KR102064671B1

KR102064671B1 - 환원제 보조된 과량적 갈바닉 치환 반응을 통한 다공성 금 나노구조체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 금 나노구조체

Info

Publication number: KR102064671B1
Application number: KR1020180057201A
Authority: KR
Inventors: 장홍제
Original assignee: 광운대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2020-01-09
Also published as: KR20190132028A

Abstract

본 발명은, 은 나노플레이트(용액) 제조 과정 중, 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 금(Au) 이온을 투입하여 다공성 금 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 특정 첨가제에 의해 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상을 방지할 수 있고, 첨가되는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 농도를 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있는 다공성 금 나노구조체 제조방법에 관한 것이다.

Description

환원제 보조된 과량적 갈바닉 치환 반응을 통한 다공성 금 나노구조체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 금 나노구조체{REDUCING AGENT-ASSISTED EXCESSIVE GALVANIC REPLACEMENT MEDIATED SEED-MEDIATED SYNTHESIS OF POROUS GOLD NANOSTRUCTURES AND POROUS GOLD NANOSTRUCTURES USING THE SAME}

본 발명은 환원제 보조된 과량적 갈바닉 치환 반응을 통한 다공성 금 나노구조체의 제조방법 및 이를 통해 제조된 다공성 금 나노구조체에 관한 것이다.

지난 수십년 동안 바이오 의약품, 촉매, 광학 및 데이터 저장 등 다양한 분야에서 활용 가능한 콜로이드성 나노입자 디자인 및 합성 기술에 대한 연구가 계속되어 오고 있다. 한편, 이방성 나노입자인 은(Ag) 나노플레이트는 이차원 평면 구조 및 독특한 물리화학적 특성 때문에 오랜 기간 연구되어 왔다. 오늘날 이들의 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR) 특성의 집단 모듈화를 위해, 이들 나노플레이트의 가장자리 길이, 두께 및 형상을 변형하고자 하는 시도 뿐만 아니라, 화학적 에칭, 광 에칭 및 원소 치환 반응 등과 같은 포스트합성(postsynthetic) 변형 테크닉을 이용하여 다양한 특성을 가진 은 나노플레이트를 제조하고자 하는 연구 역시 활발히 이루어지고 있다.

한편, 이러한 포스트합성 변형 테크닉으로 널리 알려진 갈바닉 치환 반응은, 두 원소 사이의 표준환원전위 차이에 기초한 용액 상의 산화환원 반응의 일종이며, 상기 갈바닉 치환 반응을 통해 은(Ag), 구리(Cu), 및 코발트(Co)와 같은 희생 주형(sacrificial template)에 금(Au), 백금(Pt) 및 팔라듐(Pd)과 같은 치환 이온을 첨가하는 경우, 화학양론적 산화환원 균형에 의해 중공 나노플레이트 또는 나노골격 등과 같은 변형된 나노구조체가 제조될 수 있다.

한편, 갈바닉 치환 반응을 통해 제조된 금 나노플레이트의 경우, 국소 표면 플라즈몬 공명 현상에 의해 전자기파를 흡수할 수 있고, 흡수된 전자기파는 금속막에 존재하는 전도성 전자들을 집단적으로 진동시켜 열 에너지를 발생시킨다. 이에 따라 상승된 온도는 단백질의 3차 또는 4차 구조를 비가역적으로 변성시켜 세포를 사멸시키기 충분하므로, 금 나노플레이트는 암세포에 대한 광열 치료(혹은 온열 치료) 용도로 사용될 수 있음이 알려져 있다.

한편, 종래 기술 중 J. Kimling 등은 아스코르브산(Ascrobic acid)으로 환원시키고, 소듐 시트레이트(Sodium Citrate)로 안정화시킨 5 내지 120㎚의 금 나노입자의 흡수 스펙트럼을 측정하고 모양을 확인한 바 있다. 한편 Brian G. Prevo 등은 소듐 시트레이트(Sodium Citrate)로 안정화시키고 소듐 보로하이드라이드(Sodium borohydride)로 환원시킨 금 나노입자에 은 나노입자를 합금시켜 광열 치료에 적용할 수 있다는 연구를 발표한 바 있다.

그러나, 위와 같은 방법들의 경우, 금 나노플레이트 합성 과정이 복잡할 뿐만 아니라, 나노구조체 제조 시 파편화(fragmentation)와 응집(aggregation) 현상이 일어나는 문제점이 존재하였다. 또한, 제조된 나노구조체는 광열-전환 효율이 낮고, 전달체 적재에 필요한 충분한 부피 대 표면 비율을 가지지 못하였기에, 유전자-발열 복합 치료 용도로 사용하기 부적합한 문제점이 있었다.

대한민국 공개특허 제10-2011-0044668호(2011.04.29.)

본 발명의 목적은, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중, 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 금(Au) 이온을 투입하여 다공성 금 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 특정 첨가제에 의해 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상을 방지할 수 있고, 첨가되는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 농도를 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있는 다공성 금 나노구조체 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체로서, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지는 다공성 금 나노구조체를 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 명세서에서는, 질산은(AgNO₃) 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 은 나노플레이트 용액 내에 금(Au) 이온을 투입하여 갈바닉 치환 반응을 수행시킴으로써, 금 이온이 치환된 다공성 금 나노구조체를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 단계는 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 조건 하에서 원팟(one-pot) 반응으로 수행되는 다공성 금 나노구조체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 명세서에서는, 금(Au) 및 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900 ㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과를 나타내는 다공성 금 나노구조체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중, 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 금(Au) 이온을 투입하여 다공성 금 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 특정 첨가제에 의해 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상을 방지하며, 첨가되는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 농도를 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다.

