KR102067328B1 - 지의류 추출물을 포함하는 항-인플루엔자 바이러스용 조성물 - Google Patents

지의류 추출물을 포함하는 항-인플루엔자 바이러스용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 제공한다. 본 발명은 지의류의 인플루엔자 바이러스 감염 및 복제 억제 효과를 제공한다.

Description

지의류 추출물을 포함하는 항-인플루엔자 바이러스용 조성물{Compositions for Anti-Influenza Virus comprising Lichen Extract}
본 발명은 지의류 추출물을 포함하는 항-인플루엔자 바이러스용 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus, IAV)는 전염성 호흡기 질환을 유발하는 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae)에 속하는 네가티브-센스 단일-가닥의 RNA 바이러스이다. 대유행성 인플루엔자 A 바이러스 및 계절성 인플루엔자 A 바이러스는 전세계적으로 심각한 전염병 및 사망을 초래할 수 있는 위험한 바이러스이다. 종래의 항-IAV 제제에 대한 IAV의 내성으로 인해, 신규한 항-IAV 제제의 개발에 많은 관심이 있어왔으며, 항-IAV 제제의 새로운 후보 물질로 천연물 소재가 주목받고 있다.
지의류(Lichens)는 곰팡이와, 조류 또는 남세균(cyanobacteria)과 같은 광합성 파트너의 공생을 통해 형성되는 복합 유기체이다. 육지 표면의 약 8%를 차지하고, 약 18,500 종의 지의류가 보고되었으며, 800종 이상의 지의류 산물이 알려져 있다. 지의류는 하나 또는 여러 개의 광합성 녹조류 또는 독특한 공생 구조를 형성하는 시아노박테리아와 서식처를 제공하는 우세한 곰팡이 (mycobiont) 사이에서 자립적이며 상호 공생적인 것으로 잘 알려져 있다.
본 발명자들은 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 지의류 중 클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) 및 니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior)가 항-인플루엔자 바이러스의 감염 및 복제 억제 활성을 나타냄을 규명하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Araujo, A. A. S. et al. (2015). Review of the biological properties and toxicity of usnic acid. Natural Product Research, 6419(January 2016), 1-14. Shrestha, G., & St. Clair, L. L. (2013). Lichens: A promising source of antibiotic and anticancer drugs. Phytochemistry Reviews, 12(1), 229-244. Musharraf, S. G. et al. (2017). Sensitive analysis of bioactive secondary metabolites in lichen species using liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 146, 279-284.
본 발명자들은 천연물 유래의 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 32종의 지의류 중 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 2종의 지의류를 선별하고, 선별된 지의류의 인플루엔자 바이러스 감염 및 복제 억제 활성을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior) 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 항-인플루엔자 A 바이러스용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 천연물 유래의 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 32종의 지의류 중 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는 2종의 지의류를 선별하고, 선별된 지의류의 인플루엔자 바이러스의 세포 감염 및 복제 억제 활성을 규명하였다.
본 명세서에서 용어 '지의류'란 곰팡이와, 조류 또는 남세균과 같은 광합성 파트너의 공생을 통해 형성되는 복합 유기체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 '인플루엔자 바이러스'는 유행성 독감을 유발하는 네가티브-센스 단일-가닥의 RNA 지놈의 바이러스를 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B 또는 인플루엔자 바이러스 C이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A이다.
본 명세서에서 용어 '인플루엔자 바이러스 A'는 네가티브-센스 단일-가닥의 RNA 지놈을 갖으며, 유행성 독감을 유발하는 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae) 과(family)-인플루엔자바이러스 A(Influenza Virus A) 속(genus)에 속하는 바이러스이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 C 바이러스이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H1N2, H2N2, H3N1, H3N2, H3N8, H5N1, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H9N2 및 H10N7로 구성된 군으로부터 선택되는 인플루엔자 A 바이러스 아형(subtype)이다.
