KR102051559B1 - 섬유증의 진단 또는 치료를 위한 스테아르산의 용도 - Google Patents

섬유증의 진단 또는 치료를 위한 스테아르산의 용도 Download PDF

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Abstract

유리 지방산을 포함하는 섬유증 진단용 바이오마커, 유리 지방산의 검출 시약을 포함하는 섬유증 진단용 조성물, 유리 지방산의 검출 수단을 포함하는 섬유증 진단용 키트, 조직 내 유리 지방산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법, 및 스테아르산을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 조성물이 제공된다.

Description

섬유증의 진단 또는 치료를 위한 스테아르산의 용도{Use of Stearic Acid for diagnosis or treatment of fibrosis}
유리 지방산을 포함하는 섬유증 진단용 바이오마커, 유리 지방산의 검출 시약을 포함하는 섬유증 진단용 조성물, 유리 지방산의 검출 수단을 포함하는 섬유증 진단용 키트, 조직 내 유리 지방산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법, 및 스테아르산을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물이 제공된다.
섬유증(fibrosis)은 재생(reparative)이나 반응 과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것을 의미하며, 기관이나 조직에서 형성되는 정상적인 섬유조직의 형성과는 대조적이다. 섬유증의 예로 폐부종(폐), 간섬유증(간), 신장섬유증(신장), 췌장섬유증(췌장), 심내막심근섬유증(심장), 종격동섬유증(종격의 연조직), 골수섬유증(골수), 후복막섬유증(복막후강의 연조직), 괴상섬유화(폐), 신원성전신섬유증(피부), 크론병(장), 흉터종(피부), 심근경색(심장), 전신성경피증(피부, 폐) 등이 있다(강영희, 생명과학대사전, 도서출판 여초, 2014).
대표적인 폐질환 중 하나인 특발성 폐섬유증 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis; IPF)는 폐포 손상으로 인한 반복적 염증이 섬유화를 유도하고 환자의 호흡부전으로 이어지는 간질성 폐질환 가운데 원인불명의 질병을 의미한다.
특발성 폐섬유증은 아직 그 발병 원인이 밝혀져 있지 않은 진행성 질환으로, 호흡곤란 및 기침이 악화되다가, 진단 후 3-4년 이내에 호흡부전으로 사망에 이르게 되며, 5년 생존률은 약 20%로 정도로 폐암과 유사하다.　
IPF 유병률은 10만명당 14-43 명으로 보고되었으나, 고령 및 남자일수록 높은 유병률을 보여 65세 이상의 남자에서는 500-1500명당 1명 정도로 드물지 않고, 인구의 고령화로 발생률도 증가하는 것으로 알려져 있다.
현재 여러 가지 폐기능 검사를 통한 환자의 폐기능 평가와 방사선학적 검사, 기관지 내시경검사 및 기관지 폐포 세척 검사, 조직학적 검사 등을 통해IPF의진단 및 예후 등을 분석하고 있으나, 다른 간질성 폐질환과의 구분이 쉽지 않고 환자 개개인의 경과가 다양하여 정확한 진단 및 예후 예측이 어려운 상황이다. 또한, IPF 진단을 위한 분자수준의 바이오 마커가 개발되어 있지 않아서, 치료타겟 발굴 및 개발된 신약의 검증에 한계가 있는 상황이다.
IPF에 대한 바이오 마커로서, 혈액 내 KL-6 (Krebs von den Lungen-6), SP-A 및 D (Surfactant protein A and D), CCL-18 (Chemokine [C-C motif] ligand 18), MMP-7 (Matrix metalloproteinase-7) 등이 특발성 폐섬유증의 경과 및 사망예측에 유용함이 보고된 바 있다. 혈액 내 cytokine 이나 fibrocyte 이 IPF의 진단 및 경과 예측을 위한 바이오 마커로 활용되었으나, 임상에서 활용될 정도의 유효성은 보여주지 못하여, 새로운 개념의 바이오 마커의 개발이 필요한 상황이다.
Redox Biology 7 (2016) 48-57 (2015-11-22)
본 발명의 일 예는 유리 지방산을 포함하는 섬유증 진단용 바이오 마커를 제공한다.
또 다른 예는 유리 지방산의 검출 시약을 포함하는 섬유증 진단용 조성물을 제공한다.
다른 예는 유리 지방산의 검출 수단을 포함하는 섬유증 진단용 키트를 제공한다.
다른 예는 조직 내 유리 지방산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료 및/또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 약학적 유효량을 섬유증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다.
다른 예는 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 스테아르산 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 개선 및/또는 예방을 위한 식품 조성물을 제공한다.
섬유증(fibrosis)에서는 조직 손상 후 상처치유과정의 이상(aberrant wound healing), 즉, 손상된 상피(epithelial cells)의 재생이 제대로 일어나지 않고, 섬유아세포(fibroblasts)가 지속적으로 증식하여 기질(matrix)을 생성하므로, 조직은 교원질과 섬유아세포들로 대체되어 구조가 손상(remodelling) 되는데, 상피세포의 과도한 세포사멸과 섬유아세포의 세포사멸장애, 기질 형성시 유리되는 지방산을 바이오마커로서 활용하고자 본 발명을 착안하였다.　
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 섬유증은 폐섬유증, 간섬유증, 신장섬유증, 췌장섬유증 및 심근섬유증을 포함한다.
본 발명자들은 섬유증, 예컨대, 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis; IPF)은 정확한 진단 수단이 없어서 적절한 치료가 이루어지기 힘든 상황에서, 폐섬유증 폐조직 (폐섬유증을 앓는 대상으로부터 분리된 폐조직) 내의 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 함량이 정상 폐조직 (폐섬유증을 앓지 않는 대상으로부터 분리된 폐조직)에서와 유의적인 차이를 나타냄을 확인하였으며 (도 1 참조), 이러한 결과를 기초로 폐섬유증 폐조직 내의 유리 지방산, 예컨대, 스테아르산의 함량을 측정하여 이를 정상 폐조직과비교함으로써 폐섬유증의 진단에 유용한 정보를 제공할 수 있음을 확인하였다. 이에, 폐조직 내 유리 지방산, 예컨대, 스테아르산의 섬유증 진단을 위한 바이오마커로서의 용도가 제안된다.