또한, 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체는, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가진다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 크기 조절된 은(Ag) 나노플레이트의 TEM 이미지 및 LSPR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 금 이온의 양(농도)을 조절한 경우 얻어지는 다공성 금 나노구조체의 TEM 이미지 및 LSPR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 시트르산 삼나트륨를 포함하는 경우 및 포함하지 않는 경우의 파편화 및 응집화 현상을 비교한 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 폴리(바이닐피롤리돈) 농도를 조절함에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체의 TEM 이미지 및 LSPR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 L-아스코르브산 농도를 조절함에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체의 TEM 이미지 및 LSPR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 상술한 3종의 첨가제의 존재 하에서 얻어진 다공성 금 나노구조체의 반응시간 별 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체의 원소 맵핑사진이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체의 광열-전환 효과, 전달체 적재 성능 및 세포 내재화 향상 효과 등을 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체를 이용한 MTT 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따라 얻어진 다공성 금 나노구조체를 이용한 유전자-발열 복합 치료의 시너지 효과 및 세포 생존 테스트 결과를 나타낸 것이다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 다공성 금 나노구조체 제조방법 및 이에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체에 대하여, 보다 상세하게 설명하기로 한다.

다공성 금 나노구조체(pAuNPs) 제조방법

상술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따르면, 질산은(AgNO₃) 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 은 나노플레이트 용액 내에 금(Au) 이온을 투입하여 갈바닉 치환 반응을 수행시킴으로써, 금 이온이 치환된 다공성 금 나노구조체를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 단계는 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 조건 하에서 원팟(one-pot) 반응으로 수행되는 다공성 금 나노구조체의 제조방법이 제공될 수 있다.

본 발명자들은 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중, 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 과량의 금(Au) 이온을 투입하는 경우, 원팟(one-pot) 반응으로 다공성 금 나노구조체를 간단하고 편리하게 제조할 수 있고, 특정 첨가제에 의해 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상이 방지되며, 첨가되는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 농도를 조절하는 경우, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다는 점을 실험을 통하여 확인하였다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체는, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료 능을 가진다는 점을 실험을 통하여 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 은 나노플레이트(용액)를 제조하는 과정은 당해 기술 분야에서 일반적인 방법에 의한 것일 수 있고, 구체적으로 질산은(AgNO₃) 용액에 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP), 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 과산화수소수소, 수소화붕소나트륨 등과 같은 첨가제를 가하여, 은 나노시드를 먼저 제조한 다음, 시드 기반 성장을 통해 크기 조절하여 은 나노플레이트(용액)로 제조될 수 있다. 일례로, 본 발명의 일실시예에 따르면 은 나노플레이트는 시드 기반 성장법으로 크기 조절된 것이 사용될 수 있으며(도 1 참조), 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)이 근적외선 영역으로 적색 이동된 것일 수 있다. 참고로 도 1의 스케일바는 100㎚이다.

본 발명의 일실시예에 따라 상기 은 나노플레이트 용액 내에 투입되는 금(Au) 이온은 표준환원전위 차이에 기초한 용액 상의 산화환원 반응인, 갈바닉 치환 반응에 의해 은 나노플레이트 표면의 은 원자로부터 전자를 전달받음으로써 도금을 수행하는 역할을 한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 치환 이온인 금 이온은 염화금산(AuCl₄ ^-)과 같은 형태로 은 나노플레이트(용액)에 첨가될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계에서 금(Au) 이온은, 은(Ag) 나노플레이트 전체 용액 부피를 기준으로 1 내지 20% 로 투입될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 갈바닉 치환 반응에서 치환 이온인 금 이온의 과량 첨가가 이루어질 수 있는데, 금 이온이 과량 치환되면 치환과 환원 속도 사이의 균형 변동을 유도하여 다공성을 가지는 금 나노플레이트가 제조될 수 있다. 특히, 금(Au) 이온이 은(Ag) 나노플레이트 전체 용액 부피를 기준으로 1 내지 20%로 투입되는 경우, 플레이트 형태가 일부 유지되며 다공성 확보 및 표면적 확장이 가능한 효과가 있으며, 상기 범위 이외의 범위로 투입되는 경우 과성장에 의해 다공성과 부피 대비 표면적이 감소하여 문제될 수 있다.

일례로, 4v/v% 농도의 염화금산(AuCl₄ ^-) 용액을 첨가하는 경우, 중공 형성, 내부 에칭 및 나노골격 형성 등과 같은 나노구조체의 구조 변형을 가져오며, 10v/v% 농도를 초과하는 염화금산(AuCl₄ ^-) 용액을 첨가하는 경우, 다공성 나노플레이트 구조체 및 백필(backfilled)된 요철형 나노구조체를 유도할 수 있다. 즉, 상기 치환 이온인 금 이온의 양(농도)을 조절함으로써, 제조되는 다공성 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체는 나노플레이트, 중공 나노플레이트, 나노골격 및 요철형 나노플레이트로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형상을 가질 수 있다(도 2 참조).

한편, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 단계는 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 첨가제가 포함된 조건 하에서 원팟(one-pot) 반응으로 수행될 수 있다. 구체적으로는 상술한 3종의 첨가제가 모두 포함된 조건 하에서 수행될 수 있다.

특히, 종래 기술에 따라 금 나노구조체를 제조할 때, 먼저 은 나노플레이트를 제조하게 되는데, 상기 은 나노플레이트가 제조된 다음 사용하였던 첨가제 성분들을 불순물로 상정하여 이를 제거 또는 정제한다. 다음으로, 은 나노플레이트를 금 나노플레이트로 이행시킬 때, 추가적인 성분들을 가하여 반응을 진행시키게 되는데, 본 발명은 은 나노플레이트를 제조한 후, 별도의 정제 혹은 첨가제 성분 제거 과정 없이 금 이온을 첨가하여 원팟(one-pot) 반응으로 금 나노구조체를 제조한다는 점에서 종래 기술 대비 차별화되며, 따라서 종래 기술 대비 경제성 및 공정 간편성 측면에서도 유리한 효과가 있고, 나아가 특정 첨가제 조합 하에서 반응을 수행함으로써 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상을 방지하고, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 도 있게 된다.