본 명세서에서 용어 '인플루엔자 A 바이러스 아형'은 인플루엔자 A 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin, H) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, N)에 의해 결정되는 아형을 의미한다. 상기 헤마글루티닌은 적혈구의 응집을 유도하는 단백질로 H1 내지 H18의 18가지 형태가 알려져 있고, 상기 뉴라미니다아제는 뉴라민산(neuraminic acid)의 글리코시드 결합(glycosidic bond)을 절단하는 효소로, N1 내지 N11의 11가지 형태가 알려져 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 바이러스 H1N1아형은 1형 헤마글루티닌 및 1형 뉴라미니다아제의 조합이다. 이론적으로, 상기 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제의 198가지 조합이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1N1이다.
본 발명의 항-인플루엔자 바이러스용 조성물은 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물을 포함한다.
상기 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 각각 클래도니아 퍼르카타 및 니폰노파르멜리아 래비오르를 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용하여 추출할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물의 조추출물 제조에 사용되는 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 60%이상 내지 80%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 80%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
또한, 상기 알코올 수용액은 메탄올 수용액, 에탄올 수용액, 프로판올 수용액, 및 부탄올 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들면 상기 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
예를 들면, 상기 클래도니아 퍼르카타 및 니폰노파르멜리아 래비오르를 각각 물 및 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올, 아세톤으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 용매 조추출물을 에틸에테르, 아세트산에틸, 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있다.
상기 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 각각 클래도니아 퍼르카타 및 니폰노파르멜리아 래비오르의 용매 조추출물, 용매 분획물을 포함하며 상술한 바와 같다.
상기 용매는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 60%이상 내지 100%(v/v)미만, 70%이상 내지 100%(v/v)미만, 10%이상 내지 90%(v/v)미만, 20%이상 내지 90%(v/v)미만, 30%이상 내지 90%(v/v)미만, 40%이상 내지 90%(v/v)미만, 50%이상 내지 90%(v/v)미만, 60%이상 내지 90%(v/v)미만 또는 60%이상 내지 80%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액, 예를 들어, 70%(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있다.
본 발명에 따른 클래도니아 퍼르카타 추출물 또는 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물의 제조 과정을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 클래도니아 퍼르카타 또는 니폰노파르멜리아 래비오르를 분말화하고 건조시킨 후, 상기 클래도니아 퍼르카타 또는 니폰노파르멜리아 래비오르의 중량에 대하여 약 10 내지 1000배 중량의 추출용매로 추출한다. 추출 후 여과하여 여과액을 모은다. 추출 온도는 특별한 제한은 없지만 15 내지 110, 바람직하게는 20 내지 90인 것이 좋다.
추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 일 예에서, 추출공정을 2회 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매, 약 5 내지 15 부피배, 바람직하게는 8 내지 12 부피배로 환류 추출한다. 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 여과액과 합쳐서 감압농축을 하여 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.
상기 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물의 제조 시에 사용되는 용매의 양이 너무 적으면 교반이 어렵게 되고 추출물의 용해도가 낮아져 추출효율이 떨어지게 되고, 지나치게 많은 경우는 다음의 정제단계에서 사용되는 용매의 사용량이 많아져 경제적이지 못하여 취급상 문제가 발생할 수 있으므로, 용매의 사용량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.
이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 의약품 또는 식품 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30 중량배, 바람직하게는 15 내지 25 중량배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질하게 현탁시킨 후 동결건조하여 분말상태의 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물로서 제조될 수 있다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, '추출물'은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 포함하며, 상기 클래도니아 퍼르카타 추출물 및 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태를 모두 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 클래도니아 퍼르카타 추출물은 프로토세트라릭산(protocetraric acid)을 포함한다.
상기 프로토세드라릭산은 다음의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이다.
[화학식 1]
Figure 112018014709318-pat00001
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 2-0-메틸라이조닉산(2-0-methylrhizonic acid)을 포함한다.
상기 2-0-메틸라이조닉산은 다음의 화학식 2의 구조를 갖는 화합물이다.
[화학식 2]
Figure 112018014709318-pat00002
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물의 약제학적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물의 대상질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴 또는 조류독감일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 클래도니아 퍼르카타 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 식품 조성물은 건강기능식품 조성물로 제조될 수 있다.
인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 건강기능식품은 식품 제조 시 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 수국차 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물 및 식품 조성물은 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 증상, 예를 들어, 기침, 오한, 열, 설사, 근육통, 구토, 인후통, 객담, 두통, 피로감 등의 개선, 예방 또는 치료용 조성물이다.