보다 구체적으로, 일 예는 유리 지방산을 포함하는 섬유증 진단을 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.
다른 예는 유리 지방산의 검출 시약을 포함하는 섬유증 진단용 조성물을 제공한다.
다른 예는 유리 지방산의 검출 수단을 포함하는 섬유증 진단용 키트를 제공한다.
다른 예는 조직 내 유리 지방산의 함량을 측정하는 단계를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "폐섬유증"은 폐조직이 섬유화되어 호흡장애를 유발하는 모든 질병을 의미하기 위하여 사용될 수 있으며, 예컨대, 폐섬유화를 특징으로 하는 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis; IPF), 특발성 간질성 폐렴 (Idiopathic Interstitial Pneumonia), 결체조직질환 연관 간질성 폐질환 등의 간질성 폐질환, 또는 과민성 폐장염일 수 있다.
특발성 폐섬유증은 특발성 폐섬유화증이라고도 하며, 원인도 모르게 폐포벽의 반복적 손상과 이로 인한 상처회복과정의 이상으로 섬유모세포 및 교원질의 침착이 증가되어 폐조직의 구조적 변화를 야기하며, 점차 폐기능 장애가 심화되어 심한 경우 사망에 이르게 되는 질병이다.
도 1에서 보여지는 바와 같이, 섬유증 조직에서의 탄소수 16 내지 18의 포화 또는 불포화 유리 지방산 (예컨대, 팔미토레산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 등), 예컨대, 스테아르산의 함량이 정상 조직에서와 비교하여 현저한 차이를 나타냄을 확인하였다. 특히, 섬유증 조직에서의 스테아르산 함량이 정상 조직과 비교하여 유의적으로 감소함이 확인되었다. 또한, 리놀레산 및 올레산, 바람직하게는 팔미토레산, 팔미트산, 리놀레산 및 올레산은 섬유증 조직에서의 함량이 정상 조직보다 상승하는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 시험 시료 내의 스테아르산의 함량은 비교 대상 시료와 비교하여 감소되어 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 시험 시료 내의 리놀레산 및 올레산의 함량은 비교 대상 시료와 비교하여 증가되어 있음을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 시험 시료 내의 팔미토레산 및 팔미트산의 함량은 비교 대상 시료와 비교하여 증가되어 있음을 특징으로 한다.
따라서, 본 명세서에 사용된 유리지방산은 탄소수 16 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 구체적으로, 팔미토레산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 스테아르산일 수 있다. 상기 유리 지방산은 조직 내에 존재하거나 조직으로부터 분리 (또는 추출)된 것일 수 있다.
상기 섬유증 진단용 키트는 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 존재 여부 및/또는 수준 (농도)을 측정할 수 있는 모든 검출 수단을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 검출 수단은 화학적 유도체화 과정을 거쳐 메틸에스테르화된 지방산 (fatty acid methyl ester)을 측정 (또는 검출 또는 분석 또는 정량)하는 가스크로마토그래피 질량분석기 (GC/MS) 또는 가스크로마토그래피 (GC) 검출기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대, 스테아르산의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명은 섬유증 진단을 위하여 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대, 스테아르산의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은 섬유증 진단을 위하여 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 수준을 측정하는 방법과 동일한 의미로 사용된다.
일 예에서, 상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은,
시험 시료 내의 탄소수 16 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 유리 지방산 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 시험 시료 내의 유리 지방산 수준을 비교 대상 시료의 유리 지방산 수준과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 유리 지방산은 앞서 설명한 바와 같다.
보다 구체 예에서, 상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은,
시험 시료 내의 스테아르산 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 시험 시료 내의 스테아르산 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산 수준과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대 스테아르산 수준이 비교 대상 시료의 수준보다 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래된 대상을 섬유증 환자로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 구체 예에서, 상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은,
시험 시료 내의 스테아르산, 리놀레산 및 올레산 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 시험 시료 내의 스테아르산, 리놀레산 및 올레산 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산 수준과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 시험 시료 내의 유리 지방산, 예컨대 스테아르산 수준이 비교 대상 시료의 수준보다 낮고, 리놀레산 및 올레산 수준은 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래된 대상을 섬유증 환자로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 구체 예에서, 상기 방법은 비교 대상 시료와 비교하여 시험 시료 내의 팔미토레산 및 팔미트산의 함량도 추가적으로 증가되어 있는 경우 , 상기 시험 시료가 유래된 대상을 섬유증 환자로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 시험 시료 내의 스테아르산 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산 수준과 비교하기 위하여, 상기 비교하는 단계 이전에 비교 대상 시료에서의 스테아르산 및/또는 리놀레산 및 올레산(추가적으로, 팔미토레산 및 팔미트산) 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 단계는 상기 시험 시료 내의 유리지방산 수준을 측정하는 단계 전, 후, 또는 동시에 수행할 수 있다.
다른 구체 예에서, 상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은,
시험 시료 내의 스테아르산을 제외한 탄소수 16 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유리 지방산의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 시험 시료 내의 스테아르산을 제외한 유리 지방산의 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산을 제외한 유리 지방산의 수준과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 스테아르산을 제외한 유리 지방산은 예컨대 팔미토레산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 시험 시료 내의 스테아르산을 제외한 유리 지방산의 수준이 비교 대상 시료의 수준보다 높은 경우, 상기 시험 시료가 유래된 대상을 섬유증, 예컨대 특발성 폐섬유증 환자로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 시험 시료 내의 스테아르산을 제외한 유리 지방산 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산을 제외한 유리 지방산 수준과 비교하기 위하여, 상기 비교하는 단계 이전에 비교 대상 시료에서의 스테아르산을 제외한 유리 지방산 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이 단계는 상기 시험 시료 내의 스테아르산을 제외한 유리 지방산 수준을 측정하는 단계 전, 후, 또는 동시에 수행할 수 있다.
상기 시험 시료는 진단 대상으로부터 분리된 세포, 조직, 상기 조직의 파쇄물, 또는 상기 조직으로부터 추출(예컨대, 최종농도가 25 mM이 되도록 소량의 염산을 첨가한 후, 이소옥탄 (iso-octane)과 같은 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 분지형 알칸 등의 유기용매로 추출)된 지방산 혼합물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 비교 대상 시료는 섬유증을 앓지 않는 대상으로부터 분리된 조직 (예컨대, 섬유화가 관찰되지 않은 폐조직), 상기 조직의 파쇄물, 또는 상기 조직으로부터 추출(예컨대, 25 mM이 되도록 소량의 염산을 첨가한 후, 이소옥탄 (iso-octane)과 같은 탄소수 1 내지 10의 직쇄 또는 분지형알칸 등의 유기용매로 추출)을 사용하여 추출)된 지방산 혼합물을 포함하는 것 일 수 있다. 상기 시험 시료와 비교 대상 시료는 모두 생체, 예컨대 인체로부터 분리된 것이고, 상기 방법은 생체 외, 예컨대, 인체 외에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 대상은 모든 포유동물, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등으로 이루어진 군에서 선택된 동물일 수 있고, 예컨대, 인간일 수 있다.
상기 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 수준은 조직 내의 스테아르산의 모든 정량 결과를 의미하는 것으로, 농도, 함량, 비율 등에서 선택된 정량 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 보다 정확한 섬유증의 진단을 위하여, 섬유증 조직에서의 스테아르산의 함량을 섬유증 조직에서의 유리 지방산의 총량, 에컨대, 스테아르산을 포함한 탄소수 14 내지 18의 포화 유리 지방산 및 불포화 유리 지방산의 총량으로 나눈 값, 즉 섬유증 조직에서의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산의 총량)의 비율이 정상 조직에서의 비율과 현저한 차이를 보임을 확인하였다. 즉, 섬유증 조직에서의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산의 총량)의 비율이 정상 조직에서의 비율보다 유의적으로 감소함을 확인하였다 (도 2 참조).
상기 섬유증 진단용 키트는 스테아르산의 검출 수단을 포함하거나, 또는 스테아르산의 검출 수단에 더하여, 스테아르산을 제외한 탄소수 14 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하기 위한 검출 수단을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 검출 수단은 화학적 유도체화 과정을 거쳐 메틸에스테르화된 지방산 (fatty acid methyl ester)을 검출 (측정 또는 분석 또는 정량)할 수 있는 가스크로마토그래피 질량분석기 (GC/MS) 또는 가스크로마토그래피 (GC) 검출기등을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법은
시험 시료 내의 스테아르산의 함량 및 탄소수 14 내지 18의 유리 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 함량(이하, '탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량')을 측정하는 단계;
시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 얻는 단계, 및
상기 얻어진 시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 비교 대상 시료에서의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율과 비교하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 방법은, 상기 비교하는 단계 이후에, 시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율이 비교 대상 시료의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율보다 낮은 경우, 상기 시험 시료가 유래된 대상을 섬유증, 예컨대 특발성 폐섬유증 환자로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에서, 시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 비교 대상 시료의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율과 비교하기 위하여, 상기 비교하는 단계 이전에 비교 대상 시료에서의 탄소수 14 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 수준을 측정하는 단계; 및 시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 얻는 단계 스테아르산 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄소수 14 내지 18의 유리 지방산은 탄소수 14 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 스테아르산 및 스테아르산을 제외한 조직 내에서 측정된 모든 종류의 탄소수 14 내지 18의 지방산들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혼합물일 수 있다. 예컨대, 상기 탄소수 14 내지 18의 유리 지방산은 스테아르산과, 미리스트산, 팔미트산, 팔미톨레산, 리놀레산, 올레산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혼합물일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 스테아르산, 및/또는 탄소수 14 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산의 함량은 통상적인 모든 지방산 정량 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 가스크로마토그래피 질량분석법 (GC/MS) 또는 가스크로마토그래피 (GC)등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같이 섬유증 조직에서 스테아르산 함량이 저하됨(부족함)에 착안하여, 스테아르산을 투여함으로써 섬유증 치료 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다 (도 3 내지 도 8 참조). 따라서, 스테아르산의 섬유증, 예컨대, 특발성 폐섬유증의 치료제로서의 용도가 제안된다.
구체적으로, 일 예는 스테아르산 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료, 개선 및/또는 예방을 위한 조성물을 제공한다. 상기 유효성분은 소망하는 효과, 예컨대 섬유증 치료, 개선 및/또는 예방에 효과를 발휘하는 성분을 의미한다.
본 명세서에서 용어, “스테아르산”은 18개의 탄소사슬을 갖는 화학식 C17H35CO2H의 옥타데칸산(octadecanoic acid) 및 상기 화학식의 수소 원자 중 하나 또는 그 이상이 치환된 유도체를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 스테아르산은 목적하는 용도에 따라 당업계에 공지된 다양한 방법으로 치환기를 도입하여 유도체를 제조할 수 있으며, 상기 스테아르산의 유도체 역시 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석된다. 상기 유도체의 예로는 메틸 스테아르산, 부틸 스테아르산, 이소프로필 이소스테아르산, 에틸렌글리콜 모노스테아르산, 프로필렌글리콜 모노스테아르산, 글리세롤 모노스테아르산, 페길화된(PEGylated) 스테아르산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료, 및/또는 예방을 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 약학적 유효량을 섬유증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 섬유증의 치료 및/또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 섬유증의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 섬유증의 치료 및/또는 예방을 위한 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물은 체중 감소 억제능 및/또는 항산화능을 추가로 포함한다.
상기 예방 및/또는 치료 대상은 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등이거나, 이들의 생체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다. 일 예에서, 상기 대상은 섬유증, 예컨대 특발성 폐섬유증을 앓는 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류, 또는 이들의 생체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "약학적으로 허용가능한 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물 또는 유효성분인 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 또는 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "약학적 유효량"은 유효성분이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 유효성분 (스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염)의 약학적 유효량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 1회 투여를 위한 스테아르산의 약학적 유효량은0.0001 내지 200mg/kg, 0.001 내지 100mg/kg, 또는 0.02 내지 10mg/kg 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물 또는 유효성분인 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
다른 예는 스테아르산 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 개선 및/또는 예방을 위한 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 식품 조성물은 체중 감소 억제능 및/또는 항산화능을 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 [예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 명세서에서 용어, "식품학적으로 허용가능한 염"은, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 식품학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식품 조성물은 인간용 식품 또는 동물용 사료나 사료첨가제 등으로 사용될 수 있다.
조직 내 유리 지방산, 예컨대 스테아르산의 함량, 또는 스테아르산과 탄소수 14-18의 지방산 함량 간의 비율을 측정함으로써, 섬유증의 정확한 진단이 가능하여, 조기에 적절하고 유효한 치료를 가능하게 하여 질병의 예후를 개선시킬 수 있으며, 스테아르산을 치료제로서 사용함으로써 섬유증, 예를 들어, 특발성 폐섬유증의 보다 효과적인 치료를 가능하게 할 수 있다.
도 1은 사람 폐조직내 유리 지방산 정량 결과를 보여주는 그래프이다 (Normal: 정상군 환자 폐조직, n=10; IPF: 특발성 폐질환 환자 폐조직, n=10).
도 2는 도 1의 사람 폐조직내 유리 지방산 정량 결과를 바탕으로 스테아르산의 양을 탄소 14-18개인 유리지방산들의 양으로 나눈 값을 보여주는 그래프이다 (Normal: 정상군 환자 폐조직, n=10; IPF: 특발성 폐질환 환자 폐조직, n=10).
도 3은 TGF-베타와 스테아르산 (SA)를 함께 처리한 경우의 스테아르산의 TGF-베타로 인한 섬유아세포 활성화 및 상피세포 소실에 대한 효과를 보여주는 그래프로서, (A)는 섬유아세포에 미치는 효과를, (B)는 상피세포에 미치는 효과를 각각 보여준다.
도 4는 스테아르산에 의한 섬유아세포내 섬유화의 마커인(A) 콜라겐 1(collagen 1/actin)과 (B) 알파-SMA의 변화 (알파-SMA/actin)를 대조군 (CTL)에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다. 여기서 collagen1/actin 또는 알파-SMA/actin은 collagen1 또는 알파-SMA의 단백질양을 세포내 대조단백질인 actin양으로 normalize한 값을 나타낸다.
도 5는 팔미트산 (PA)을 처리한 경우 섬유아세포 활성화 및 상피세포 소실에 대한 효과를 보여주는 그래프로서, (A)는 섬유아세포에 미치는 효과를, (B)는 상피세포에 미치는 효과를 각각 보여준다.
도 6은 팔미트산에 의한 섬유아세포 내 섬유화의 마커인(A) 콜라겐 1(collagen 1/actin)과 (B) 알파-SMA의 변화 (알파-SMA/actin)를 대조군 (CTL)에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 폐섬유아세포에 TGF-베타 처리, 팔미트산 처리, 스테아르산 처리, TGF-베타와 스테아르산의 병용처리, 및 팔미트산과스테아르산의 병용처리시의 폐 섬유아세포내 섬유화의 마커인 (A) 콜라겐 1(collagen 1/actin)과 (B) 알파-SMA의 변화 (알파-SMA/actin)를 대조군 (CTL)에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다 (CTL: 대조군; TGF-b: TGF-베타 5ng/mL 처리군; PA: 팔미트산 10uM(micromole)/mL 처리군; SA: 스테아르산 40uM/mL 처리군; TGF-b+SA: TGF-베타 5ng/mL + 스테아르산 40uM/mL 병용 처리군; PA+SA: 팔미트산 10uM/mL + 스테아르산 40uM/mL 병용 처리군).
도 8은 폐섬유아세포에 TGF-베타 처리, 올레산(OA) 처리, 스테아르산 처리, TGF-베타와 스테아르산의 병용처리, 및 올레산과스테아르산의 병용처리시의 폐 섬유아세포 내 섬유화의 마커인 (A) 콜라겐 1(collagen 1/actin)과 (B) 알파-SMA의 변화 (알파-SMA/actin)를 대조군 (CTL)에 대한 상대값으로 나타낸 그래프이다 (CTL: 대조군; TGF-b: TGF-베타 5ng/mL 처리군; OA: 올레산 40uM/mL 처리군; SA: 스테아르산 40uM/mL 처리군; TGF-b+SA: TGF-베타 5ng/mL + 스테아르산 40uM/mL 병용 처리군; OA+SA: 올레산 40uM/mL + 스테아르산 40uM/mL 병용 처리군).
도 9는 Bleomycin에 의해 유도된 폐 섬유화 동물모델에서 스테아르산의 항섬유화 효과를 나타낸다((A) 마우스 체중 곡선- 대조군 (Con, n=4), bleomycin (Bleo, n=5), stearic acid (SA, n=4), bleomycin + stearic acid (Bleo+SA, n=6). (B) 마우스 폐조직 염색 (H&E 염색). (C) hydroxyproline 함유량. (D) 폐조직에서 α-SMA의 발현량. (E) 폐조직에서 p-smad2/3의 발현량. (F) 혈청 TGF-β1 변화. (**p<0.01, *p<0.05는 대조군과의 비교시 p값. #p<0.05는 bleomycin 처리군과 비교시 p값.)).
도 10은 Human primary fibroblast에서 스테아르산의 항섬유화 효과를 나타낸다((A)와 (B). stearic acid의 농도증가에 따른 섬유화 마커의 억제. (C). 4명의 환자로부터 얻은 primary fibroblast에서 stearic acid의 항섬유화 효과. (D)와 (E). TGF-β1 자극에 대한 stearic acid의 항섬유화 효과. (*p<0.05는 대조군과의 비교시. #p<0.05는 bleomycin 처리군과 비교시 p값.)).
도 11은 상피세포 (Epithelial cell)에서 스테아르산의 역할을 나타낸다((A)와 (B). Stearci acid에 의한 E-cadherin의 발현 변화 (*p<0.05는 대조군과의 비교시 p값. #p<0.05는 bleomycin 처리군과 비교시 p값.) ).
도 12는 섬유아세포 (fibroblast)에서 스테아르산의 항섬유화 기전을 나타낸다((A)와 (B) stearic acid 처리에 따른 p-Smad2/3, Smad7 단백질 발현 (C) stearic acid, TGF-β1 처리후 ROS 변화 (D) TGF-β, 항산화제 (NAC) 처리에 따른 p-Smad2/3의 발현 변화).
이하 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
참고예 1: 시료 준비
50mg이하 (~50mg)의 인간특발성 폐섬유증 환자 (n=10) 및 정상인 (n=10)의폐조직(서울아산병원 조직자원은행에서 입수하거나, 임상시험심사위원회 (IRB) 절차에 따라 임상연구자가 수집한 폐조직)을TissueLyzer (Qiagen)를 사용하여 균질화시키고, 25mM이 되도록 소량의 염산을 첨가한 후, 이소옥탄 (iso-octane)을 이용하여 추출하였다. 50 uL, 0.1 mg/mL의 내부 표준 지방산 (Internal standard;heneicosanoic acid(C21:0) for free fatty acids)을 유리 지방산 추출 전에 상기 시료에 첨가하였다. 얻어진 시료를 지질 추출 이후에 진공 원심분리하여 건조시켰다.
GC/MS (gas chromatography mass spectrometry)분석을 위하여 유리 지방산들을 유도체화 시켰다(derivatized). 60 ℃에서 30분동안 유리 지방산들을 BCl3-MeOH와 반응시킨 후 유리 지방산의 메틸에스테르화 (Methyl esterification)를 수행하였다.
참고예 2: GC /MS 분석
Agilent 7890/5975 GCMSD system (Agilent Technology) 및 HP-5 MS 30m x 250 um (micrometer)x 0.25 um column (Agilent 19091S-433)을 사용하여 지방산 메틸에스테르를 분석하였다. He (99.999 %)를 carrier gas로 사용하였다. 초기 온도를 50℃로 하고, 2분의 홀드시간 후 10℃/min 속도로 120℃까지 승온시켰다. 그 후, 온도를 10℃/min 속도로 250℃까지 올리고 15분간 유지시켰다. 마지막으로, 300℃에서 GC컬럼을 청소하였다. 5분 동안의용매 지연 및 스캔 모드를 적용하였다. 특정 지방산에 대응하는 추출된 이온 크로마토그램을 사용하여 정량하였다. 각 지방산 메틸에스테르/헤네이코산메틸에스테르 (eicosanoid acid methyl ester)의 피크 영역 비율을 구하여 지방산들 간 상대적 비교를 수행하였다.
실시예1 : 특발성 폐섬유증의 진단 마커 선별
특발성 폐섬유증(IPF) 환자의 진단 마커를 선별하기 위하여, 정상군의폐조직과 특발성 폐섬유증환자군의폐조직 내의 유리지방산을 정량하였다.
보다 구체적으로, 특발성 폐섬유증환자군의폐조직 (n=10)과 정상군의폐조직(n=10)(서울아산병원 조직자원은행에서 입수하거나, IRB 절차에 따라 임상연구자가 수집한 폐조직)을 시험에 사용하였다.
폐조직 내 유리 지방산의 측정은 상기 참고예 2에 기재한 GC/MS 분석 방법에 따라서 수행하였다.
상기 측정된 폐조직 내 유리 지방산의 함량의 평균값을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 팔미톨레산 (Palmitoleic acid; C16:1), 팔미트산 (Palmitic acid; C16:0), 리놀레산 (Linoleic acid; C18:2), 및 올레산 (Oleic acid; C18:1)의 경우, 특발성 폐섬유증 환자군의 폐조직에서의 함량이 정상군의 폐조직과 비교하여 현저하게 증가되어 있는 반면, 스테아르산 (Stearic acid; C18:0)의 경우에는 특발성 폐섬유증 환자군의 폐조직에서의 함량이 정상군의 폐조직과 비교하여 유의미하게 감소되어 있음을 확인할 수 있다 (p=0.017). 한편, 탄소수 14개의 포화 지방산인 미리스트산 (Myristic acid; C14:0)과, 탄소수 20개의 불포화 지방산인 아라키돈산 (Arachidonic acid; C20:4), EPA (Eicosapentaenoic acid; C20:5) 및 DHA (Docosahexaenoic acid; C22:6)의 경우에는 특발성 폐섬유증 환자군의 폐조직과 정상군의 폐조직에서 뚜렷한 함량 차이가 나타나지 않았다.
이와 같은 결과에 기초하여, 스테아르산을 특발성 폐섬유증 환자의 진단 마커로서 선별하였다.
도 1에서 보여지는 바와 같이, 특발성 폐섬유증 환자군의 폐조직내 유리지방산을 정량하여 얻어진 스테아르산을 제외한 탄소수 18개 이하의 포화 및 불포화 유리지방산들의 총량을 양은 정상군의폐 조직에서와 비교하여 증가하였다. 이에 폐조직 내 스테아르산 (C18:0)의 함량을 탄소 14-18개의 포화 및 불포화 유리지방산들 (미리스트산(C14:0), 팔미토레산 (C16:1), 팔미트산 (C16:0), 리놀레산 (C18:2), 올레산 (C18:1), 및 스테아르산 (C18:0))의 합으로 나누어 얻어진 값 (스테아르산 함량/C14-C18 총량)을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 특발성 폐섬유증 환자군의 폐조직에서의(스테아르산 함량/C14-C18 총량)비율이 정상군 폐조직과 비교하여 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있다 (p= 0.007). 따라서, 폐조직 내 스테아르산 함량과 함께, 폐조직 내의 (스테아르산 함량/C14-C18 총량)비율이 특발성 폐섬유증 환자의 진단을 위한 지표로서 제안된다.
실시예 2: 스테아르산의 특발성 폐섬유증 치료 효과
상기 실시예 1에서 얻어진 바와 같이, 특발성 폐섬유증 환자의 폐조직 내 스테아르산 함량이 낮아진 것에 착안하여, 특발성 폐섬유증 환자에게 스테아르산을 투여한 경우의 치료 효과를 시험함으로써 스테아르산의 특발성 폐섬유증 진단 마커뿐 아니라 치료제로서의 효능을 확인하였다.
특발성 폐섬유증 환자 폐세포의 특징은 TGF(Transforming growth factor)-베타로 인한 섬유아세포의 활성화와 상피세포의 소실로 알려져 있다. 이러한 사실에 기초하여, 폐 섬유아세포와 폐 상피세포에 TGF-베타를 처리하여 특발성 폐섬유증과 유사한 환경을 조성하여 스테아르산 처리 효과를 시험하였다.
인간의 폐 섬유아세포 (MRC-5; ATCC
Figure 112017113912874-pat00001
CCL-171TM;)와 인간의 폐 상피세포 (BEAS-2B; ATCC
Figure 112017113912874-pat00002
CRL-9609TM)의 각각의 배양물(MRC-5의 경우 BEGM (Lonza), BEAS-2B의 경우 BMEM (ATCC))에 스테아르산 (40uM/mL), TGF-베타(5ng/mL; Sigma), 또는 스테아르산 (40uM/mL) + TGF-베타 (5ng/mL)를 24시간 동안처리한후, cell viability를 측정하였다. cell viability는 MTT assay kit(Sigma)를 사용하여 측정하였다. 비교를 위하여, 스테아르산과 TGF-베타 모두 처리하지 않은 (medium only) 세포 배양물에서의 cell viability를 상기 방법으로 측정하였다 (대조군).
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다 (CTL: 대조군 (medium only); SA: stearic acid (스테아르산) 40uM/mL 처리군; TGF-b: TGF-베타 5ng/mL 처리군; SA+TGF-b; 스테아르산 40uM/mL 및 TGF-베타 5ng/mL 처리군). 도 3의 상단 (A)는 폐 섬유아세포의 cell viability(%)를, 하단 (B)는 폐 상피세포의 cell viability(%)를 각각 나타내며, 다. 도 3에서, 각 시험군에서의 cell viability는 대조군 (CTL)에서의 cell viability를 100%로 한 상대값으로 나타내었다.
도 3 (A)에 나타난 바와 같이, 폐 섬유아세포의 경우TGF-베타만 단독 처리시 cell viability가 증가하였고, TGF-베타에 스테아르산을 병용처리시 cell viability는 감소하였다. 반면, 도 3 (B)에서 보는 바와 같이, 폐 상피세포의 경우에는 TGF-베타만 단독 처리시 cell viability가 감소하였고, TGF-베타에 스테아르산을 병용 처리시 cell viability는 증가하였다. 이와 같은 결과는, 스테아르산이 TGF-베타로 인한 폐 섬유아세포의 활성화와 폐 상피세포의 소실을 억제할 수 있음을 보여주는 것이며, 이는 스테아르산의 TGF-베타로 인한 폐 섬유아세포의 활성화와 폐 상피세포의 소실로 설명할 수 있는 특발성 폐섬유증의 치료 효과를 제안한다 (Proc Am Thorac Society 2012, 9(3) pp. 111-116).
또한, 폐 섬유아세포내 스테아르산에 의한 섬유화의 마커인 콜라겐 1(도 4의 (A))과 알파-SMA (alpha-alpha smooth muscle actin)(도 4의 (B))의 변화를 관찰하여 그 결과를 도 4에 나타내었다 (CTL: 스테아르산이나 TGF-베타를 처리하지 않은 폐 섬유아세포(medium only)). 도 4의 y축에 표시된 collagen 1/actin 또는 알파-SMA/actin은 collagen 1 또는 알파-SMA의 단백질양을 세포내 대조 단백질인 actin양으로 normalize한 값을 의미한다.
도 4에서 나타난 바와 같이, 특발성 폐섬유화의 기전 물질로 알려진 TGF-베타만 처리한 경우에는 콜라겐 1과알파-SMA 모두 증가함을 확인하였고, 이러한 변화는 스테아르산의 처리에 의하여 억제됨이 확인되었으며, 이러한 결과는 스테아르산의 폐섬유화 저해 효과를 보여주는 것이다.
특발성 폐섬유증 환자의 폐조직에서 스테아르산은 감소된 반면, 팔미트산을 비롯한 탄소 14-18 개를 포함하는 다른 포화, 불포화지방산들은 증가되어 관찰되었으므로, 폐섬유증의 치료에 있어 스테아르산의 치료효과를 검증하기 위해 폐섬유증 환자에서 증가된 것으로 관찰된 팔미트산 처리에 따른 효과도 관찰하였다.
도 5 (A)는 폐 섬유아세포에 팔미트산을 처리한 경우 팔미트산 농도에 따라 cell viability가 증가함을 보여주고, 도 5 (B)는 폐 상피세포는 팔미트산 처리농도에 따라 cell viability가 감소함을 보여준다. 도 5는 고농도의 팔미트산 처리시에는 TGF-베타와 유사한 수준의 결과를 보여준다.
도 6은 도 4의 결과를 얻은 시험 방법을 참조하여, 폐 섬유아세포에 팔미트산 처리시의 섬유아세포내 섬유화의 마커인 collage 1 (collagen 1/actin); (A))과 (B) 알파-SMA (알파-SMA/actin; (B))의 수준을 측정하여 대조군 (CTL; medium only)에 대한 상대값으로 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 폐 섬유아세포에 팔미트산을 처리시, 스테아르산 단독 처리시와 달리, 특발성 폐섬유화의 기전 물질로 알려진 TGF-베타만 처리한 경우와 유사한 수준으로 collage 1과 알파-SMA 모두 증가함을 보여주고 있다.
상기 도 5 및 도 6에서 폐섬유화를 활성화시키는 것으로 나타난 팔미트산(PA)에 의하여 유발된 폐 섬유화에 대한 스테아르산(SA)의 억제 효과를 시험하기 위하여, collage 1 (collagen 1/actin); (A))과 (B) 알파-SMA (알파-SMA/actin; (B))의 수준을 측정하여 대조군 (CTL; medium only)에 대한 상대값으로 도 7에 나타내었다. 상기 시험에 스테아르산 40uM/mL, 팔미트산 10uM/mL, 및 TGF-베타 5ng/mL을 각각 사용하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 팔미트산과 TGF-베타로 증가된 섬유화가 스테아르산에 의해 억제됨을 확인할 수 있다.
상기 도 7의 결과를 얻은 시험 방법을 참조하여, 팔미트산 대신 올레산(OA)를 사용하여 시험하였으며, collage 1 (collagen 1/actin); (A))과 (B) 알파-SMA (알파-SMA/actin; (B))의 수준을 측정하여 대조군 (CTL; medium only)에 대한 상대값으로 도 8에 나타내었다. 상기 시험에 스테아르산 40uM/mL, 올레산 40uM/mL, TGF-베타 5ng/mL을 각각 사용하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 팔미트산과 유사하게, 올레산 역시 TGF-베타와 동등한 수준으로 폐섬유화를 활성화시킴을 알 수 있으며, 이와 같이 TGF-베타와올레산 처리에 의하여 증가된 폐섬유화는 스테아르산 처리에 의하여 유의미하게 감소함을 확인할 수 있다.
도 4 내지 도 8의 결과를 구하기 위한 Collagen 1과 알파-SMA 측정 및 cell viability의 측정은 다음의 방법으로 수행하였다:
- 시료전처리
상피세포와 섬유아세포를 6well plate에 2*104cells/well로 뿌리고 24시간동안 안정화 시간을 부여한 후, 결핍을 주고 난 15시간 후에 stearic acid (40uM/mL), TGF-베타 (5ng/mL), stearic acid (40uM/mL) + TGF-베타 (5ng/mL)의 순서로 세포에 처리를 하였다. 처리 후 24시간 동안 배양기에서 24시간을 배양 후 다음 단계로 실험을 진행하였다.
- Cell viability assay
24시간동안의 세포내 자극이 끝난 후 상피세포와 섬유아세포의 배지를 보통의 배지로 교체하고 MTT solution(20mg/ml) 10ul를 추가로 넣어주고 난 후 plate외부를 은박지로 감싸주어 배양기에서 2시간 동안 배양을 진행하였다. 2시간의 배양시간이 지난 후 세포 내 모든 배지는 걷어내고 100ul의 양으로 dimethylsulfoxide를 교체하고 1시간동안 추가로 배양기에서 배양을 진행하여 세포들을 파쇄하였다. 2시간이 지난 후 ELISA reader를 이용하여 595nm의 흡광도 값으로 세포의 활성화를 측정하였다.
- Collagen 1과 알파-SMA 측정
24시간의 자극이 끝난 후 차가운phosphate buffer saline으로 2번을 세척한 후 protein lysate solution을 넣고 세포를 긁어 내어 1.5ml의 EP tube에 모은 후 분쇄기로 30초가 세포들을 용해시켰다. 그리고 난 후 원심분리기를 이용하여 14,000rpm, 20min, 4℃의 조건으로 원심분리를 진행하였다. 그리고 BCA분석법을 이용하여 단백질 양을 측정 후 동량으로 정량하여 95℃에서 10분간 sample을 끓인 후, immune-blot을 통해 collagen type 1과 알파-SMA의 발현양을 측정하였다. 단백질의 발현양을 확인 후 통계프로그램을 이용하여 sample간의 유의성테스트를 진행하였다.
실시예 3: Bleomycin에 의해 유도된 폐 섬유화 동물모델에서 스테아르산의 항섬유화 효과
6주령 마우스 (C57BL/6J)들을 4 또는 5마리씩 4그룹으로 나누었다. ((1) intratracheal saline + vehicle, (2) intratracheal saline + stearic acid, (3) intratracheal 4 units/kg bleomycin + vehicle, (4) intratracheal bleomycin + stearic acid를 처리한 그룹). 마우스들을 50 mg/kg alfaxan과 5 mg/kg rumpun으로 마취시킨 후 bleomycin과 saline을 intratracheal로 주입시켰다. 3 mg/kg stearic acid는 3주 동안 주 3회 oral gavage (zonde)를 이용하여 처치하였다. 21일차에 마우스들로부터 폐 조직 및 혈액을 취하여 연구에 사용하였다.
(1) Stearic acid는 bleomycin에 의한 체중 감소를 억제 효과: bleomycin 처리군은 7일차에 급격한 체중감소가 관찰 되며 이후 체중의 증가 패턴을 보이나 지속적으로 대조군에 비하여 유의미하게 체중감소가 관찰되었다. stearic acid는 bleomycin에 의한 7일차의 급격한 체중감소를 유의미하게 억제함을 확인하였다(도 9 (A)).
(2) Stearic acid가 bleomycin에 의해 유도되는 섬유화에 의한 조직 병리학적 특성을 완화: 대조군은 정상 폐조직의 특성이 잘 관찰 되고 있으나 bleomycin 처리군은 세포밀집, 폐포벽의 비후 및 폐포 공간의 remodeling과 같은 폐 섬유화 조직병리학 특성이 잘 나타나고 있다. bleomycin + stearic acid 처리군은 bleomycin 처리군에 비하여 폐섬유화의 조직 병리학적 특성이 현저하게 감소하였다(도 9 (B)).
(3) Stearic acid의 bleomycin에 의한 조직내 콜라겐의 주요성분인 hydroxyproline 축적을 억제: Bleomycin은 폐 조직에서 유의미하게 hydroxyproline 함유량을 증가시켰으며, 이러한 증가는 stearic acid에 의해 의미 있게 감소하였다(도 9 (C)).
(4) Stearic acid는 bleomycin에 의해 유도된 α- SMA ( 근육세포 분화표지자) 발현을 억제: Bleomycin은 폐 조직에서 α-SMA 발현을 증가 시켰으며, 이러한 증가는 stearic acid에 의하여 의미 있게 감소하였다 (도 9 (D)).
(5) Stearic acid는 bleomycin에 의해 유도된 smad signaling을 억제: bleomycin 처리군에서 p-smad2/3의 발현이 약하게 증가하였으며, 이러한 증가는 stearic acid에 의하여 의미 있게 감소하였다(도 9 (E)).
(6) Stearic acid는 bleomycin에 의해 유도된 혈중 TGF - β1 레벨을 감소시킴: stearic acid는 bleomycin에 의해 증가한 혈중 TGF-β1 레벨을 유의미하게 감소시켰다 (도 9 (F)).
(7) stearic acid가 p- smad2 /3의 발현을 억제 : TGF-β1는 p-smad2/3를 통해 폐 섬유화가 유도되는데, stearic acid가 TGF-β1로 증가한 p-smad2/3의 발현을 억제함으로써 항섬유화 역할을 하는 것으로 이해된다.
실시예 4: Human primary fibroblast에서 스테아르산의 항섬유화 효과
IPF 환자의 폐조직으로부터 human primary fibroblast를 분리하였다. 이 세포에 stearic acid를 여러 농도로 24 시간 처리 후 collagen type 1과 α-SMA의 발현량을 조사하였으며(도 10(A) 및 (B)), 4명의 환자로부터 얻은 fibroblast에서 80 μM stearic acid를 24 시간 처리 후 collagen type 1과 α-SMA의 발현량을 조사하였다(도 10(C)). 환자 fibroblast에 TGF-β1에 의해 섬유화를 유도하여 collagen type 1과 α-SMA의 발현을 증가시킨 후, stearic acid의 항섬유화 효과를 검증하였다(도 10(D)).
(1) 80 μM stearic acid는 human primary fibroblast에서 basal levels의 collagen type 1과 α-SMA의 발현을 유의미하게 감소시켰다 (도 10(A) 및 (B)).
(2) 80 μM stearic acid는 4명의 IPF 환자로부터 얻은 human primary fibroblast에서 모두 basal levels의 collagen type 1과 α-SMA의 발현을 유의미하게 감소시켰다(도 10 (C)).
(3) 80 μM stearic acid는 human primary fibroblast에서 TGF-β1에 의해 유도된 collagen type 1과 α-SMA의 발현을 현저하게 감소시켰다 (도 10(D) 및 (E)).
실시예 5: 상피세포 (Epithelial cell)에서 스테아르산의 역할
Beas-2B (human epithelial cells)에 TGF-β1과 40 μM stearic acid를 24 시간 처리한 후 E-cadherin 의 발현량을 조사하였다. 40 μM stearic acid는 Beas-2B세포에서 TGF-β1에 의해 감소된 E-cadherin의 발현을 회복시켰다 (도 11(A) 및 (B)). TGF-β1를 상피세포에 처리하면 EMT로 인해 상피세포가 섬유아세포로 분화되면서 상피세포의 수는 감소하게 된다. 또한 EMT가 일어나면 상피세포의 기능을 유지시키는 역할을 하는 E-cahherin의 발현량은 감소하는 것으로 알려져 있다. 상피세포에 스테아르산을 처리하면 TGF-β1 처리로 인한 EMT 증가를 억제시키고, E-cahherin의 발현량을 증가시킴을 확인하였다. TGF-β1를 상피세포에 처리시 상피세포의 증식이 억제되고, 스테아르산에 의해 상피세포의 증식이 회복됨은 상기 도 3(B)에 확인하였다.
실시예 6: 섬유아세포 (fibroblast)에서 스테아르산의 항섬유화 기전
Human fibroblasts (MRC5 cells)에 40 μM stearic acid를 16 시간 동안 전처리하고 TGF-β1를 1시간 처리한 후 p-Smad2/3과 Smad7 의 발현을 조사하였다(도 12(A) 및 (B)). stearic acid가 활성산소 (ROS) 생성에 미치는 영향을 연구하기 위하여 MRC5 cells에 40 μM stearic acid를 16 시간 동안 전처리하고 TGF-β1를 1시간 처리한 세포에 DCF-DA를 염색하여 FACS로 분석하였다(도 12(C)). MRC5 cells에 항산화제인 5 mM N-acetylcysteine (NAC)를 1 시간 동안 전처리하고 TGF-β1를 1시간 처리한 후 p-Smad2/3의 발현을 조사하였다(도 12(D)).
(1) stearic acid는 MRC5 세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 p-Smad2/3의 발현을 억제하였으며, TGF-β1에 의해 감소된 Smad 7의 발현을 회복시켰다 (도 12(A) 및 (B)).
(2) stearic acid는 MRC5 세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 ROS level을 현저하게 감소시켰다(도 12(C)).
(3) 항산화제인 NAC는 MRC5 세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 p-Smad2/3의 발현을 억제하였다(도 12(D)).
(4) 따라서 stearic acid는 TGF-β1에 의해 유도된 p-Smad2/3의 발현 억제를 통하여 ROS 생성 억제하고 있음을 나타낸다.

Claims (19)

  1. 스테아르산을 포함하는, 섬유증 진단을 위한 바이오마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 스테아르산의 함량은 섬유증 환자의 시료에서 감소되어 있는 것을 특징으로 하는 섬유증 진단을 위한 바이오마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스테아르산은 폐, 간, 신장, 췌장 또는 심장 조직으로부터 분리된 것인, 섬유증 진단을 위한 바이오마커 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 섬유증은 폐섬유증, 간섬유증, 신장섬유증, 췌장섬유증 및 심근섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 섬유증인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폐섬유증은 특발성 폐섬유증 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis; IPF)인 것을 특징으로 하는 바이오마커 조성물.
  7. 스테아르산의 검출 수단을 포함하는, 섬유증 진단용 키트.
  8. 시험 시료 내의 스테아르산 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 시험 시료 내의 스테아르산 수준을 비교 대상 시료의 스테아르산 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 섬유증 진단에 제공하는 정보는 비교 대상 시료와 비교하여 시험 시료 내의 스테아르산의 함량은 감소되어 있는 것을 특징으로 하는 섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법.
  11. 삭제
  12. 시험 시료 내의 스테아르산의 함량 및 탄소수 14 내지 18의 유리 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 함량 (탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)을 측정하는 단계;
    시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 얻는 단계, 및
    상기 얻어진 시험 시료 내의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율을 비교 대상 시료에서의 (스테아르산 함량)/(탄소수 14 내지 18의 유리 지방산 총량)의 비율과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    상기 탄소수 14 내지 18의 유리 지방산은 스테아르산을 제외한 탄소수 14 내지 18의 포화 지방산 및 불포화 지방산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 스테아르산과의 혼합물인,
    섬유증 진단에 정보를 제공하는 방법.
  13. 스테아르산 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 체중 감소 억제능을 추가로 포함하는, 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항산화능을 추가로 포함하는, 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 섬유증은 폐섬유증, 간섬유증, 신장섬유증, 췌장섬유증 및 심근섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 섬유증인 것을 특징으로 하는 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 폐섬유증은 특발성 폐섬유증 (Idiopathic Pulmonary Fibrosis; IPF)인 것을 특징으로 하는 섬유증 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물.
  19. 스테아르산 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 섬유증 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물.
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