KR102075539B1 - 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 고등어 부산물, 비타민나무 열매, 물, 솔비톨, 인산나트륨, 감자전분, 베타글루칸을 포함하는 반려동물 사료 조성물 및 그 조성물을 포함하는 반려동물 사료의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법을 제공함으로써 고등어를 포함하는 종래의 사료에 비해 비린내 저감 효과가 있으며, 고등어 부산물의 활용도가 높고, 항산화 활성이 우수하여 유통기한이 증가하는 효과가 있다.
또한, 사료 내 조지방, 조단백질, 칼슘, 휘발성염기태질소, 크롬, 카드뮴, 비소, 납, 셀레늄, 수은, 및 살모넬라 함량이 모두 사료관리법에 적합하며, 일반세균, 대장균과 같은 미생물이 검출되지 않아 사료의 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

Description

고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법 {Animal feeds containing mackerel by-product and sea buckthorn fruit, and their preparation method}

본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 고등어 부산물, 비타민나무 열매, 물, 솔비톨, 인산나트륨, 감자전분, 베타글루칸을 포함하는 반려동물 사료 조성물 및 그 조성물을 포함하는 반려동물 사료의 제조방법에 관한 것이다.

대한민국은 삼면이 바다로 되어 있어 어류, 패류, 해조류와 같이 바다로부터 얻을 수 있는 자원이 풍부하여 바닷가 근처에서는 이러한 해양자원을 획득하여 생업에 종사하고 있다. 이러한 해양자원중에서 어류, 특히 생선은 예로부터 단백질 공급원 뿐만 아니라 사람에게 필요한 각종 영양성분을 많이 포함하고 있어 사람들에게 우수한 식품의 하나로써 자주 섭취되고 있다.

이러한 생선은 머리부분, 지느러미, 내장, 뼈 등의 부산물이 있는데, 이런 부산물들은 사람들이 섭취하기 곤란하므로 생선부산물이 없거나 감소된 생선의 수요가 증가하고 있으며 이로 인해 생선부산물은 대부분 따로 모아서 쓰레기로 버려져 폐기되는 양이 점차적으로 증가하고 있다.

국내 수산물 가공 중 어류 특히 생선의 가공에 대한 현재 수준은 단순히 생선을 절개하여 생선부산물과 어육살을 분리하여 어육살만 요리하여 섭취하고 나머지 부산물은 음식물쓰레기로 폐기되고 있는 실정이며, 특히 어육 내부에 존재하는 생선뼈, 가시 등에 대해서는 가공이 번거롭고 어려운 문제가 있다.

최근에는 이러한 부산물을 활용한 비료, 사료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히, 전 세계적으로 반려동물의 수가 급증함에 따라 반려동물의 사료에 이를 응용하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

이에 따라, '대한민국 공개특허 제10-2017-0081657호'는 육류 및 어류 부산물 외에 쌀, 옥수수 글루텐, 가금류 가루 부산물 등을 포함하는 기호성 건조 고양이 사료에 대하여 개시하고 있으나, 고양이의 기호성과 다이어트에 초점을 맞춘 사료 조성물을 제공하고 있으며, 부산물을 활용한다고 할 수 있을만큼의 양을 시료에 포함하고 있지 않고, 사료의 안전성에 대한 데이터가 부족하다는 문제점이 있다.

KR 10-2017-0081657 A KR 10-0650569 B1

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 해결하기 위하여 본 발명은,

고등어 부산물 50 - 90 중량%, 비타민나무 열매 1 - 40 중량%, 물 2 - 5 중량%, 솔비톨 1 - 3 중량%, 인산나트륨 1 -2 중량%, 감자전분 1 - 2 중량%, 및 베타글루칸 1 - 2 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료 조성물을 제공한다.

고등어 부산물은 어두, 어골, 지느러미, 내장, 어미, 및 등뼈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하며, 사료 조성물은 65 내지 99.9 %의 항산화활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 해결하기 위하여 본 발명은,

고등어 부산물을 분쇄하고 연화하는 단계;

상기 고등어 부산물에 물, 솔비톨, 인산나트륨, 감자전분, 및 베타글루칸을 넣고 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계;

상기 혼합물을 살균하는 단계; 및

상기 살균된 혼합물에 비타민나무 열매를 첨가하고 포장하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법을 제공함으로써 고등어를 포함하는 종래의 사료에 비해 비린내 저감 효과가 있으며, 고등어 부산물의 활용도가 높고, 항산화 활성이 우수하여 유통기한이 증가하는 효과가 있다.

또한, 사료 내 조지방, 조단백질, 칼슘, 휘발성염기태질소, 크롬, 카드뮴, 비소, 납, 셀레늄, 수은, 및 살모넬라 함량이 모두 사료관리법에 적합하며, 일반세균, 대장균과 같은 미생물이 검출되지 않아 사료의 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아임계수 추출기계 (supercritical water reaction; SWE)의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매 시료와 L-ascorbic acid의 SOD 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매 시료와 L-ascorbic acid의 DPPH 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매 시료와 L-ascorbic acid의 ABTS 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 및 L-ascorbic acid의 SOD 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 및 L-ascorbic acid의 DPPH 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예 및 일 비교예에 따른 아임계수 추출 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함하는 사료, 및 L-ascorbic acid의 ABTS 활성도를 나타낸 그래프이다.

본 명세서에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 그리고 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 명세서에서 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는한 복수형도 포함한다.

본 발명은 고등어 부산물과 비타민나무 열매를 포함하는 반려동물 사료 및 그 제조방법에 관한 것이다.

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

일측면에 다르면, 본 발명은 고등어 부산물 50 - 90 중량%, 비타민나무 열매 1 - 40 중량%, 물 2 - 5 중량%, 솔비톨 1 - 3 중량%, 인산나트륨 1 -2 중량%, 감자전분 1 - 2 중량%, 및 베타글루칸 1 - 2 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료 조성물을 제공한다.

고등어 부산물은 어두, 어골, 지느러미, 내장, 어미, 및 등뼈로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 50 내지 90 중량% 포함될 수 있다. 고등어 부산물이 50 중량% 미만 포함될 경우, 타우린 등의 영양성분의 함량이 줄어들 수 있으며, 90 중량%를 초과하여 포함될 경우, 사료 안정성이 떨어질 수 있다.

본 발명의 비타민나무 열매는 바람직하게는 아임계수 추출한 비타민나무 열매 가루일 수 있으며, 1 내지 40 중량% 포함될 수 있고, 바람직하게는 10 내지 40 중량% 포함될 수 있다. 비타민나무 열매가 1 중량% 미만 포함될 경우, 비타민나무 열매의 효능이 미미할 수 있으며, 40 중량%를 초과하여 포함될 경우, 고등어 부산물의 양이 줄어들어 영양분의 함량이 줄어들 수 있다.

비타민나무(Sea-Buckthorn)는 산자나무라고도 하며, Hippophae속 나무이다. 척박하고 추운 지방에서도 잘 자라며, 염분이 많은 바닷가에서도 자랄 수 있다. 그 열매는 주변에 가시가 많고 익을수록 수분함량이 많아 터지기 쉬우므로 주로 가루 형태로 많이 유통된다. 이러한 가루는 물, 우유, 두유, 요거트 등에 타서 마시거나, 다른 과일 주스에 섞어 마시기도 하며, 화장품의 원료 성분으로도 사용되기도 한다.

