KR102051811B1 - Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter - Google Patents

Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter Download PDF

Info

Publication number
KR102051811B1
KR102051811B1 KR1020180074546A KR20180074546A KR102051811B1 KR 102051811 B1 KR102051811 B1 KR 102051811B1 KR 1020180074546 A KR1020180074546 A KR 1020180074546A KR 20180074546 A KR20180074546 A KR 20180074546A KR 102051811 B1 KR102051811 B1 KR 102051811B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glucose
biosensor
cell membrane
biological sample
present
Prior art date
Application number
KR1020180074546A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20190013474A (en
Inventor
김인수
권도형
윤대성
이동택
이상원
이규도
Original Assignee
고려대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교산학협력단 filed Critical 고려대학교산학협력단
Priority to US16/031,251 priority Critical patent/US11045119B2/en
Publication of KR20190013474A publication Critical patent/KR20190013474A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102051811B1 publication Critical patent/KR102051811B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Abstract

본 발명은 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 프럭토스, 자일로스, 말토스, 시스테인, 아스코르브산, 요산, 갈락토오스 등과 같은 신호방해물질의 첨가에도 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된, 세포막으로 이루어진 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다. The present invention relates to a biosensor for measuring glucose, and more particularly, to a biosensor for glucose measurement in a biological sample including a filter unit consisting of a cell membrane for selectively permeating glucose in a biological sample. The biosensor of the present invention includes a filter unit consisting of a cell membrane for selectively permeating glucose in a biological sample, and thus has a higher sensitivity to detecting glucose than conventionally used blood glucose measurement sensors, and at the same time, fructose, xylose, maltose, The addition of signal blockers, such as cysteine, ascorbic acid, uric acid, galactose, and the like, also has high glucose detection specificity. In addition, the filter unit consisting of the cell membrane included in the glucose measurement biosensor according to the present invention is not significantly affected by changes in conditions in the air such as moisture and moisture. It can be applied to various products.

Description

세포막으로 이루어진 필터를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서{Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter}Biosensor for measuring glucose including filter consisting of cell membranes

본 발명은 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor for measuring glucose, and more particularly, to a biosensor for glucose measurement in a biological sample including a filter unit consisting of a cell membrane for selectively permeating glucose in a biological sample.

당뇨병은 체내에 흡수된 글루코스를 제대로 사용하지 못하는 부적절한 탄수화물 대사로 인하여 발생하며, 혈액 내에 과다한 혈당을 가지게 되어 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다. 이는 크게 세 가지로 분류되며, 제1형 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병으로, 이자 세포의 자가면역반응에 의하여 인슐린을 합성하거나 분비하는 기능을 상실하는 타입이라 할 수 있다. 다음으로, 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로, 인슐린에 대한 체내 저항성 또는 부적절한 인슐린 분비 등에 의해 발병한다. 그 외에 임신 중 발생할 수 있는 태아 당뇨병이 있다. 그러나 제1형 당뇨병과 태아 당뇨 형태의 당뇨병은 흔하지 않으며, 당뇨병 중 대부분은 제2형 당뇨병으로서 선진국 당뇨질환 중 90 내지 95%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있다. Diabetes is caused by inadequate carbohydrate metabolism in which glucose is not properly absorbed in the body and has excessive blood sugar in the blood and can cause various complications. This is classified into three categories, type 1 diabetes mellitus is insulin-dependent diabetes mellitus, a type that loses the function of synthesizing or secreting insulin by the autoimmune response of the cells. Next, type 2 diabetes is insulin-independent diabetes, which is caused by resistance to insulin or inappropriate insulin secretion. Other fetal diabetes may occur during pregnancy. However, diabetes mellitus of type 1 and fetal diabetes is not common, and most of the diabetes is type 2 diabetes, which accounts for 90% to 95% of diabetes in developed countries.

현대인의 식습관, 정신적 스트레스, 생활 패턴에 의하여 대사성 질환에 해당하는 당뇨병을 앓는 환자의 수는 계속 늘어나는 추세이고, 구체적으로는 2015년 기준 전 세계의 약 9%인 4억1500만명으로 추산되며, 2040년에는 당뇨병 환자가 약 10%인 6억4200만명으로 증가할 것으로 추정된다. 이에 따라 연간 6730억 달러에 달하는 비용이 소모되고 있으며 이는 전체 헬스케어 시장의 12%에 해당한다(국제 당뇨 연맹).The number of patients suffering from diabetes mellitus, which is a metabolic disease, continues to increase due to modern people's eating habits, mental stress, and life patterns. Specifically, it is estimated at 415 million people, about 9% of the world as of 2015, 2040 It is estimated that the number of diabetics will increase to about 620 million, or 10%, per year. As a result, it costs $ 673 billion annually, accounting for 12% of the entire healthcare market (International Diabetes Federation).

당뇨병을 앓은 환자들은 주기적으로 인슐린을 투여하여야 하며, 정확한 인슐린의 투여를 위해 글루코스 센서라고 불리는 자가 혈당 진단 기기를 이용하게 된다. 이러한 기기의 이용은 인슐린 투여 시간과 용량의 결정에 매우 중요하며 이는 결국 당뇨병 치료에 중요한 부분을 차지한다. 또한, 전세계적으로 4억 명 정도의 환자들이 매일 5~10여개의 센서를 사용하며 이는 자가 혈당 측정이 당뇨병 환자에게 중요한 것임을 반증한다. Patients with diabetes must periodically administer insulin and use an autologous glucose diagnostic device called a glucose sensor for accurate insulin administration. The use of such a device is very important in determining insulin administration time and dose, which is an important part of diabetes treatment. In addition, 400 million patients worldwide use about 5 to 10 sensors each day, which proves that self-blood glucose measurement is important for diabetics.

상기와 같은 혈당 진단 기기들은 일반적으로 전기 화학적 방식을 사용해 신속하며 높은 정밀도를 가지는 것을 목표로 한다. 특히 효소를 사용한 방법으로 글루코스 산화효소(Glucose oxidase) 혹은 글루코스 탈수소효소(Glucose dehydrogenase)를 이용하여 혈액 내의 글루코스를 전기적인 신호로 바꾸어 측정하는 기술이 상용화되어 있다. 즉 혈액 속의 글루코스가 상기 효소들과 만나면서 산화-환원반응을 촉진시키게 되면 글루코스는 산화되고 전자 전달 물질 (물 또는 조효소)은 환원되어 전기적 신호를 띄게 된다. 환원된 전자 전달 물질이 전극과 만나 전자를 주어 발생한 전기적 신호의 세기를 측정하여 용액 혹은 혈액의 글루코스 농도를 빠른 시간 내에 측정한다. 다만, 상기와 같은 효소 기반 글루코스 센서는 효소의 안정성, 산소 의존 또는 매개체의 역할, 효소 침출 면에서 많은 문제점이 있다. GOx는 pH 4 이하 및 pH 7 이상에서 빠르게 그 활성을 상실하고 70℃ 이상에서 빠르게 변성된다. 고습도 및 저습도는 센서의 저장 뿐만 아니라 사용에도 유해하다. Such blood glucose diagnostic devices generally aim to be fast and have high precision using an electrochemical method. In particular, an enzyme-based method has been commercialized by measuring glucose in the blood by an electrical signal using glucose oxidase or glucose dehydrogenase. That is, when glucose in the blood meets the enzymes to promote the oxidation-reduction reaction, the glucose is oxidized and the electron transfer material (water or coenzyme) is reduced to give an electrical signal. The reduced electron transfer material meets the electrode and gives electrons to measure the strength of the generated electrical signal to quickly measure the glucose concentration of the solution or blood. However, the enzyme-based glucose sensor as described above has many problems in terms of enzyme stability, oxygen dependence or mediator, and enzyme leaching. GOx quickly loses its activity below pH 4 and above pH 7 and rapidly denatures above 70 ° C. High humidity and low humidity are harmful to the storage as well as the use of the sensor.

그 외에도 최근 비침습적으로 혈당을 측정하는 기기가 등장하기 시작하였으나 이들 혈당 측정 기기는 여전히 채혈 또는 채뇨 등을 통한 혈당 측정 기기에 비하여 글루코스 농도 검출 효율이 현저하게 낮고, 채혈 또는 채뇨를 통한 글루코스 측정 기기 또한 신호방해입자들에 의한 글루코스 검출 효율 및 정확도가 떨어지는바 직접적으로 글루코스 농도를 측정하는 대신 당화헤모글로빈 검출 등 혈당을 측정하기 위하여 다양한 우회적인 방법을 이용해왔다. 이에, 직접적인 글루코스 검출이 가능하며, 동시에 글루코스 검출 효율 및 정확도가 높은 당뇨병 진단 방법에 대하여 연구를 진행하던 중 본 발명의 세포막 필터를 이용한 생물학적 시료 내 글루코스 검출용 바이오센서를 완성하였다. In addition, recently, non-invasive blood glucose measuring devices have appeared, but these glucose measuring devices still have significantly lower glucose concentration detection efficiency than blood glucose measuring devices through blood collection or urine collection, and glucose measurement devices through blood collection or urine collection. In addition, the efficiency and accuracy of glucose detection by signal-inhibiting particles are inferior. Instead of directly measuring glucose concentration, various bypass methods have been used to measure blood glucose such as glycated hemoglobin detection. Thus, while direct glucose detection is possible, and at the same time research on a method for diagnosing diabetes with high glucose detection efficiency and accuracy, a biosensor for detecting glucose in a biological sample using the membrane filter of the present invention was completed.