또한, 일반적으로 과량적 갈바닉 치환 반응을 이용한 변형 나노구조체 제조 시, 나노구조체의 심각한 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation)이 발생하는 문제점이 있었다. 본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 조건 하에서, 특히 상술한 3종의 첨가제가 모두 포함된 조건 하에서 반응을 수행하는 경우, 상기 첨가제들의 상승 작용 및 상호보완 효과에 의해 나노구조체의 파편화 및 응집이 효과적으로 방지될 수 있게 된다. 또한, 상술한 금(Au) 이온의 양(농도) 이외에, 상기 첨가제의 종류 및 첨가제 농도 역시 나노구조체 형상 제어를 가능하게 하는 요인으로 작용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit)은 표면-캡핑 안정제 역할을 수행하는 것으로서, 나노 물질의 분산에 기여할 수 있다. 시트르산 삼나트륨의 부재 시, 갈바닉 치환 반응의 부산물로 형성된 염화은(AgCl)이 생성된 작은 나노입자 조각 표면에 밀집하여 응집되는 문제가 있을 수 있다. 반면, 시트르산 삼나트륨을 첨가제로서 포함하는 경우 나노 물질 표면에서 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit)의 흡착 거동에 의해 야기된 추가적인 안정화 효과에 의해 위와 같은 문제를 효과적으로 방지할 수 있게 된다(도 3 참조).

본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 폴리(바이닐피롤리돈)(PVP)은 과량적 갈바닉 치환 반응에서 나노구조체의 파편화(fragmentation)를 방지하기 위한 것으로서, 폴리(바이닐피롤리돈)부재 시, 나노플레이트의 초기 구조가 유지되지 않고, 작은 파편(debris)으로 파편화되는 문제점이 있다. 일례로 도 4를 참조하면, [L-AA], [Na₃Cit] 및 [Au³⁺]가 10v/v% 로 고정된 상태에서, PVP 첨가제 농도를 조절하는 경우, 형성된 나노 구조체의 소광 스펙트럼이 NIR 영역에서 점차적으로 벗어나는 현상을 확인할 수 있고(도 4 (a) 참조), TEM 관찰 결과 적정 첨가량을 초과하는 경우 구형 나노껍질 형태가 주로 생성되는 것을 확인할 수 있다(도 4 (b) 참조, 스케일바: 100㎚).

본 발명의 일실시예에 따른 첨가제 중 하나인 L-아스코르브산(L-AA)은 2차 환원제로서, 갈바닉 치환 반응에 있어 파편화를 방지하고, 나노구조체를 2차 성장시키는 역할을 수행할 수 있다. L-AA 부재 시, 갈바닉 치환에 의해 나노구조체는 과량의 염화금산(AuCl₄ ^-)의 첨가에 의해 보다 빨리 변형되고, 특히 염화금산(AuCl₄ ^-)이 4v/v% 이상의 농도로 첨가될 때, 더 많은 파편화를 나타내게 된다. 일례로 도 5를 참조하면, [PVP], [Na₃Cit] 및 [Au³⁺]가 10v/v% 로 고정된 상태에서, L-AA 첨가제 농도를 조절하는 경우, 형성된 나노 구조체의 소광 스펙트럼 및 TEM 을 관찰하면, L-AA 농도가 증가할수록 구형 중공 나노구조체가 나노플레이트 대비 선택적으로 형성되는 것을 확인할 수 있고, 특히, L-AA의 높은 농도와 높은 반응 속도는 표면-흡착 PVP 대비 나노물질의 구조에 더 많은 영향을 끼치는 인자인 것을 확인할 수 있다(도 5 참조, 스케일바: 100㎚).

본 발명의 일실시예에 따르면, 첨가제로서 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산이 모두 포함된 조건 하에서 상기 단계가 수행될 수 있고, 일례로 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산은 은(Ag) 나노플레이트 전체 용액 40 ㎖ 를 기준으로, 각각 0.15 mM, 30 mM, 1 mM 의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 상기 농도로 포함되는 경우 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation)이 효과적으로 방지된다. 또한 제조되는 나노구조체는 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가진다(도 6 참조).

보다 구체적으로 살펴볼 때, 상술한 본 발명의 일실시예에 따른 변형된 나노구조체 제조는 갈바닉 치환 반응의 핵심 요소인 표준 환원 전위와 관련된 것으로 보인다. 수성 표준 수소 전극(SHE)에 대한 염화금산(AuCl₄ ^-) (aq) 및 은 이온(Ag⁺) (aq)의 표준 환원 전위는 각각 0.99 및 0.80V이고, 상기 값에 따르면, 은 나노플레이트와 염화금산(AuCl₄ ^-) 이온 사이의 갈바닉 치환은 드라이빙포스 0.19V의 열역학적으로 유리한 반응에 해당한다. 화학양론적 균형 방정식을 고려하면, Au (Ⅲ)의 환원은 3 당량의 Ag의 산화를 요구한다:

AuCl₄ ^-(aq) + 3Ag(s)

→ Au(s) + 4Cl^-(aq) + 3Ag⁺(aq)

→ Au(s) + 3AgCl(s) + Cl^- (aq) (1)

상기 화학양론은, 은 표면 원자가 금을 환원시키기에 충분하지 않아, 코어 은 원자가 소비된다는 것을 의미하고, 염화은(AgCl) 첨가물의 즉시 침전은 Le Chatelier의 원리에 따라, 은 표면의 산화를 선호한다. 한편, AgCl(s) 형태의 은 원자는 0.22V의 전위로 단일-전자 환원에 의해 회복될 수 있다.