아임계수 추출기술(Subcritical Water Extraction; SWE)은 순수한 물만을 이용하는 추출 방법으로, 물의 물리화학적 성질인 상대 유전율을 변화시켜 극성에 다른 생리활성 물질을 선택적으로 잘 녹여내며, 농축 조작이 용이한 효과적인 기술이다. 온도 또는 압력 조절에 의해 간단하게 속성을 바꿀 수 있어 목적에 따라 유효성분 추출에 다양하게 이용할 수 있다. 아임계수 추출은 친환경 추출 기술로 유기용매를 전혀 사용하지 않으며, 메탄올, 에탄올과 같은 유기용매를 이용하는 추출법보다 매우 높은 효율과 빠른 추출 시간을 나타낼 수 있다.

본 발명의 반려동물 사료 조성물은 고등어 부산물 및 비타민나무 열매 외에 물 2 - 5 중량%, 솔비톨 1 - 3 중량%, 인산나트륨 1 -2 중량%, 감자전분 1 - 2 중량%, 및 베타글루칸 1 - 2 중량%를 포함할 수 있다. 물은 2 중량% 미만 포함될 시, 사료의 경도가 증가할 수 있으며, 5 중량%를 초과하여 포함될 시, 사료의 경도가 감소하여 묽어질 수 있다. 솔비톨은 단백질 변성을 방지하고, 사료의 감미와 습윤을 조정하기 위해 첨가할 수 있으며, 1 중량% 미만 포함될 시, 쉽게 변질될 수 있고, 3 중량%를 초과하여 포함될 시, 반려동물의 기호도가 저감될 수 있다. 인산나트륨은 pH 완충 기능을 하기 위하여 사료에 첨가할 수 있으며, 1 중량% 미만 포함될 시, 쉽게 변질될 수 있고, 2 중량%를 초과하여 포함될 시, 반려동물의 기호도가 저감될 수 있다. 또한, 감자전분은 1 중량% 미만 포함될 시, 점도가 감소할 수 있고, 2 중량%를 초과하여 포함될 시, 경도가 증가할 수 있다. 베타글루칸은 첨가량이 많을수록 면역력이 증가되는 효과를 나타낼 수 있으나, 특유의 냄새로 반려동물의 기호도가 저감될 수 있으므로 바람직하게 1 내지 2 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 65 내지 99.9 %의 항산화활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 일반 비타민나무 열매에 비하여 높은 항산화활성을 나타내는 아임계수 추출 과정을 거진 비타민나무 열매와 고등어 부산물이 포함되어 형성된 사료 조성물로서, 65 내지 99.9 %의 높은 항산화활성을 나타낼 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 고등어 부산물을 분쇄하고 연화하는 단계; 상기 고등어 부산물에 물, 솔비톨, 인산나트륨, 감자전분, 및 베타글루칸을 넣고 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 상기 혼합물을 살균하는 단계; 및 상기 살균된 혼합물에 비타민나무 열매를 첨가하고 포장하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료 제조방법을 제공한다.

본 발명의 반려동물 사료 제조방법에서 고등어 부산물에 물, 솔비톨, 인산나트륨, 감자전분, 베타글루칸, 및 비타민나무 열매에 대한 설명은 본 발명의 반려동물 사료 조성물에 대하여 상술한 설명과 동일 또는 유사하므로, 생략하기로 한다.

하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

<실시예>

실시예 1 - 고등어 부산물 (어두, 내장, 등뼈, 어미) 사료 제조

고등어 원물을 필렛팅 한 후, 필렛을 제거하고 어두, 내장, 등뼈 및 어미를 포함한 부산물을 분쇄한 다음, autoclave(HB-506)에서 80분간 90℃ 조건으로 뼈 연화 과정을 거쳤다. 이 후 분쇄한 부산물 90.0 중량%, 물 3.0 중량%, 감자전분 1.8 중량%, 인산나트륨 1.5 중량%, 솔비톨 2.0 중량%, 소금 1.0 중량%, 및 베타 글루칸 0.7 중량%를 혼합하여 플라스틱 용기에 포장한 후 레토르트 살균기(PRS-06-I)에서 5분간 121℃ 조건으로 살균하여 사료를 제조하였다.

실시예 2 - 아임계수 추출시간에 따른 비타민나무 열매 시료 제조

비타민나무 열매 시료는 도 1에 도시한 아임계수 추출기계 (supercritical water reaction; SWE)를 이용하여 제조하였다. Hastselloy C-276으로 만들어진 부피 300 cm³의 회분식 반응기에 비타민나무 열매 가루 2 g 및 증류수 200 ㎖에 넣고 혼합하여 반응기에 장착된 온도 조절기를 이용하여 처리온도를 200℃로 설정한 후, 반응시간을 각각 0, 5, 10, 20, 30, 및 40분으로 하고 반응이 끝난 다음 시료를 꺼내어 아임계수 추출시간에 따른 비타민나무 열매 시료 제조하였다.

실시예 3 - 고등어 부산물 (어두, 내장, 등뼈, 어미) 및 아임계수 추출한 비타민나무 열매를 포함하는 사료 제조

고등어 원물을 필렛팅 한 후, 필렛을 제거하고 어두, 내장, 등뼈 및 어미를 포함한 부산물을 분쇄한 다음, autoclave(HB-506)에서 80분간 90℃ 조건으로 뼈 연화 과정을 거쳤다. 이 후 분쇄한 부산물 50.0 내지 80.0 중량%, 20 분간 아임계수 추출한 비타민나무 열매 가루 10 내지 40 중량%, 물 3.5 중량%, 인산나트륨 1.5 중량%, 솔비톨 2.0 중량%, 및 베타 글루칸 1.5 중량%를 혼합하여 플라스틱 용기에 포장한 후 레토르트 살균기(PRS-06-I)에서 5분간 121℃ 조건으로 살균하여 고등어 부산물과 아임계수 추출한 비타민나무 열매의 중량%를 달리한 사료를 제조하였다.

비교예 1 - L-ascorbic acid 시료 제조

상기 실시예 2의 아임계수 추출 시간에 다른 비타민나무 열매 시료 및 실시예 3의 사료와 항산화활성을 비교하기 위하여 높은 항산화활성을 나타내는 L-ascorbic acid를 증류수에 혼합하여 100 ㎍/㎖(SOD), 0.25 ㎍/㎖(DPPH), 및 10 ㎍/㎖(ABTS) 농도로 제조하였다.

비교예 2 - 고등어 부산물 (어두, 내장, 등뼈, 어미) 및 아임계수 추출하지 않은 비타민나무 열매를 포함하는 사료 제조

고등어 원물을 필렛팅 한 후, 필렛을 제거하고 어두, 내장, 등뼈 및 어미를 포함한 부산물을 분쇄한 다음, autoclave(HB-506)에서 80분간 90℃ 조건으로 뼈 연화 과정을 거쳤다. 이 후 분쇄한 부산물 50.0 내지 80.0 중량%, 비타민나무 열매 가루 10 내지 40 중량%, 물 3.5 중량%, 인산나트륨 1.5 중량%, 솔비톨 2.0 중량%, 및 베타 글루칸 1.5 중량%를 혼합하여 플라스틱 용기에 포장한 후 레토르트 살균기(PRS-06-I)에서 5분간 121℃ 조건으로 살균하여 고등어 부산물과 아임계수 추출하지 않은 비타민나무 열매의 중량%를 달리한 사료를 제조하였다.