본 발명에서 사용되는 용어 “개선”은 본 발명의 조성물의 투여로 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 또는 질병이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 또는 질병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “치료”는 (a) 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 인플루엔자 바이러스에 의한 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물 및 식품 조성물은 앞서 기재된 항-인플루엔자 바이러스용 조성물의 성분 및 효과가 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 항-인플루엔자 바이러스용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명은 지의류의 인플루엔자 바이러스 감염 및 복제 억제 효과를 제공한다.
도 1a 및 1b는 지의류 추출물의 HPLC 결과를 나타낸다. 도 1a는 LC14(클래도니아 퍼르카타) 추출물의 HPLC 결과를 나타낸다. 도 1b는 LC24(니폰노파르멜리아 래비오르) 추출물의 HPLC 결과를 나타낸다.
도 2는 지의류 추출물의 MDCK 세포에 대한 세포독성 분석 실험을 도식화하여 나타낸다.
도 3은 LC14 및 LC24, 각각의 메탄올 추출물 6.25 내지 200 ug/ml에 대한 세포생존능을 나타낸다. 'CTL'은 지의류 추출물을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.
도 4a 및 4b는 LC14 추출물 및 LC24 추출물, 각각의 인플루엔자 A 바이러스의 아폽토시스(apoptosis) 유도 억제 효과를 나타낸다. 도 4a는 생존 세포 및 아폽토틱(apoptotic) 세포를 분석한 유세포 분석 결과를 나타낸다. 도 4a의 'A'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시키지 않은 대조군(MOCK)이고, 'B'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 세포에 LC14 추출물 100 ug/ml을 처리한 결과이며, 'C'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 세포에 LC24 추출물 100 ug/ml을 처리한 결과이고, 'D'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시키고 지의류 추출물을 처리하지 않은 대조군이다. 도 4b는 도 4a의 아폽토시스 유도 억제 결과를 그래프로 나타낸다. 도 4b의 세포생존능은 도 2의 CCK-8 분석을 이용하여 지의류 추출물을 처리하고 IAV를 감염시킨 후 세포생존률을 측정한 결과를 아폽토시스 분석 결과와 병합하여 산출하였다.
도 5는 LC14 추출물 및 LC24 추출물의 인플루엔자 A 바이러스의 세포병변(cytopathic) 유도 억제 효과를 나타낸다. 'A'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시키지 않은 대조군(MOCK)이고, 'B'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 세포에 LC14 추출물 100 ug/ml을 처리한 결과이며, 'C'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 세포에 LC24 추출물 100 ug/ml을 처리한 결과이고, 'D'는 인플루엔자 A 바이러스를 감염시키고 지의류 추출물을 처리하지 않은 대조군을 나타낸다. 'hpi'는 '감염 후 경과시간(hours post infection)'을 의미한다.
도 6은 LC14 추출물 및 LC24 추출물의 인플루엔자 A 바이러스의 PA mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다.
도 7은 LC14 추출물 및 LC24 추출물의 인플루엔자 A 바이러스의 HSPA4, HSPA5 및 HSPA8 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다.
도 8은 LC14 추출물 및 LC24 추출물의 인플루엔자 A 바이러스의 ANXA1 및 ANXA2 mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다.
도 9는 LC14 추출물 및 LC24 추출물의 인플루엔자 A 바이러스의 AKT1 및 HIF1a mRNA 발현 억제 효과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 지의류의 수집 및 추출물의 제조
대한민국에 서식하는 32종의 지의류를 수집하였다. 수집된 지의류의 종류는 순천대학교 한국이끼연구소(KoLRI)의 환경교육 균학과 허지선 교수가 확인하였다. 수집된 지의류의 정보를 표 1에 기재하였다.