한편, 갈바닉 치환 및 금속 원자와의 상호 작용에서의 L-AA의 영향을 살펴보면, 산화된 L-AA (L-AA(ox)로 표시됨)는 0.28-0.35V의 전위로 2 전자, 2 양성자 감소를 겪는 것으로 알려져 있는데, 0.35V의 환원 전위는 본 발명에서 각각의 산화환원 반응의 자발성을 조사하기 위해 선택된다. 표준 환원 전위 분석에 기초하면, 갈바닉 치환에서 L-AA의 참여 시, 단일 단계 및 두 단계 환원과 같은 두가지 특징적 환원 메커니즘을 거친다. 단일 단계 및 두 단계 환원은 Au(Ⅲ) 전구체와 L-AA 사이의 상호 작용에 있어서 차이가 있다. 단일 단계 환원은 갈바닉 치환 및 염화은(AgCl) 첨가물 형성 사이에서 경쟁적 환원으로부터 금의 직접 침전을 나타낸다(하기 표 1.(i)-3 참조). 식 (i)-1은 금 전구체와 은 나노플레이트 사이의 갈바닉 치환을 나타낸다. 모든 산화환원 반응은 발열 반응이며, 동시에 일어난다. 두 단계 환원의 경우, 하나의 중간 산화 상태인 Au(I)가 추가적으로 고려된다. AuCl₄ ^- 및 L-AA 사이의 두-전자 이동은 AuCl₂ ^-를 생성한다. AuCl₂ ^-는 1.11V의 환원 전위를 가지며, 이는 전자-공여 Cl 음이온의 손실 때문에 AuCl₄ ^-에 상응하는 값보다 0.11V 만큼 높다. 종래의 갈바닉 치환 반응은 두 단계 환원 동안 식 (ii)-2에 의해 치환되고, AuCl₄ ^-에서 AuCl₂ ^-로 금 전구체의 변화는 0.12V 만큼의 열역학적 드라이빙 포스를 증가시킨다(두 단계 환원 경로의 경우 0.31V, 기존 갈바닉 치환의 경우 0.19V). 이러한 분석에 따르면, 갈바닉 치환이 두 단계 환원 경로에서 L-AA에 의한 AuCl₄ ^-의 예비적 환원에 의해 촉진되는 것으로 보인다.

갈바닉 치환에서 금과 은 사이의 화학양론은 제안된 두 단계 환원 메커니즘에서 1 : 1로 변화되며, 이는 경쟁적 반응 경로에 의한 종전 갈바닉 치환 반응에서의 1 : 3의 비율에 비해 L-AA 존재 하에서 관찰된 느린 반응 종결을 설명한다. 또한, 1 : 1 의 비율은 산화환원 반응을 보다 제어가능하게 하고, 다른 형태를 가져올 수 있다. 이 지배적인 경로를 확인하는데 결정적인 증거는 없으나, 두 메커니즘 모두 작동하는 것에 있어서 동시에 서로 다른 기여를 하는 것으로 간주된다.

다공성 금 나노구조체

한편, 상술한 방법에 따라 제조된 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 금 나노구조체는, 금(Au) 및 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900 ㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과를 나타낸다(도 7 참조).

한편, 상술한 바와 같이, 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 금 나노구조체는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 첨가제 농도로 이루어지는 군에 선택되는 1종 이상의 인자를 조절함으로써, 형상이 제어된 형태로 제조될 수 있고, 구체적으로, 나노플레이트, 중공 나노플레이트, 나노골격 및 요철형 나노플레이트로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형상을 가지는 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체의 광열 전환 효과는 전자-포논 상호 작용을 통한 운동 에너지 전달에 대한 입사광 흡수 및 전자 진동에서부터 시작되는 것으로 보인다. 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체(pAuNPs)의 주된 흡수 파장은 UV-Vis-NIR 전영역이고, 800-900㎚ 영역에서도 우수한 흡광도를 가지므로, 특히 800-900㎚ 파장을 주로 활용하는 의약학적 활용에 적합하며, 이는 종래의 구형 나노입자와 비교하여 우수한 광열 전환 효과를 나타낸다.

한편, 상기와 같은 형상을 가지는 경우, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체의 적재가 용이하다. 이에 따라, 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 금 나노구조체는 다공성 금 나노구조체의 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체가 적재될 수 있다. 이와 같이 다공성 금 나노구조체의 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상이 적재되는 경우, 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가질 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 ICP-MS 분석을 통해 분석한 결과, 상기 다공성 금 나노구조체에 포함된 금(Au) 및 은(Ag)의 합금(alloy)은 금/은의 비율이 약 3.64에 해당하는 것을 확인할 수 있었다.

다공성 금 나노구조체에 대한 전달체 적재

한편, 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 금 나노구조체 제조방법는, 상술한 단계에 의해 제조된 다공성 금 나노구조체에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체를 적재하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 다공성 금 나노구조체는 약물 전달 및 치료 분야에서 일반적으로 사용되는 종래의 구형 금 나노입자와 비교할 때, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지므로, 약물 전달 및 치료 분야에서 더욱 효과적으로 활용될 수 있다.

이상으로 설명한 바와 같이, 은 나노플레이트 용액 제조 과정 중, 특정 첨가제가 포함된 조건 하에서 금(Au) 이온을 투입하여 다공성 금 나노구조체를 원팟(one-pot) 반응으로 간단하고 편리하게 제조하되, 특정 첨가제에 의해 다공성 금 나노구조체의 파편화(fragmentation) 및 응집(aggregation) 현상을 방지하며, 첨가되는 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 농도를 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 임의로 제어할 수 있다. 또한, 상기 방법에 따라 제조된 나노구조체는, 800 내지 900㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 대한 흡광도가 높아 우수한 광열-전환 효과를 나타내며, 높은 부피 대 표면 비율로 인해 전달체 적재가 용이하여 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지므로, 약물 전달 및 치료 분야에서 더욱 효과적으로 활용될 것으로 기대된다.