<실험예>

실험예 1 - 시료 및 사료 품질분석

고등어 부산물 시료 및 상기 실시예 1에 따른 사료의 품질을 하기 실험예 1-1 내지 실험예 1-5에 따라 분석하였다.

실험예 1-1 - 일반세균수 측정방법

식품공전 3.3제조법에 따라 고등어 부산물 시료 및 상기 실시예 1에 따른 사료의 일반세균수를 측정하였다.

시험검체 10 g과 각 10배 단계 희석액 1 ㎖를 3M 건조필름배지에 각 2매씩 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1℃에서 48±2시간 배양한 후 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수를 산출하였다.

실험예 1-2 - 대장균 및 대장균군수 측정방법

시험검체 10 g과 각 10배 단계 희석액 1 ㎖를 각 2매씩 대장균 및 대장균군 건조필름배지에 접종한 후 35℃에서 24시간 배양하였다. 이후 배지에 생성된 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군수를 산출하였다.

실험예 1-3 - 휘발성 염기질소 측정방법(미량확산(Conway)법)

어육은 부분적으로 품질이나 조성이 다르기 때문에 전체를 대표할 수 있는 검체를 얻기 어려우므로 검체는 부위를 달리하는 여러 곳에서 취하여야 하고 가능한 한 육질부분을 취하여야 한다.

고등어 부산물 및 상기 실시예 1에 따른 사료 각각의 검체의 크기 또는 수량에 따라 임의로 3~5개소로부터 각각 20~50 g씩을 취하여 이를 잘게 썰어 잘 섞어준 후 10 g(W)씩 비이커에 담았다. 이후 증류수 50 ㎖를 넣고 잘 저어 섞어 30분간 침출하고 여과한 후 여과액을 황산(5%)으로 중화시킨 후 증류수를 넣어 시험용액을 제조하였다.

지름 35 mm의 내실과 지름 61 mm의 외실로 내부가 구성되어 있으며, 기밀성이 유지된 확산기를 기울여 놓고 외실의 아래족에 피펫을 이용하여 시험용액 1.00 ㎖를 분주하고 내실에 0.01N 황산 1.00 ㎖를 같은 방법으로 분주하여 넣었다. 이후 확산기의 덮개의 갈아 맞추는 부분에 기밀제인 글리세린을 고루 바른 다음 탄산칼륨 포화용액(1.2 g/㎖) 약 1 ㎖를 외실의 위쪽에 넣고 즉시 덮개를 덮어 클립으로 고정하고 확산기를 전후좌우로 기울이면서 회전하여 외실 내의 시험용액과 탄산칼륨 포화용액을 잘 섞었다. 이때 외실의 용액과 내실의 용액이 섞이지 않도록 주의하여 혼합하였으며, 혼합 후 25℃에서 1시간 정치하였다. (20℃에서는 120분, 16℃에서는 140분, 10℃에서는 160분 이상 정치하여 시험함)

정치 후 확산기의 덮개를 열고 내실의 황산용액에 Brunswik시액 한방울을 넣은 후 0.01N 수산화나트륨용액을 마이크로뷰렛으로 적정하여 그 2회 평균치(a ㎖)를 구하며, 시험용액 대신 증류수를 써서 같은 방법으로 공시험을 하여 그 2회 평균치(b ㎖)를 구하여 하기 계산식 1에 따라 휘발성염기질소를 계산하였다.

[계산식 1]

휘발성염기질소(mg/%) = 0.14 × [(b-a)×f/W] × 100 × d

상기 W는 검체채취량(g)을 의미하며, 상기 f는 0.01N-NaOH의 역가, d는 희석배수를 의미한다.

실험예 1-4 - pH 측정

시험 검체 10 g에 증류수 90 ㎖을 넣은 후 Homogenizer를 이용하여 균질화 (15,000 rpm, 10 min)한 후 균질화 된 시료를 대상으로 pH meter(S20 SevenEasy™)기를 이용하여 pH를 측정하였다.

실험예 1-5 - TBARS 측정

시험 검체 5 g에 시약 20 % trichloroacetic acid(TCA) in 2M phosphoric acid 12.5 ㎖을 첨가한 후 균질기 SCILABTISTM SHG-15D를 이용하여 14,000 rpm, 1분간 균질화한 용액을 메스실린더에 옮긴 후 증류수 5 ㎖로 균질기를 씻어 메스실린더에 합친 뒤 증류수를 이용하여 총 25 ㎖되도록 맞추었다. 이후 원심분리기(centrifuge FLETA 5)를 이용하여 4℃에서 1500 rpm으로 15분간 분리하고 여과한 후 여과액 2 ㎖에 0.005M thiobarbituric acid (TBA) 용액 2 ㎖을 넣어 혼합하고 95℃ 항온수조에서 30분간 가열하여 식힌 후 SPECTROstar nano을 이용하여 파장 530 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 계산식 2에 따라 TBARS를 계산하였다.

[계산식 2]

TBARS (MDAmg/kg) = (샘플흡광도 - Blank) × 5.2

실험예 2 - 분쇄조건 및 어골 연화조건에 따른 조직감 측정방법

어두, 내장, 등뼈, 및 어미를 포함하는 고등어 부산물의 분쇄조건 및 어골 연화조건에 따른 조직감을 측정하고 가장 적합한 조건을 적용하여 상기 실시예 1에 따른 사료의 조직감을 측정하였다.

실험예 2-1 - 분쇄조건 확립 시험

어두(어골), 등뼈 등이 함유된 고등어 부산물로 반려동물 식이에 안전한 사료 제조하기 위하여 분쇄기의 분쇄 조건을 확립하는 실험을 실시하였다.

고등어 부산물을 분쇄기(덕산식품기계, 습식겸용 분쇄기 (고급형))에 넣고, 분쇄기의 스피드를 0, 25, 50, 75로 하여 분쇄한 후 조직감을 측정하였다.

조직감은 Texture Analyser(CT3, 4500, Brookfield, USA)를 이용하고 TA4/1000 probe를 사용하였으며, T.P.A(texture profile anaysis)로 지정하였다. distance를 5.0 mm로 설정한 후, 경도(hardness), 점착성(adhesiveness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 점성(gumminess), 및 씹힘성(chewiness)을 측정하였다.

실험예 2-2 - 어골 연화조건 시험 및 살균시험

고등어 부산물의 어골 연화 조건을 확립하고 고온 고압으로 살균을 하여 반려동물의 사료로서 미생물에 의한 변패 방지가능성과 물리적 안전성을 확인하기 위한 실험을 실시하였다.

사료관리법상 동물성단백질류는 배합 전 90℃에서 60분 이상 열처리해야한다는 점을 감안하여 90℃에서 autoclave(한백과학, HB-506)를 이용한 시료의 처리시간을 60, 70, 80분으로 한 후 조직감을 측정하였다.

조직감은 Texture Analyser(CT3, 4500, Brookfield, USA)를 이용하고 TA4/1000 probe를 사용하였으며, T.P.A(texture profile anaysis)로 지정하였다. distance를 5.0 mm로 설정한 후, 경도(hardness), 점착성(adhesiveness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 점성(gumminess), 및 씹힘성(chewiness)을 측정하였다.