KRKR 10-2013-005930410-2013-0059304 AA KRKR 10-2017-005318910-2017-0053189 AA

본 발명의 목적은 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내글루코스 측정용 바이오센서, 이를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트, 및 상기 바이오센서를 이용한 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a biosensor for measuring glucose in a biological sample comprising a filter unit consisting of a cell membrane, a kit for measuring glucose in a biological sample comprising the same, and a method for measuring glucose concentration in a biological sample using the biosensor.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제1 양태는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서로서, 상기 필터부는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서를 제공한다. In order to achieve the above object, a first aspect of the present invention is a biosensor for glucose measurement comprising a filter unit consisting of a cell membrane, wherein the filter unit selectively transmits glucose in a biological sample, the biosensor for glucose measurement in a biological sample Provide a sensor.

또한, 본 발명의 제2 양태는 상기 바이오센서를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트를 제공한다.In addition, a second aspect of the present invention provides a kit for measuring glucose in a biological sample, comprising the biosensor.

또한, 본 발명의 제3 양태는 상기 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공한다.In addition, a third aspect of the present invention provides a method for measuring glucose concentration in a biological sample, comprising contacting the biological sample with the biosensor.

본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 아스코르브산, 요산 또는 갈락토오스와 같은 신호방해물질의 첨가에도 생물학적 시료 내 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된, 세포막으로 이루어진 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 본 발명의 바이오센서는 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다. The biosensor of the present invention includes a filter unit consisting of a cell membrane that selectively permeates glucose in a biological sample, and thus has a higher sensitivity to detecting glucose than conventionally used blood glucose measurement sensors, and at the same time, interferes with signals such as ascorbic acid, uric acid or galactose. The addition of a substance also has high specificity for detecting glucose in biological samples. In addition, the filter unit made of the cell membrane included in the glucose measurement biosensor of the present invention is not significantly affected by conditions such as moisture and moisture in the air. The biosensor of the present invention is a disposable blood glucose test paper, an adhesive or It can be applied to a variety of products, such as implantable glucose measuring instruments.

도 1은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 원리를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 구조를 도식화하여 나타낸 도이다. 도 2에서 (iii)은 필터부, (ii)는 센서부, (i)은 측정부이고, 해독부는 도면상에 나타나진 않으나 센서의 뒤쪽 부분에 회로를 연결하여 전기화학장비 (potentiostat)에 연결되는 형태이다.
도 3은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서를 제조하기 위하여, 적혈구로부터 세포막을 분리하여 센서부에 도포하는 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 4는 SEM 분석을 통해 글루코스 측정용 바이오센서의 표면을 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 4a는 세포막 필터를 도포한 실험군에 대한 결과를 나타낸 도이고, 도 4b는 대조군에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 바이오센서 내 필터부 두께 차이에 따른 신호 전달 효율을 확인한 결과를 나타낸 도로, (a)는 적혈구 세포막의 농도와 필터부 두께의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도이고, (b)는 적혈구 세포막의 농도와 전류량간의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도이며, (c)는 (b)의 결과 중 3초 내지 10초 사이의 선형성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 암세포 세포막의 두께에 따른 전류량의 관계를 나타낸 도이다.
도 7은 글루코스 농도 변화에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 전류량으로 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 7b는 도 7a 중 일부 농도 범위(2.5~10 mM)를 확대한 도이다.
도 8은 본 발명에 따라 암세포 세포막(2.5%)이 도포된 바이오센서에 대해 글루코스 농도를 달리하여 Cyclic voltammetry(CV) 방식으로 전류량을 측정한 결과를 나타낸 도이고(a); 글루코스의 농도에 따른 CV 측정 신호 중 가장 높은 값(peak current)를 모아 글루코스 농도에 대한 전류량 관계를 나타낸 도이다(b). 각 점들을 이은 linear fitting 값과 그 식을 그래프 내부에 나타냈다.
도 9는 신호방해물질 첨가에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 9a는 아스코르브산(ascorbic acid, AA), 도 9b는 요산(uric acid, UA), 도 9c는 갈락토오스(galactose, GA), 도 9d는 AA, UA 및 GA를 모두 첨가한 결과이다.
도 10은 암세포 세포막을 도포하지 않은 바이오센서(a)과, 암세포 세포막을 도포한 바이오센서(b)를 대상으로 글루코스 외의 물질(방해물질)에 대해 얼마나 신호를 나타내는지를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.(G: glucose 5 mM, F: fructose 5 mM, Xy: xylose 5 mM, Mal: maltose 1 mM, Cys: cysteine 1 mM, AA: ascorbic acid 1 mM, UA: uric acid 0.5 mM).
도 11은 혈청 내 글루코스 농도 증가에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 적혈구 세포막(RBCM)을 필터로 포함하는 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 필터로 포함하는 바이오센서의 혈청(serum)에 대한 신호를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 공기 중 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.1 is a view showing the principle of the biosensor for glucose measurement of the present invention.
Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of the biosensor for glucose measurement of the present invention. In FIG. 2, (iii) is a filter part, (ii) is a sensor part, (i) is a measuring part, and a readout part is not shown in the drawing, but a circuit is connected to the rear part of the sensor and connected to a potentiostat. It is a form.
3 is a diagram illustrating a process of separating a cell membrane from red blood cells and applying it to a sensor unit in order to manufacture the glucose sensor for measuring glucose of the present invention.
Figure 4 is a road showing the result of confirming the surface of the biosensor for glucose measurement through SEM analysis, Figure 4a is a view showing the results for the experimental group to which the membrane filter applied, Figure 4b is a view showing the results for the control group.
Figure 5 is a road showing the results of confirming the signal transmission efficiency according to the difference in the thickness of the filter in the biosensor, (a) is a diagram showing the result of confirming the correlation between the concentration of the red blood cell membrane and the filter portion, (b) is a red blood cell It is a figure which shows the result which confirmed the correlation between the density | concentration of a cell membrane, and (c) is a figure which shows the result of analyzing the linearity between 3 second-10 second among the results of (b).
6 is a view showing the relationship between the amount of current according to the thickness of the cancer cell membrane.
7 is a diagram showing the results of confirming the glucose detection sensitivity of the biosensor according to the change in glucose concentration as a current amount, Figure 7b is an enlarged view of some concentration range (2.5 ~ 10 mM) in Figure 7a.
Figure 8 is a diagram showing the results of measuring the amount of current by the Cyclic voltammetry (CV) method by varying the glucose concentration for the biosensor cell membrane (2.5%) coated biosensor according to the present invention (a); (B) is a graph showing the relationship between the amount of current to glucose concentration by collecting the peak value of the CV measurement signal according to the concentration of glucose (b). The linear fitting values followed by the points and their equations are shown inside the graph.
9 is a road showing the result of confirming the glucose detection specificity of the biosensor according to the addition of a signal interrupter, Figure 9a is ascorbic acid (AA), Figure 9b is uric acid (UA), Figure 9c is galactose ( galactose, GA), Figure 9d is the result of adding all AA, UA and GA.
FIG. 10 is a graph showing a result of measuring how much signal is displayed for a substance other than glucose (interfering substance) in a biosensor (a) not coated with a cancer cell membrane and a biosensor (b) coated with a cancer cell membrane. (G: glucose 5 mM, F: fructose 5 mM, Xy: xylose 5 mM, Mal: maltose 1 mM, Cys: cysteine 1 mM, AA: ascorbic acid 1 mM, UA: uric acid 0.5 mM).
11 is a diagram showing the results of confirming the glucose detection sensitivity of the biosensor according to the increase in the concentration of glucose in the serum.
FIG. 12 is a diagram illustrating a result of measuring a signal of a serum of a biosensor including a red blood cell membrane (RBCM) as a filter and a biosensor including a cancer cell membrane (CCM) as a filter.
13 is a view showing the results of confirming the stability in the air of the glucose sensor for measuring glucose of the present invention.

이하, 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the invention will be described in detail.

본 발명의 일 양태는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서로서, 상기 필터부는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 것인, 글루코스 측정용 바이오센서를 제공한다. One aspect of the present invention provides a biosensor for glucose measurement comprising a filter unit consisting of a cell membrane, wherein the filter unit selectively transmits glucose in a biological sample.

본 발명에 있어서, '바이오센서'는 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질의 성질 등을 조사하는 기계로서 피분석물의 검출을 위해 사용하는 분석장치를 지칭하는 것으로, 크게 감지성 생물적 요소(sensitivity biological element), 전도체 또는 검출 요소(transducer or the detector element) 및 바이오센서 해독 장치(biosensor reader device)를 가지는 것이 특징이며, 본 발명의 목적상 상기 바이오센서는 글루코스 센서로 해석될 수 있다. In the present invention, the 'biosensor' refers to an analytical device used for detecting an analyte as a machine for investigating the properties of a substance using a function of a living organism, and is largely sensitive to a biological element (sensitivity). a biological element, a conductor or a detector element, and a biosensor reader device. For the purposes of the present invention, the biosensor can be interpreted as a glucose sensor.