실시예

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 예시하고 하기에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

<실시예 1: 다공성 금 나노플레이트 제조>

은(Ag) 나노시드의 준비

10mM의 질산은(AgNO₃) 250㎕, 30mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 300㎕, 3.5mM의 폴리(바이닐피롤리돈)(Mw=29kDa) 1.5㎖ 및 24.75㎖의 탈이온수를 유리 바이알(vial)에 넣고, 30% 과산화수소 60㎕를 첨가한 다음, 균일한 혼합을 위해 부드럽게 교반하였다. 상기 혼합물에 100mM의 수소화붕소나트륨을 첨가하여 옅은 노란색으로 변색시켰다. 그런 다음, 3시간의 반응 시간 동안 투명, 짙은 노란색, 오렌지색, 그리고 최종적으로 보라색으로 변화가 일어난 후 추가적인 색상 변화가 진행되지 않는 것을 확인하고 별도의 정제 과정 없이 다음 성장 반응 단계로 이행하였다.

시드 성장법에 의한 은(Ag) 나노플레이트의 합성

상기 시드 용액 10㎖에 75mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 0.125㎖ 및 100mM의 L-아스코르브산 0.375㎖를 첨가하였다. 다음으로, 성장 용액은 1mM의 질산은(AgNO₃) 20㎖, 100mM의 시트르산 0.125㎖, 75mM의 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit) 10㎕와 함께 준비되었다. 상기 시드 용액 혼합물에 5㎖의 성장 용액을 5초당 1㎖의 속도로 첨가하여 은 나노플레이트를 제조하였다(도 1 참조). 추가적인 성장을 위해 5㎖의 성장 용액을 위와 같은 방식으로 첨가되었다. 환원제 보조 갈바닉 치환을 통해 금 나노플레이트를 제조하기 위해 별도의 정제 과정 없이 다음 변형 반응 단계로 이행하였다.

갈바닉 치환에 의한 다공성 금 나노플레이트의 합성

도 2 내지 7을 참조하면, 환원제 보조 갈바닉 치환을 위해, 첨가제를 상술한 바와 같이 포함하는 은(Ag) 나노플레이트 용액을 탈이온수(DI)에 희석시키고, 10㎖ 유리 바이알에 1㎖의 은 나노플레이트를 첨가하였다. 그런 다음, 1.5㎖의 탈이온수를 첨가하였다. 한편, 1, 2, 4, 10 및 20v/v%의 금 나노플레이트는 각각 1C의 AuCl₄ ^- 용액 50, 100, 200, 500 및 1000㎕의 첨가에 의해 제조되었다. AuCl₄ ^- 용액을 첨가한 후 혼합물은 실온에서 2시간 동안 배양되었으며, 최종 생성물은 8,000rpm에서 15분간 원심분리를 통해 정제되고, 탈이온수로 3회 세척되었다(도 2 내지 7 참조).

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따른 환원제 보조 과량적 갈바닉 치환 반응을 이해하기 위해, TEM에 의한 구조적 변형 캐스캐이드를 관찰하였다. 10 v/v%의 AuCl₄ ^- 치환 이온을 Na₃Cit, PVP 및 L-AA 함유한, 은 나노플레이트 주형에 첨가한 후, 반응 혼합물을 분배하고 원심 분리 기반 정제를 통해 켄칭(quenched)시켰다. 얻어진 TEM 이미지는 나노골격(5 분)에서 다공성 금 나노구조체(pAuNPs)(30 분)까지 순차적 구조 변환을 명확하게 나타내었다(도 6 참조). 가장 중요한 단계에서, 과량의 AuCl₄ ^- 첨가는 단일 단계 환원 경로(표 1. (i)-1)와 AuCl₂ ^- 이온 형성(표 1. (ii)-1) 모두에서 갈바닉 치환에 의해 소모될 수 있다. 다음으로, 두 단계 환원 경로에서 갈바닉 치환(표 1. (ii)-2)은 충분한 AuCl₂ ^- 이온의 발생과 단일 단계 경로의 0.19V에 비해 높은 0.31V의 높은 환원 전위로 인하여, 지배적인 치환 반응이 되었다. Ag(0) 및 AuCl₂ ^- 사이의 갈바닉 치환은 하나의 전달 전자 카운트의 화학양론적 균형으로 인해 단편화를 유도하지 않아야 한다. 게다가 이 단계에서, 기존의 환원제에 의해 Ag(I), Au(I), 및 Au(Ⅲ)의 환원이 주로 일어났다. 동시적인 금속 양이온 환원 및 새로이 생성된 Ag(0)의 AuCl₂ ^- 로의 추가적인 치환은 pAuNPs 에 대한 주형으로서 나노골격의 지속적인 성장을 유도했다. 이러한 경쟁적 성장 경로로 인해, 형성된 pAuNPs는 원소 맵핑 분석에서 금-은 합금 조성을 포함한 다공성 나노구조체를 나타내었다(도 7 참조). 은 및 금 나노구조체의 성장은 필-인(fill-in) 과정을 수행하기 위해, 나노 프레임의 내부 방향에 대해 고도로 조절되었으며, 이 특징은 흡착 구조적 지지체로서 역할을 수행할 수 있는 PVP의 농도에 주로 의존했다.