또한, 90℃에서 autoclave(한백과학, HB-506)를 이용한 시료의 처리 후 처리시간에 따른 일반세균수를 시험예 1-1의 방법에 따라 측정하였다.

실험예 3 - 사료 성분분석

사료관리법 기준상 적합 여부를 판단하기 위하여 상기 실시예 1에 다른 사료 성분을 하기 실험예 3-1 내지 실험예 3-13에 따라 분석하였다.

실험예 3-1 - 수분 측정

미리 항량으로 달한 대형 칭량병에 일정량의 시료를 달아 60～80℃의 건조기내에서 48시간 예비 건조한 다음, 상온에서 24시간 방치하여 원물(풍건물)의 수분함량을 구한 후 분쇄하여 ,다시 분쇄된 시료를 가루상태의 시료와 동일한 방법으로 수분을 정량한 후 하기 계산식 3에 따라 수분함량을 구하였다.

[계산식 3]

W = W₁ + [(100 - W₁) × W₂] / 100

상기 W는 원물의 수분함량(%)이고, W₁은 예비건조시의 감량(%)이며, W₂는 풍건물 공시품의 수분함량(%)을 의미한다.

실험예 3-2 - 조회분 측정

600℃ 전기로에서 1～2시간 태운 크루시블을 데시케이터내에서 40분간 방냉 후 칭량한 다음 시료 2～3 g을 취하여 전기곤로 또는 가스버너로 열을 가하여 예비 회화시킨 후 600℃ 전기로에 넣어 2시간 태운 다음 데시케이터내에서 40분간 방냉 후 칭량하여 이 중량으로부터 크루시블의 중량을 감(減)한 것을 조회분 함량으로 하였으며, 하기 계산식 4에 따라 그 함량을 구하였다.

[계산식 4]

조회분(%) = [회화 후 무게(시료＋크루시블) - 크루시블 무게] / 시료중량(g) × 100

실험예 3-3 - 조지방 측정

지방 정량병을 95～100℃에서 2시간 정도 건조하고 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 칭량(秤量)하고 시료 2～3 g을 No.2 여과지에 싸서 95～100℃에서 2시간 건조시켰다. 이후 지방추출장치에 넣고 에테르를 부어 80℃로 가열하여 8시간 지방을 추출한 다음 에테르를 회수하고 지방 정량병을 95～100℃에서 3시간 건조 후 데시케이터 내에서 40분간 방냉한 후 칭량하여 지방 정량병의 중량을 감(減)한 것을 시료량에 대한 백분율을 구하여 하기 계산식 5에 따라 조지방 함량을 계산하였다.

[계산식 5]

조지방(%) = (추출후 지방 정량병중량 - 추출전 지방 정량병중량) / 시료중량 × 100

실험예 3-4 - 조단백질 측정

농염산(비중 1.18) 8.7 ㎖를 1000 ㎖ 메스플라스크에 넣고 남은 눈금까지 증류수를 넣어 혼합하여 0.1N 염산용액(HCl)을 제조하였고, 황산칼륨(Potassium sulfate) 9 g에 황산동(Copper sulfate) 1 g의 비율로 유발(乳鉢)에서 완전히 혼합하여 분해촉진제를 제조하였으며, 수산화나트륨 500 g과 치오황산나트륨(Sodium thiosulfate) 100 g을 증류수 1000 ㎖에 녹여 수산화나트륨(Sodium hydroxide) 혼합액을 제조하였다. 또한, 브로모크레졸그린(Bromocresol green) 0.5 g과 메틸레드(Methyl red) 0.1 g을 95 %이상의 에탄올(Ethanol) 300 ㎖에 용해하여 지시약을 만들었으며, 붕산 40 g을 증류수에 용해하여 1,000 ㎖로 만든 후 라)의 지시약 4 ㎖를 가하여 혼합하여 4 % 붕산(Boric acid)용액을 제조하였다.

시료 0.5～1 g을 500 ㎖ 분해 플라스크에 취하고 분해촉진제 7～8 g(10 g)을 가하여 잘 혼합한 후 H₂SO₄ 10 ㎖를 서서히 가해서 잘 혼합하였다. 이를 처음에는 거품이 넘치지 않도록 서서히 가열하다가 거품이 나지 않으면 투명하게 될 때까지 강하게 가열하여 50분 내지 90분간 분해시켰다. 이후 300 ㎖ 삼각플라스크에 4 %붕산용액 25～75 ㎖(21～63% 조단백질에 해당)를 취하고 지시약 2～3방울을 가하여 냉각기의 관 끝이 붕산용액에 잠기도록 받쳐 놓는다. 그 다음 냉각된 분해액에 증류수 200 ㎖와 아연립(亞鉛粒) 2～3개를 넣고 수산화나트륨 혼합액 45 ㎖를 가한 다음 즉시 증류장치에 연결하고 서서히 가열하여 증류하는데 분해액의 양이 약 2/3로 줄어들거나 증류액이 120～150 ㎖ 될 때까지 증류하여 받은 액을 적정하였다. 증류하여 받은 액을 0.1N-염산용액으로 적정하면 종말점(end point)부근에서 무색으로 변하며 이때 1～2방울 더 가하여 적갈색으로 변할 때의 0.1N 염산용액 소비 ㎖수를 측정하여 하기 계산식 6에 따라 조단백질을 구하였다.

[계산식 6]

조단백질(%) = 0.00140067 × T × F × 6.25 × 100/W

상기 0.00140067은 0.1N 염산용액 1 ㎖가 해당하는 질소(N)의 g을 의미하며, T는 0.1N 염산용액 적정치(㎖) 즉, Blank 적정치를 의미하고, F는 0.1N 염산용액의 Factor, W는 시료무게(g)를 의미한다.

실험예 3-5 - 조섬유 측정

농황산(비중1.84) 27.2 ㎖를 증류수에 희석하여 1,000 ㎖로 하여 5 % 황산액(H₂SO₄, w/v)을 제조하였으며, 수산화나트륨 50 g을 증류수에 용해하여 1,000 ㎖로 하여 5 % 수산화나트륨액(NaOH, w/v)을 제조하였다.

시료 1～2 g(지방함량이 많은 것은 탈지하거나 조지방을 정량한 후 남은 찌꺼기 시료 잔사를 사용)을 500 ㎖ 톨비이커에 취하고 5 % 황산액 50 ㎖와 증류수 150 ㎖를 가하고 거품방지제 2～3방울 떨어뜨린 다음 30분간 끓인 후 스텐레스 금망(0.044㎜)으로 여과하여 잔사(殘渣)를 산성이 완전히 없어질 때까지 뜨거운 증류수로 여러 번 세척하였다. 산 불용해물은 증류수 130～140 ㎖로 톨비이커에 씻어 넣고 5 % 수산화나트륨용액 50 ㎖를 가한 다음 200 ㎖ 표선까지 증류수로 채웠으며, 다시 30분간 끓이고 No.5A 여과지 또는 유리여과기 1G2(135℃에서 2시간 건조하여 항량을 구한 것)로 여과하는데 알카리성이 없어질 때까지 뜨거운 증류수로 세척한 다음 다시 95 % 에틸알콜로 3회, 에틸에테르로 2회 세척하였다. 이후 95～100 ℃에서 2시간 예비 건조하고 135±2℃에서 2시간 건조 후 데시케이터내에서 30분간 방냉한 다음 칭량 후 5A 여과지에 사용시에는 자제크루시블(600℃ 전기로에서 2시간 태워 항량을 구한 것)에 넣고, 유리여과기의 경우 직접 전기로에 넣어 600℃에서 2시간 회화하고 40분간 데시케이터내에서 방냉한 후 무게를 측정하였다. 이후 하기 계산식 7에 따라 조섬유을 구하였다.