지의류 시료명 채집 위치(GPS) 고도
(m)		 기층
(Substratum)		 채집 장소
클래도니아 마시렌타(Cladonia macilenta) LC1 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
클래도니아 픽시다타(Cladonia pyxidata) LC2 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
클래도니아 랭기페리나(Cladonia rangiferina) LC3 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
파르모트레마 크리스티페룸(Parmotrema cristiferum) LC4 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
산토파르멜리아 멕시카나(Xanthoparmelia mexicana) LC5 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
라말리나 종(Ramalina sp.) 1 LC6 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
라말리나 종(Ramalina sp.) 2 LC7 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
라말리나 폴리나리아(Ramalina pollinaria) LC8 35°01'17.80"N, 126°10'14.71"E 0 암석 전라남도 신안군
산토파르멜리아 코리아나(Xanthoparmelia coreana) LC9 34°59'47.61"N, 126°10'52.41"E 0 암석 전라남도 신안군
클래도니아 라물로사(Cladonia ramulosa) LC10 35°02'21.15"N, 126°12'00.24"E 0 암석 전라남도 신안군
클래도니아 드히스센스(Cladonia dehiscens) LC11 34°55'16.55"N, 126°22'04.70"E 0 토양 전라남도 무안군
라말리나 리토랄리스(Ramalina litoralis) LC12 34°40'33.71"N, 126°15'38.78"E 6 암석 전라남도 해남군
파르모트레마 아우스트로시넨스(Parmotrema austrosinense) LC13 34°29'42.21"N, 127°37'01.12"E 76 나무껍질 전라남도 해남군
클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) LC14 34°36'07.03"N, 126°00'52.07"E 8 토양 전라남도 신안군
스티크타 닐란데리아나(Sticta nylanderiana) LC15 37°11'49.4"N, 128°54'41.2"E 1428 나무껍질 강원도 정선군
미엘로크로아 엔도데이오크로아(Myelochroa entotheiochroa) LC16 37°11'49.4"N, 128°54'41.2"E 1428 나무껍질 강원도 정선군
로바리아 스파투라타(Lobaria spathulata) LC17 37°11'49.4"N, 128°54'41.2"E 1428 나무껍질 강원도 정선군
로바리아 아프. 아드스크립두리엔스(Lobaria aff. Adscripturiens) LC18 37°11'43.8"N, 128°54'45.6"E 1431 나무껍질 강원도 정선군
세트렐리아 슈도리베토럼(Cetrelia pseudolivetorum) LC19 37°11'43.8"N, 128°54'45.6"E 1431 나무껍질 강원도 정선군
파르모트레마 세트라텀(Parmotrema cetratum) LC20 37°11'03.9"N, 128°54'50.3"E 1266 나무껍질 강원도 정선군
미엘로크로아 아우루렌타(Myelochroa aurulenta) LC21 37°11'03.9"N, 128°54'50.3"E 1266 나무껍질 강원도 정선군
헤테로데르미아 하이포루카(Heterodermia hypoleuca) LC22 37°10'41.4"N, 128°54'51.4"E 1350 나무껍질 강원도 정선군
펠티제라 루페스센스(Peltigera rufescens) LC23 37°10'33.9"N, 128°54'47.8"E 1393 나무껍질 강원도 정선군
니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior) LC24 37°10'33.9"N, 128°54'47.8"E 1393 나무껍질 강원도 정선군
로바리아 메리디오날리스(Lobaria meridionalis) LC25 37°10'33.9"N, 128°54'47.8"E 1393 나무껍질 강원도 정선군
피시아 아프. 오리엔탈리스(Physcia aff. Orientalis) LC26 33°31'35.32"N, 126°43'09.75"E 84 나무껍질 제주도 제주시
파르모트레마 틴크토럼(Parmotrema tinctorum) LC27 33°31'35.32"N, 126°43'09.75"E 84 나무껍질 제주도 제주시
파르모트레마 레티쿨라텀(Parmotrema reticulatum) LC28 33°27'34.13"N, 126°33'35.21"E 272 나무껍질 제주도 제주시
피스코니아 호카이덴시스(Physconia hokkaidensis) LC29 33°25'24.86"N, 126°33'31.33"E 596 나무껍질 제주도 제주시
스테레오카울론 자포니쿰(Stereocaulon japonicum) LC30 33°25'53.54"N, 126°41'24.79"E 419 암석 제주도 제주시
클래도니아 그라실리스 susbp. 투르비나테(Cladonia gracilis subsp. Turbinate) LC31 33°25'04.11"N, 126°30'11.66"E 631 토양 제주도 제주시
클래도니아 스쿠아모살(Cladonia squamosal) LC32 33°25'04.11"N, 126°30'11.66"E 631 토양 제주도 제주시
표 1의 모든 지의류를 미세분말로 분쇄하고, 건조된 미세분말을 칭량하여 분말 10 mg을 메탄올 또는 아세톤 1 ml에 용해시켜 실온에서 Soxhlet으로 추출하였다. 추출물을 여과한 후 회전증발기에서 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 건조하고, 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. 추출물의 피토케미칼 분석은 HPLC-UV 시스템을 이용하여 실시하였다.