본 발명에 있어서, 바이오센서는 체내 이식형, 패치형 또는 1회용 혈당 시험지에 적용되는 형태일 수 있으며, 글루코스 측정을 목적으로 하는 한 어떠한 형태로든 제한되지 않는다. In the present invention, the biosensor may be a form applied to an implantable body, a patch form, or a disposable blood glucose test paper, and is not limited to any form as long as it is for the purpose of measuring glucose.

본 발명에 있어서, 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부; 투과된 글루코스를 인식하는 센서부; 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 해독(read)부;를 포함하며, 센서부와 해독부 사이에 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 측정부를 더 포함할 수 있다. In the present invention, the biosensor is a filter unit consisting of a cell membrane, selectively permeable glucose in a biological sample; A sensor unit for recognizing transmitted glucose; And a reading unit for reading the signal by the recognized glucose. The measurement unit may further include a measurement unit for converting the recognized glucose between the sensor unit and the reading unit into a signal.

본 발명에 있어서, '생물학적 시료'는 글루코스를 포함하고 있는 분석대상을 지칭하는 것으로, 혈액, 소변, 땀, 눈물 등을 포함하며, 바람직하게는 혈액이나 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the "biological sample" refers to an analyte including glucose, and includes blood, urine, sweat, tears, and the like, and preferably, but not limited thereto.

본 발명에 있어서, '필터부'는 생물학적 시료를 정제하는 구역을 의미하는 것으로, 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 역할을 한다. 본 발명에 따른 '필터부'는 '세포막'으로 이루어져있으며, 상기 세포막은 적혈구 또는 암세포로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the 'filter unit' means a region for purifying a biological sample, and serves to selectively permeate glucose in the biological sample. 'Filter unit' according to the present invention is composed of a 'cell membrane', the cell membrane may be derived from red blood cells or cancer cells, but is not limited thereto.

상기 세포막은 바람직하게는 막 단백질, 글루코스 수송체(Glucose trasporter, GLUT) 단백질을 포함할 수 있다. The cell membrane may preferably comprise a membrane protein, a glucose transporter (GLUT) protein.

상기 글루코스 수송체 단백질은 세포막에 글루코스를 통과시켜 세포 내에 이입시키는 단백질의 일종으로 세포 내외의 글루코스 농도 차이를 글루코스 수송의 원동력으로 하는 촉진확산형 수송체이며, GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4 등일 수 있으며, 바람직하게는 GLUT1이나 이에 제한되지 않는다.The glucose transporter protein is a kind of protein that is introduced into the cell by passing glucose through the cell membrane. The glucose transporter protein is a accelerated diffusion type transporter that uses glucose as a driving force for glucose transport. The glucose transporter may be GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, and the like. Preferably, but not limited to GLUT1.

상기 필터부의 두께는 글루코스의 선택적 투과 및 안정적인 신호 전달을 위해, 세포막의 종류 및 생물학적 시료의 종류에 따라 조절하여 최적화될 수 있다. The thickness of the filter part may be optimized by adjusting the type of cell membrane and the type of biological sample for selective permeation and stable signal transmission of glucose.

필터부는 바이오센서에 세포막을 도포함으로써 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 적혈구 세포막의 농도가 증가함에 따라 세포막의 두께가 증가함을 확인하였다(도 5a). The filter portion may be formed by applying a cell membrane to the biosensor. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the thickness of the cell membrane increases as the concentration of the red blood cell membrane increases (FIG. 5A).

본 발명에서, ‘적혈구 세포막의 농도’는 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 적혈구 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)로 표시된다.In the present invention, the 'concentration of the red blood cell membrane' is expressed in% (v / v) based on the volume of the red blood cell membrane contained in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer solution.

본 발명에서, 필터부의 두께는 100 내지 300 nm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 필터부의 두께가 100 nm 미만이면 포도당 외의 분자가 세포막을 통과할 확률이 늘어나는 문제가 있고, 300 nm 초과이면 포도당의 세포막 통과가 지연되는 문제가 발생할 수 있다.In the present invention, the thickness of the filter unit is preferably 100 to 300 nm, more preferably 150 to 250 nm, but is not limited thereto. If the thickness of the filter portion is less than 100 nm, there is a problem that the probability that molecules other than glucose pass through the cell membrane is increased, and if it is more than 300 nm, there may be a problem that the passage of glucose cell membrane is delayed.

본 발명의 일 실시예에서, 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막을 도포하여 약 220 nm 두께의 필터부를 형성한 경우 반응 초반부의 단위 시간당 신호 세기의 변화량이 가장 높게 나타남을 확인하였다(도 5 참조).In an embodiment of the present invention, when the filter unit having a thickness of about 220 nm was formed by applying a red blood cell membrane having a concentration of 0.25% (v / v), it was confirmed that the change in signal intensity per unit time at the beginning of the reaction was the highest (FIG. 5).

생물학적 시료가 혈액인 경우 100 내지 300 nm, 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 소변 및 눈물 등 다른 농도 대역의 생물학적 시료의 경우 다르게 두께를 조절하여 최적화될 수 있다.When the biological sample is blood, it may be 100 to 300 nm, preferably 150 to 250 nm, but is not limited thereto. Biological samples of different concentration bands, such as urine and tears, can be optimized by varying the thickness.

본 발명에 있어서, '센서부'는 필터부에 의하여 투과된 생물학적 시료 내 글루코스를 인식하는 구역을 의미한다. 상기 센서부는 바람직하게는 글루코스 산화효소(Glucose oixdase), 글루코스 탈수소효소(GDH; glucose dehydrogenase), 글루코스 헥소키나아제(glucose hexokinase), 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(GOT; Glutamic Oxaloacetic Transaminase) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(GPT; Glutamic Pyruvic Transaminase) 등의 효소를 포함할 수 있으며, 더 나아가 상기 각 효소에 조효소인 피로퀴놀린퀴논(PQQ; pyrroquinoline quinone)를 더 포함하도록 구성할 수 있으나, 글루코스를 기질로 하는 효소라면 제한없이 포함될 수 있다. 센서부에 포함된 효소들이 혈액 속의 글루코스와 만나면 글루코스는 산화되고 효소들은 환원되어 전기적 신호를 띄게 되고, 환원된 효소들이 전극과 만나 전자를 줌으로써 전기적 신호를 발생하게 된다.In the present invention, the 'sensor part' refers to a region that recognizes glucose in a biological sample transmitted by the filter part. The sensor unit is preferably a glucose oxidase (Glucose oixdase), glucose dehydrogenase (GDH), glucose hexokinase (glucose hexokinase), cholesterol oxidase, glutamic oxalacetic transminase (GOT; Glutamic Oxaloacetic) Enzymes, such as Transaminase) or Glutamic Pyruvic Transaminase (GPT), and may further be configured to further include a coenzyme pyrroquinoline quinone (PQQ). However, any enzyme based on glucose may be included without limitation. When the enzymes in the sensor meet the glucose in the blood, the glucose is oxidized and the enzymes are reduced to give an electrical signal. The reduced enzymes meet the electrode to give an electron to generate an electrical signal.

본 발명에 있어서, '측정부'는 센서부와 해독부 사이에 위치하면서 센서부에 의하여 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 구역이다. 일례로 상기 센서부 내 효소와 전자 전달 매개체(mediator) 간의 일련의 산화환원반응을 통하여 글루코스를 전자(e-) 형태의 신호로 변환시키고, 이에 따른 산화전위를 전극으로 인가시켜 전류를 발생시킬 수 있다. In the present invention, the 'measurement unit' is a zone which is located between the sensor unit and the deciphering unit and converts the glucose recognized by the sensor unit into a signal. For example, through a series of redox reactions between the enzyme in the sensor unit and an electron transfer mediator, glucose is converted into an electron (e − ) type signal, and the corresponding oxidation potential is applied to the electrode to generate a current. have.

이때, 상기 전자 전달 매개체는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt) 또는 비오로겐(viologen), 포타슘핵사시아노페레이트(Ⅲ)(Potassium hexacyanoferrate Ⅲ), 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 또는 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium Ⅲ) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 전극은 금(Au), 은(Ag) 또는 구리(Cu) 전극일 수 있고, 전기적인 신호의 정확성을 고려할 때 금 전극이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. In this case, the electron transport medium is ferrocene (ferrocene), ferrocene derivatives, quinones (quinones), quinone derivatives, organic conducting salts (organic conducting salt) or biorogen (viologen), potassium nucleated cyanoferrate (III) (Potassium hexacyanoferrate III), potassium ferricyanide, potassium ferrocyanide or hexaamineruthenium III, and the like, but is not limited thereto. The electrode may be a gold (Au), silver (Ag), or copper (Cu) electrode, and the gold electrode is preferable in consideration of the accuracy of the electrical signal, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, '해독부'는 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 구역이다. 일례로, 글루코스를 변환하여 얻은 전류 신호를 객관적인 수치로 표시하여 정보를 제공할 수 있다. In the present invention, the 'detoxification unit' is a region for decoding a signal by the recognized glucose. For example, the current signal obtained by converting glucose may be displayed as an objective value to provide information.