[계산식 7]

조섬유(%) = (d - a) / s × 100

상기 d는 분해후 여과한 잔사의 건조중량(g)이고, a는 잔사를 회화한 후 남은 회분량(g)이며, s는 공시료의 중량(g)이다.

실험예 3-6 - 칼슘 측정

시료 2～5 g를 자제 크루시블에 취하고 열판에서 예비회화시킨 후 전기로 600℃에서 2시간 이상(회백색) 회화시킨 뒤 방냉하고 염산용액(1:1) 10 ㎖를 가하여 하룻밤 방치 용해시킨 다음 No.6 여과지를 이용 뜨거운 물로 여과하여 일정량으로 맞춰 시료액을 제조하였다.

시료액 일정량을 50 ㎖ 메스플라스크에 취하고 5 % 란타늄용액 10 ㎖를 넣고(용액중 란타늄 함량이 1% 되도록 함), 다시 염산용액(1:1) 1 ㎖를 가하고 증류수로 표선을 맞추었으며, 미리 30분간 예열한 원자흡광광도계 파장 422.7 ㎚에서 흡광도를 측정하였다 이후 칼슘표준용액을 0, 2, 4, 6, 8, 10 ppm이 되도록 50 ㎖ 메스플라스크에 취한 다음 여기에 란타늄 용액 10 ㎖를 각각 넣고 증류수로 표선까지 채워 흡광도를 측정하고 표준곡선(검량곡선)을 작성하였다. 이후 하기 계산식 8에 따라 칼슘 함량 %를 구하였다.

[계산식 8]

칼슘(%) = (시료액의흡광도 / 1ppm 기준흡광도×희석배수) / (시료중량(g) × 10⁶) × 100

실험예 3-7 - 인 측정

암모늄몰리브데이트(Ammonium molybdate) 25 g을 증류수에 녹인 수용액 400 ㎖ 와 암모늄메타바나데이트(Ammonium metavanadate) 1.25 g을 증류수 300 ㎖에 용해하고 질산 250 ㎖를 가한 후 냉각한 수용액을 혼합하여 1,000 ㎖까지 증류수로 추가하여 발색제를 제조하였다.

또한, 105℃에서 1시간 건조 후 데시케이터에서 방냉한 제1인산칼륨(Potassium-phosphate, monobasic) 2.195 g을 1,000 ㎖의 메스플라스크에 넣고 증류수로 용해하여 이 눈금을 맞춘 500 ppm의 표준용액을 10배 희석하여 50 ppm의 표준액을 만든 후, 측정시 0, 2, 4, 6, 8, 10 ppm으로 만들어 인(P)표준용액으로 사용하였다.

시료액은 상기 실험예 3-6과 동일하게 조제하였으며, 25 ㎖ 메스플라스크에 시료액 1～20 ㎖(인 함량에 따라)를 취하고 발색제 2.5 ㎖(용기 의1/10)를 가한 다음 증류수로 표선을 맞춘 후 혼합하고 15분간 방치 후 파장 470 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 표준액도 같은 방법으로 실험을 실시하였다. 이후 하기 계산식 9에 따라 인 함량 %를 구하였다.

[계산식 9]

인 (%) = (시료액의흡광도 / 1ppm 기준흡광도×희석배수) / (시료중량(g) × 10⁶) × 100

실험예 3-8 - 휘발성염기태질소 측정

시료 5～10 g을 250 ㎖ 메스플라스크에 정확히 취하고 증류수 200 ㎖를 가하여 30분간 진탕 후 표준선까지 증류수로 채우고 No. 5A 여과지로 여과하였다. 이때 여과가 잘 안되면 3000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 시료액으로 사용하였다.

시료액 50 ㎖를 분해플라스크에 정확히 취하여 산화마그네슘 2 g, 액체파라핀 0.5 g 및 증류수 50 ㎖를 가하고 조단백질 정량법에 준하여 증류 및 적정을 행하여 질소량을 산출하였으며, 하기 계산식 10에 따라 휘발성염기태질소를 구하였다.

[계산식 10]

휘발성염기태질소(%) = (0.140067×A×5×F) / 시료무게(g)

상기 A는 0.1N - 염산용액의 소모량(㎖)이고, F는 0.1N - 염산용액의 factor이며, 5는 희석배수를 의미한다.

실험예 3-9 - 크롬 측정

시료 2～5 g을 자제 크루시블에 취하고 열판에서 예비회화시킨 후 전기로 600℃에서 2시간 이상(회백색) 회화시킨 뒤 방냉하고 염산용액(1:1) 10 ㎖를 가하여 하룻밤 방치 용해시킨 다음 No.6 여과지를 이용 뜨거운 물로 여과하여 일정량으로 맞춰 시료액으로 사용하였다.

시료액 20～30 ㎖(크롬으로 50 ㎍이하)를 50 ㎖ 메스플라스크에 취하고 황산(1:6) 2 ㎖, 디페닐 카르바지드 용액 1 ㎖를 가하고 표선까지 증류수로 채우고 혼합하여 30분간 방치한 후 공시험액을 대조액으로 하여 파장 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 따로 표준용액을 측정하여 검량선을 작성하였다. 이후 하기 계산식 11에 따라 크롬의 농도를 구하였다.

[계산식 11]

크롬(ppm) = (시료액의흡광도 / 1ppm 기준 흡광도×희석배수) /시료중량(g)

실험예 3-10 - 카드뮴, 비소, 납 측정

시료 5～20 g을 분해플라스크에 취해 물 50～70 ㎖, 질산 10～40 ㎖를 넣고 혼합하여 방치하였으며, 조용히 가열하여 격렬한 반응이 그치면 식힌 다음 황산 5～20 ㎖를 넣고 다시 가열하였다. 이후 내용물이 암색이 되기 시작하면 질산 2～3 ㎖씩을 추가하면서 가열을 계속하여 내용물이 미황색～무색이 되었을 때 분해가 끝난 것으로 간주하였으며, 분해액을 식힌 후 물 30～50 ㎖, 포화수산암모늄용액 10～25 ㎖를 가해서 황산의 흰 연기가 발생할 때까지 가열하고 식힌 다음 물로 일정량으로 하여 시험용액으로 하였다. 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보정하였다. 이러한 황산-질산법에 의해 시험용액을 제조하였다.

아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 플라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 또는 질량값을 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법을 이용하여 표준용액과 시험용액 및 공시험용액을 ICP(유도결합플라즈마)에 주입하여 시험용액의 농도를 구하였다.

실험예 3-11 - 셀레늄 측정

셀레늄 0.5g을 톨비이커에 넣고 초산 10 ㎖를 가해 수욕조에서 가열 용해하였다. 이후 과연소산 2 ㎖를 가하고 가열하면서 약 2 ㎖ 정도가 될 때까지 농축하고 염산 5 ㎖를 가하여 5분간 가열하였으며, 방냉 후 증류수로 500 ㎖ 메스플라스크에 옮겨 담고, 표선까지 증류수를 가하여 셀레늄 표준원액을 조제하였다. 그리고 사용시, 표준원액의 일정량을 염산:증류수 (1:100)으로 정확히 희석하고 1 ㎖ 중에 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 ㎍을 함유하는 각 셀레늄 표준액을 제조하였다.