32종의 지의류 중 IAV에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 지의류로 LC14 및 LC24가 확인되었다. 상기 LC14는 페놀성 화합물인 프로토세트라르산(protocetraric acid)을 우세하게 함유하고, 상기 LC24는 2-0-메틸리조닉산을 우세하게 함유하였다. 이러한 물질이 항-IAV 활성을 가질 것으로 추측되었다(도 1a 및 1b).
실시예 2: 세포독성 분석
세포 및 바이러스
MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포를 한국세포주은행(KCBL10034, Lot No. 30419)으로부터 구매하였다. 10% FBS(fetal bovine serum) 및 항생제(스트렙토마이신 100 mg/mL 및 페니실린 100 U/mL, 시그마-알드리치, 미국)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium (웰진, 대한민국)으로 37℃, 5% CO2 조건에서 MDCK를 배양하였다.
낮은 병원성의 인간 IAV H1N1 A/PR/8/34를 ATCC(VR-1469, 미국)에서 구입하고, MDCK 세포에 감염시켜 37℃, 5% CO2 조건에서, 2 μg/mL N-p-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(N-p-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone; TPCK, 시그마-알드리치)가 처리된 트립신을 포함하는 바이러스 감염용 배지(스트렙토마이신 100 mg/mL 및 페니실린 100 U/mL 첨가된 DMEM)를 이용하여 증식시켰다.
세포독성 분석
MDCK 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 단일층(monolayer)을 형성하면, PBS(phosphate buffered saline)을 처리하여 세척하였다. 지의류 추출물을 DMSO에 10 mg/ml로 용해시키고 최종 농도 200, 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 ug/ml이 되도록 DMEM으로 2-폴드 희석하였다. 희석한 지의류 추출물을 MDCK 세포에 48시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 처리하였다. CCK8(cell counting kit 8) 시약을 웰당 10 μl 처리하고, 37℃에서 1시간 항온반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(Synergy, Bio-Tek, 미국)로 450 nm에서 흡광도를 분석하고, 세포독성을 계산하였다(도 2).
그 결과, LC14(Cladonia furcata) 및 LC24(Nipponoparmelia laevior)는 최대 200 μl/ml의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다(도 3).
인플루엔자 A 바이러스의 아폽토시스(apoptosis) 유도 억제 효과
MDCK 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 지의류 추출물을 DMSO로 10 mg/ml 농도로 용해시키고, 최종 농도 100 μl/ml이 되도록 DMEM으로 회석하였다. 지의류 추출물을 MDCK 세포에 37℃, 24시간 동안 처리하고, IAV H1N1을 1.0 MOI로 48시간 동안 감염시켰다. 감염 후 상층액을 T-EDTA 용액을 이용하여 회수하고, PBS로 세포를 동일한 농도로 희석한 후 Muse Annexin V and Dead Cell Kit (EMD Millipore Corporation, Hayward, CA 94545)를 이용하여 염색하였다. 염색 후, 세포는 암실에서 20분간 배양한 뒤 Muse Cell Analyzer를 이용하여 아폽토시스 정도를 측정하였다. 결과는 생존 세포(live cell), 초기 아폽토틱 세포(early apoptotic), 후기 아폽토틱 및 사멸 세포(late apoptotic+dead)를 %로 표시하였으며 이는 Muse Cell Analyzer (Merk, KGaA, Darmstadt, Germany) 프로토콜을 참조하여 분석하였다.
실험결과, 대조구에 비하여 LC14 및 LC24를 처리한 실험구에서 바이러스 감염에 의해 유도되는 세포자살율이 각각 약 13.16% 및 23.26% 저해(IAV 처리군의 아폽토틱 세포의 합 - 지의류 추출물 처리군의 아폽토틱 세포의 합)되어지는 것을 확인하였다(도4a 및 4b). 기존 연구에서 인플루엔자 바이러스에 의해 세포 내의 caspase-3가 증가하여 아폽토시스가 유도되므로, 지의류의 세포자살율 저해 효과는 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 증가되어진 caspase-3 저해를 통한 것이라 생각되어진다.