본 발명의 다른 실시예에서는, 측정부를 거치지 않고 글루코스 자체를 수치화하여 정보를 제공하도록 하였다. In another embodiment of the present invention, the glucose itself is digitized without passing through the measurement unit to provide information.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이오센서를 포함하는, 글루코스 측정용 키트를 제공한다.Another aspect of the invention provides a kit for measuring glucose, comprising the biosensor.

본 발명에 따른 키트는 보다 효과적으로 글루코스를 측정할 수 있도록 본 발명의 바이오센서 외에 채혈 또는 채뇨 등을 도와주는 도구 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 외부패키지를 포함할 수 있으며, 외부패키지는 구성요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.The kit according to the present invention may further include a tool to help blood collection or urine collection, etc. in addition to the biosensor of the present invention to measure glucose more effectively. The kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공한다. Another aspect of the invention provides a method of measuring glucose concentration in a biological sample, comprising contacting the biological sample with the biosensor.

상기 방법의 목적상 글루코스 농도 측정을 통해 당뇨병의 진단 또는 예후를 판단할 수 있다.For the purpose of the method, the diagnosis or prognosis of diabetes can be determined by measuring glucose concentration.

본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 글루코스 측정용 바이오센서의 제조방법을 제공한다:Another aspect of the present invention provides a method of manufacturing a biosensor for glucose measurement, comprising the following steps:

(1) 세포를 원심분리하여 세포막을 수득하는 단계; (1) centrifuging the cells to obtain a cell membrane;

(2) 상기 (1) 단계에서 수득한 세포막을 초음파 처리 또는 압출하여 소낭 상태로 제조하는 단계; 및 (2) producing a vesicle state by sonicating or extruding the cell membrane obtained in step (1); And

(3) 상기 (2) 단계에서 제조한 소낭 상태의 세포막을 센서부에 도포하는 단계. (3) applying the cell membrane of the vesicle state prepared in step (2) to the sensor unit.

각 단계에 대해 보다 구체적으로 설명한다. Each step is explained in more detail.

상기 (1) 단계는 세포로부터 막단백질을 포함하는 세포막 이외의 물질, 즉, 세포내 소기관 또는 헤모글로빈을 제거하는 단계이며, 세포막 분리 효율을 높이기 위해 원심분리를 반복할 수 있다. Step (1) is a step of removing a substance other than the cell membrane including the membrane protein from the cell, that is, intracellular organelles or hemoglobin, and centrifugation may be repeated to increase cell membrane separation efficiency.

상기 (2) 단계는 세포막의 효율적인 도포를 위해 세포막을 초음파 처리 또는 압출하여 소낭 상태로 제조하는 단계이며, 상기 초음파 처리는 약 20분 내지 60분 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 30분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 초음파 처리 또는 압출을 통해 제조된 소낭은 바람직하게는 70 내지 200 nm의 지름 크기를 가지며, 이에 제한되지 않는다. Step (2) is a step of producing a vesicle state by sonicating or extruding the cell membrane for efficient application of the cell membrane, the sonication may be performed for about 20 to 60 minutes, preferably about 30 minutes May be performed, but is not limited thereto. The vesicles prepared by sonication or extrusion preferably have a diameter size of 70 to 200 nm, but are not limited thereto.

상기 (3) 단계는 소낭 상태의 세포막이 필터부의 역할을 할 수 있도록 소낭 상태의 세포막을 센서부에 도포하는 단계이며, 상기 소낭 상태의 세포막은 0.1 내지 0.5 vol%의 농도로 도포될 수 있고, 이에 제한되지 않는다. Step (3) is a step of applying the cell membrane in the vesicle state so that the cell membrane in the vesicle state to act as a filter unit, the cell membrane in the vesicle state may be applied at a concentration of 0.1 to 0.5 vol%, This is not restrictive.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Duplicate content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, terms not otherwise defined herein have a meaning commonly used in the art to which the present invention belongs.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, examples and experimental examples will be described in detail to help the understanding of the present invention. However, the following Examples and Experimental Examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited by the following Examples and Experimental Examples.

실시예 1. 막단백질을 포함하는 세포막 구조로 이루어진 필터부를 포함하는 바이오센서의 제조Example 1. Preparation of a biosensor comprising a filter unit consisting of a cell membrane structure containing a membrane protein

1-1. 세포막의 분리1-1. Separation of cell membrane

1-1-1. 적혈구로부터 세포막의 분리1-1-1. Isolation of Cell Membranes from Red Blood Cells

EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)가 처리된 튜브를 이용하여 혈액(전혈)을 채취한 후, 이를 4 ℃ 조건에서 500 g로 5분간 원심분리하였다. 이에 따라 상대적으로 가벼운 혈장 및 백혈구를 포함하는 상층액을 제거하고. 적혈구를 포함하는 하층액만을 분리하였다. 분리한 하층액에 1ml의 1X PBS(pH 7.4, Gibco)를 첨가하고, 500 g로 5분간 원심분리한 후, 적혈구를 제외한 상층부를 제거하는 워싱을 3회 반복하여 적혈구를 정제하였다. 이후 적혈구의 용혈을 유도하기 위하여 20분 동안 0.25X PBS에 담가놓았다. 적혈구 세포막과 막 단백질, 그리고 헤모글로빈이 혼재하는 상기 PBS 용액에서 막 단백질 및 적혈구 세포막만을 분리하기 위하여 추가적으로 1000 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 상층액을 제거하여 연분홍빛으로 가라앉은 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 수득하였으며, 추가 정제를 위하여 1 ml의 1X PBS를 첨가하고 1000 g 5분 원심분리하는 과정을 3회 반복하였다. Blood (whole blood) was collected using a tube treated with EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), and then centrifuged at 500 g for 5 minutes at 4 ° C. This removes the supernatant containing relatively light plasma and leukocytes. Only the lower layer solution containing red blood cells was isolated. 1 ml of 1X PBS (pH 7.4, Gibco) was added to the separated lower layer solution, and centrifuged at 500 g for 5 minutes, and washing was repeated three times to remove the upper layer except red blood cells. It was then immersed in 0.25X PBS for 20 minutes to induce hemolysis of red blood cells. In order to separate only the membrane protein and the red blood cell membrane from the PBS solution containing the red blood cell membrane, the membrane protein, and the hemoglobin, centrifugation was further performed at 1000 g for 5 minutes. Thereafter, the supernatant was removed to obtain an erythrocyte cell membrane containing the membrane protein which was pale pink. For the further purification, 1 ml of 1X PBS was added and centrifugation at 1000 g for 5 minutes was repeated three times.

1-1-2. 암세포로부터 세포막의 분리1-1-2. Separation of Cell Membranes from Cancer Cells

한국 세포주 은행으로부터 수득한 암세포 MDA-MB-231와 배양배지 PBS (pH 7.4, Gibco)를 혼합한 후 4 ℃, 500 g로 5분 동안 원심분리를 수행하여 하층에 가라앉은 군집을 형성한 세포들 외 상층액을 제거하였다. 이에 1 ml의 1X PBS(pH 7.4, Gibco)를 첨가하고, 500 g로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하는 정제과정을 3회 반복하였다. 이후 세포막의 분리를 유도하기 위하여 20분 동안 0.25X PBS에 담가놓았다. 세포막과 막단백질, 그리고 세포 내 소기관이 혼재하는 상기 PBS 용액에서 막단백질 및 세포막을 분리하기 위하여 추가적으로 1000 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 상층액을 제거하여 하층에 가라앉은 막단백질을 포함하는 세포막을 수득하였으며, 정제를 위하여 1 ml의 1X PBS를 첨가하고, 1000 g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하는 과정을 3회 수행하였다.Cancer cells MDA-MB-231 obtained from the Korean Cell Line Bank and culture medium PBS (pH 7.4, Gibco) were mixed and centrifuged at 500 ° C. for 5 minutes at 4 ° C. for 5 minutes to form a subpopulated colony in the lower layer. The outer supernatant was removed. 1 ml of 1X PBS (pH 7.4, Gibco) was added thereto, followed by centrifugation at 500 g for 5 minutes, and the purification process of removing the supernatant was repeated three times. It was then immersed in 0.25X PBS for 20 minutes to induce separation of the cell membrane. In order to separate membrane proteins and membranes from the PBS solution in which cell membranes and membrane proteins and intracellular organelles were mixed, centrifugation was further performed at 1000 g for 5 minutes. Thereafter, the supernatant was removed to obtain a cell membrane including the membrane protein submerged in the lower layer. For purification, 1 ml of 1X PBS was added, centrifuged at 1000 g for 5 minutes, and then the supernatant was removed three times. Was performed.