2,3-디아미노나프탈렌 0.1 g을 200 ㎖ 톨비이커에 넣고 염산:증류수(1:100)을 가하고 50℃ 수욕조에서 가온하면서 용해하였다. 방냉 후 이 액을 분액여두 A에 넣고 시클로핵산 40 ㎖를 가하여 진탕하였으며, 수층(하층)을 분액여두 B에 넣고 시클로헥산 40 ㎖를 가하여 진탕하고 수층을 No. 2S여과지로 여과하여 디아미노나프탈렌액을 제조하였다.

또한, 분석시료 2 g을 정확히 칭량하여 200 ㎖의 톨비이커에 넣고 질산 20 ㎖ 및 과염소산 5 ㎖를 가하여 시계접시를 덮고 하룻밤 방치한 후 가열교반기에서 서서히 가열하다 거품이 사라지면 온도를 높여 건고 직전까지 농축하였으며, 방냉 후, 염산 5 ㎖를 가하고 5분간 가열하여 환원시켰다. 다시 방냉 후 증류수로 100 ㎖의 메스플라스크에 옮기고 표선까지 증류수를 가하여 시료액을 제조하였으며, 시료를 넣지 않고 조제한 것을 blank로 하였다.

시료액의 일정량을 100 ㎖의 톨비이커에 정확히 넣고 EDTA 용액 5 ㎖를 가하여 pH를 염산:증류수(1:4)로 1.0～1.5로 조정한 다음, 염산:증류수(1:100)로 100 ㎖의 분액여두에 옮겨 담았다. 이후 시클로헥산 10 ㎖를 정확히 가하고 5분간 진탕하고 방치한 후 수층(하층)을 버리고 잔류액을 염산:증류수(1:100) 25 ㎖씩 2회 진탕 세정하였다. 시클로핵산층(상층)을 시험관에 옮겨담고, 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 후 No.2S여과지로 여과하여 시료액으로 하였으며, blank용액 및 각 셀레늄 표준액을 동일하게 조제하였다. blank용액을 대조액으로 하고 시료용액에 대하여 여기파장 378 ㎚ 및 형광파장 520 ㎚로 형광광도를 측정하여 셀레늄의 농도를 구하였다.

실험예 3-12 - 수은 측정

산화알루미늄을 750℃ 전기로에서 2시간이상 가열 처리한 다음 데시케이터내에서 공기 중 수은이 오염되지 않도록 하여 방냉시켰으며, 수산화칼슘 및 탄산나트륨시약을 1:1 무게비율로 혼합하여 잘 섞고 적당량을 750℃ 전기로에서 2시간 이상 가열 처리한 다음 데시케이터내에서 공기중 수은이 오염되지 않도록 방냉하였다.

고체 시료의 경우, 750℃ 전기로에서 보트에 상기 수산화칼슘 및 탄산나트륨 혼합 시약을 깔고 그 위에 0.1 g의 시료를 취하여 깐 다음 다시 수산화칼슘 및 탄산나트륨 혼합 시약으로 덮고 그 위에 상기 산화알루미늄을 깔아 그 위를 수산화칼슘 및 탄산나트륨 혼합 시약으로 덮었다.

액체 시료의 경우, 상기와 동일한 처리를 한 보트에 산화알루미늄을 깔고 그 위에 액체 시료를 100 내지 1000 ㎕ 취한 다음 다시 산화알루미늄을 덮고 그 위를 수산화칼슘 및 탄산나트륨 혼합 시약으로 덮었다.

수은전용분석기(Mercury atomizer)의 글라스 캡을 열고, 시료 처리보트를 밀어 넣어 캡을 닫은 다음 작동 스위치를 누르고, 측정량을 ng으로 기록하였으며, 하기 계산식 12에 따라 수은량을 구하였다.

[계산식 12]

수은량(ppm) = 시료 측정량(ng) / 시료량(㎎)

실험예 3-13 - 살모넬라 측정

시료 25 g을 취하여 225 ㎖의 펩톤수(Beffered peptone water)에 가한 후 35~37℃ 에서 24±2시간 동안 1차증균배양하였으며, 1차증균배양액 0.1 ㎖를 취하여 10 ㎖의 Rappaport-Vassiliadis broth에 접종하여 42±1℃에서 24±2시간 배양하고, 1차증균배양액 1 ㎖를 취하여 10 ㎖의 Tetrathionate Broth에 접종하여 36±1℃에서 24±2시간 배양하여 2차증균배양을 실시하였다.

또한, 각각의 2차증균배양액을 1~2 백금이를 이용하여 MacConkey agar, SS(Salmonella&Shigella) agar, Desoxycholate Citrate agar, XLD agar, Bismuth Sulfite agar 또는 Brilliant Green Sulfa (BG Sulfa) Agar 중 2개를 선택한 후 도말하여 35~37℃에서 24±2시간 배양한 후 집락을 관찰하였으며, 이때 살모넬라 의심 집락은 확인시험을 실시하였다.

살모넬라로 의심되는 집락을 보통한천배지에 옮겨 35~37℃에서 18~24시간 배양한 후, TSI 사면배지의 사면과 고층부에 접종하고 35~37℃에서 18~24시간 배양하여 생물학적 성상을 검사하였으며, 유당, 서당 비분해(사면부 적색), 가스생성(균열 확인) 양성이면 생화학 검사를 실시하여 살모넬라 집락임을 확인하였다.

실험예 4 - 항산화활성 측정방법

상기 실시예 및 비교예에 따른 아임계수 추출 시간에 따른 비타민나무 열매 가루 및 사료의 항산화활성을 비교하기 위하여 하기 실험예 4-1 내지 실험예 4-3에 따라 항산화활성을 측정하였다.

실험예 4-1 - SOD 측정방법

WST 500 tests 키트를 사용하여 SOD(superoxide dismutase) 활성도를 측정하였으며, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 96well plate에 각각의 샘플과 대조군을 분주하여 실험을 진행하였다.

	S	SC	SB	CB
	샘플	샘플control	샘플blank	control blank
샘플 solution	20 ㎕	-	20 ㎕	-
ddH 2 O (2차증류수)	-	20 ㎕	-	20 ㎕
WST working solution	200 ㎕	200 ㎕	200 ㎕	200 ㎕
Dilution buffer	-	-	20 ㎕	20 ㎕
Enzyme working solution	20 ㎕	20 ㎕	-	-

WST working solution은 팔콘튜브에 WST solution 1 ㎖와 Buffer solution 19 ㎖을 넣고 혼합하여 제조하였으며, Enzyme working solution은 enzyme solution tube를 5초간 원심분리한 후 피펫으로 잘 섞고 Dilution buffer 2.5 ㎖와 Enzyme solution 15 ㎕를 분주하여 피펫으로 잘 혼합하여 제조하였다.