<실시예 2: TAT 펩티드, FAM-Dz 적재된 다공성 금 나노플레이트의 제조>

TAT 펩티드 접합

TAT 펩티드(1μM, 20㎕)가 포함된 증류수 저장 용액은, 1 OD의 흡광도 값을 가지는 1㎖의 다공성 금 나노플레이트에 첨가되었다. 다공성 금 나노플레이트에 대한 TAT 펩티드 적재를을 달성하기 위해, 반응 혼합물을 암실, 실온 조건에서 쉐이커로 180rpm의 속도로 12시간 배양하였다. 접합되지 않은 TAT 펩티드는 7,000rpm에서 각각 15분간 원심분리하여 제거하고, 증류수로 3회 세척하였다. 최종적으로 TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트를 1㎖의 1X PBS에 재분산시켰다(도 8 (c) 및 (d) 참조).

FAM-Dz 접합

FAM-Dz-SH(FDz; 10μM의 15㎕)가 포함된 증류수 저장 용액은, 1 OD의 흡광도 값을 가지는 1㎖의 다공성 금 나노플레이트에 첨가되었다. 다공성 금 나노플레이트에 대한 FDz 적재를을 달성하기 위해, 반응 혼합물을 암실, 실온 조건에서 쉐이커로 180rpm의 속도로 12시간 배양하였다. 접합되지 않은 기질은 7,000rpm에서 각각 15분간 원심분리하여 제거하고, 증류수로 3회 세척하였다. 최종적으로 FDz 적재된 다공성 금 나노플레이트를 1㎖의 1X PBS에 재분산시켰다. 적재된 FDz의 계산은 원심분리된 상층액에서 FAM(λ_ex=495 nm, λ_em=520 nm)의 형광 스펙트럼에 기초하였다(도 8 (e) 참조).

TAT 펩티드 및 FAM-Dz 이중 접합

10μM의 FDz 15㎕, 1μM의 TAT 펩티드 20㎕가 혼합되어 포함된 증류수 저장 용액은, 1 OD의 흡광도 값을 가지는 1㎖의 다공성 금 나노플레이트에 첨가되었다. 이어서, 반응 혼합물을 암실, 실온 조건에서 쉐이커로 180rpm의 속도로 12시간 배양하였다. 접합되지 않은 기질은 7,000rpm에서 각각 15분간 원심분리하여 제거하고, 증류수로 3회 세척하였다. 최종적으로 FDz/TAT 펩티드가 동시에 적재된 다공성 금 나노플레이트를 1㎖의 1X PBS에 재분산시켰다. 적재된 FDz의 계산은 원심분리된 상층액에서 FAM의 형광 스펙트럼에 기초하였다.

FAM-Dz 방출 프로파일

세포질-모방 조건 하에서 적재된 FDz의 방출을 모니터링하기 위하여, FDz 적재된 다공성 금 나노플레이트를 실온 조건 하에서 2mM의 글루타티온(glutathione)을 포함/포함하지 않는 PBS(pH 7.4) 용액에 분산시켰다. 0, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 18 및 24시간의 관찰에서, FDz 적재된 다공성 금 나노플레이트 용액은 Centrifuge 5148(Eppendorff, Germany)에 의해 7000rpm에서 15분간 원심분리하여, 나노복합체를 풀어내고, 방출된 FDz의 양은 각각 FAM의 형광 스펙트럼을 측정하여 결정하였다(도 8 (e) 참조).

<실험 1: 광열 전환 특성>

온도 상승 측정

광열 전환에 의한 온도 상승을 평가하기 위해, 1 OD의 흡광도 값을 갖는 1㎖의 다공성 금 나노플레이트와 대조군으로서 1X PBS를 2㎖ 튜브에 넣었다. 808㎚의 NIR 레이저를 3분 동안 4W/cm²의 강도로 각 용액에 조사하고, 매 30초마다 디지털 온도계로 온도 변화를 측정하였다(도 8 (a) 및 (b)참조).

세포 기반 발열 측정

광열 전환에 의한 발열을 측정하기 위해, 1X PBS 중의 TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트를, 12-웰 플레이트에 80,000 cells/well의 컨플루언시(confluency)로 씨딩된 NS3 레플리콘 Huh7 세포에 처리하였다. 5% 습도의 37℃ 조건 CO₂ 인큐베이터에서, 6시간 동안 배양한 후, 잔류 TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트를 제거하고, 1X PBS로 2회 세척한 후 혈청 함유 배지(serum-containing media)로 교체하였다. 다음으로, 세포를 주위 조건 하에, 808㎚의 NIR 레이저를 5분 동안 4W/cm²의 강도로 조사하고, 12시간 동안 추가적으로 배양하였다. 배양 후, 결합된 live/dead 세포 염색 용액(2 μM calcein AM 및 4 μM D-PBS 중의 EthiD-1) 500㎕를 각 웰에 첨가하고, 염색을 위해 20분 동안 배양하였다. 형광 현미경을 이용하여 세포들의 형광 이미지를 얻었다(도 8 (a) 및 (b)참조).

흡수 파장으로부터 기대되는 광열 변환 효과를 조사하기 위하여, pAuNPs의 근적외선 조사 하에서 온도 상승을 측정하였다. 이들은 cuvette assay에서, 808 ㎚ NIR 레이저 조사에 180s 노출되면 49.8℃(△T =26.5 ℃)에 이르는 유의적인 온도 상승을 나타내며, pAuNPs가 없는 1X 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)는 단지, 24.7℃(△T = 0.7℃, 도 8a)에 이르는 무시할 수 있는 온도 변화를 나타낸다.