1-2. 바이오센서의 센서부에 세포막의 도포1-2. Application of Cell Membrane to Sensor of Biosensor

상기 실시예 1-1-1, 및 1-1-2에서 분리한 막단백질을 포함하는 정제된 세포막 2.5 μl를 각각 1 ml의 증류수에 용해시켜 400배 희석시켰다. 그리고 나서, 30분 동안 초음파를 처리하여 세포막이 지름 약 170 nm 크기의 소낭 상태가 되도록 하였다. 이어서 상업적으로 판매되고 있는 제품(The Accu-Chek　Inform II system, Roche Diagnostics, USA)으로부터 글루코스 센서를 분리한 후, 이의 효소 부분(약 33 mm2), 즉 센서부를 충분히 감쌀 수 있도록 상기 글루코스 센서 위에 소낭 상태가 된 세포막 25 μL를 도포하였다. 상기 세포막이 효소를 손상시키지 않는 범위 내에서 센서 위에 충분히 도포될 수 있도록 50 ℃로 맞춰진 건조 오븐에서 50분간 열을 가해주었다. 50분이 경과한 후에는 상온에서 50분간 방치하였다. 2.5 μl of purified cell membranes containing the membrane proteins isolated in Examples 1-1-1 and 1-1-2 were dissolved in 1 ml of distilled water and diluted 400-fold. Ultrasonication was then performed for 30 minutes to allow the cell membrane to become vesicles of about 170 nm in diameter. The glucose sensor was then separated from a commercially available product (The Accu-Chek Inform II system, Roche Diagnostics, USA) and then placed on its glucose sensor (ie about 33 mm 2 ) to cover the sensor part sufficiently. 25 μL of vesicles were applied. Heat was applied for 50 minutes in a drying oven set at 50 ° C. so that the cell membrane could be sufficiently coated on the sensor within the range of not damaging the enzyme. After 50 minutes had elapsed, it was allowed to stand at room temperature for 50 minutes.

본 발명에 따른 바이오센서의 원리를 도 1에, 구조를 도 2에 나타내었다. 아울러, 상기 일련의 바이오센서 제조과정을 도식화하여 도 3에 나타내었다. The principle of the biosensor according to the present invention is shown in FIG. 1 and the structure in FIG. 2. In addition, the series of biosensor manufacturing process is shown in FIG.

실험예 1. SEM 분석을 통한 바이오센서 내 세포막 도포 여부 확인Experimental Example 1. Confirmation of application of cell membrane in the biosensor through SEM analysis

상기 실시예 1-2에서 제조한 세포막이 도포된 바이오센서의 센서부를 SEM으로 분석하여 막단백질을 포함하는 세포막이 정상적으로 도포되었는지 확인하였다. 아울러 본 발명의 세포막을 도포하지 않은 제품(The Accu-Chek　 Inform II system, Roche Diagnostics, USA)의 동일 부분을 대조군으로 하여 SEM 분석을 수행하였다. 실험군에 대한 결과는 도 4a에 나타내었고, 대조군에 대한 결과는 도 4b에 나타내었다.The sensor unit of the biosensor coated with the cell membrane prepared in Example 1-2 was analyzed by SEM to confirm whether the cell membrane including the membrane protein was normally applied. In addition, SEM analysis was performed using the same part of the product (The Accu-Chek® Inform II system, Roche Diagnostics, USA) not coated with the cell membrane of the present invention as a control. The results for the experimental group are shown in Figure 4a, the results for the control group is shown in Figure 4b.

도 4에 나타낸 바와 같이, 바이오센서의 센서부 관찰을 통해 세포막의 도포가 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다. As shown in FIG. 4, the observation of the sensor unit of the biosensor confirmed that the application of the cell membrane was normally performed.

실험예 2. 적혈구 세포막을 도포한 필터부의 두께 차이에 따른 전류량 확인Experimental Example 2 Check the amount of current according to the difference in thickness of the filter unit coated with the red blood cell membrane

본 발명의 바이오센서를 제조하는 과정에서 최적의 필터부 두께를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막의 농도를 0에서 0.5 %(v/v)의 농도로 바이오센서의 센서부에 도포하였다. 보다 구체적으로, 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 적혈구 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)를 계산하였으며, 예를 들어, 0.25 %(v/v)는 1 ml의 인산완충용액에 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막 2.5 ul를 첨가한 경우를 의미한다. 적혈구 세포막의 농도에 따른 필터의 두께를 stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor)를 이용하여 측정하였으며, 이는 도 5a에 나타내었다. In order to determine the optimal filter thickness in the process of manufacturing the biosensor of the present invention, the concentration of the erythrocyte cell membranes obtained in Example 1-1-1 was adjusted from 0 to 0.5% (v / v). It was applied to the sensor part. More specifically,% (v / v) was calculated based on the volume of red blood cell membranes contained in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer solution, for example, 0.25% (v / v) is 1 ml of phosphate buffer solution. It refers to the case where 2.5 ul of the red blood cell membrane obtained in Example 1-1-1 was added to the above. The thickness of the filter according to the concentration of red blood cell membranes was measured using a stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor), which is shown in FIG. 5A.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 적혈구 세포막의 농도가 증가함에 따라 필터부의 두께가 증가함을 확인하였다. As shown in Figure 5a, it was confirmed that as the concentration of the red blood cell membrane increases, the thickness of the filter portion increases.

또한, 0.1 %(v/v), 0.25 %(v/v), 0.5 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막을 이용하여 제조한 바이오센서 내 전류량을 전기화학장비인 potentiostat (versastat3)으로 분석하였으며, 상기 결과를 토대로 1 내지 10초 사이의 선형성을 분석하였다. 이를 위해 센서부(세포막 필터의 위)에 30 ul의 측정 용액을 떨어트리고 -0.3V의 전압을 걸어주어 0.5초 단위로 측정하였다. 각각의 실험 결과를 도 5b 및 도 5c에 나타내었다. 도 5b는 각 농도에 대한 전기적 신호의 변화를 1초에서 60초까지 관찰한 결과를 나타내며, 도 5c는 도 5b의 1초 내지 10초 사이의 선형성을 분석하여 나타낸 것이다. In addition, the amount of current in the biosensor manufactured using red blood cell membranes of 0.1% (v / v), 0.25% (v / v) and 0.5% (v / v) concentrations was analyzed by potentiostat (versastat3), an electrochemical device. Based on the results, the linearity between 1 and 10 seconds was analyzed. To this end, 30 ul of the measurement solution was dropped on the sensor unit (on the membrane filter), and a voltage of -0.3V was applied thereto, and the measurement was performed in 0.5 second units. Each experimental result is shown in FIGS. 5B and 5C. Figure 5b shows the results of observing the change in the electrical signal for each concentration from 1 second to 60 seconds, Figure 5c shows the analysis of the linearity between 1 second to 10 seconds of Figure 5b.

도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이, 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막(약 220 nm의 두께)을 이용한 경우 신호 전달이 안정적으로 일어남을 확인하였다. 특히, 글루코스 센서의 특성상 빠르게 결과를 얻는 것이 중요한데, 도 5c에 나타낸 바와 같이 반응 초반부의 단위 시간당 신호 세기의 변화량이 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막(약 220 nm의 두께)을 이용한 경우 가장 높게 나타남을 확인하였다. As shown in Figure 5b and 5c, it was confirmed that the signal transduction is stable when using a red blood cell membrane (thickness of about 220 nm) of 0.25% (v / v) concentration. In particular, it is important to obtain a result quickly due to the characteristics of the glucose sensor, as shown in FIG. It was confirmed that the highest appeared.

실험예 3. 암세포 세포막을 도포한 필터부의 두께 차이에 따른 전류량 확인Experimental Example 3. Checking the amount of current according to the thickness difference of the filter unit coated with the cancer cell membrane

본 발명의 바이오센서를 제조하는 과정에서 최적의 필터부 두께를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-1-2에서 수득한 암세포 세포막을 0에서 5 %(v/v)의 농도로 바이오센서의 센서부에 도포하였다. 보다 구체적으로, 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 암세포 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)를 계산하였으며, 예를 들어, 0.5 %(v/v)는 1 ml의 인산완충용액에 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막 5.0 ul를 첨가한 경우를 의미한다. 암세포 세포막의 농도에 따른 필터의 두께를 stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor)를 이용하여 측정하였다. 암세포 세포막의 농도가 증가함에 따라 필터부의 두께가 증가함을 확인하였다. In order to determine the optimal filter thickness in the process of manufacturing the biosensor of the present invention, the cancer cell membrane obtained in Example 1-1-2 has a concentration of 0 to 5% (v / v) of the sensor of the biosensor. Was applied. More specifically,% (v / v) was calculated based on the volume of the cancer cell membrane contained in 1 ml of 0.1 M phosphate buffer solution, for example, 0.5% (v / v) is 1 ml of phosphate buffer solution. It refers to the case where 5.0 ul of the red blood cell membrane obtained in Example 1-1-1 was added thereto. The thickness of the filter according to the concentration of the cancer cell membrane was measured using a stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor). As the concentration of the cancer cell membrane increased, the thickness of the filter part was confirmed to increase.

또한, 0.5 %(v/v) (두께: 450 ± 40 nm), 1 %(v/v) (두께: 900 ± 53 nm), 5 %(v/v) (두께 : 4700 ± 102 nm) 농도의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서에 대하여, 글루코스 농도를 0 내지 20mM로 달리하여 전기화학장비인 potentiostat (versastat3)으로 전류량을 분석하였다. 도 6은 암세포 세포막의 두께별 전류량을 확인한 결과이다. 암세포 세포막을 너무 두껍게(5%) 도포한 경우 신호가 낮게 나오는 경향을 보였으며, 0.5~1% 농도의 암세포 세포막을 도포할 경우 도포하지 않은 전극과 차이가 없이 전기신호 전달이 일어남을 확인하였다.0.5% (v / v) (thickness: 450 ± 40 nm), 1% (v / v) (thickness: 900 ± 53 nm), 5% (v / v) (thickness: 4700 ± 102 nm) concentrations For the biosensor coated with the cancer cell membrane, the current was analyzed by potentiostat (versastat3), an electrochemical device, by varying the glucose concentration from 0 to 20 mM. 6 is a result of confirming the amount of current for each thickness of the cancer cell membrane. When the cancer cell membrane was applied too thick (5%), the signal tended to come out low. When applying the cancer cell membrane of 0.5 ~ 1% concentration, it was confirmed that the electrical signal transmission occurred without any difference from the electrode that was not applied.