멀티피펫으로 DW 250 ㎕씩 96well plate 테두리에 피펫팅 하였으며, 샘플 solution 20 ㎕을 샘플과 샘플blank well에 넣고, 2차 증류수 20 ㎕ 샘플control과 control blank well에 넣었다. 이후 WST working solution 200 ㎕를 모든 well에 넣고 피펫팅으로 잘 섞고, Dilution buffer 20 ㎕를 샘플blank와 control blank well에 넣고 피펫팅으로 잘 섞었으며, Enzyme working solution 20 ㎕을 샘플과 샘플 control well에 넣고 피펫팅으로 잘 섞었다. 이후 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도 값을 이용하여 하기 계산식 13에 따라 SOD 활성을 구하였다.

[계산식 13]

SOD activity(Inhibition rate%) = [(A_{샘플contro1} - A_{control blank}) - (A_샘플 - A_샘플blank)] / (A_{샘플control} - A_{control blank}) × 100

실험예 4-2 - DPPH 측정방법

50 ㎖의 100 % 에탄올과 0.019712 g의 DPPH를 혼합하여 0.1 mM DPPH solution을 제조하였고, 100 ㎕의 샘플과 50 ㎕의 DPPH solution 및 100 ㎕의 70 % 에탄올을 혼합하여 샘플 용액을 제조하였으며, 100 ㎕의 샘플과 150 ㎕의 70 % 에탄올을 혼합하여 샘플 blank를 제조하였다. 또한, 50 ㎕의 DPPH solution과 200 ㎕의 70 % 에탄올을 혼합하여 control을 제조하였으며, 250 ㎕의 70 % 에탄올을 control blank로 이용하였다.

각각의 시험 용액을 96well plate에 분주하고 빛을 차단하여 30분간 실온에서 정치한 후, 517 nm에서 흡광도(Abs)를 측정하여 하기 계산식 14를 이용하여 DPPH 활성을 구하였다.

[계산식 14]

실험예 4-3 - ABTS 측정방법

0.192038 g 의 ABTS와 50 ㎖ 증류수를 혼합하여 7 mM ABTS solution을 제조하였으며, 0.0662284 g의 Potassium persulfate와 100 ㎖의 증류수를 혼합하여 2.45 mM potassium persulfate (과황산칼륨. K₂SO₄) solution을 제조하였다.

유리비커 또는 병에 7 mM ABTS solution과 2.45 mM potassium persulfate를 1:1의 비율로 섞고 16시간 정치하고, ABTS solution을 하기 표 2와 같이 10% 에탄올로 희석하여 734 nm에서 흡광도 값이 0.7(±0.02)가 되는 비율을 선택하였다.

ABTS solution (㎕)	10% EtOH (㎕)	합계 (㎕)
0	200	200
2	198	200
4	196	200
6	194	200
8	192	200
10	190	200
12	188	200
14	186	200
16	184	200

이후 20 ㎕의 샘플과 180 ㎕의 ABTS solution(선택된 비율의 용액)을 섞은 후 5분간 정치하고 이후 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로 20 ㎕의 10 % 에탄올과 180 ㎕의 ABTS solution을 혼합하여 흡광도를 측정하여 하기 계산식 15에 따라 ABTS 활성을 구하였다.

[계산식 15]

<평가 및 결과>

결과 1 - 고등어 부산물 종류에 따른 품질검사

상기 실험예 1-1 내지 1-5에 따라 고등어 부산물 시료의 일반세균수, 대장균 및 대장균군수, 휘발성 염기질소, pH, 및 TBARS를 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.

그 결과, 일반세균, 대장균 및 대장균군, 휘발성염기질소, pH, 및 TBARS에서 어두와 내장의 유무에 따른 유의한 차이가 없으며, 그 차이가 미세하거나 동일한 수치를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 어미와 등뼈 뿐만 아니라 어두와 내장을 사용하여 반려동물의 사료원료로 활용할 수 있을 것으로 판단되며, 추가적인 비용의 발생 없이 수산가공 부산물의 회수 및 수집이 가능하여 보다 경제적으로 고등어 부산물을 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

결과 2 - 고등어 부산물(어두, 내장, 등뼈, 어미)을 포함하는 사료의 품질검사

상기 실시예 1에 따라 제조한 사료의 일반세균수, 대장균 및 대장균군수, 휘발성 염기질소, pH, 및 TBARS를 상기 실험예 1-1 내지 1-5에 따라 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.

그 결과, 일반세균, 대장균 및 대장균군에서 모두 미생물이 검출되지 않아 안정성을 확보한 것을 확인할 수 있었으며, 휘발성염기질소 및 pH는 가공공정이 진행되어도 크게 유의미한 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다. TBARS에서는 사료 완제품이 고등어 부산물 시료보다 50 % 가량 적은 값을 나타내어 지질산화가 보다 더디게 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

결과 3 - 고등어 부산물의 분쇄조건 및 어골 연화조건에 따른 조직감 측정

상기 실험예 2-1에 따라 고등어 부산물의 분쇄조건에 따른 조직감을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.

그 결과, 분쇄를 하지 않은 상태(스피드 0)에 비하여 경도(hardness), 점착성(adhesiveness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 검성(gumminess), 및 씹힘성(chewiness)의 값은 분쇄 스피드 50 이상일 시 각각의 값들이 유사해지는 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 분쇄 스피드 50 이상의 조건으로 분쇄하면 반려동물이 식이로 사용하기 충분한 조직감을 나타내는 것으로 판단된다.

또한, 상기 실험예 2-2에 따라 고등어 부산물의 연화 시간에 따른 조직감을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.

그 결과, 열처리를 하지 않은 상태(0분)에 비하여 경도(hardness), 점착성(adhesiveness), 응집성(cohesiveness), 탄력성(springiness), 검성(gumminess), 및 씹힘성(chewiness)의 값은 분쇄 스피드 60분 이상일 시 각각의 값들이 거의 유사한 것을 확인할 수 있었다.

고등어 부산물의 연화 시간에 따른 일반미생물 수를 확인하여 상기 표 7에 나타내었으며, 열처리를 하지 않은 상태(0분)에 비하여 열처리를 하는 시간이 증가할수록 일반미생물 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 표 3 내지 표 4의 결과를 종합해보면, 오토클레이브를 이용하여 고등어 부산물을 열처리할 경우, 90℃에서 60분 이상 열처리하게되면 사료로서 허용범위 내에 포함될 수 있으나, 처리시간이 80분일 때 일반미생물 수가 효과적으로 감소하는 것으로 나타남으로 오토클레이브를 이용하여 90℃에서 80분 이상 열처리하는 것이 사료로 사용하기 적합할 것으로 판단된다.

결과 4 - 고등어 부산물(어두, 내장, 등뼈, 어미)을 포함하는 사료의 성분분석 결과

상기 실시예 1에 따른 사료 완제품의 실험예 3-1 내지 3-13에 따라 성분분석한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

사료 완제품의 실험 결과에서 조지방, 조단백질, 칼슘, 휘발성염기태질소, 크롬, 카드뮴, 비소, 납, 셀레늄, 수은, 살모넬라의 결과는 사료관리법 및 본 용역의 기준에 모두 적합한 것으로 확인되었으며, 어두, 내장, 등뼈, 어미를 포함하더라도 적합한 사료를 제조할 수 있음을 확인하였다.

결과 5 - 아임계수 추출 시간에 따른 비타민나무 열매의 항산화 효과

상기 실시예 2에 따라 0분에서 40분까지 10분 간격으로 아임계수 추출한 비타민나무 열매 시료와 상기 비교예 1에 따라 제조한 L-ascorbic acid를 상기 실험예 4-1 내지 4-3에 따라 항산화효과를 비교하였으며, 이를 도 2 내지 도 4에 도시하였다.