바이러스 유도성 세포병변 효과
MDCK 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포가 단일층을 형성하면, PBS을 처리하여 세척하였다. 지의류 추출물을 DMSO로 10 mg/ml 농도로 용해시키고, 최종 농도 100 μl/ml이 되도록 DMEM으로 회석하였다. 지의류 추출물을 MDCK 세포에 37℃, 24시간 동안 처리하고, IAV H1N1을 1.0 MOI(multiplicity of infection)로 48시간 동안 감염시켰다. 감염 후, 디지털 현미경 카메라(DCM310)가 장착된 도립현미경(Optinity KI 400, 대한민국)을 이용하여 바이러스-유도성 세포병변 효과(virus-induced cytopathic effect)를 관찰하였다. 48시간 후, CCK8 시약을 첨가하고 1시간동안 37℃, 5% CO2 조건 하에 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하고 항바이러스 활성을 계산하였다.
48시간 후, 바이러스-유도성 세포병변 효과를 관찰하였다. 그 결과, 지의류 추출물은 IVA 감염에 대하여 억제 활성을 나타냈으며, 특히 LC14 및 LC24는 바이러스-유도성 세포병변에 영향 없이 세포를 보호하는 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 지의류가 항-IVA 제제의 신규한 원료로 이용될 수 있음을 의미한다(도 4b 및 5).
실시예 3: 항바이러스 활성 분석
인플루엔자 A 바이러스의 복제 억제 효과
RNAiso 플러스 시약(다카라 바이오, 일본)을 이용하여 실시예 2의 MDCK 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 나노드롭 1000 분광광도계(Thermo Scientific, 미국)를 이용하여 총 RNA 농도를 측정하고 모든 처리를 동일하게 하였다. RNA 분액(aliquot)을 Superscript First-Strand cDNA 합성 키트(바이오니아, 대한민국)을 이용하여 cDNA로 역전사 하였다. cDNA 2 μl을 주형으로 실-시간 PCR을 실시하였다. 실-시간 PCR은 SYBR Premix Ex Taq 키트(다카라 바이오) 및 다카라 Thermal Cycler Dice Real Time System을 이용하여 다음의 단계로 수행하였다: (95℃ 10초)-(95℃ 5초 및 60℃ 30초, 45사이클)-(95℃ 15초 및 60℃ 30초, 1 사이클)-(95℃ 15초).
IAV H1N1의 PA(polymerase acidic) 유전자 검출을 위한 PCR 프로그램 작동 세팅은 (94℃ 30초, 60℃ 30초 및 72℃ 30초, 40사이클)-(72℃ 10분)으로 실시하였다. IAV H1N1의 PA 유전자 및 IAV 감염의 바이오마커[HSPA(Heat shock protein)4, HSPA5, HSPA8, ANXA(annexin)1, ANXA2, Akt(serine-threonine protein kinase)1 및 HIF1a(hypoxia inducible factor 1 alpha)]의 검출을 위한 프라이머 서열은 표 2와 같다.
유전자 프라이머 서열번호
IAV PA F: CGGTCCAAATTCCTGCTGA 1
R: CATTGGGTTCCTTCCATCCA 2
18S F: TGTGCCGCTAGAGGTGAAATT 3
R: TGGCAAATGCTTTCGCTTT 4
HSPA4 F: TGAGGAAAACGAGGAACCGA 5
R: TGATGCAGCTTGAGAGGTCT 6
HSPA5 F: GCCAAGAACCAGCTCACTTC 7
R: CTTTGTTTGCCCACCTCCAA 8
HPSA8 F: GCCTACCTTGGGAAGACTGT 9
R: CGTTCCTTTCAGCTCCAACC 10
ANXA1 F: ATGCACAGCGTCAACAGATC 11
R: TCAGTTCCAAGGCCCTTCAT 12
ANXA2 F: CTGGGGACTGATGAGGACTC 13
R: CATCAGCTTGCGGAAGTCAC 14
Akt1 F: GGCACATCAAGATCACGGAC 15
R: TCCTGGTTGTAGAAGGGCAG 16
HIF1a F: AAGCCCTGGATGGTTTTGTT 17
R: TCACAAGGCCATTTCTGTGTG 18
정량적 PCR을 통해 바이러스의 발현을 확인하였다. 2-△△Ct 방법을 통해 유전자 발현을 결정하였다. 타겟 유전자 발현 수준은 18S mRNA 발현으로 보정하였고 대조군과 비교하여 상대적인 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, PA 및 열충격단백질(HSPA4, HSPA5 및 HSPA8) mRNA의 발현은 IAV 감염에 의해 상향조절된 반면, 지의류 추출물의 처리에 따라 발현이 억제되었다. 이러한 결과는, 지의류가 IVA의 감염을 억제 및 감소시키는 데 관련이 있음을 의미한다(도 6 및 7). 열충격단백질은 스트레스-유도성 유전자로 알려져 있으며, 바이러스 복제 동안 IAV 단백질의 핵 내 유입 및 유출, 및 어셈블리(assembly)를 유도하는데 관여하는 바이러스 감염의 바이오마커이다.
바이러스 감염의 바이오마커인 선별된 유전자(ANXA1, ANXA2, Akt1 및 HIF-1α)의 mRNA 발현을 분석하였다. RNA 분리 및 정량적 PCR은 앞서 기재된 방법과 같이 실시하였다.
그 결과, MDCK 세포에서, ANXA1 및 ANXA2의 발현은 IAV 감염에 의해 유의하게 유도된 반면, 지의류 추출물의 처리에 의해 점진적으로 감소되었다(도 8). 상기 ANXA1은 바이러스의 복제 동안 바이러스의 핵 유출에 관여하고, ANXA2는 바이러스 단백질의 번역에 관여한다. 또한, ANXA1은 다양한 기작을 통해 인플루엔자 바이러스의 복제 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
도 9의 결과는, IAV 감염에 의해 Akt1 및 HIF-1α mRNA의 발현이 증가된 반면, 지의류 추출물의 처리는 이의 발현이 억제하였다.
본 연구는 한국산 지의류 2종 유래의 메탄올 추출물의 세포 생존능 개선 및 바이러스 복제 감소 활성 등의 다양한 기작을 통한 항-IAV 활성을 확인하였다. 따라서, 클래도니아 푸르카타(LC14) 및 니폰노파르멜리아 래비오르(LC24)는 IAV치료를 위한 약제 개발에 유용할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Compositions for Anti-Influenza Virus comprising Lichen Extract <130> PN170342 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAV PA <400> 1 cggtccaaat tcctgctga 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAV PA <400> 2 cattgggttc cttccatcca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S <400> 3 tgtgccgcta gaggtgaaat t 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S <400> 4 tggcaaatgc tttcgcttt 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPA4 <400> 5 tgaggaaaac gaggaaccga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPA4 <400> 6 tgatgcagct tgagaggtct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPA5 <400> 7 gccaagaacc agctcacttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPA5 <400> 8 ctttgtttgc ccacctccaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPSA8 <400> 9 gcctaccttg ggaagactgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPSA8 <400> 10 cgttcctttc agctccaacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA1 <400> 11 atgcacagcg tcaacagatc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA1 <400> 12 tcagttccaa ggcccttcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA2 <400> 13 ctggggactg atgaggactc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANXA2 <400> 14 catcagcttg cggaagtcac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt1 <400> 15 ggcacatcaa gatcacggac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt1 <400> 16 tcctggttgt agaagggcag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF1a <400> 17 aagccctgga tggttttgtt 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIF1a <400> 18 tcacaaggcc atttctgtgt g 21

Claims (6)

  1. 클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior) 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 항-인플루엔자 A 바이러스용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 클래도니아 퍼르카타 추출물은 프로토세트라릭산(protocetraric acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 니폰노파르멜리아 래비오르 추출물은 2-0-메틸라이조닉산(2-0-methylrhizonic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior) 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 약제학적 조성물.
  6. 클래도니아 퍼르카타(Cladonia furcata) 추출물, 니폰노파르멜리아 래비오르(Nipponoparmelia laevior) 추출물 또는 이의 혼합물을 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 식품 조성물.
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