실험예 4. 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막으로 이루어진 필터부의 포함 여부 및 시료에 포함된 글루코스 농도 변화에 따른 글루코스 검출 효율 확인Experimental Example 4. Confirmation of the glucose detection efficiency according to the change in the glucose concentration contained in the sample and whether the filter portion consisting of the erythrocyte cell membrane including the membrane protein

본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 효율을 확인하기 위하여, 막단백질을 포함하는 세포막 구조로 이루어진 필터부의 포함 여부에 따른 글루코스 검출 효율을 비교 분석하였다. 구체적으로 대조군으로 아큐첵퍼포마(ACCU-CHECK사; Control sensor) 및 아큐첵퍼포마에 GLUT1이 없는 인공 인지질막을 도포한 바이오센서(DPPC sensor)를 이용하고, 실험군으로 본 발명의 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서(RBCM sensor)를 이용하였다. 이후 0 내지 40 mM 농도의 글루코스 (sigma) (인산 완충용액 pH 7.4에 녹임) 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호변화량을 도출하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었으며, 도 7b는 임상적으로 건강한 사람의 혈당 농도인 3.5~7 mM 및 당뇨병 환자의 혈당 농도인 7 mM 초과 부분을 보다 정확하게 확인하기 위하여, 도 7a의 결과 중 2.5 내지 10 mM 농도 범위의 측정 결과만을 확대하여 나타낸 도이다. 이때, 도면 내 x축은 글루코스의 농도이고, y축은 3초 내지 7초 사이의 전기신호 변화량 값이다. In order to confirm the glucose detection efficiency of the biosensor of the present invention, the glucose detection efficiency according to the inclusion or absence of the filter unit consisting of the cell membrane structure including the membrane protein was analyzed. Specifically, the control group using the ACCU-CHECK (Control sensor) and the biosensor (DPPC sensor) coated with the artificial phospholipid membrane without GLUT1 to the accumulator, and the red blood cell membrane containing the membrane protein of the present invention as an experimental group A biosensor (RBCM sensor) to which the coating was applied was used. After adding 30 ul of glucose (sigma) (dissolved in phosphate buffer pH 7.4) at a concentration of 0 to 40 mM, the amount of current was measured under a voltage of -0.3 V, and the amount of signal change was 3 to 7 seconds. Was derived. The results are shown in FIG. 7, and FIG. 7B shows a range of 2.5 to 7-7 of the results of FIG. 7A to more accurately identify portions of 3.5 to 7 mM, which are clinically healthy persons, and more than 7 mM, which are the blood sugar levels of diabetic patients. It is the figure which only expanded the measurement result of 10 mM concentration range. At this time, the x-axis in the figure is the concentration of glucose, the y-axis is the electric signal change amount value between 3 seconds to 7 seconds.

도 7에 나타낸 바와 같이, 인공 인지질막을 도포한 바이오센서의 경우, 막의 도포로 인하여 필터부의 정제율을 증가시킬 수 있으나, 궁극적으로는 글루코스의 이동 자체를 제한하여 글루코스의 농도 변화를 민감하게 측정할 수 없음을 확인하였다. 반면 본 발명의 세포막을 도포한 바이오센서는 별도로 막을 도포하지 않은 바이오센서보다 혈청에서의 측정 한계 (LOD)가 뛰어남을 확인했다. 구체적으로, 막을 도포하지 않은 바이오센서의 경우 인산완충용액에서 1.34 mM의 LOD를 가지는데 반해, 혈청에서는 2.51 mM의 LOD를 가지고 있어, 혈청에서 측정한계가 약 2배 저하되는 것을 확인하였다. 반면에 본 발명의 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서의 경우, 인산완충용액에서는 1.06 mM의 LOD, 혈청에서는 1.11 mM의 LOD를 가져 혈청의 단백질 및 이온의 영향을 크게 받지 않음을 확인하였다. As shown in FIG. 7, in the case of a biosensor coated with an artificial phospholipid membrane, the purification rate of the filter unit may be increased due to the application of the membrane, but ultimately, the change in glucose concentration may be sensitively measured by limiting the movement of glucose itself. It was confirmed that it could not be. On the other hand, the biosensor coated with the cell membrane of the present invention was confirmed to have a superior measurement limit (LOD) in serum than the biosensor not coated with the membrane separately. Specifically, the biosensor without a membrane had a LOD of 1.34 mM in the phosphate buffer solution, whereas the LOD of 2.51 mM was found in the serum, and the limit of measurement in the serum was reduced by about two times. On the other hand, the biosensor coated with the red blood cell membrane of the present invention had a LOD of 1.06 mM in the phosphate buffer solution and a LOD of 1.11 mM in the serum, indicating that the protein and ions of the serum were not significantly affected.

실험예 5. 암세포 세포막을 도포한 바이오센서에 대해 시료에 첨가된 글루코스 농도 변화에 따른 검출 민감성 확인Experimental Example 5. Confirmation of detection sensitivity according to the glucose concentration added to the sample for the biosensor coated with cancer cell membrane

본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 효율을 확인하기 위하여, 막단백질을 포함하는 암세포 세포막으로 이루어진 바이오센서에 대해 시료에 첨가된 글루코스 농도 변화에 따른 검출 민감성을 분석하였다. 구체적으로 본 발명에 따라 2.5% 농도의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서(RBCM sensor)에 대하여 0 내지 20 mM 농도의 글루코스 (sigma) (인산 완충용액 pH 7.4에 녹임) 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.1 내지 0.4 V의 전압을 걸어준 상태에서 Cyclic voltammetry(CV) 방식으로 전류량을 측정하여, 그 결과를 도 8(a)에 나타내었다. 도 8(b)는 글루코스의 농도에 따른 CV 측정 신호 중 가장 높은 값(peak current)를 모아 글루코스 농도 에 대한 전류량 관계를 나타낸 그래프이다(b). 이때, 도면 내 x축은 글루코스의 농도이고, y축은 3초 내지 7초 사이의 전기신호 변화량 값이다. 각 점들을 이은 linear fitting 값과 그 식을 그래프 내부에 나타내었고 측정 한계(limit of detection)을 계산한 결과 0.24 mM까지의 한계를 갖는 것으로 나타났다.In order to confirm the glucose detection efficiency of the biosensor of the present invention, the detection sensitivity according to the glucose concentration change added to the sample was analyzed for the biosensor consisting of cancer cell membrane containing membrane protein. Specifically, 30 μl of glucose (sigma) dissolved in phosphate buffer pH 7.4 was added to a biosensor (RBCM sensor) coated with 2.5% cancer cell membrane according to the present invention. The amount of current was measured by Cyclic voltammetry (CV) in the state of applying a voltage of -0.1 to 0.4 V, and the result is shown in FIG. 8 (a). Figure 8 (b) is a graph showing the relationship between the amount of current to the glucose concentration (peak current) of the highest value (peak current) of the CV measurement signal according to the concentration of glucose (b). At this time, the x-axis in the figure is the concentration of glucose, the y-axis is the electric signal change amount value between 3 seconds to 7 seconds. The linear fitting values followed by the points and their equations are shown in the graph and the limit of detection was calculated and found to have a limit of 0.24 mM.

막을 도포하지 않은 바이오센서의 경우 인산완충용액에서 1.34 mM의 LOD를 가지는데 반해, 글루코스에서는 0.24 mM의 LOD를 가지고 있어, 측정한계가 현저하게 상승되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서의 경우, 측정한계가 현저히 향상됨을 확인하였다.The biosensor without membranes had a LOD of 1.34 mM in the phosphate buffer solution, whereas the LOD of 0.24 mM in glucose, indicating that the measurement limit was significantly increased. Therefore, it was confirmed that the measurement limit of the biosensor coated with the cancer cell membrane of the present invention was significantly improved.

실험예 6. 신호방해물질 첨가에 따른 본 발명의 적혈구 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성 확인 Experimental Example 6. Confirmation of glucose detection specificity of the biosensor coated with the red blood cell membrane of the present invention according to the addition of a signal blocking substance

본 발명에 따른 적혈구 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인하기 위하여, 시료에 인체 내 평균 글루코스 농도인 5 mM의 글루코스에 추가적으로 신호방해물질인 아스코르브산(ascorbic acid, AA), 요산(uric acid, UA) 또는 갈락토오스(galactose, GA)를 각각 농도 구배별로 첨가한 후, 전류량 변화를 측정하였다. 구체적으로, 센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. AA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 도 9a에 나타내었고, UA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 9b에 나타내었으며, GA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 도 9c에 나타내었다. 이때, 신호방해물질이 없을 때의 값을 도면 내 점선으로 표시하였다. In order to confirm the glucose detection specificity of the biosensor coated with red blood cell membrane according to the present invention, 5 mM glucose, which is the average glucose concentration in the human body, is added to the sample, ascorbic acid (AA), uric acid (uric acid). acid, UA) or galactose (GA) were added for each concentration gradient, and then the change in the amount of current was measured. Specifically, after adding 30 ul of the sample to the sensor, the amount of current was measured while applying a voltage of -0.3 V, and the change amount was derived by receiving a signal of 3 to 7 seconds. The results of the addition of AA are shown in Figure 9a, the results of the addition of UA is shown in 9b, the results of the addition of GA is shown in Figure 9c. At this time, the value when there is no signal interference material is indicated by a dotted line in the figure.