SOD	PC	0 min	5 min	10 min	20 min	30 min	40 min
활성도%	36.50	19.22	21.21	27.23	73.14	72.48	64.52

그 결과, SOD 활성을 나타내는 도 2 내지 상기 표 9를 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 36.50 %로 나타났으며, 아임계수 추출 시간이 10분 이하일 경우는 그 보다 낮은 활성을 나타냈지만, 추출 시간이 20분 이상일 경우 비타민나무 열매 시료의 항산화활성이 175 내지 200 % 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 아임계수 추출 시간이 20분일 때 항산화활성이 73.14 %로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

DPPH	PC	0 min	5 min	10 min	20 min	30 min	40 min
활성도%	41.00	2.66	26.61	43.37	87.65	81.12	76.36

DPPH 활성을 나타내는 도 3 내지 상기 표 10을 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 41.00 %로 나타났으며, 아임계수 추출 시간이 5분 이하일 경우는 그 보다 낮은 활성을 나타냈지만, 추출 시간이 10분 이상일 경우 비타민나무 열매 시료의 항산화활성이 105 내지 214 % 증가하는 것으로 나타났으며, 특히 아임계수 추출 시간이 20분일 때 항산화활성이 87.65 %로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

ABTS	PC	0 min	5 min	10 min	20 min	30 min	40 min
활성도%	62.43	66.44	65.03	68.32	86.49	78.36	73.47

또한, ABTS 활성을 나타내는 도 4 내지 상기 표 11을 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 62.43 %로 나타났으며, 아임계수 추출 시간에 관계없이 비타민나무 열매의 모든 시료에서 PC 보다 높은 항산화활성을 나타내었다. 비타민나무 열매 시료의 항산화활성이 106 내지 140 % 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 아임계수 추출 시간이 20분일 때 항산화활성이 86.49 %로 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

결과 6 - 비타민나무 열매의 아임계수 추출여부에 따른 사료의 항산화활성 비교

상기 실시예 3에 따라 아임계수 추출한 비타민나무 열매를 포함한 사료, 비교예 1에 따라 제조한 L-ascorbic acid, 및 상기 비교예 2에 따라 제조한 아임계수 추출하지 않은 비타민나무 열매를 포함한 사료를 상기 실험예 4-1 내지 4-3에 따라 항산화효과를 비교하였으며, 이를 도 5 내지 도 7에 도시하였다.

SOD (비타민나무열매 비율)	PC	0%	10%	20%	30%	40%
아임계수 추출	40.25	10.97	83.33	91.65	97.70	98.46
아임계수 추출 미처리	40.25	10.97	16.55	11.87	9.31	8.71

그 결과, SOD 활성을 나타내는 도 5 내지 상기 표 12를 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 40.25 %로 나타났으며, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함한 사료에서 가장 낮은 항산화활성을 나타냈으며, 중량%가 30 이상이 될 경우 오히려 항산화 활성을 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 20분간 아임계수 추출한 비타민나무 열매를 포함한 사료의 항산화활성은 그 중량%가 증가함에 따라 항산화 활성이 최대 98.46 %까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

DPPH (비타민나무열매 비율)	PC	0%	10%	20%	30%	40%
아임계수 추출	42.50	45.95	90.03	92.13	93.15	94.62
아임계수 추출 미처리	42.50	45.95	45.27	45.55	45.96	45.27

DPPH 활성을 나타내는 도 6 내지 상기 표 13을 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 42.50 %로 나타났으며, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함한 사료는 중량%와 관계없이 약 45.00 내지 46.00 %의 항산화활성을 나타냈다. 반면, 20분간 아임계수 추출한 비타민나무 열매를 포함한 사료의 항산화활성은 그 중량%가 증가함에 따라 항산화 활성이 최대 94.62 %까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

ABTS (비타민나무열매 비율)	PC	0%	10%	20%	30%	40%
아임계수 추출	64.83	59.33	65.50	86.16	91.62	91.28
아임계수 추출 미처리	64.83	59.33	55.71	55.04	52.32	49.56

ABTS 활성을 나타내는 도 7 내지 상기 표 14를 참고하면, L-ascorbic acid(PC)의 항산화활성이 64.83 %로 나타났으며, 아임계수 추출을 하지 않은 비타민나무 열매를 포함한 사료에서 가장 낮은 항산화활성을 나타냈으며, 그 중량%가 증가할수록 오히려 항산화 활성을 감소하는 것으로 나타났다. 반면, 20분간 아임계수 추출한 비타민나무 열매를 포함한 사료의 항산화활성은 그 중량%가 증가함에 따라 항산화 활성이 최대 91.28 %까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 종합하면, 기존에 높은 항산화활성이 알려진 L-ascorbic acid와 항산화활성이 있는 것으로 알려진 일반 비타민나무 열매에 비하여 아임계수 추출 과정을 거진 비타민나무 열매에서 아주 우수한 황산화활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 고등어 부산물을 포함하는 사료에 아임계수 추출 비타민나무 열매를 첨가함으로써 기존의 항산화활성보다 더 높은 항산화활성을 나타내어 시너지 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 이러한 높은 항산화활성으로 인해 유통기한이 증가하여 사료의 안정성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다.

1 : 반응기
2 : 통형 난방기
3 : 물 재킷 (과열 방지용)
4 : 온도 조절기
5 : 압력계
6 : 볼 밸브 (물 유출 조절)
7 : 냉각수 배출구
8 : 냉각수 유입구
9 : 열 교환기
10 : 배압 조절기

Claims (4)

1. 어두, 내장, 등뼈, 및 어미 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 고등어 부산물을 분쇄하여 고등어 부산물의 분쇄물을 형성하는 제 1 단계;
   상기 고등어 부산물의 분쇄물을 열처리하여 연화하는 제 2 단계;
   비타민나무 열매 가루와 물을 회분식 반응기에 첨가하고 혼합하는 제 3 단계;
   상기 회분식 반응기에 장착된 온도 조절기를 이용하여 물의 온도를 200℃로 설정하는 제 4 단계;
   상기 회분식 반응기 내에서 비타민나무 열매 가루와 200℃의 물을 20분 내지 30분간 반응시켜 아임계수 추출 비타민나무 열매 가루를 형성하는 제 5 단계;
   상기 아임계수 추출 비타민나무 열매 가루와 상기 열처리한 고등어 부산물의 분쇄물을 1 : 1.25 - 2.5의 중량비로 혼합하여 혼합물을 형성하는 제 6 단계;
   제 6 단계의 상기 혼합물에 물, 인산나트륨, 솔비톨, 베타 글루칸, 소금, 및 감자전분 중에서 선택된 하나 이상을 첨가하고 교반하여 교반물을 형성하는 제 7 단계; 및
   상기 교반물을 용기에 포장하고 살균하는 제 8 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료의 제조방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 제 2 단계는 고등어 부산물의 분쇄물을 60분 내지 80분 열처리하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료의 제조방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 제 7 단계는 상기 혼합물에 물, 인산나트륨, 솔비톨, 및 베타글루칸을 첨가하여 교반물을 형성하는 것을 특징으로 하는 반려동물 사료의 제조방법.
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