관련한 내용을 상세히 설명하면, 유전자-발열 복합 항암 치료에서의 pAuNPs의 적용의 검증을 위해 인간 면역 결핍 바이러스 CGGYGRKKRRQRRR 의 전사(TAT) 세포 침투 펩티드 전사촉진제(밑줄친 문자는 TAT 펩티드의 필수적 서열을 나타냄)를 pAuNPs 표면으로 적재하는 과정 및 세포 독성 시험을 수행할 수 있다. 시스테인 말단의 측쇄로부터의 노출된 금 표면과 티올 작용기 사이의 화학적 친화력을 이용하여 pAuNPs의 표면 상에 TAT 펩타이드를 성공적으로 적재할 수 있다. 이는 동적 산란광(DLS)에 의해 유체역학 반경의 증가(63.75 ± 0.58 ㎚ (pAuNPs)에서 73.04 ± 0.31 ㎚ (TAT-pAuNPs)까지) 및 양전하를 띠는 TAT펩티드의 적재로 제타 전위가 증가(-18.8 ± 0.18)mV(pAuNPs)에서 -14.1 ± 0.48mV (TAT-pAuNPs) 까지) 한 것으로부터 간접적으로 확인될 수 있다(도 8d). 상기 TAT 펩티드 적재에 의한 pAuNPs의 세포 내재화 향상은 현미경을 이용한 밝은 필드 이미지의 비교를 통하여 명확히 관찰될 수 있다(도 8c). pAuNPs가 세포 내로 도입되는 경우는 거의 없었으나, TAT-pAuNPs는 밝은 필드 이미지에서 검은 점으로 관찰될 수 있다. pAuNPs의 세포 독성은 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetraza-lium bromide)(MTT)를 사용한 세포 생존능 분석에 의해 조사될 수 있다. MTT 분석 데이터에 따르면, pAuNPs와 TAT-pAuNPs는 모두 0.45의 나노 입자 광학 밀도(OD)로 93% 이상의 탁월한 세포 생존력을 나타내는 것을 확인할 수 있다(도 9 참조). TAT 펩티드 결합에 의한 향상된 세포 내재화 능력 및 낮은 세포 독성을 기초로 하여, TAT-pAuNPs의 0.45 OD에서 유전자 전달 및 치료 분석을 위한 세포-기반 연구가 수행되었으며, TAT-pAuNPs의 광열 전환에 의한 암 세포 발열 치료는 808 ㎚ 근적외선 조사 후 인간 간암-운반 HCV 비구조 단백질 3(NS3) 레플리콘(Luc-Neo NS3 레플리콘 Huh7)의 처리에 의해 확인되었다. calcein AM과 EthiD-1로 살아있는/죽은 세포 염색 후, 형광 현미경 이미징(도 8b 참조)에 의해 발열 치료된 디자인 영역이 관찰되었다.

한편, HCV의 NS3-암호화된 게놈 RNA 결합 및 절단을 위한 DNAzyme(DZ) 서열이 유전자 전달을 위해 수행되었다. Dz에 대한 적재 전략은 TAT 펩티드 결합에서와 같이 금과 말단-표지된 티올 사이의 상호작용을 동일하게 활용하였다. 형광-표지된 Dz(FAM-Dz; 5'-FAM-AAT GGG GAG GCT AGC TAC AAC GAG GCT TTG C-티올-3 ', DNAzyme의 촉매 모티프)를 사용하여 편리하게 세포내 전달을 정량하고 확인하였다. 1 OD의 소광 값을 가지는 pAuNPs에 다양한 농도의 FAM-Dz를 첨가하고 배양하여, 적재 용량 및 효율을 조사하였다. FAM-Dz의 적재 과정을 최적화함으로써, 150pmol의 FAM-Dz를 1OD의 pAuNPs에 첨가하였고, 적재 프로파일을 24시간 동안 관찰하였다. 처음 3시간 이내에, ~50%의 FAM-Dz가 pAuNPs의 표면에 접합되었고, 그 이후에는 거의 적재되지 않았다(도 8e 참조). pAuNPs에 적재된 FAM-Dz의 세포내 방출을 분석하기 위하여, 결합된 FAM-Dz와의 리간드 교환을 위한 고농도의 글루타티온(2mM GSH, 1X PBS)을 포함하는 모방된 세포 내 환경에서 FAM-Dz의 방출 프로파일을 24시간 에 걸쳐 얻었다. 대조 실험(0 mM GSH, 1X PBS)은 FAM-Dz의 2% 방출을 나타내는 반면, ~68%의 FAM-Dz는 모방된 세포내 환경 내에서 24시간 동안 방출되었다(도 8f 참고). 치료에 응용하기 위한 FAM-Dz 및 TAT 펩티드의 동시 적재는 이들을 pAuNPs에 위치시킴으로써 수행되었다. 적재 용량은 번잡함과 경쟁적 바인딩에 의해 감소(~11.8%)되었다(도 8e).

마지막으로, NS3 레플리콘 Huh7 세포에 대한 FAM-Dz/TAT-pAuNPs의 사용에 의한 발열-유전자 이중-모달 치료의 치료 효능을 평가하였다. 비치료된 세포(100% 생존)의 대조군과 비교한 결과, NIR 방사선 조사(93.69 %), pAuNPs(101.75 %) 및 TAT-pAuNPs(99.68%), 단일 모달 치료는 다소 향상된 치료 효율을 보였다. 유전자(FAM-Dz), FAM-Dz-pAuNPs (81.14 %) 및 FAM-Dz/TAT-pAuNPs (47.45% 생존)의 단일 치료의 경우, 프리 FAM-Dz 치료(98.65% 생존)에 비해 유의미한 세포 생존 감소를 나타내었다.

<실험 2: 세포 생존능 분석>

세포 배양

NS3 C형 간염 바이러스 RNA를 함유하는 인간 간암 세포주 Huh7을 10% FBS, 100 units/㎖의 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 500 ㎍/㎖ 의 G418을 보충한 4.5 g/L D-글루코스(D-glucose)를 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. 세포를 5% 습도의 37℃ 조건 CO₂ 인큐베이터에서 성장시켰다(도 9 및 10 참조).

세포 생존능 측정을 위한 MTT 분석

MTT 분말을 5mg/㎖ 농도의 1X PBS에 용해시키고, 0.2㎛ 공극 크기를 가지는 멸균 주사기 필터를 통해 여과시켰다. 저장 용액은 4℃에서 보관하였다. NS3 레플리콘 Huh7 세포는 100㎕의 성장 배지(약 ~50-70%의 confluency)를 갖는 96-웰 배양 플레이트의 1 웰당 10,000 세포의 밀도로 씨딩(seeded)하였다.

TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트 및 다공성 금 나노플레이트 매개 약물 전달 효율을 비교하기 위하여, 무혈청 배지에서 세포를 프리 FDz, FDz 적재 다공성 금 나노플레이트 및 FDz/TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트로 처리하고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 1X PBS로 2번 씻어서 혈청 함유 배지로 교체하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 1X PBS로 두번 헹구었다. 0.5mg/㎖의 MTT 농도에서 무혈청 배지(100㎕)를 세포에 보충하고, 보라색이 발현되어 대사 활성 세포를 검출할 때까지, 2시간 동안 배양하였다. 배지를 버리고, 세포를 1X PBS로 1회 헹구었다. 이어서, 100㎕의 디메틸술폭시드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여, 수-불용성 포르마잔(formazan)염을 가용화시켰다. 플레이트 내의 각 웰의 광학 밀도를 560㎚에서 측정하였다. 삼중 값의 평균 및 표준편차가 계산되고, 플롯되었다.

다공성 금 나노플레이트 기반 화학요법과 근적외선(NIR) 조사의 상승효과를 조사하기 위하여, 무혈청 배지에서 프리 FDz, TAT 펩티드 적재된 다공성 금 나노플레이트 및 TAT/FDz 적재된 다공성 금 나노플레이트로 세포를 처리하고, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포를 1X PBS로 2회 헹구고, 혈청 함유 배지로 교체하였다. 다음으로, 세포를 대기 조건 하에, 808㎚의 NIR 레이저를 2분 동안 4W/cm²의 강도로 조사하고, 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 1X PBS로 2회 헹구었다. 0.5mg/㎖의 MTT 농도에서 무혈청 배지(100㎕)를 세포에 보충하고, 보라색이 발현되어 대사 활성 세포를 검출할 때까지, 2시간 동안 배양하였다. 배지를 버리고, 세포를 1X PBS로 1회 헹구었다. 이어서, 100㎕의 디메틸술폭시드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여, 수-불용성 포르마잔(formazan)염을 가용화시켰다. 플레이트 내의 각 웰의 광학 밀도를 560㎚에서 측정하였다. 삼중 값의 평균 및 표준편차가 계산되고, 플롯되었다(도 9 및 10 참조).

또한, 열적 단일치료 테스트에서, 근적외선 조사 하에서 TAT-pAuNPs는(45.96% 생존) 암 세포 제거에 근적외선 조사 하에서 pAuNPs 단독보다(97.53% 생존) 훨씬 더 높은 치료 효율을 나타내었다. 이러한 결과는 치료 효과에 있어서, 전달 수단의 중요성을 나타낸다. 본 평가에서, 이중-모달 접근과의 비교를 강조하기 위해, 시험관 내 발열 테스트에 사용된 것과 비교하여 808㎚ 근적외선 레이저 출력(또는 조사 시간)이 감소되었다. 치료는 매우 효과적인 암 세포 절제 효율(10.98% 생존)을 나타내었으며, 복합 치료의 시너지 효과를 성공적으로 확인하였다(도 10a 참조). FAM-Dz 전달 및 유전자-발열 복합 치료로부터 세포 생존력의 변화를 시각화하여 보여주기 위하여, 형광현미경을 사용하여 Hoechst33342(청색) 및 EthiD-1(적색)으로 염색하는 것이 조사되었다. 방출된 FAM-Dz로부터 녹색 형광, 아폽토시스 세포로부터 적색 형광은 세포 생존력 테스트 결과와 높은 일치를 보였다(도 10b 참조).

Claims

질산은(AgNO₃) 용액으로부터 은 나노플레이트 용액을 제조하고, 상기 은 나노플레이트 용액 내에 금(Au) 이온을 투입하여 갈바닉 치환 반응을 수행시킴으로써, 금 이온이 치환된 다공성 금 나노구조체를 제조하는 단계를 포함하며,
상기 단계는 시트르산 삼나트륨(Na₃Cit), 폴리(바이닐피롤리돈) 및 L-아스코르브산을 첨가하여 원팟(one-pot) 반응으로 수행되는 다공성 금 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 제조된 다공성 금 나노구조체에 DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체를 적재하는 단계;를 더 포함하는 다공성 금 나노구조체 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계에서 금(Au) 이온은, 은(Ag) 나노플레이트 전체 용액 부피를 기준으로, 1 내지 20% 로 투입되는 다공성 금 나노구조체의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 금(Au) 이온의 양, 첨가제의 종류 및 첨가제 농도로 이루어지는 군에 선택되는 1종 이상의 인자를 조절하여, 제조되는 나노구조체의 형상을 제어하는 다공성 금 나노구조체의 제조방법.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는 다공성 금 나노구조체로서,
금(Au) 및 은(Ag)의 합금(alloy)을 포함하며, 800 내지 900 ㎚ 파장 영역의 근적외선(NIR) 레이저 조사에 의해 광열-전환 효과 및 암 세포에 대한 선택적인 유전자-발열 복합 치료능을 가지는 다공성 금 나노구조체.
제 5 항에 있어서,
상기 다공성 금 나노구조체는 나노플레이트, 중공 나노플레이트, 나노골격 및 요철형 나노플레이트로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 형상을 가지는 다공성 금 나노구조체.
제 5 항에 있어서,
상기 다공성 금 나노구조체의 기공 내부 및 표면 중 선택되는 하나 이상의 위치에, DNA 기반 효소(DNAzyme) 및 TAT 세포침투 펩티드 중 선택되는 1종 이상의 전달체가 적재된 다공성 금 나노구조체.
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