아울러, 5 mM의 글루코스를 포함하는 시료에 신호방해물질인 AA, US 및 GA를 100 μM씩 모두 넣은 후, 전류량 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 9d에 나타내었다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다. In addition, 100 μM of each of AA, US, and GA, which are signal blockers, was added to the sample containing 5 mM glucose, and then the change in the amount of current was measured. The results are shown in Figure 9d. As a control, accumulators without cell membranes were used.

도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군은 신호방해물질의 농도 증가에 따라 정상 값과의 차이가 증가하나, 본 발명의 세포막을 도포한 바이오센서를 이용하는 경우에는 신호방해물질을 첨가하더라도 크게 영향을 받지 않고 글루코스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 필터로 이용할 경우, 시료 내 존재하는 단당류, 이당류뿐만 아니라 글루코스 외 다른 다당류 또한 투과하지 못하게 함으로써 시료 내 존재하는 글루코스를 높은 민감도로 검출할 수 있다. As shown in FIG. 9, the control group increases the difference from the normal value as the concentration of the signal interfering substance increases. However, when the biosensor coated with the cell membrane of the present invention is used, the control agent is not significantly affected even if the signal interfering substance is added. It was confirmed that only glucose can be specifically detected. That is, when using a red blood cell membrane containing a membrane protein according to the present invention as a filter, it is possible to detect the glucose present in the sample with high sensitivity by preventing not only the monosaccharides and disaccharides present in the sample but also other polysaccharides other than glucose. .

실험예 7. 신호방해물질 첨가에 따른 본 발명의 암세포 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성 확인 Experimental Example 7. Confirmation of glucose detection specificity of the biosensor coated with the cancer cell membrane of the present invention according to the addition of a signal blocking substance

본 발명에 따른 암세포 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인하기 위하여, 암세포 세포막을 도포하지 않은 바이오센서와 암세포 세포막을 도포한 바이오센서를 대상으로, 시료에 인체 내 평균 글루코스 농도인 5 mM의 글루코스에 추가적으로 신호방해물질인 프럭토스(fructose), 자일로스(Xylose), 말토스(Maltose), 시스테인(Cysteine), 아스코르브산(ascorbic acid, AA) 또는 요산(uric acid, UA)을 각각 농도 구배별로 첨가한 후, 전류량 변화를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타냈다. 구체적으로, 센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. 단일 분자들의 신호값을 왼쪽의 흑백 그래프에 나타내었고, 5 mM의 글루코스에 각각의 분자들을 첨가하여 측정한 값을 오른쪽의 컬러그래프 및 표로 나타내었다. 이때, 신호방해물질이 없을 때의 값을 도면 내 점선으로 표시하였다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다. In order to confirm the glucose detection specificity of the biosensor coated with the cancer cell membrane according to the present invention, a biosensor not coated with the cancer cell membrane and a biosensor coated with the cancer cell membrane were applied to the sample, and the average glucose concentration in the human body was 5 mM. In addition to glucose, the concentrations of fructose (fructose), xylose, maltose (Maltose), cysteine, ascorbic acid (AA) or uric acid (uric acid, UA) After the addition by gradient, the change in the amount of current was measured and the result is shown in FIG. 10. Specifically, after adding 30 ul of the sample to the sensor, the amount of current was measured while applying a voltage of -0.3 V, and the change amount was derived by receiving a signal of 3 to 7 seconds. Signal values of the single molecules are shown in the black and white graph on the left, and the values measured by adding each molecule to 5 mM glucose are shown in the color graph and table on the right. At this time, the value when there is no signal interference material is indicated by a dotted line in the figure. As a control, accumulators without cell membranes were used.

도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군은 신호방해물질의 농도 증가에 따라 정상 값과의 차이가 증가하나, 본 발명의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서를 이용하는 경우에는 신호방해물질을 첨가하더라도 크게 영향을 받지 않고 글루코스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 막단백질을 포함하는 암세포 세포막을 필터로 이용할 경우, 시료 내 존재하는 단당류, 이당류뿐만 아니라 글루코스 외 다른 다당류 또한 투과하지 못하게 함으로써 시료 내 존재하는 글루코스를 높은 민감도로 검출할 수 있다. As shown in FIG. 10, the control group increases the difference from the normal value as the concentration of the signal interfering substance increases. However, when the biosensor coated with the cancer cell membrane of the present invention is used, the control is not significantly affected even by the addition of the signal interfering substance. It was confirmed that only glucose can be detected without specificity. That is, according to the present invention, when the cancer cell membrane containing the membrane protein is used as a filter, the glucose present in the sample can be detected with high sensitivity by preventing permeation not only of monosaccharides and disaccharides present in the sample but also other polysaccharides other than glucose. .

실험예 8. 혈청에 글루코스 첨가에 따른 본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 민감성 확인Experimental Example 8. Confirmation of glucose detection sensitivity of the biosensor of the present invention according to the addition of glucose to serum

본 발명에 따른 바이오센서의 검출 민감성을 확인하기 위하여, Sigma로부터 공급받은 사람의 혈청을 시료로 하고, 이에 글루코스를 농도별로 첨가한 후 본 발명의 바이오센서에 대해 글루코스의 첨가에 따른 전류량 변화를 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 세포막(RBCM)이 도포된 바이오센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다. In order to confirm the detection sensitivity of the biosensor according to the present invention, the serum of a person supplied from Sigma was taken as a sample, and glucose was added according to the concentration, and then the change in the amount of current according to the addition of glucose to the biosensor of the present invention was measured. It was. Specifically, after adding 30 ul of the sample to the biosensor coated with red blood cell membrane (RBCM), the amount of current was measured while applying a voltage of -0.3 V, and the change amount was derived by receiving a signal of 3 to 7 seconds. . As a control, accumulators without cell membranes were used. The results are shown in FIG.

도 11에 나타낸 바와 같이, 혈청에 첨가한 글루코스 양이 증가함에 따라 전하의 세기가 비례하여 증가하였으며, 본 발명의 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서는 대조군에 비하여 현저하게 높은 민감도로 글루코스를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이는 혈액 내 그 자체로 전기적 신호를 가지는 물질이나 효소-글루코스 작용이 방해하는 물질이 존재하여 세포막을 도포하지 않은 기존 바이오센서의 경우 글루코스 검출 효율이 다소 떨어지지만, 본 발명과 같이 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서를 이용할 경우 혈청 자체를 시료로 이용하더라도 높은 민감도로 글루코스를 검출할 수 있음을 나타낸다.As shown in Figure 11, as the amount of glucose added to the serum was increased in proportion to the charge intensity, the biosensor coated with the red blood cell membrane of the present invention can detect glucose with a significantly higher sensitivity than the control group It was confirmed that there is. This is due to the presence of a substance that has an electrical signal in itself or a substance that interferes with enzyme-glucose, and thus the existing biosensor that does not apply a cell membrane has a slightly lower glucose detection efficiency, but contains a membrane protein as in the present invention. When using a biosensor that includes a red blood cell membrane as a filter, even if serum itself is used as a sample, it indicates that glucose can be detected with high sensitivity.

실험예 9. 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서의 글루코스 검출 민감도 비교Experimental Example 9. Comparison of glucose detection sensitivity between biosensor coated with red blood cell membrane (RBCM) and biosensor coated with cancer cell membrane (CCM)

적혈구막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포막(CCM)을 도포한 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 비교하기 위해, Sigma로부터 공급받은 사람의 혈청을 시료로 하고, 이에 글루코스를 농도별로 첨가한 후 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서에 대해 혈청에 대한 검출 신호 강도를 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 potentiostat (Versastat3)를 이용하여 검출 신호 강도를 분석하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다. To compare the glucose detection sensitivity of biosensors coated with red blood cell membrane (RBCM) and biosensors coated with cancer cell membrane (CCM), serum from humans from Sigma was used as a sample, and glucose was added according to the concentration. The detection signal intensity of serum was measured for the biosensor coated with red blood cell membrane (RBCM) and the biosensor coated with cancer cell membrane (CCM). Specifically, after adding 30 ul of the sample to the biosensor coated with red blood cell membrane (RBCM) and the biosensor coated with cancer cell membrane (CCM), using potentiostat (Versastat3) while applying a voltage of -0.3V The detection signal intensity was analyzed and the result is shown in FIG.

도 12에 나타낸 바와 같이, 적혈구 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서 및 암세포 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서 모두 높은 민감성을 나타내며 혈청 내 글루코스를 검출할 수 있음을 알 수 있다.As shown in FIG. 12, it can be seen that both biosensors including red blood cell membranes as filters and biosensors including cancer cell membranes as filters exhibit high sensitivity and detect glucose in serum.

