(Hs68, humanforeskin fibroblast), DMEM media, 섬유아세포(Hs68)를 48-웰 플레이트에 웰당 5×104 개로 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubation24시간 배양하였다. 배지를 버리고 10% PBS(phosphate bufferedsaline)로 세척한 후 새로운 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 배양 웰의 상등액을 취하여 다카라사의 Procollagen type I peptide EIA kit(Takara Biomedical Co.)로 콜라겐 양을 측정하였다. 양성대조군으로는 항산화제인 아스코르빈산을 사용하였다.The cell type was H.68 (Hs68, humanforeskin fibroblast), DMEM media, fibroblasts (Hs68) in a 48-well plate was dispensed at 5 × 10 4 per well and then incubated at 37 ℃, 5% CO2 incubation for 24 hours. The medium was discarded and washed with 10% PBS (phosphate buffered saline), exchanged with fresh medium, and cultured for 24 hours. The supernatant of the culture well was taken and the amount of collagen was measured by Takara's Procollagen type I peptide EIA kit (Takara Biomedical Co.). Ascorbic acid was used as a positive control.
도 16에 나타난 바와 같이, 저분자량 히알루론산-7,8 디하이드록시플라본 컨쥬게이트는 양성대조군인 비타민C에 비해 35% 내지 15% 더 높은 콜라겐 합성을 유도하는 것을 확인하였다.As shown in FIG. 16, the low molecular weight hyaluronic acid-7,8 dihydroxyflavone conjugate was found to induce
Claims (21)
[화학식 1]
Hyaluronic acid-flavonoid conjugate, in which a hyaluronic acid having a molecular weight of 20 kDa to 80 kDa and a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the formula 1 are covalently bonded:
[Formula 1]
상기 히알루론산의 분자량이 45kDa 내지 55kDa인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
Hyaluronic acid-flavonoid conjugate, wherein the hyaluronic acid has a molecular weight of 45kDa to 55kDa.
상기 20kDa 내지 80kDa의 분자량을 갖는 히알루론산은 하기 화학식 2를 갖는 화합물인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트:
[화학식 2]
여기서, n은 105 내지 130의 정수이다.
The method of claim 1,
Hyaluronic acid having a molecular weight of 20kDa to 80kDa is a compound having the formula (2), hyaluronic acid-flavonoid conjugate:
[Formula 2]
Here, n is an integer of 105-130.
상기 히알루론산의 카르복실기와 상기 플라보노이드의 하이드록실기가 에스테르 결합을 형성함으로써 컨쥬게이션된, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트.
The method of claim 1,
A hyaluronic acid-flavonoid conjugate, wherein the carboxyl group of the hyaluronic acid and the hydroxyl group of the flavonoid are conjugated by forming an ester bond.
상기 컨쥬게이트는 하기 화학식 3을 갖는 화합물인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트:
[화학식 3]
여기서, n은 105 내지 130의 정수이다.
The method of claim 1,
The conjugate is a compound having the formula (3), hyaluronic acid-flavonoid conjugate:
[Formula 3]
Here, n is an integer of 105-130.
[화학식 1]
Nanoparticles comprising a hyaluronic acid-flavonoid conjugate in which covalently bonded hyaluronic acid having a molecular weight of 20 kDa to 80 kDa and a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the formula (1):
[Formula 1]
상기 나노입자의 평균 입경은 100nm 내지 200nm인, 나노입자.
The method of claim 7, wherein
The average particle diameter of the nanoparticles is 100nm to 200nm, nanoparticles.
상기 나노입자의 제타전위는 -20mV 내지 -40mV인, 나노입자.
The method of claim 7, wherein
Zeta potential of the nanoparticles is -20mV to -40mV, nanoparticles.
Hyaluronic acid-flavonoid conjugates according to any one of claims 1 and 3; And at least one of the nanoparticles according to any one of claims 7, 9 and 10 as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
Hyaluronic acid-flavonoid conjugates according to any one of claims 1 and 3; And at least one of the nanoparticles according to any one of claims 7, 9 and 10 as an active ingredient, cosmetic composition.
하기 화학식 1을 갖는 플라보노이드(7,8-디하이드록시플라본)를 메탄올, 아세트산, 아세톤, 디메틸포름아미드 및 디메틸 설폭사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유기용매에 용해시켜 제2 조성물을 준비하는 단계;
상기 제1 조성물에 디엠티엠엠(DMTMM; 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리니움 클로라이드)을 투입하고 교반시키는 단계; 및
상기 교반된 제1 조성물에 제2 조성물을 투입하여 히알루론산과 플라보노이드를 공유적으로 결합시키는 단계를 포함하는, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법:
[화학식 1]
Preparing a first composition by dissolving hyaluronic acid having a molecular weight of 20 kDa to 80 kDa in water;
To prepare a second composition by dissolving a flavonoid (7,8-dihydroxyflavone) having the formula (1) in any one organic solvent selected from the group consisting of methanol, acetic acid, acetone, dimethylformamide and dimethyl sulfoxide step;
Adding and stirring DMTM (DMTMM; 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride) to the first composition; And
Method of preparing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate comprising the step of covalently binding hyaluronic acid and flavonoids by injecting a second composition into the stirred first composition:
[Formula 1]
상기 히알루론산의 분자량이 45kDa 내지 55kDa인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법.
The method of claim 14,
A method for producing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate, wherein the hyaluronic acid has a molecular weight of 45 kDa to 55 kDa.
상기 20kDa 내지 80kDa의 분자량을 갖는 히알루론산은 하기 화학식 2를 갖는 화합물인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법:
[화학식 2]
여기서, n은 105 내지 130의 정수이다.
The method of claim 14,
Hyaluronic acid having a molecular weight of 20kDa to 80kDa is a compound having the formula (2), a method for producing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate:
[Formula 2]
Here, n is an integer of 105-130.
상기 히알루론산의 카르복실기와 상기 플라보노이드의 하이드록실기가 에스테르 결합을 형성함으로써 컨쥬게이션된, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법.
The method of claim 14,
A method for producing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate, wherein the carboxyl group of the hyaluronic acid and the hydroxyl group of the flavonoid are conjugated by forming an ester bond.
상기 디엠티엠엠은 상기 제1 조성물에 대하여 0.025 내지 0.2 g/L의 농도가 되도록 투입되는, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법.
The method of claim 14,
The DMMT is added to the concentration of 0.025 to 0.2 g / L with respect to the first composition, a method for producing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate.
수득된 컨쥬게이트를 동결 건조시키는 단계를 더 포함하는, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법.
The method of claim 14,
A method of producing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate further comprising the step of freeze drying the obtained conjugate.
상기 컨쥬게이트는 하기 화학식 3을 갖는 화합물인, 히알루론산-플라보노이드 컨쥬게이트의 제조방법:
[화학식 3]
여기서, n은 105 내지 130의 정수이다.The method of claim 14,
The conjugate is a compound having the formula (3), a method for preparing a hyaluronic acid-flavonoid conjugate:
[Formula 3]
Here, n is an integer of 105-130.
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