실험예 10. 바이오센서의 안정성 확인Experimental Example 10. Check the stability of the biosensor

본 발명의 바이오센서를 실제 활용하기 위하여, 공기 중 안정성을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 바이오센서를 제조한 직후 및 3주 동안 건조 장치인 데시케이터(desicator) 내에 넣어둔 후, 글루코스 농도별 전류량 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.In order to actually use the biosensor of the present invention, the stability in the air was confirmed. Specifically, after the biosensor of the present invention was manufactured and placed in a desiccator, which is a drying device, for 3 weeks, the change in the amount of current for each glucose concentration was measured. The results are shown in FIG.

도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이오센서는 공기와의 접촉에도 큰 영향을 받지 않고 제조 직후와 동일하게 선택적 글루코스 투과 능력을 보유하고 있으며, 효과적으로 글루코스를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명에 따른 세포막 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건에 의하여 영향을 크게 받지 않는바, 산업적으로 활용 가치가 높다. As shown in FIG. 13, it was confirmed that the biosensor of the present invention had a selective glucose permeability as well as immediately after preparation without being influenced by contact with air and could effectively detect glucose. As such, the cell membrane filter unit according to the present invention is not significantly affected by conditions in the air such as moisture and moisture, and thus has high industrial value.

종합적으로, 본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 세포막 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 프럭토스, 자일로스, 말토스, 시스테인, 아스코르브산, 요산, 갈락토오스 등과 같은 신호방해물질의 첨가에도 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된 세포막 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다. Overall, the biosensor of the present invention includes a cell membrane filter unit for selectively permeating glucose in a biological sample, and thus has higher sensitivity to detecting glucose than conventionally used glucose measuring sensors, and at the same time, fructose, xylose, maltose, Addition of signal blockers such as cysteine, ascorbic acid, uric acid, galactose and the like also has high glucose detection specificity. In addition, the cell membrane filter part included in the glucose measurement biosensor of the present invention is not significantly affected by changes in air conditions such as moisture and moisture. Can be applied.

Claims (9)

세포막으로 이루어지며, 글루코스 수송체(Glucose trasporter, GLUT) 단백질을 포함하여, 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 필터부;
상기 필터부에서 투과된 글루코스를 인식하는 센서부; 를 포함하며,
상기 센서부는 글루코스 산화효소(Glucose oixdase), 글루코스 탈수소효소(GDH; glucose dehydrogenase), 글루코스 헥소키나아제(glucose hexokinase), 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(GOT; Glutamic Oxaloacetic Transaminase) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(GPT; Glutamic Pyruvic Transaminase)를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.A filter unit made of a cell membrane and including a glucose transporter (GLUT) protein to selectively permeate glucose in a biological sample;
A sensor unit recognizing glucose transmitted from the filter unit; Including;
The sensor unit is a glucose oxidase (Glucose oixdase), glucose dehydrogenase (GDH), glucose hexokinase (glucose hexokinase), cholesterol oxidase, glutamic oxalacetic transaminase (GOT) or A biosensor for measuring glucose in a biological sample, comprising a glutamic pyruvic transaminase (GPT). 제1항에 있어서,
상기 세포막은 적혈구 및 암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 세포로부터 분리한 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.The method of claim 1,
The cell membrane is isolated from one or more cells selected from the group consisting of red blood cells and cancer cells, biosensor for measuring glucose in a biological sample. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 눈물, 소변 및 땀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.The method of claim 1,
The biological sample is one or more selected from the group consisting of blood, tears, urine and sweat, biosensor for measuring glucose in a biological sample. 제1항에 있어서,
상기 필터부의 두께는 100 내지 300 nm인 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.The method of claim 1,
The filter unit has a thickness of 100 to 300 nm, biosensor for measuring glucose in a biological sample. 제1항에 있어서,
상기 바이오센서는
센서부에서 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 해독(read)부;를 더 포함하는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.The method of claim 1,
The biosensor
A biosensor for measuring glucose in a biological sample, further comprising a read unit for reading a signal by glucose recognized by the sensor unit. 제6항에 있어서,
센서부와 해독부 사이에 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 측정부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.The method of claim 6,
A biosensor for measuring glucose in a biological sample, further comprising a measuring unit converting the glucose recognized between the sensor unit and the reading unit into a signal. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트.8. A kit for measuring glucose in a biological sample, comprising the biosensor according to claim 1. 제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법. A method of measuring glucose concentration in a biological sample, comprising contacting a biological sample with a biosensor according to any one of claims 1, 2 and 4-7.
KR1020180074546A 2017-07-27 2018-06-28 Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter KR102051811B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/031,251 US11045119B2 (en) 2017-07-27 2018-07-10 Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170095192 2017-07-27
KR20170095192 2017-07-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190013474A KR20190013474A (en) 2019-02-11
KR102051811B1 true KR102051811B1 (en) 2019-12-04

Family

ID=65370239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180074546A KR102051811B1 (en) 2017-07-27 2018-06-28 Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102051811B1 (en)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102546761B1 (en) * 2019-12-03 2023-06-22 동우 화인켐 주식회사 Bio sensor
KR102332093B1 (en) * 2019-12-03 2021-11-29 고려대학교 산학협력단 Senssor for measuring Hemolysin and method for measuring Hemolysin using the same
KR102433000B1 (en) 2020-01-30 2022-08-18 고려대학교 산학협력단 A metal nanoparticle for glucose detection and glucose detection method using the same
EP4123304A4 (en) * 2020-03-20 2024-03-20 Mara Nanotech Korea Inc Nanowell diagnostic kit for diagnosing cardiovascular disease substances in blood

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002527177A (en) 1998-10-19 2002-08-27 マインハルド クノール Minimally invasive sensor system
KR101145668B1 (en) 2010-11-22 2012-05-24 전자부품연구원 The continuous glucose monitoring system
JP5616235B2 (en) 2009-02-09 2014-10-29 アークレイ株式会社 Electrochemical sensor and manufacturing method thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA03006726A (en) * 2001-01-26 2004-10-15 Sensys Medical Inc Noninvasive measurement of glucose through the optical properties of tissue.
KR20120108760A (en) * 2011-03-25 2012-10-05 (주)미코바이오메드 Electrochemical biosensor strip, and the method for measuring specimen using the same
KR101541798B1 (en) 2011-11-28 2015-08-04 에스디 바이오센서 주식회사 Biosensor for determining concentration of glycated hemoglobin by means of potentiometry
KR101798295B1 (en) 2015-11-05 2017-11-17 성균관대학교산학협력단 Manufacturing method of biosensor platform using graphene and protein, biosensor platform made by the same, and field effect transistor type biosensor comprising the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002527177A (en) 1998-10-19 2002-08-27 マインハルド クノール Minimally invasive sensor system
JP5616235B2 (en) 2009-02-09 2014-10-29 アークレイ株式会社 Electrochemical sensor and manufacturing method thereof
KR101145668B1 (en) 2010-11-22 2012-05-24 전자부품연구원 The continuous glucose monitoring system

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adv Mater. 2017 April ; Vol. 29(16), p.1-18 [doi:10.1002/adma.201606209]
Biomaterials, 2017, Vol. 128. pp. 69-83 (2017.03.01.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190013474A (en) 2019-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102051811B1 (en) Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter
Chen et al. A biocompatible needle-type glucose sensor based on platinum-electroplated carbon electrode
CN2372689Y (en) Current biological sensor
US20080177166A1 (en) Ultrasensitive amperometric saliva glucose sensor strip
JPS6026978B2 (en) Polarographic analysis method
US11435344B2 (en) Electrochemical biosensor and a method of sensing albumin and its complexes
US20200150074A1 (en) Test strip and method for simultaneously detecting glucose concentration and percentage of glycated hemoglobin in single test strip
KR101818368B1 (en) Disposable amperometric detection of hemoglobin and glycated hemoglobin
CN104931560A (en) Biosensor and preparation method and application thereof
EP3965655A1 (en) Method and device for detecting nicotine in sweat
CN210775317U (en) Electrochemical test strip for detecting total cholesterol in blood sample
Leegsma‐Vogt et al. The potential of biosensor technology in clinical monitoring and experimental research
US11045119B2 (en) Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter
CN214622434U (en) Electrochemical biosensor
KR20140143999A (en) Disposable amperometric detection of glycated hemoglobin
JP2023538715A (en) Method for determining the actual concentration of a substrate using an array of self-calibrating biosensors and apparatus for carrying out the method
JP5247043B2 (en) Information acquisition device for concentration of thioredoxins in sample, stress level information acquisition device, and stress level determination method
JPH1038844A (en) Online biosensor
KR102407845B1 (en) High sensitive sensor for measuring glucose and method of the same
KR20220061893A (en) Biosensor for measuring uric acid comprising cytoplasmic filter
CN111521829B (en) Glycosylated hemoglobin test paper and glycosylated hemoglobin detection method thereof
Qi et al. Advanced electrochemical strategy for in vivo detection of electrochemically inactive molecules
TWI299084B (en) Fructosamine reagent
US20210231598A1 (en) Detection of 1, 5-anhydroglucitol (1, 5-ag) in saliva
Alam Zinc-Oxide Nanostructure-Based Wearable Biosensor Platform for Sweat Analysis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant