KR102046265B1 - 원자 치료 지수 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플의 3D 영역의 복셀 (voxtel) 내 망간의 정량화에 의한 시험 샘플에 대한 원자 치료 지수 (Atomic Therapeutic Indicator: ATI)의 생성에 관한 것으로; 3D 영역은 좌표 X'xY'xZ에 의해 지형적으로 정의된다. ATI는 암, 즉, 종양/신생물의 방사선-반응도, 즉, 방사선 치료에 대한 민감성 또는 내성을 평가하는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 ATI를 생성하고, ATI에 근거하여 종양/신생물의 방사선-반응도를 평가하고, 평가에 근거하여 방사선으로 종양을 치료하거나 치료하지 않는 방법에 관한다. 본 발명은 또한, 암이 방사선 치료 이후 재발할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법 및 관련 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 암으로부터의 시험 샘플의 3D 영역의 복셀 중의 망간 수준을 정량화하는 단계, 암 중의 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)의 빈도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 HMR의 높은 빈도는 암이 재발할 가능성을 나타내고, HMR의 낮은 빈도는 암이 재발하지 않을 가능성을 나타낸다.

Description

원자 치료 지수
본 발명은 샘플의 3D 영역의 복셀 (voxtel) 내 망간의 정량화에 의한 시험 샘플에 대한 원자 치료 지수 (Atomic Therapeutic Indicator: ATI)의 생성에 관한 것으로; 3D 영역은 좌표 X'xY'xZ에 의해 지형적으로 정의된다. ATI는 암, 즉, 종양/신생물의 방사선-반응도, 즉, 방사선 치료에 대한 민감성 또는 내성을 평가하는데 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 ATI를 생성하고, ATI에 근거하여 종양/신생물의 방사선-반응도를 평가하고, 평가에 근거하여 방사선으로 종양을 치료하거나 치료하지 않는 방법에 관한다.
본 발명은 또한, 암이 방사선 치료 이후 재발할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 방법 및 관련 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 암으로부터의 시험 샘플의 3D 영역의 복셀 중의 망간 수준을 정량화하는 단계, 암 중의 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)의 빈도를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 HMR의 높은 빈도는 암이 재발할 가능성을 나타내고, HMR의 낮은 빈도는 암이 재발하지 않을 가능성을 나타낸다.
본 발명은 또한, 흑색종의 방사선-반응도를 결정하는 방법 및 관련 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 흑색종으로부터의 시험 샘플 중의 멜라닌 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 멜라닌 수준이 낮을수록 흑색종은 방사선에 대해 더욱 민감하고, 멜라닌 수준이 높을수록 흑색종은 방사선에 대해 더욱 내성이다.
본 명세서 전반에 걸친 선행 기술에 대한 임의의 논의는 그러한 선행 기술이 널리 알려져 있거나, 당해 분야의 통상적인 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로서 고려되어서는 안된다.
미국 내 환자의 60% 이상이 질병 중에 방사선 치료를 받으며, 이들 600,000명 정도의 개인은 2천만 회 이상의 방사선 치료 방문을 하고, 각 환자는 치료 목적으로 평균 30회의 외부 광선 방사선 치료를 받는다. 유방암, 폐암 및 전립선암 환자는 방사선 치료를 받는 모든 환자의 50% 이상을 차지한다 (미국 방사선 종양 학회, ASTRO, 2012).
방사선으로 "암 환자"를 치료하거나, 이 치료법의 사용을 피하기 위한 임상적 결정은, 현재 일반적으로 의학적 "기술" 포함되는 주관적, 경험적 및 역사적 관행의 혼합에 근거한다. 치료 및 관리 결정은 완결 수술 (definitive surgery), 환자의 연령, 심폐 보존의 정도, 정의된 합병증, 종양의 병리학적 등급 및 MRI, fMRI, CT, 초음파, X 선, PET 및 이들의 조합과 같은 다양한 영상 양식에 의해 결정되는 질병 단계에 대한 환자의 적합성을 초기에 포함한다. 종양 자체의 특성에 관한 최소한의 정량적인 정보를 입력하고, 병리학자는 종양 세포가 정상 세포로부터의 형태학적 편차의 관점에서 어떻게 "보이는"지, 정상 조직의 것으로부터 종양 구조의 명백한 차이점, 및 현미경 영역 내에서의 세포 분열 정도를 해석한다.
보다 구체적으로, 개체가 치료를 필요로 하는 종양 또는 암을 가진 것으로 의심되는지 여부에 대한 평가는, 현재 조직 샘플, 기관 또는 혈액 샘플의 병리학 적 검사에 따른다. 병리 결과는 의료 기술의 현재 컨베이어 벨트의 일부인 플로우-온 (flow-on) 임상 사건을 독자적으로 결정한다. 미국 (USA)에서는 60% 초과의 암 환자가 통상 수술 및 선택된 약물을 포함하는 전신요법과 병용하여, 더욱 최근에는 면역 치료와 병용하여 일부 형태의 방사선 치료를 받는다. 환자가 방사선을 받아야 하는지, 그렇지 않아야 하는지에 대한 임상적 결정은 병리학자가 작성한 보고서에 우선적으로 달려있다 (Davidson and Rimm; JAMA; 313; 1109-1110; 2015. Elmore et al., JAMA; 313; 1122-1132. 2015). 이 보고서는 환자 관리에 대한 결정이 내려지는 현재의 기준이며, 방사선 종양 전문의, 의학 종양 전문의 및 외과의를 포함하는 종합적인 환경에서 주로 실시된다. 그러나, 이러한 중요한 결정은 현재 포르말린-고정 파라핀-포매 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 조직 절편의 세포 형태 및 조직 구조에 관한 상술한 주관적 분석을 근거로 한 병리학적 진단에 주로 의존한다 (예를 들어, 도 1 참조).
진단 해석의 병리학자들 사이의 일치도는 가변적이며, 조사 중인 종양의 유형에 의존한다. 유방의 비정형 증식증 (atypical hyperplasia)의 경우, 일치도는 48%에 불과하다 (Elmore et al., JAMA, 313; 1122-1132. 2015). 예를 들어, 갑상선 종양의 경우, 매우 후기 단계의 종양을 제외하고는 정상 조직과 "암성" 조직을 구별하는 것은 매우 어렵다. 이 병리 해석의 주관성은 방사선 치료로부터 거의 이익을 얻지 못하지만, 이의 잘 알려진 유해로 고통 받는 환자의 과도한 치료를 초래하고, 방사선으로부터의 이익을 받을 가능성이 있지만, 이러한 방사선 치료를 받을 수 없게 되는 결과를 초래한다. 법적 문제를 피하기 위해 의사는 조심스럽게 잘못을 저지르고, 수술 후에 예를 들어, 방사선이 절제된 종양 주변의 여백에 남겨진 임의의 잔여 암세포의 영향을 최소화할 것이라는 믿음으로 이익의 어떠한 정량적 증거도 없이 많은 환자에게 방사선이 제공된다. 종양 및 관련된 기질 벽감 (stromal niche)이 어느 정도의 방사선-내성을 가지는 환자의 경우, 일부 방사선 민감성 세포가 사멸하더라도 생존하는 종양 및 기질 세포 집단이 더 많은 방사선-내성을 위해 선택되기 때문에, 방사선 치료는 효과가 없다.
의료 종사자는 일반적으로 http://www.uptodate.com과 같은 증거-기반 임상적 결정 지원 리소스에 의존한다. 이 리소스는 외부 방사선 치료 (external beam radiotherapy), 근접 치료 (brachytherapy), 수술 중 방사선 치료 (intraoperative radiotherapy) 및 타겟화된 핵종 치료 (targeted radionuclide therapy)와 같은 방사선 유형을 포함하여 여러 수준의 암 제어에 있어서 방사선 치료 기술의 현재의 임상적 요약을 제공한다.
메디케어 및 메디케이드 서비스 센터의 커버리지 및 분석 그룹 (미국 보건 복지부의 연방 기관)은 미국 메릴랜드주 록빌의 건강관리 연구 기관 (Healthcare Research and Quality: RHQ)과 계약하에 Tufts Evidence-based Practice Centre에서 Ip 등이 2010년에 제공한 전립선암에 대한 평가보고서를 요청했다. (계약 #290 2007 10055 I). 이 보고서는 국소 전립선암 (T1 및 T2 질병) 환자의 주촉성체 방사선 치료 (stereotactic body radiation therapy), 분획 외부 빔 방사선 치료 (fractionated external beam radiation therapy) 및 근접 치료와 같은 다른 방사선 치료의 임상적 및 생화학적 결과에 대한 증거를 제시하였다. 외부 빔 방사선 치료 (external beam radiation therapiy: EBRT)는 강도 변조 방사선 치료 (intensity-modulated radiotherapy), 등각 방사선 치료 (conformal radiation), 정위 신체 방사선 치료 (stereotactic body radiation), 사이버나이프 (CyberKnife) 및 양성자 빔 방사선 (proton beam radiation)을 포함하며, 근접 치료는 방사성 동위 원소 "종자 (seed)"의 영구 이식이나 일시적인 고선량 방사능 종자를 포함한다.
환자에게 전달되는 방사선의 종류는 그것이 광자 또는 프로톤 기반인지 여부, 방사선이 선형 가속기, 감마선 (코발트-60 소스로부터의 것)을 통해 전달되었는지 여부 또는 낮은 선량률 근접 치료 (Low Dose Rate Brachytherapy: LDRBT)의 경우, 125요오드, 131세슘 또는 103팔라듐을 포함하는 방사성 종자를 통해 전달되었는지 여부; 또는 높은 선량률 근접 치료 (HDRBT)의 경우, 192이리듐을 포함하는 방사성 종자를 통해 전달되었는지 여부 역시 평가되었다. 평가에는 방사능 선량, 이상 반응, 치료 계획 알고리즘 및 전달된 분율의 수를 포함하여 환자 결과에 영향을 미치는 매개 변수도 포함되었다.
임의의 시험으로부터 생기는 증거의 강도의 관점에서 여러 임삼 시험을 평가하기 위해 Ip 등에 의해 사용된 등급 시스템은, 주관적인 3-티어 원 (3-tier one): 높음, 중간 및 불출분이다.
상이한 방사선 치료의 이익 대 유해성 측면에서, 결과는 이하에 기재한 바와 같다.
방사능 치료의 이익 대 유해성 비교, 대 방사선 치료를 하지 않는 것의 측면에서, 증거의 강도는 카테고리 3인, 불충분인 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 낮은 선량률 근접 치료와 외부 빔 방사선 치료를 비교할 때, 환자 생존에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 근접 치료와 외부 빔 방사선 치료를 비교할 때, 및 높은 선량률 근접 치료와 낮은 선량률 근접 치료를 비교할 때, 생화학적 제어에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 낮은 선량률 근접 치료와 외부 빔 방사선 치료를 비교할 때,비뇨 생식기 및 위장 독성에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 LDRBT + EBRT의 다양한 병용 치료에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 정위 신체 방사선 치료 (SBRT) 및 EBRT 우산 (EBRT umbrellas)내 다양한 연구, 즉 방광 및 직장 독성, 생화학적 실패로부터의 자유 및 비뇨 생식기 또는 위장 독성에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 방사성 종자 비교, 125요오드 및 103팔라듐의 관점에서 낮은 선량률 근접 치료에 불충분한 것으로 판명되었다.
증거의 강도는 연령, 인종, 민족성, 합병증, 치료 관련 부작용 및 질병 진행이 방사선 치료 결과에 기여하는 환자의 기본 위험에 대한 기여에 불충분한 것으로 판명되었다.
Ip 등, 2010 년의 상세한 보고서는 가장 광범위하게 연구된 2종의 종양 유형 (국소 전립선 및 국소 유방) 중 하나에서, 방사선 치료의 이점에 대한 증거와 T1 또는 T2 전립선 "암"을 가진 남자에 대해 치료하지 않은 것의 비교는 환자의 방사선 치료에 대한 정량적 지수 (quantitative indicator)를 밝히지 않았다고 결론지었다. 게다가, 연구 내에서 그리고 연구 사이에 상당한 이질성이 있었으나, 이 대부분 평가에서 판명된 많은 것들은 일관성이 없었다.
Ip 등의 보고서는 전이성 상태로 질병이 진행되는 기본적인 위험이 환자마다 크게 다르다는 것을 나타낸다. 진행 위험을 객관적으로 결정할 수 없다는 것은 "낮은" 위험으로 간주되는 환자는 근접 치료를 권고받지만, "중간" 위험으로 간주되는 환자는 외부 빔 방사선 치료를 받는 경향이 있음을 의미한다.
따라서, 하나의 치료 방식에 유리한 생물학적 파라미터를 가지는 환자와 다른 환자, 예를 들어, 방사선 치료에 대해 우호적인 종양 특성, 즉, 종양이 방사선에 민감한 종양을 갖는 환자와 보다 방사선 내성인 종양을 가진 환자를 비교하여 동정하는 것을 시급히 필요로 하며, 따라서 쓸모없고 해로울 수 있는 예비 방사선 치료를 받지 않아야 한다.
비정상적인 종양 세포 그 자체의 특성, 및 기질의 특징 및 이러한 비정상 세포가 포매된 3차원 (3D) 분포를 구별하는데 유용할 수 있는 생물학적 파라미터를 확인하는 것이 더욱 필요하다. 예를 들어, 기질 성분 내에서 고르게 퍼진 비정상 세포를 갖는 종양은, 비정상 세포가 기질 세포로부터 크게 분리되는 종양과 매우 상이하다. 전립선암의 경우, 이러한 상황은 모두 선 (gland) 자체 내의 비정상적인 세포의 상이한 병소 내에서 발생하고, 또한, 뼈로의 전이에서 발생한다. 현재의 외부 이미징 방법 (MRI, CT 또는 18FDG 이미징 방법)으로는 이러한 서로 다른 영역 또는 다른 특성을 안정적으로 식별할 수 없다.
현재까지, 특정 환자의 주어진 종양에 대한 방사선 치료의 사용에 관한 이용 가능한 데이터는 존재하지 않으며: 현재의 데이터는 확고한 정량적인 기본을 가지지 않는다.
방사선으로 "암 환자"를 치료할지 또는 치료하지 않을지 여부 또는 방사선 사용을 피하는 것과 같은 환자 치료와 관련한 적절한 결정을 내릴 때, 샘플 중의 생물학적 파라미터, 예를 들어 방사선-민감성 또는 방사선-무감각성/방사선-내성의 식별을 가능하게 하는 정량적 지수를 제공하는 분석법에 대한 필요성이 남아있다.
본 발명의 목적은 이전 기술의 치료법의 단점 중 적어도 하나를 극복하거나 개선 및/또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자는 놀랍게도 암 중의 망간 수준이 암의 방사선-반응도의 지수로서 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 암 중의 망간의 수준이 높을수록 암은 방사선에 대해 더욱이 내성이고; 암의 망간 수준이 낮을수록 암은 방사선에 대해 더욱 민감하다. 암의 방사선-반응도는 3D 및 2D 분석 조합을 사용하는 것이 최선의 결정을 내릴 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 시험 샘플의 3D 영역 내 복셀 중의 망간 수준을 정량하는 단계를 포함하는 생물학적 시험 샘플의 원자 치료 지수 (ATI)를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
(a) 상기 시험 샘플의 2D 영역을 선택하는 단계로서, 상기 2D 영역은 X':Y' 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 여기서 X'는 2D 영역의 길이이고, Y'는 2D 영역의 너비이며, 상기 3D 영역은 상기 2D 영역에 대응하고 Z로 표시되는 선택된 높이를 가지며, 상기 3D 영역은 미리 정의된 체적의 복셀로 분할되고, 각 복셀의 체적은 XxYxZ에 의해 정의되며, 여기서 X는 복셀의 길이이고, Y는 복셀의 너비이며, Z는 복셀의 높이인 단계;
(b) 각 복셀 중의 망간 수준을 정량화하는 단계; 및
(c) 선택된 복셀 중의 망간의 중심 경향 수준 (central tendency level)을 계산하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 선택된 복셀 중의 망간의 중심 경향 수준은 ATI를 정의한다.
본 발명의 다른 실시양태는, 암의 방사능-민감도를 결정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 시험 샘플의 ATI 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 ATI가 낮을수록 암은 방사선에 대해 더욱 민감하고, ATI가 높을수록 암은 방사선에 대해 더욱 내성이다.
다른 실시양태에서, 상기 ATI는 미리 결정된 ATI 역치와 비교되고, 상기 암의 방사선-반응도는 상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 낮으면 상기 암은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 높으면 상기 암은 방사선에 내성인 것으로 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 ATI는 2개의 미리 결정된 ATI 역치와 비교되고, 상기 암의 방사선-반응도는 상기 ATI가 상기 2개의 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
상기 ATI가 낮은 ATI 역치보다 낮으면 상기 암은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
상기 ATI가 2번째 ATI 역치보다 높으면 상기 암은 방사선에 내성인 것으로 결정되고;
상기 ATI가 상기 2개의 ATI 역치 사이이면 상기 암은 방사선에 부분적으로 민감한 것으로 결정된다.
바람직하게, 시험 샘플의 복셀 중의 망간 수준의 정량화는 하나 이상의 참조 복셀을 포함하는 참조 표준을 사용하여 교정되고, 여기서 각 참조 복셀은 공지된 양의 망간을 포함한다.
공지된 양의 망간에 추가하여, 참조 표준은 참조 표준 중의 망간의 양을 시험 샘플에서 망간의 양 또는 수준과 비교할 수 있게 하는 임의의 추가 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 참조 표준은 공지된 양의 내인성 또는 외인성 망간을 포함하는 생물학적 샘플이다. 상기 생물학적 샘플은 인간 또는 동물 조직을 포함할 수 있다.
바람직하게, 참조 표준은 공지된 양의 망간이 첨가된 동물 (예를 들어, 포유류 또는 조류종을 포함)로부터의 조직을 포함한다. 당업자는 정확하게 정의된 양의 망간을 가진 매트릭스와 일치하는 참조 표준이 매일의 신호 변동성을 완화시키기 위해 보정된 초당 교정 카운트의 계산에 유용하다는 것을 이해할 것이다. 일 실시양태에서, 상기 참조 표준 조직은 닭 가슴살 유래이다.
일 실시양태에서, 하나 이상의 대조 샘플의 3D 영역에서 정량되는 망간 수준은 시험 샘플이 정량화될 때 동시에 또는 임의의 순서로 연속적으로 정량화되거나, 시험 샘플과 나란히 정량화된다.
일 실시양태에서, 상기 대조 샘플은 분석을 위해 시험 샘플에 첨가되었다.
바람직하게는, 상기 중심 경향 수준은 중간값, 산술 평균 또는 모드이다.
당업자는 시험 샘플이 염색되거나 염색되지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 바람직하게는, 선택된 복셀은 암세포가 검출된 복셀이다. 더욱 바람직하게는, 상기 암세포는 암세포를 다른 세포와 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 2D 영역의 육안 검사로 검출된다. 상기 암세포가 다른 세포로부터 암세포를 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 2D 영역의 육안 검사로 검출될 때, 바람직하게는 상기 염색은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)이다. 일 실시양태에서, 상기 암세포는 암세포에 항체, 바람직하게는 금속-표지 항체를 결합시킴으로써 검출된다.
본 발명과 관련하여, 복셀의 길이 X는 측정 가능한 임의의 범위, 바람직하게는 약 1 미크론 내지 약 200 미크론 범위이다. 일부 실시양태에서, X는 약 10 내지 약 50 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택되고, 바람직하게는, X는 약 35 미크론이다.
본 발명과 관련하여, 복셀의 너비 Y는 측정 가능한 임의의 범위, 바람직하게는 약 1 미크론 내지 약 200 미크론 범위이다. 일부 실시양태에서, Y는 약 10 내지 약 50 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택되고, 바람직하게는, Y는 약 35 미크론이다.
본 발명과 관련하여, 복셀의 길이 Z는 측정 가능한 임의의 범위, 바람직하게는 약 1 미크론 내지 약 20 미크론 범위이다. 일부 실시양태에서, Z는 약 1 내지 약 20 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택되고, 바람직하게는, Z는 약 1, 또는 약 2, 또는 약 3, 또는 약 4, 또는 약 5 미크론이다.
바람직한 실시양태에서, X, Y 및 Z는 각각 약 1 내지 200 미크론, 1 내지 200 미크론 및 1 내지 20 미크론의 범위, 및 각 범위 내의 임의의 값으로부터 선택된다. 바람직하게는, X, Y 및 Z는 각각 35 미크론, 35 미크론 및 5 미크론이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 각 복셀의 미리 정의된 체적은 약 1 입방 미크론 내지 약 8x105 입방 미크론, 또는 약 1 입방 미크론 내지 약 10,000 입방 미크론, 또는 약 2,000 입방 미크론 내지 약 8,000 입방 미크론의 범위이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미리 정의된 체적은 약 6,125 입방 미크론이다.
복셀 중의 망간 수준은 임의의 원소 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 상기 원소 분석 기술은, 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (laser ablation-Inductively coupled plasma-mass spectrometry: LA-ICP-MS), 레이저 절단-비행시간-질량 분석법 (laser ablation-time-of-flight-mass spectrometry: LA-TOF-MS), 유도 결합 플라즈마-광학 발광 분광법 (inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy: ICP-OES), 마이크로웨이브 플라즈마-원자 방출 분광법 (microwave plasma-atomic emission spectroscopy: MP-AES), 레이저 유도 브레이크 다운 분광법 (laser induced break down spectroscopy: LIBS), 2차 이온 질량 분석법 (secondary ion mass spectrometry: SIMS), X-선 흡수 근처 엣지 구조 (X-ray absorption near edge structure: XANES), 원자 흡수 분광법 (atomic absorption spectroscopy: AA) 또는 X-선 형광법 (X-ray fluorescenc: XRF)이다.
얻어진 데이터는 컴퓨터 보조 스크리닝 기술을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 5 미크론 절편은 레이저로 슬라이드 측면으로 가로 질러 래스터링 함으로써 레이저 절단할 수 있으며, 하나의 절제 트랙은 위부터 아래까지 한번에 진행한다. 대안적으로, 5 미크론 절편은 레이저로 슬라이드를 가로 질러 위에서 아래로 래스터링 함으로써 레이저 절단될 수 있으며, 하나의 절제 트랙은 측면으로 한번에 진행한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 ATI는 시험 샘플 및/또는 대조 샘플을 가로지르는 적어도 하나의 트랙의 레이저 절단에 의해 생성될 수 있으며, 상기 절단 트랙은 적어도 하나의 복셀을 포함한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 절단 트랙 및 여러 복셀을 포함한다.
바람직하게는, 상기 시험 샘플은 세포, 세포 집단, 하나 이상의 단세포 유기체, 조직 샘플 또는 그의 일부, 장기 샘플 또는 그의 일부, 원핵 생물 또는 진핵 생물로부터 수득한/유래한 하나 이상의 세포, 세포 및 이와 관련된 비-세포 기질 성분의 집단, 신생물 세포 또는 신생물 세포 집단, 개체로부터의 임의의 장기 또는 조직으로부터의 조직 샘플, 종양, 세포의 고체 매쓰 또는 세포의 "액체" 집단, 백혈병 세포를 포함한 조혈 계통의 임의의 암의 세포, 고형 종양의 순환 세포 유도체, 및 전이된 세포의 세포 또는 집단으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체로부터의 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행하는 단계, 및 상기 암이 방사선에 민감한 것으로 결정되면 상기 개체의 암을 치료하는데 방사선 치료를 포함하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체로부터의 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행하는 단계, 및 상기 암이 방사선에 내성인 것으로 결정되면 상기 개체의 암을 치료하는데 방사선 치료를 포함하지 않는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 개체는 정상적인 인간 또는 포유류, 치료 또는 예방이 필요한 정상적인 인간 또는 포유류, 암으로 진단받은 개체, 암/신생물을 갖는 것으로 의심되는 신생물/종양, 임의의 암을 포함하는 임의의 장애에 대한 치료 및/또는 예방 중인 개체, 기저 질환을 나타내는 검사 또는 스캔을 받은 무증상 개체, 기저 질환을 나타내는 검사 또는 스캔을 받은 증상 개체, 암 치료를 포함하는 임상 치료 중인 개체, 또는 약물, 화학 요법, 면역 치료, 수술, 방사선 또는 치료 장치의 형태로 임상적 개입, 또는 아직 임의의 임상적 치료 중이 아닌 개체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 대조 샘플은 세포, 세포 집단, 하나 이상의 단세포 유기체, 조직 샘플 또는 그 일부, 장기 샘플 또는 그 일부, 원핵 생물 또는 진핵 생물로부터 수득한/유래한 하나 이상의 세포, 세포 및 이와 관련된 비-세포 기질 성분의 집단, 신생물 세포 또는 신생물 세포 집단, 개체로부터의 임의의 장기 또는 조직으로부터의 조직 샘플, 종양, 예를 들어, 세포의 고체 매쓰 또는 "액체" 집단, 백혈병 세포를 포함한 조혈 계통의 임의의 암, 고형 종양의 순환 세포 유도체, 또는 전이된 세포의 세포 또는 집단을 포함하거나 이로부터 유래된다.
일 실시양태에서, 상기 시험 및/또는 대조 샘플은 세포, 세포 집단, 또는 유방암, 전립선암, 고환암, 림프종, 소세포폐암, 뇌암, 중피종 또는 흑색종의 종양/신생물의 조직 샘플을 포함하거나 이로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 방사선 치료 후 암의 재발 가능성을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 암으로부터의 시험 샘플의 2D 영역을 선택함으로써 상기 시험 샘플의 3D 영역 내 망간 수준을 정량화하는 단계로서, 상기 2D 영역이 X':Y' 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 여기서 X'는 2D 영역의 길이이고, Y'는 2D 영역의 너비이며, 상기 3D 영역은 상기 2D 영역에 대응하고 Z로 표시되는 선택된 높이를 가지며, 상기 3D 영역은 미리 정의된 체적의 3개 이상의 복셀로 분할되고, 각 복셀의 체적은 XxYxZ에 의해 정의되며, 여기서 X는 복셀의 길이이고, Y는 복셀의 너비이며, Z는 복셀의 높이인 단계, 및 각 복셀 중의 망간 수준을 정량화하는 단계;
(b) 상기 복셀의 X 및 Y 좌표에 대응하는 2D 영역에서, 망간 수준이 주위 영역보다 높은 암 영역인 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)을 중심 경향의 배수 또는 정수 사이의 임의의 근사치인 통계적 역치에 의해 확인하는 단계를 포함하고;
여기서 상기 HMR의 빈도가 높을수록 암이 재발할 가능성이 높고, HMR의 빈도가 낮을수록 암이 재발할 가능성이 낮다.
바람직하게는, 상기 HMR은 또한 기질 성분으로부터 암세포를 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 2D 영역에서 확인되고, 바람직하게는 상기 염색은 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색이다.
본 발명과 관련하여, 방사선-반응도는 방사선 치료에 대한 민감성/내성의 척도이다.
일 실시예에서, 상기 시험 샘플은 시험 샘플의 ATI가 방사선 민감성인 것으로 알려진 대조 샘플에서 수득한 미리 결정된 역치 이하이면 방사선 치료에 민감한 것으로 결정된다. 또 다른 실시예에서, 상기 시험 샘플은 시험 샘플의 ATI가 방사선 내성인 것으로 알려진 대조 샘플에서 수득한 미리 결정된 역치 이상이면 방사선 치료에 내성인 것으로 결정된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 더 낮은 역치 한계 또는 그 이하의 ATIfmf 갖는 시험 샘플은 방사선 치료에 민감한 것으로 결정되고, 더 높은 역치 한계 또는 그 이상의 시험 샘플은 방사선에 내성인 것으로 결정된다.
참조 표준 (reference standard) 또는 대조 샘플을 포함하는 복셀의 체적은 시험 샘플의 복셀의 체적과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명은 본원 발명에 따른 방법을 추가로 제공하며, 여기서 ATI는 시험 샘플 중의 하나 이상의 3D 영역 내 망간 수준을 정량화함으로써 생성되고, 모든 3D 영역에서 망간의 중심 경향 수준을 계산하여 추가 ATI를 생성한다.
본 발명은 본원 발명에 따른 방법을 추가로 제공하며, 여기서 ATI는 하나 이상의 시험 샘플 내 망간 수준을 정량화함으로써 생성되고, 상기 샘플에서 망간의 중심 경향 수준을 계산하여 추가 ATI를 생성한다.
본 발명은 본원 발명에 따른 방법을 추가로 제공하며, 여기서 대조 샘플의 3D 영역에서 정량되는 망간 수준은 시험 샘플이 정량될 때 동시에 또는 임의의 순서로 연속적으로 정량되거나, 시험 샘플과 나란히 정량된다.
또한, 대조 샘플은 분석을 위해 시험 샘플에 추가될 수 있음이 고려된다.
원자 치료 지수 (ATI)는 임의의 단위로 표현될 수 있다. 예를 들어, 교정 카운트/초 (CC/S) 또는 마이크로그램/그램, 밀리그램/킬로그램, 백만분율, 마이크로그램/복셀, 밀리그램/복셀, 몰 또는 몰/복셀과 같은 등가 비례 농도 단위 (equivalent proportional concentration unit)로 표현 될 수 있다.
본 발명 이전까지는, 방사선 민감성 샘플, 예를 들어, 세포/조직, 신생물 세포/종양으로부터의 ATI가 방사선 내성인 샘플, 예를 들어, 세포/조직, 신생물 세포/종양의 ATI와 구별될 수 있다는 것을 인식하지 못했다. 이런 정량적인 구별은 주어진 선택된 세포, 조직 샘플 또는 그의 일부, 신생물 세포, 또는 종양 샘플 또는 그의 일부에 대한 방사선-반응도 결정 (즉, 방사선 민감성 및/또는 방사선 내성의 결정)을 가능하게 한다. 당업자에게는 용어 "세포"는 신생물 세포를 포함하고, 용어 "조직 샘플 또는 그의 일부"는 종양 샘플 또는 그의 일부를 포함함은 명백할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "신생물"은 전-암성이든 또는 암성이든 세포의 비정상적인 성장을 일으킬 가능성에 기여하는 세포의 변화를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 하나 이상의 신생물 세포 및/또는 그 벽감 내의 관련 기질 성분의 집합체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 뼈에 전이된 전립선암의 경우, 본 발명 이전에 사용된 하나의 방사선 치료는, 바람직한 목표로서, 주요 골 성분인 하이드록시아파타이트 (Ca5(PO4)3OH)를 갖는 223라듐을 사용했다. 223라듐은 효율적으로 뼈에 "집"을 만든다. 전립선암, 유방암 또는 임의의 다른 암세포가 뼈로 전이되면, 상기 암세포는 하이드록시아파타이트와 섞이게된다. 단 범위 알파 입자 (short range alpha particle)의 방출은 골아 세포를 파괴시키지만, 암세포 그 자체에는 직접적인 영향을 미치지 않는다. 따라서, 이 경우에는 전립선 암세포을 이 벽감에서 자라게 하는 기질 (골아 세포)에 의해 생성되는 인자의 억제가 손상되고, 상기 암세포가 잘 성장하지 않으며, 환자의 생존율이 증가한다. 따라서, 당업자는 상이한 기질 벽감이 암세포를 다른 정도로 서포트하는 것을 이해할 것이며, 그 벽감 자체 역시 매우 높은 것에서부터 매우 낮은 것까지 그들의 금속 함량이 다를 수 있고, 방사선-감수성 또는 방사선-내성일 수 있다. 따라서 방사선이 "종양"에 적용될 때, 네 가지 경계 조건-유형 가능성이 있다. 기질 세포와 암세포 모두 방사선-감수성이라면, 종양의 성장은 중지된다. 기질 세포가 방사선-감수성이고, 암세포가 방사선-내성이라면, 기질 세포는 방사선에 의해 효과적으로 사멸되고, 암세포의 성장은 또한 중지된다. 왜냐하면, 그들은 현재 자신의 기질로부터의 대사/인자 지원이 없어서 종양이 자라지 않기 때문이다. 따라서, 당업자는 "종양 또는 그의 일부"라는 용어가 종양 세포 및/또는 관련 기질 세포의 완전한 다양성 (혈관, 침윤 및 상주 면역 세포, 섬유아세포, 주피 세포 및 침윤성 엑소좀)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기술된 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에 따라 선택된 3D 영역 내 망간 수준의 결정은, 시험 샘플, 참조 표준 및/또는 대조 샘플, 예를 들어, 세포, 조직 샘플 또는 그의 일부, 신생물 세포, 종양 샘플 또는 그의 일부에 대해 직접적으로 측정을 수행하는 것을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 상기 시험 샘플 및/또는 대조 샘플은 이의 자연적 환경에서 예를 들어, 공지된 방법에 따라 시험 샘플 및/또는 대조 샘플의 선택된 3D 영역에서 망간 수준을 직접적으로 스캐닝하고 정량화함으로써 직접적으로 처리할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 예를 들어 세포, 조직 샘플 또는 그의 일부, 신생물 세포, 종양 샘플 또는 그의 일부를 포함하거나 이로부터 유래된 시험 샘플 및/또는 대조 샘플은, 현미경 검사 또는 공지된 방법에 따른 기계 스캐닝에 의한 자동화된 분석을 위해 준비된다. 세포, 조직 샘플 또는 그의 일부, 신생물 세포, 종양 샘플 또는 그의 일부는 급속 냉동되거나, 포르말린-고정 및 파라핀-포매되거나, 또는 하나 이상의 세포가, 예를 들어 SurePath 유사 시스템을 통해 현미경 슬라이드 상에 단층 또는 거의 단층으로서 침착된다. 조직/종양 샘플 또는 그의 일부는, 또한 처리되어 이로부터 세포 또는 세포 집단이 얻어지고, 예를 들어 SurePath 유사 시스템을 통해 현미경 슬라이드 상에 단층 또는 거의 단층으로서 침착될 수 있다. 세포, 조직 샘플 또는 그의 일부, 신생물 세포, 종양 샘플 또는 그의 일부의 절편은 현미경 검사 또는 기계 스캐닝에 의한 자동화된 분석을 위한 절편을 준비하기 위해 공지된 방법에 따라 처리된다. 선택적으로, 하나 이상의 절편이 H&E 염색 및/또는 관심있는 형태학적 양상을 시각화하기 위한 특이적 항체로 염색된다. 일 실시예에서, 하나 이상의 순차적 절편은 염색되지 않은 상태로 고정되고, 본 발명에 따른 망간 수준의 결정에 직접적으로 사용된다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 절편은 순차적으로 준비, 예를 들어, 매칭되고, 적어도 하나는 H&E 염색 및/또는 관심있는 형태학적 양상을 시각화하기 위한 특이적 항체로 염색되고, 염색된 절편은 염색되지 않은 절편, 예를 들어, 순차적인 절편이 준비되고, 여기서 적어도 하나는 본원에 기술된 바와 같이 염색될 수 있고, 적어도 하나는 염색되지 않는다. 염색된 절편은 먼저 시각화된 다음, 본 발명에 따른 망간 수준의 결정을 위해 직접적으로 사용되거나, 또는 당업계의 표준 방법에 따라 제조되고, 병리학자에 의해 형태학적 양상을 결정하기 위해 시각화되고, 매치된 염색되지 않은 절편, 예를 들어 순차적인 절편이 선택되고 본 발명에 따른 망간 수준의 결정을 위해 사용된다.
본 발명에 따른 망간의 수준은 선택된 3D 영역이 X':Y':Z 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 미리 결정된 체적의 복셀로 분할될 수 있게 하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 상기 망간의 수준은 미리 정의된 체적의 복셀에서 측정되며, 동일하거나 상이한 미리 정의된 체적은 참조 표준 또는 대조 샘플에 사용될 수 있다.
당업자는 하나 이상의 복셀을 포함하는 몇몇 절단 트랙에 대한 ATI가 얻어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 절단 트랙의 수는 처리될 것으로 생각되는 임의의 수일 수 있으며, 약 1 내지 100개의 절단 트랙을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 실시예에서, 상기 절단 트랙의 수는 적어도 3개이다. 절단 트랙의 길이는 다양할 수 있으며, 본 발명에 따른 복셀의 임의의 수를 포함할 수 있다.
당업자라면 복셀의 개수가 복셀 크기에 따라 달라질 것이라는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 트랙 길이는 사용되는 계측기가 허용하는 임의의 길이 일 수 있다. 일 실시예에서, 트랙 길이는 0.5 내지 1.0 cm 일 수 있다. 또 다른 실시예에서, 트랙 길이는 약 5.0 cm, 또는 약 5.35 cm이다. 예를 들어, 각 복셀은 6,125 입방 미크론의 체적을 가진 약 35(길이)x35(폭)x5(높이) 인 단일 트랙이고, 5.35 cm의 트랙 길이를 기반으로 약 1,500 복셀의 분석을 산출한다. 본 발명에 따르면, 샘플의 하나 이상의 영역은 본원의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에 따라 ATI를 생성하기 위해 절단되는 것 역시 고려된다. 예를 들어, 당업자는 1 mm x 1 mm의 영역이 슬라이드 상의 유사 분열률을 측정하기 위해 병리학자들에 의해 전형적으로 사용되고, 이러한 영역은 본 발명에 따라 절단될 수 있음을 이해할 것이다. 이 실시예에서, 이러한 영역은 약 30개의 복셀×30개의 복셀 영역에 해당하고, 각 복셀은 6,125 입방 미크론의 체적을 가지는 약 35(길이)x35(폭)x5(높이) 이다. 분석을 위한 최소 영역을 정의하는 것은 검출 방법의 감수성에 좌우될 것이라는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 상기 영역의 크기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 등의 연속적인 복셀을 특정 종양의 분석을 위해 선택된 샘플 크기인 정수로 변환한다. 당업자는 본 발명에 따른 크기 영역이 현존하는 기술을 사용하여 측정 가능한 임의의 범위임을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 망간의 수준을 결정하는 것은 백그라운드에 대해 보정될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 레이저 절단 질량 분석법의 경우, 시험 샘플 및/또는 대조 샘플이 없는 영역이 백그라운드 보정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 슬라이드 상의 시험 샘플 및/또는 대조 샘플은 직접 레이저 절단될 수 있으며, 시험 샘플 및/또는 대조 샘플이 없는 슬라이드 영역의 백그라운드는 백그라운드 보정에 사용된다.
하나 이상의 실시양태에서, 백그라운드 보정은 특히 높은 금속 함량의 영역이 밝혀질 수 있는 수준으로 설정된다. 이러한 영역을 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)이라고 한다.
당업자는 본 발명에 따른 시험 샘플, 참조 표준 및/또는 대조 샘플의 복셀이 관련 기술을 사용하여 측정 가능한 임의의 범위에 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, X는 측정 가능한 임의의 범위에 있으며, 상기 나타낸 바와 같이, 약 1 미크론 내지 약 200 미크론의 범위 및 그 사이의 임의의 값인 것이 바람직하다. 일 실시예에서, X는 약 10 내지 약 50 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택된다. 바람직하게는, X는 약 35 미크론이다. 예를 들어, Y는 측정 가능한 임의의 범위이고, 바람직하게는 약 1 미크론 내지 약 200 미크론의 범위 및 그 사이의 임의의 값이다. 일 실시예에서, Y는 약 10 내지 약 50 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택된다. 바람직하게는, Y는 약 35 미크론이다. 예를 들어, Z는 측정 가능한 임의의 범위이고, 바람직하게는 약 1 미크론 내지 약 200 미크론의 범위 및 그 사이의 임의의 값이다. 일 실시예에서, Z는 약 1 내지 약 20 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로부터 선택된다. 바람직하게는, Z는 약 1 또는 약 2 또는 약 3 또는 약 4 또는 약 5 또는 약 6 또는 약 7 또는 약 8 또는 약 9 또는 약 10 미크론이다. 당업자는 X '및 Y' 좌표가 시험 샘플의 선택된 2D 영역을 정의하고, Z가 시험 샘플의 두께를 나타내는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 복셀, 예를 들어 XxYxZ는 약 1 내지 200:1 내지 200:1 내지 20 입방 미크론 및 그 사이의 임의의 값으로 선택된 범위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 X 값은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110 ,111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200 미크론 또는 임의의 정수 사이의 근사치이다. 예를 들어, Y 값은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 또는 200 미크론 또는 임의의 정수 사이의 근사치이다. 예를 들어, Z 값은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 미크론 또는 임의의 정수 사이의 근사치이다. 따라서 나열된 각 X 값 중 하나는 나열된 각 Y 값 중 하나와 결합될 수 있으며, 그런 다음 나열된 각 Z 값 중 하나 내에서 결합될 수 있다. 또한, X, Y 및 Z는 길이가 동일하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로, X, Y 및 Z는 길이가 동일할 수 있다. 또 다른 실시예에서, X 및 Y는 길이가 동일하고, Z는 X 및 Y와 동일하지 않다. 또 다른 실시예에서, X 및 Z는 길이가 동일하고, Y는 X 및 Z와 동일하지 않다. 바람직하게는, X 및 Y는 동일한 길이이다. 예를 들어, 복셀은 약 1x1x1, 또는 약 5x5x1, 또는 약 10x10x1, 또는 약 15x15x1, 또는 약 20x20x1, 또는 약 25x25x1, 또는 약 30x30x1, 또는 약 35x35x1, 또는 약 40x40x1, 또는 약 45x45x1, 또는 약 50x50x1, 또는 약 55x55x1, 또는 약 60x60x1, 또는 약 65x65x1, 또는 약 70x70x1, 또는 약 1x1x2, 또는 약 5x5x2, 또는 약 10x10x2, 또는 약 15x15x2, 또는 약 20x20x2, 또는 약 25x25x2, 또는 약 30x30x2, 또는 약 35x35x2, 또는 약 40x40x2, 또는 약 45x45x2, 또는 약 50x50x2, 또는 약 55x55x2, 또는 약 60x60x2, 또는 약 65x65x2, 또는 약 70x70x2, 또는 약 1x1x3, 또는 약 5x5x3, 또는 약 10x10x3, 또는 약 15x15x3, 또는 약 20x20x3, 또는 약 25x25x3, 또는 약 30x30x3, 또는 약 35x35x3, 또는 약 40x40x3, 또는 약 45x45x3, 또는 약 50x50x3, 또는 약 55x55x3, 또는 약 60x60x3, 또는 약 65x65x3, 또는 약 70x70x3, 또는 약 1x1x4, 또는 약 5x5x4, 또는 약 10x10x4, 또는 약 15x15x4, 또는 약 20x20x4, 또는 약 25x25x4, 또는 약 30x30x4, 또는 약 35x35x4, 또는 약 40x40x4, 또는 약 45x45x4, 또는 약 50x50x4, 또는 약 55x55x4, 또는 약 60x60x4, 또는 약 65x65x4, 또는 약 70x70x4, 또는 약 1x1x5, 또는 약 5x5x5, 또는 약 10x10x5, 또는 약 15x15x5, 또는 약 20x20x5, 또는 약 25x25x5, 또는 약 30x30x5, 또는 약 35x35x5, 또는 약 40x40x5, 또는 약 45x45x5, 또는 약 50x50x5, 또는 약 55x55x5, 또는 약 60x60x5, 또는 약 65x65x5, 또는 약 70x70x5, 또는 약 1x1x6, 또는 약 5x5x6, 또는 약 10x10x6, 또는 약 15x15x6, 또는 약 20x20x6, 또는 약 25x25x6, 또는 약 30x30x6, 또는 약 35x35x6, 또는 약 40x40x6, 또는 약 45x45x6, 또는 약 50x50x6, 또는 약 55x55x6, 또는 약 60x60x6, 또는 약 65x65x6, 또는 약 70x70x6, 또는 약 1x1x7, 또는 약 5x5x7, 또는 약 10x10x7, 또는 약 15x15x7, 또는 약 20x20x7, 또는 약 25x25x7, 또는 약 30x30x7, 또는 약 35x35x7, 또는 약 40x40x7, 또는 약 45x45x7, 또는 약 50x50x7, 또는 약 55x55x7, 또는 약 60x60x7, 또는 약 65x65x7, 또는 약 70x70x7, 또는 약 1x1x8, 또는 약 5x5x8, 또는 약 10x10x8, 또는 약 15x15x8, 또는 약 20x20x8, 또는 약 25x25x8, 또는 약 30x30x8, 또는 약 35x35x8, 또는 약 40x40x8, 또는 약 45x45x8, 또는 약 50x50x8, 또는 약 55x55x8, 또는 약 60x60x8, 또는 약 65x65x8, 또는 약 70x70x8, 또는 약 1x1x9, 또는 약 5x5x9, 또는 약 10x10x9, 또는 약 15x15x9, 또는 약 20x20x9, 또는 약 25x25x9, 또는 약 30x30x9, 또는 약 35x35x9, 또는 약 40x40x9, 또는 약 45x45x9, 또는 약 50x50x9, 또는 약 55x55x9, 또는 약 60x60x9, 또는 약 65x65x9, 또는 약 70x70x9, 또는 약 1x1x10, 또는 약 5x5x10, 또는 약 10x10x10, 또는 약 15x15x10, 또는 약 20x20x10, 또는 약 25x25x10, 또는 약 30x30x10, 또는 약 35x35x10, 또는 약 40x40x10, 또는 약 45x45x10, 또는 약 50x50x10, 또는 약 55x55x10, 또는 약 60x60x10, 또는 약 65x65x10, 또는 약 70x70x10 입방 미크론이다. 바람직하게는, 상기 복셀은 35x35x5 입방 미크론이다.
당업자는 또한 참조 표준 및 대조 샘플의 복셀이 임의의 크기 (dimension) 일 수 있음을 이해할 것이다. 상기한 바와 같이, 상기 참조 표준 및 대조 샘플은 시험 샘플과 동일한 체적일 수도 있고 상이한 체적일 수도 있으며, 당업자는 시험 샘플, 참조 표준 및 대조 샘플을 비교하는 계산은 시험 샘플, 참조 표준 및 대조 샘플 사이의 체적 변화를 허용해야 함을 이해할 것이다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같이, 미리 정의된 복셀은 약 1 입방 미크론 내지 약 8x105 입방 미크론의 범위를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 미리 정의된 복셀은 약 1 입방 미크론 내지 10,000 입방 미크론, 또는 약 10,000 내지 100,000 입방 미크론, 또는 약 100,000 내지 800,000 입방 미크론의 범위 내이다. 일 실시예에서, 상기 미리 정의된 복셀은 약 1 입방 마이크론 내지 10,000 입방 마이크론, 또는 약 2,000 입방 마이크론 내지 약 8,000 입방 마이크론이다. 또 다른 실시예에서, 복셀은 약 6,125 입방 미크론이다.
병리학적 지형과 원자 지형 사이의 2차원 (2D) 맵핑은 망간의 상대적 존재량을 나타낸다.
본 발명의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에 따른 방법은 선택적으로 개체로부터의 시험 샘플을 얻거나 유도하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 샘플은 본원에서 "개체"로 불리는 "개체", "참가자" 또는 "환자"로부터 얻는다. 상기 샘플은 개체의 조직 또는 기관 유래일 수 있다. 본 발명의 임의의 양태, 실시양태 및/또는 실시예에 따라 기술된 개체는 임의의 정상적인 인간 또는 포유류, 임의의 치료 또는 예방이 필요한 정상적인 인간 또는 포유류를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 개체는 본 발명에 따라 기재된 암, 또는 암 또는 신생물의 임의의 형태, 또는 본 발명에 따라 기재된 암을 갖는 것으로 의심되는 개체, 또는 암 또는 신생물의 임의의 형태를 포함한다. 또한 당업자는, 상기 개체가 임의의 암을 포함하는 임의의 장애에 대한 치료 및/또는 예방을 받을 수 있음을 이해할 것이다. 상기 개체는 기저 질환을 나타내는 시험 또는 스캔을 받았지만 무증상일 수 있고, 또는 증상을 보일 수도 있다. 상기 개체는 암 치료, 또는 약물, 화학 요법, 면역 치료, 수술, 방사선 또는 치료 장치의 형태로 임상적 개입을 포함하는 임상 치료, 또는 아직 임의의 임상 치료 중이 아닌 개체를 포함한다. 포유류는 유인원, 고릴라, 침팬지, 멸종 위기의 종, 가축, 예를 들어, 소, 돼지, 말 및 반려 동물, 예를 들어, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 대조 샘플은 임의의 적합한 샘플일 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 대조 샘플은 세포, 세포 집단, 하나 이상의 단세포 유기체, 조직 샘플 또는 그 일부, 장기 샘플 또는 그 일부, 원핵 생물 또는 진핵 생물로부터 수득한/유래한 하나 이상의 세포, 세포 및 이와 관련된 비-세포 기질 성분의 집단, 신생물 세포 또는 신생물 세포 집단, 임의의 장기로부터의 조직 샘플 또는 개체로부터의 조직, 종양, 예를 들어, 세포의 고체 매쓰 또는 세포의 "액체" 집단, 예를 들어, 백혈병 세포를 포함한 조혈 계통의 임의의 암, 또는 고형 종양의 순환 세포 유도체, 또는 엑소좀과 같은 세포 유도체를 포함하거나 이로부터 유도된 것일 수 있고,전이된 세포 또는 세포 집단이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 대조 샘플은 세포, 세포 집단, "정상" 조직 샘플, 고환암 (예를 들어, 정상 피종)의 종양/신생물의 조직 샘플, 림프종 (예를 들어, B-세포 림프종), 소세포 폐암, 뇌암 (예를 들어, 교모세포종/성상세포종), 중피종, 흑색종 및 유방 및 전립선암을 포함하거나 이로부터 유래한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 방사선 치료 후에 재발할 가능성이 있는 암을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은:
(a) 시험 샘플의 2D 영역을 선택함으로써 종양으로부터의 시험 샘플의 3D 영역 내의 망간 수준을 정량화하는 단계로서, 상기 2D 영역은 X':Y' 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 상기 3D 영역은 상기 2D 영역에 대응하고 X로 표시되는 선택된 높이를 가지며, 상기 3D 영역은 미리 정의된 체적의 3개 이상의 복셀로 분할되고, 각 복셀의 체적은 XxYxZ에 의해 정의되는 단계;
(b) 각 복셀 중의 망간의 중심 경향 수준을 측정하는 단계;
상기 복셀의 X 및 Y 좌표에 대응하는 2D 영역에서, 망간 수준이 주위 영역보다 높은 암 영역인 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)을 중심 경향의 배수 또는 정수 사이의 임의의 근사치인 통계적 역치에 의해 확인하는 단계를 포함하고;
여기서 HMR의 빈도가 높으면 방사선 치료 후 암의 재발 가능성을 나타내고, HMR의 빈도가 낮으면 방사선 이후 암의 비-재발 가능성을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 제공하며, 여기서 HMR은 또한 암세포를 다른 것들과 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 해당하는 2D 영역에서 확인되고, 바람직하게는 헤톡실린 및 에오신 (H&E)염색이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 종양의 방사선-반응도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 종양으로부터의 시험 샘플 중의 멜라닌 수준을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 멜라닌 수준이 낮을수록 암이 방사선에 대해 더욱 민감하고, 멜라닌 수준이 높을 수록 암이 방사선에 대해 더욱 내성이다.
본 발명의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에 따른 방법 또는 용도는, 선택적으로 개체로부터 대조 샘플을 얻거나 유도하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 대조 샘플은 본원에서 "개체"로 불리는 "개체", "참가자" 또는 "환자"로부터 얻는다. 본 발명의 임의의 양태, 실시양태 및/또는 실시예에 따라 기재된 개체는 임의의 정상적인 인간 또는 포유류, 또는 본 발명에 따라 기재된 바와 같이 임의의 치료 또는 예방이 필요한 정상적인 임의의 인간 또는 포유류를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 개체는 본 발명에 따라 기재된 암, 또는 암 또는 신생물의 임의의 형태, 또는 본 발명에 따라 기재된 암을 갖는 것으로 의심되는 개체, 또는 암 또는 신생물의 임의의 형태를 포함한다. 또한 당업자는, 상기 개체가 임의의 암을 포함하는 임의의 장애에 대한 치료 및/또는 예방을 받을 수 있음을 이해할 것이다. 상기 개체는 기저 질환을 나타내는 시험 또는 스캔을 받았지만 무증상일 수 있고, 또는 증상을 보일 수도 있다. 상기 개체는 암 치료, 또는 약물, 화학 요법, 면역 치료, 수술, 방사선 또는 치료 장치의 형태로 임상적 개입을 포함하는 임상 치료, 또는 아직 임의의 임상 치료 중이 아닌 개체를 포함한다. 포유류는 유인원, 고릴라, 침팬지, 멸종 위기의 종, 가축, 예를 들어, 소, 돼지, 말 및 반려 동물, 예를 들어, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 대조 샘플은 닭, 오리 또는 거위와 조류 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 종으로부터 또한 얻을 수 있다.
당업자는 방사선의 모든 유형, 예를 들어 광자 또는 프로톤 기반, 감마선, 알파선, 베타선이 본원에 기재된 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에서 고려될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 방사선의 임의의 유형은 임의의 일차 효과와 관계없이 물을 이온화한다. 예를 들어, 갑상선의 드문 종양을 내부 조사하기 위한 131요오드, 또는 방사성 103팔라듐 또는 125요오드를 사용하여 전립선암에 대해 삽입된 종자를 통한 근접 치료는 모두 저에너지 X-레이를 통한 물의 방사선 분해를 유도하거나 뼈 병변으로의 전이를 위해 223라듐 디클로라이드를 알파 입자를 통해 조사한다. 유사하게 192이리듐을 포함하는 니들을 일시적으로 삽입하는 높은 선량의 근접 치료는 정확하게 동일한 메카니즘으로 작동한다. 임의의 특정 이론에 구애받지 않고, 당업계의 초점은 DNA 복구에 있었지만, 이는 단백질 손상이 문제가 될 수 있고, DNA 문제가 부차적일 수 있다고 생각하였다. 여러 손상된 이온은 단백질 손상을 통해 주요 세포 문제를 일으킨다.
중심 경향의 일반적인 측정은 중간값, 산술 평균 및 모드이다. 기하 평균, 메디민 (medimean), 윈소라아이즈드 k-배 평균 (winsorized k-time mean), K-배 트림드 평균 (K-times trimmed mean) 및 가중 평균을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 중심 경향의 임의의 다른 척도가 또한 사용될 수 있고, 데이터는 또한 중심 경향을 계산하기 전에 전환될 수 있다.
본 발명 전까지는, 망간의 임상적 중요성은 인식되지 않았고, 망간은 방사선 치료에 관한 임상 결정을 하기 위해 시험 샘플의 방사선-민감성/방사선-내성을 결정하기 위해 정량화되지 않았다.
본원에서 사용되는 "방사선 민감성" 또는 "방사선에 대한 민감성"은 세포가 사멸되거나 방사선에 노출될 때 더 이상 분열하지 않도록 사용되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용된 "방사선 내성" 또는 "방사선에 대한 내성"은 방사선 치료 후에도 하나 이상의 세포가 잔존하고, 살아남은 종양 및 기질 세포가 조사된 부위에 다시 살 수 있도록 여전히 분할 가능한 것을 의미한다-이는, 방사선으로 치료할 경우, 개체 내의 원발성 종양 또는 이의 전이 유도체가 성장 및/또는 추가 전이가 가능할 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
시험 샘플 중의 망간 수준은 본 발명에 따른 ATI를 계산하기 위해 하나 이상의 참조 표준에서의 망간 수준과 비교될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 사용을 위한 역치 ATI는 분석을 위한 시험 샘플, 참조 표준 및/또는 대조 샘플을 선택하는 당업자에게 명백할 것이다. ATI 역치 또는 역치는 대조 샘플 또는 샘플들로부터 유래된 방사선-반응도에 대한 공지된 또는 유도된 CC/S 수준에 기초할 수 있으며, 여기서 대조 샘플 또는 샘플들은 시험 샘플의 것과 동일한 암 유형의 세포를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본원의 실시예에 나타난 바와 같이, 방사선-민감성 역치는 35×35×5 입방 미크론 복셀에 적용되는 55Mn에 대한 2K 교정된 초당 카운트 (CC/S)로 설정될 수 있다. 동일한 수치의 역치는 70x70x5 입방 미크론 복셀을 기초로 8K CC/S에서 설정할 수 있다. 상기 역치는 예를 들어, 방사선 민감성 대조 샘플에서 얻은 상기 중심 경향 값 (바람직하게는 평균 또는 중간값) 보다 1 표준 편차, 또는 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9 또는 4.0 표준 편차, 또는 정수들 사이의 임의의 근사치에서도 설정될 수 있다. 역치는 다른 종양 유형으로부터의 경험적 결정에 의해서도 설정될 수 있다. 흑색종을 예로서 사용한 본원 실시예에 나타난 바와 같이, 역치는 중심 경향 값 (바람직하게는 중간값 또는 평균) 보다 1.0x, 1.1x, 1.2x, 1.3x, 1.4x, 1.5x, 1.6x, 1.7x, 1.8x, 1.9x, 2.0x, 2.1x, 2.2x, 2.3x, 2.4x 또는 2.5x, 또는 정수 사이의 임의의 근사치의 인자로 설정할 수 있다. 당업자는 상기 역치가 대부분의 경우, 주어진 샘플에서 "백그라운드" 값을 허용하는 것을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 방사선 민감성 제어의 ATI를 참조함으로써 설정된 미리 결정된 ATI 역치 아래로 떨어지는 임의의 시험 샘플 ATI는 시험 샘플의 소스가 방사선에 대해 민감함을 나타낸 것으로 간주되고; 방사선 내성 제어의 ATI를 참조함으로써 미리 결정된 ATI 역치를 초과하는 임의의 시험 샘플 ATI는 시험 샘플의 소스가 방사선에 대해 내성임을 나타낸 것으로 간주된다.
추가 실시예로서, 3개의 방사선-민감성 종양 유형 (정상 피종, 림프종 및 소세포 폐)에 대한 도 11의 값의 87%가 2K 미만으로 떨어지기 때문에, 방사선-반응도를 측정하는데 사용할 수 있는 하나의 미리 결정된 ATI 역치는 2K CC/S이다. 임상 적으로 방사선-내성인 두 종양 유형, 즉 중피종 및 뇌에 대한 도 11의 값의 86%가 2K CC/S 이상으로 떨어진다. 그러나, 당업자는 2K 역치가 일부 상황에서는 적절하지만, 유전적 배경과 같은 다른 요인에 따라 환자 사이에 변화가 있을 수 있으므로 다른 상황에서는 존재하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 상황에서는 3K로 방사선-민감성 역치를 설정할 수 있다. 종양학에서 받아들여지는 임상 현실은 주어진 결과에 대해 일반적으로 두 가지 역치가 있다는 것이다. 첫 번째 역치 아래에 하나의 확신 결과가 있고, 두 번째 역치 위에는 다른 확신 결과가 있으며, 두 역치 사이에는 임상적으로 이질성이며 결과가 다양하게 나타나는 "중간 영역"이 있다. 도 11의 데이터의 경우, 3K 및 4K에서 두 가지 역치를 설정할 수 있으며, 중간 영역은 3K-4K이다. 이러한 역치는 보다 많은 금속 및 방사선 치료 데이터가 이용 가능해짐에 따라 더욱 명확해질 것이다.
본 발명이 망간을 포함하는 특히 높은 수준의 금속을 갖는 본 발명의 3D 영역 내의 복셀을 확인하는 데에도 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 복셀에 대한 역치를 상대적으로 높은 수준에서 망간에 대해 포지티브로서 나타내도록 설정함으로써, 높은 금속 함량의 영역을 확인할 수 있다는 것도 고려되었다. 본원에 사용된 바와 같이, 높은 금속 영역 (HMR)의 특정 금속을 언급할 때, 상기 HMR은 예를 들어, 각각 HMR(55Mn), HMR(66Zn), HMR(56Fe) 및 HMR(63Cu)로서 지정되고, 임의의 금속의 일반적인 경우는 HMR(AM)로 나타낸다. 당업자는 임의의 금속 HMR(AM))에 대한 HMR이 복셀 연속성의 기준을 충족시키기 위해 2개의 인접한 복셀을 최소한으로 포함할 것이라는 것을 이해할 것이다. HMR(AM)의 크기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 등의 연속적인 복셀을 특정 종양의 분석을 위해 선택된 샘플 크기 인 정수로 변환할 수 있다.
당업자는 본 발명에 따른 HMR(AM)의 크기가 현존하는 기술을 사용하여 측정 가능한 임의의 범위에 있음을 이해할 것이다. 종래의 슬라이드가 종양 물질을 갖는 에지에 로드되는 경우, 분석될 수 있는 최대 개수는 선택된 복셀 크기에 의존할 것이라는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, HMR(AM) 크기는 2 복셀 내지 약 800,000 복셀 범위일 수 있고, 35x35 (너비에 의한 길이) 평방 미크론 크기를 기준으로 한 임의의 값이다. 단지 예시로서, 경험적으로 선택된 8×8 복셀 (2D에서 35×35 평방 미크론 2D)은 실시예에서 나타난 바와 같이, 높은 금속 함량의 영역을 효율적으로 나타냈다. 최소 8x8 복셀 HMR-포함 랜드스케이프 (landscape)는 X' 및 Y' 방향으로 경계가 정해진다. 따라서 X8xY8 복셀 위의 HMR은 X' 및 Y' 2D 방향의 정수에 의해 개별적으로 증가할 수 있으며, X[8+1] x Y[8] : X[8] x Y[8+1] : X[8+1] x Y[8+1] : X[8+2] x Y[8] : X[8+2] x Y[8+1] : X[8+2] x Y[8+2] : X[8+1] x Y[8+2] : X[8] xY [8+2] ~ X[8+n] x Y[8+n]의 HMR을 산출할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 수천일 수 있으나, 바람직하게는, 30x30 복셀 (2D에서 1 mm2를 나타내는)의 샘플이 샘플링될 때 1 내지 22이다. 역치는 최소 8 복셀보다 낮게 설정될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 8의 값은 HMR에 대한 경험적으로 파생된 효율적인 검색 도구이므로, 여기에서 사용되었다.
당업자는 또한 HMR이 종양에서 암세포 또는 일반적으로 관련 기질로서 지칭되는 세포 및 비-세포 물질의 영역에 적용될 수 있음을 이해할 것이며, 이는 자체적으로 인접한 암세포와의 상호 작용 때문에 "활성화된"상태로 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 실제로 투여되는 방사선 및/또는 항암 치료의 양은 전형적으로 화학 요법 및 면역 치료과 같은 다른 옵션, 개별 환자의 나이, 체중 및 반응, 환자의 증상/상태의 중증도 등을 포함하는 관련 상황에 비추어 의사가 결정한다. 방사선 치료는, 정위 신체 방사선 치료 (stereotactic body radiation), 분할된 외부 빔 방사선 치료 (fractionated external beam radiation therapy) 및 근접 치료 (brachytherapy), 강도 변조 방사선 치료 (intensity-modulated radiotherapy), 등각 방사선 치료 (conformal radiation), 정위 신체 방사선 (stereotactic body radiation), 양성자 빔 방사선 (proton beam radiation), 감마나이프 (GammaKnife) 및 사이버나이프 (CyberKnife)를 포함하는 외부 빔 방사선 치료 (external beam radiation therapiy: EBRT), 및 방사성 동위 원소 "종자 (seed)"의 영구 이식이나 일시적인 고선량 방사능 종자를 포함하는 근접 치료를 포함한다. 환자에게 전달되는 방사선의 종류는 광자 또는 양성자 기반일 수 있고, 선형 가속기, 감마선 (모든 소스로부터의)을 통해 전달될 수 있으며, 또는, LDRBT의 경우, 125요오드, 131세슘 및 133세슘 또는 103팔라듐을 포함하는 방사성 종자를 통해 전달될 수 있고, 또는, 192이리듐 (고선량률 근접 치료 (High Dose Rate Brachytherapy: HDRBT)의 경우), 또는 실리콘 미립자에 접합된 90이트륨 수지 미립구 또는 32인을 통해 전달될 수 있다. 방사선은 하기에 나온 다른 독립체를 통해 전달될 수도 있다 (Chellan and Sadler, 2015, Phil. Trans. R. Soc , A.373: 20140182) - 예를 들어, 방사선과 결합된 면역 치료에 대한 면역 반응의 신생항원 자극제로서 단백질에 결합된 9베릴륨; 조골 전이를 위한 89스트론튬; 골 전이 및 거세-저항성 전립선암 치료를 위한 223라듐; 치료용 방사선 핵종으로서 47스칸듐 및 44스칸듐; T 세포의 면역 반응 유발을 위해 MHC와 펩타이드의 표면에 결합된 59니켈; 암 치료를 위한 소마토스타틴 수용체를 타겟으로 하는 90이트륨; 지질의 예방적 항산화제로서의 몰리브덴산염 및 유방암 및 식도암 치료로서의 96몰리브덴; 혈청 트랜스페린을 통한 암세포로의 101루테늄 전달; 뼈 전이를 위한 105로듐; 전립선암 및 맥락막 흑색종에 대한 근접 치료로서의 103팔라듐; 종양 세포에 의한 효율적인 흡수 및 연조직 육종 및 두경부암에 대한 방사선 효과의 향상을 위한 나노스피어로서의 178하프늄; 항암제로서의 폴리옥소텅스텐산염으로서의 184텅스텐; 소세포 폐암 및 전립선암에 대한 188레늄 및 186레늄; 슈퍼옥사이드 모방체로서의 190오스뮴 및 항암제로서의 오르가노-오스뮴 아렌 복합체 (organo-osmium arene complexe); 암 화학 요법의 195플라티늄; 골육종 및 뼈로 전이된 유방암에 대한 153사마륨; 내부 방사선 치료를 위한 166홀뮴; 뼈 전이에 대한 175이트륨으로 표지된 폴리아미노포스포네이트; 소세포 폐암에 대한 177루테튬 표지 펩타이드 및 항체; 골수암에 대한 225악티늄 및 이의 부식 생성물 213비스무트; 암세포 사멸을위한 감광제로서의 프탈로시아닌 함유 28실리콘; HER2에 결합하고 다른 암세포 유형의 내재화 시 방사선을 전달하기 위해 트라스투주맙과 병용하여 방사선 면역치료를 위한 212Bi를 생성하는 212납; 다른 암 치료제인 포스포콜로서의 32인; 전골수성 백혈병, 절제 불가능한 간세포 암종 및 비-소-세포 폐암에 대한 As2O3로서의 75비소; 급성골수성 백혈병의 표적 방사선 치료를 위한 213비스무스 표지 린트주맙 (lintuzumab); 갑상선암을 위한 127요오드 및 131요오드; 뇌 및 재발성 난소암 중의 종양 세포를 제거하기 위한 211아스타틴을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 물질은 붕소 (10B), 로즈 벵골, 2-데옥시-D-글루코스 또는 방사선과 결합된 면역 치료 첨가제와 같은 방사선 증감제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다 (Sharabi et al., Oncology [Williston Park] 2015, 29(5), pii:211304; Formenti, J Natl Cancer Inst 105, 256-265, 2013).
본 발명과 관련하여, 용어 "X'xY'xZ"의 문자 X', Y' 및 Z는 샘플의 "3D 영역"의 치수 (dimension)을 지칭하고, "X'xY'xZ"는 3D 영역의 체적을 제공하는 3D 영역의 길이x너비x높이와 관련한다.
본 발명과 관련하여, 용어 "XxYxZ"의 문자 X, Y 및 Z는 샘플의 "3D 영역" 내의 복셀의 치수를 지칭하고, "XxYxZ"는 복셀의 체적을 제공하는 길이x너비x높이와 관련한다.
따라서, 본 발명과 관련하여, "35x35x5"와 같은 용어가 나타나는 경우, 이들은 길이x너비x높이와 관련되고 체적의 척도를 제공한다; 반면에 "35x35"라는 용어는 길이x너비와 관련되어, 영역 (2D)을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 흑색종의 방사선-반응도를 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 흑색종으로부터의 시험 샘플 중의 멜라닌 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 낮을수록 흑색종이 방사선에 대해 더욱 민감하고, 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 높을수록 흑색종이 방사선에 대해 더운 내성이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 흑색종의 방사선-반응도를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 흑색종으로부터의 시험 샘플 중의 멜라닌 수준과 미리 결정된 멜라닌 역치를 비교하는 단계를 포함하고, 상기 흑색종의 방사선-반응도는 상기 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 멜라닌 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
상기 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 상기 멜라닌 역치보다 낮으면 상기 흑색종은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
상기 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 상기 멜라닌 역치보다 높으면 상기 흑색종은 방사선에 내성인 것으로 결정된다.
하나 이상의 실시양태에서, 상기 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 2개의 미리 결정된 멜라닌 역치와 비교되고, 상기 흑색종의 방사선-반응도는 시험 샘플 중의 멜라닌 수준이 2개의 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
상기 시험 샘플 중의 멜라닌이 낮은 멜라닌 역치보다 낮으면 상기 흑색종은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
상기 시험 샘플 중의 멜라닌이 높은 멜라닌 역치보다 높으면 상기 흑색종은 방사선에 내성인 것으로 결정되며;
상기 시험 샘플 중의 멜라닌이 상기 2개의 멜라닌 역치 사이이면 상기 흑색종은 방사선에 부분적으로 민감한 것으로 결정된다.
당업자가 미리 결정된 멜라닌 역치를 설정하는 능력은 충분하다. 하나의 절편에서 멜라닌 농도를 포함하는 복셀은 동일한 복셀 내에서 55Mn 수준을 동시에 측정하는 동안, 요소 분석 (LA-ICP-MS와 같은)의 임의의 양식을 통해 절단된 절편에 금속-표지된 멜라닌 항체를 사용하여 결정할 수 있다. 무멜라닌 (amelanotic) 흑색종 샘플에 적용된 동일한 금속 표지 항체의 역치 수준을 초과하는 멜라닌 수준을 포함하는 복셀은 유익하다. 시험 샘플 내의 멜라닌 복셀의 백분율과 그 복셀의 가중된 중간값은 방사선-보호 인덱스를 제공한다. 당업자는 멜라닌에 대한 역치가 중심 경향, 바람직하게는 중간 또는 평균의 관점에서 ATI와 동일한 일반적인 방식으로 설정될 수 있음을 주목할 것이다. 또한, 55Mn은 멜라닌에 대해 분석된 것과 동일한 복셀에서 동시에 측정될 수 있음을 주목해야 한다.
예를 들어, 역치는 방사선 치료에 대해 다르게 반응하는 코호트로부터의 흑색종 중의 멜라닌 수준의 평균 또는 중간값으로 설정될 수 있다 (즉, 일부는 민감하고 일부는 내성). 대안적으로, 두 가지 역치가 설정될 수 있는데, 예를 들어, 방사선 치료에 다르게 반응한 흑색종 집합, 예를 들어, 동일한 수의 방사선 내성 및 방사선 민감성 흑색종의 멜라닌 수준의 평균으로부터 1 또는 2 표준 편차로 설정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 흑색종을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 개체로부터의 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 흑색종이 방사선에 민감한 것으로 결정되면 상기 개체의 흑색종을 치료하는데 방사선 치료를 포함하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체의 흑색종을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 개체로부터의 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 수행하는 단계를 포함하고, 흑색종이 방사선에 내성인 것으로 결정되면 상기 개체의 흑색종을 치료하는데 방사선 치료를 포함하지 않는 단계를 포함한다.
문맥상 달리 명백히 요구하지 않는 한, 명세서 및 청구 범위에 걸쳐, '포함한다', '포함하는' 등의 단어는 배타적인 또는 포괄적인 의미와 반대되는 포괄적인 의미로 해석되어야 한다. 즉 "포함하지만, 이에 한정되지 않는다"의 의미로 사용된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단일 단계에 대한 참조, 물질 조성물, 단계군 또는 물질의 조성물은 상기 단계들, 물질 조성물들, 단계군들 또는 물질의 조성물 군들 중 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)를 포함하는 것으로 해석된다.
본원에 기재된 본 발명의 각각의 양태, 실시양태 및/또는 실시예는 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 각각의 모든 양태, 실시양태 및/또는 실시예에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 준용된다.
당업자는 본원에 기재된 본 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한, 본 명세서에서 개별적으로 또는 전체적으로 언급되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 포함하고, 임의의 모든 조합 또는 임의의 둘 이상의 상기 단계 또는 특징을 포함할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 실시양태에 의해 범위가 한정되지 않으며, 단지 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 동등한 산물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 명백히 본 발명의 범위 내이다.
당업자는 본 발명의 방법이 임상적 치료 내용에서 어떠한 방식으로도 일상적이거나 통상적이지 않다는 것을 인정할 것이다. 본 발명이 제공하는 정밀도는 현재 존재하지 않는다. 예를 들어, LA-ICP-MS를 기초로 한 종양 유형 (특히, 예시된 8 가지 종양 유형)을 구별하는 것은 완전히 새로운 것이고; 결과는 예상치 못한 것이며, 선행 기술로부터 예측될 수 없었다.
도 1: T2는 근육층 (muscularis propria)의 침윤을 나타내고; N0는 림프절 전이가없는 것을 나타내며, M0는 원격 전이가 없음을 나타내는, T2aN0M0의 TNM 스테이징 기준을 가진 48세 남성의 경부의 스테이지 Ib 악성 흑색종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지이다. 이 절편의 오른쪽 상단은 옅은 무멜라닌 종양 세포로 구성되어 있는 반면, 도면의 왼쪽과 아래쪽의 어두운 영역은 진하게 염색된 멜라닌을 포함하는 세포로 구성되어 있고, 멜라닌의 더 큰 패치는, 세포 내 및 세포 외 모두 이미지의 아래 부분에 검은 점으로 나타낸다.
도 2: 세 가지 상이한 망간-기반 결합 독립체를 도시. 단일 55Mn2 +는 세 가지 개체 모두를 한 번에 결합하지 않는다 (이 도면은 설명하기 위한 목적만을 위한 것으로, Slade and Radman, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 75, 133-191, 2011.에서 가져온 것이다.).
도 3: A. 정상적인 피질 조직의 특성을 보이는 50세의 인간 여성으로부터의 정상적인 인간 피질의 블록에서 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. 이는 동일한 블록으로부터 인접한 염색되지 않은 절편에서 수행되었지만, 다른 슬라이드에서 수행된 세 개의 트랙 절단 (더 큰 멀티-트랙 조직 절단에서 얻어진 것)의 위치를 나타낸다. 도면에 보이는 H&E 염색 영역은 다른 슬라이드 상에서 LA-ICP-MS에 의해 분석된 동등한 염색되지 않은 영역에 해당한다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 70개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 그래프는 미가공 수치 값을 나타내고 (도 3B), 각각의 트랙은 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 절제 열의 각각에서 인접한 복셀의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 70개의 복셀로 구성된다.
도 4: A. 다형성 교모세포종으로 분류된 뇌 신생물을 가진 19세의 인간 여성의 블록에서 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. 도면에 보이는 H&E 염색 영역은 다른 슬라이드 상에서 LA-ICP-MS에 의해 분석된 동등한 염색되지 않은 영역에 해당한다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 68개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 교모세포종을 가진 인간 여성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 4B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 5: A. 도 4에 나타난 다형성 교모세포종을 가진 19세의 인간 여성의 동일한 블록의 상이한 영역에서 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 69개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 교모세포종을 가진 인간 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 5B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 6: A. 악성 중피종을 가진 60세의 인간 남성으로부터의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 67개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 악성 중피종을 가진 60세의 인간 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 네 개의 금속 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 6B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 7: A. 식도에 악성 중피종을 가진 50세 남성으로부터의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 68개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 식도에 악성 중피종을 가진 50세 인간 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 7B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 8: A. 확산성 B-세포 림프종을 가진 57세 남성으로부터의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 79개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 확산성 B-세포 림프종을 가진 57세 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 8B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 9: A. 소세포 미분화 악성 폐암을 가진 38세 남성으로부터의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 65개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 소세포 미분화 악성 폐암을 가진 38세 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 9B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 10: A. 정상 피종을 가진 52세 남성으로부터의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편의 사진 이미지이다. B. 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호는 트랙 당 79개의 복셀이 절단된 조직 절편으로부터 세 개의 연속적인 절단 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다. C. 정상 피종을 가진 52세 남성으로부터의 세 개의 절단 열 각각에 인접한 복셀 중의 세 개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값 (도 10B)의 그래픽 표현이다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 세 개의 절단 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
도 11: 정상 피종 (55), 림프종 (10), 소세포 폐암(20), 흑색종 (64), 뇌 (교모세포종 및 성상세포종) (25) 및 중피종 (10)를 가진 환자로부터의 종양 내 총의 종양에서 총 망간 함량의 중간값의 그래픽 표현이다. 각 사각형은 흑색종을 제외한 단일 환자를 나타내며, 64명의 환자 중 2명이 각각 그들의 종양 내에서 2개의 주요 계통을 갖고, 각 계통은 사각형의 히스토그램에서 개별적으로 표시된다.
도 12: 레이저 절단 트랙의 2차원 표현은 종양이 2개의 주요 계통을 갖는 흑색종 환자 중 하나의 도 1에 나타낸 조직 절편의 상단를 가로지른다. 스케일; 오른쪽 (짙은 회색), 0-15,000; 중간, (약간 하얀색), 15,000-45,000; 왼쪽 (옅은 회색), 45,000-150,000 초당 교정 카운트.
도 13: 도 1에 나타난 종양의 각각 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu를 나타내는 패널 (a), (b), (c) 및 (d)을 가진 네 개의 모든 금속의 그래픽 분석이다.
도 14: 54세 남성의 왼쪽 검지의 흑색종: 스테이지 IV, T4N0M1 (상단 패널)의 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지. 절단 트팩의 2차원 표현 (하단 패널). 스케일; 옅은 회색 (종양의 주 벌크 55Mn 값) 0-2,000 CC/S; 이 특정 실시예에서는 초당 >6,500의 교정 카운트에 해당하는, 일반적으로 높은 금속 영역 (HMR)으로 불리는, 약간 하얀 평평한 영역.
도 15: A. 54세 남성의 왼쪽 검지의 흑색종으로부터의 포르말린-고정 파라핀-포매에서 표준 5 미크론, H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지는 조직 및 세포 형태를 도시하는 도 14에서 분석되었다. B. A에 나타낸 샘플의 금속 함량을 측정하였다. 파트 B는 LA-ICP-MS 이후 이 절편의 개별 복셀 내 55Mn 수준의 2차원 표현이다. HMR(55Mn)으로 표시되고, 검은색 영역으로 나타낸 높은 55Mn 함량의 연속적인 복셀의 두 클러스터는 복셀 매트릭스의 데이터를 육안으로 검사한 후에 보이게 된다. C. A 및 B 절편의 개별 복셀 내 55Mn 수준의 2차원 표현은 전체 영역의 복셀 당 중간값의 2배의 역치 (기계 백그라운드 값을 더함)를 적용하여 추가로 분석하였다. 검은색 사각형은 이 특정 (2x 중간값) 역치를 초과하는 복셀을 나타낸다. D. A 및 B 절편의 각 개별 복셀 내 55Mn 수준의 2차원 표현은 전체 영역의 복셀 당 중간값의 역치에 전체 영역의 상기 복셀 값의 표준편차 (St.Dev.)를 더하고, 기계 백그라운드 값을 더하여 적용함으로써 추가로 분석되었다. 검은색 사각형은 이 특정 (중간값 + St.Dev) 역치 보다 높은 복셀을 나타낸다.
도 16: 상단 패널. 도 15의 패널 A로부터의 흑색종 환자의 종양에서 동일한 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지. 중간 패널. HMR(55Mn)을 구성하는 연속적인 복셀의 두 클러스터를 나타내는 도 15의 패널 C에 나타난 55Mn 값의 동일한 복셀 매트릭스의 2차원 표현. 하단 패널. 중간 패널에 나타낸 것과 동일한 복셀 중의 66Zn 복셀 값 및 55Mn에 대한 것과 같이 66Zn에 대해 동일한 역치 기준 (2x 중간값)을 사용한다.
도 17: 다른 역치 기준을 사용하여 LA-ICP-MS를 통해 생성된 복셀 매트릭스 중의 HMR(55Mn)의 분포 및 출현의 2차원 표현. 네 개의 왼쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 51세 여성 환자의 소세포 미분화 폐암의 표준 염색되지 않은 5 미크론 조직 절편으로부터의 31x31 복셀 영역의 레이저 절단의 데이터를 나타낸다. 네 개의 오른쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 도 14 내지 도 16에 기재된 54세의 흑색종 환자의 31x31 복셀 영역의 레이저 절단의 데이터를 나타낸다. 복셀 매트릭스 데이터에 적용된 55Mn 역치는; T1, 0.5x 중간값; T2, 1x 중간값; T3, 1.5x 중간값, 2x 중간값이다. 각 패널의 어두운 복셀은 55Mn 값이 해당 패널의 역치를 초과하는 것이다. 역치를 초과하는 단일 비-연속적인 복셀은 싱글톤으로서 지정되고, 두 개의 연속적인 복셀은 더블릿으로서 지정된다.
도 18: 도 17의 두 명의 환자로부터의 동일한 샘플에 대해 LA-ICP-MS를 통해 생성된 복셀 매트릭스 중의 HMR(66Zn)의 분포 및 출현 없는 것의 2차원 표현이다. 네 개의 왼쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 도 17의 동일한 31x31 복셀 영역의 레이저 절단의 데이터를 나타내고, 66Zn, 56Fe 및 63Cu에 대해 동시에 분석되었다. 66Zn에 대한 데이터를 나타낸다. 네 개의 오른쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 도 17의 동일한 31x31 복셀 영역의 레이저 절단의 데이터를 나타낸다. 복셀 매트릭스 데이터에 적용된 66Zn 역치 값은 이전에 사용된 것과 같다; T1, 0.5x 중간값; T2, 1x 중간값; T3, 1.5x 중간값, 2x 중간값. 각 패널의 어두운 복셀은 66Zn 값이 해당 패널의 역치를 초과하는 것이다.
도 19: 히스토그램은 소세포 폐암을 가진 환자 20명의 종양으로부터 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로서 표시한 중간 55Mn 함량을 나타낸다. 각각의 회색 사각형은 샘플링ㄹ한 단일 환자의 종양으로부터의 약 1,800 개의 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 종양을 가진 14명의 환자를 나타낸다. 하단 히스토그램은 t1~t6로 표시한 6명의 환자로부터 HMR(55Mn)을 가진 종양을 나타내고, 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정되었다. 검은색 사각형은 2배 중간값의 표준 T4 역치를 사용하여 결정된 t1~t6 환자의 각각의 종양에서 발견된 HMR(55Mn)의 중간값이다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 환자 t1부터 t6까지의 각 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합쳐진다. 히스토그램의 빈(bin)은 200 CC/S 단위이다.
도 20: 시뮬레이션 된 2D 종양 랜드스케이프에서 연속적인 복셀 구성의 선택된 샘플의 크기, 형상 및 내용의 도식 표현. 지정된 역치를 초과하는 암세포를 포함하는 복셀은 검은색으로 나타내었다. 패널 A는 복셀 더블릿만을 검사할 경우, 8개 모두의 가능한 복셀 구성의 위치를 도시한다. 패널 B 및 E는 AM이 임의의 금속을 나타내는 역치 HMR(AM)을 초과하는 8x8 기준을 충족하는 가능한 많은 연속적인 복셀 구성 중 하나를 도시한다. 패널 C는 8x8 최소 역치 아래로 떨어지는 7x7 복셀 만의 복셀 구성을 도시한다. 패널 D 및 F는 림프관 또는 덕트의 특성이 될 복셀 구성을 도시한다. 패널 G는 암세포의 "단일 파일" 이동 또는 중요 기계의 "stutter"의 특징인 복셀 구성을 도시한다. 패널 H는 역치를 초과하는 복셀이 임의의 금속의 높은 수준을 가지는 세포 또는 임의의 금속에 결합하는 멜라닌 과립으로 인해 발생할 수 있는 일부 흑색종에 보이는 다중 복셀 구성의 특징이다.
도 21: 히스토그램은 확산성 B 세포 림프종을 가진 10명의 환자의 종양의 약 1,800개 복셀의 총 면적에서 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시되는 중간 55Mn 함량을 나타낸다. 각 회색 사각형은 단일 환자의 종양으로부터 계산된 중간값을 표시한다. 히스토그램 내의 빈은 200 CC/S 단위이다.
도 22: 전형적 정상 피종을 가진 55명의 환자의 종양으로부터의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량의 히스토그램. 각각의 회색 사각형은 단일 환자의 종양으로부터의 약 1,800 개의 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 51개의 정상 피종을 도시한다. 하단 히스토그램은 4명의 환자로부터 HMR(55Mn)을 가진 종양을 나타내고, 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정되었다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 S4~S7 환자의 각 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합쳐진다. S2, S2 및 S3로 표기된 환자는 그 종양이 표준 역치 이하의 HMR(55Mn)을 포함하지 않더라도 높은 중간값을 가진 이상치 (outlier)이다.
도 23: 중피종을 가진 10명의 환자의 종양으로부터의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량의 히스토그램. 각각의 회색 사각형은 단일 환자의 종양의 약 1,800 개의 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 9개의 종양을 도시한다. 하단 히스토그램은 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정된 단일 HMR(55Mn)을 가진 종양을 나타낸다. 검은색 사각형은 하나의 중피종 환자의 종양에서 발견된 HMR(55Mn)의 중간값이다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 그 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합류된다. 히스토그램 내 빈은 200 CC/S 단위이다.
도 24: 히스토그램은 뇌의 다형성 교모세포종 또는 성상세포종을 가진 25명의 환자의 종양으로부터의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량을 나타낸다. 각각의 회색 사각형은 단일 환자의 종양의 약 1,800 개의 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 24개의 종양을 도시한다. 하단 히스토그램은 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정된 단일 HMR(55Mn)을 가진 종양을 나타낸다. 검은색 사각형은 그 종양에서 발견된 HMR(55Mn)의 중간값이다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 그 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합류된다. 히스토그램 내 빈은 200 CC/S 단위이다.
도 25: 히스토그램은 흑색종을 가진 64명의 환자의 종양으로부터의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량을 나타낸다. 각각의 회색 사각형은 동일한 종양 내 각각 2개의 주요 계통을 가진 2명의 흑색종 환자의 경우를 제외하고는 단일 환자의 종양의 약 1,800 개의 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타내고, 상기 샘플링된 면적은 계통 당 900개 복셀 미만이다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 종양을 도시한다. 하단 히스토그램은 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정된 HMR(55Mn)을 가진 종양을 나타낸다. 검은색 사각형은 종양에서 발견된 HMR(55Mn)의 중간값이다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 그 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합류된다. 히스토그램 내 빈은 200 CC/S 단위이다. 많은 CC/S 값이 10,000 개의 복셀을 초과하기 때문에, 스케일이 압축되었음을 주의한다.
도 26: 이 출원에서 분석을 위해 사용된 금속에 결합된 멜라닌의 복잡한 고분자 구조의 개략도.
도 27: 패널 A 및 B는 조직 및 세포 형태를 도시하는 45세 여성의 흉부 벽의 악성 흑색종으로부터에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지이다. C. 검은색 영역으로 나타낸 높은 66Zn 함량의 연속적인 복셀을 가진 이 절편의 개별 복셀 내 66Zn 수준. D. 검은색 영역으로 나타낸 높은 63Cu 함량의 연속적인 복셀을 가진 이 절편의 개별 복셀 내 63Cu 수준. E. 검은색 영역으로 나타낸 높은 56Fe 함량의 연속적인 복셀을 가진 이 절편의 개별 복셀 내 56Fe 수준. F. 검은색 영역으로 나타낸 높은 55Mn 함량의 연속적인 복셀을 가진 이 절편의 개별 복셀 내 55Mn 수준.
도 28: 히스토그램은 흑색종을 가진 64명의 환자의 종양의 약 1,800개의 qahrtpf의 총 면적으로부터 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량을 나타낸다. 이전에 기재한 바와 같이, 이전에 기재한 바와 같이, 64명의 환자 중 2명은 각각 종양 내에 2개의 주요 계통을 가지고, 각각의 계통은 히스토그램에서 사각형으로 개별적으로 표시하였다. 흑색종 샘플은 주 사이트에서 유래된 것 (상단 히스토그램), 림프절에서 파생된 것 (중간 히스토그램) 및 원거리 사이트에서 유래된 것 (하단 히스토그램)으로 그룹화된다.
도 29: A: 54세 남성의 소세포 폐암에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지로, 진하게 염색된 암세포의 영역 및 보다 약하게 염색된 기질 영역의 조직 및 형태를 도시한다. B. 선택된 역치를 초과하는 66Zn 수준을 흰색/회색으로 표시하고, 이 역치 이하의 기질 구성 성분이 검은색으로 표시된 동일한 절편의 2D 릴리프 이미지.
도 30: A: 66세 남성의 직장의 악성 흑색종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지로, 진하게 염색된 암세포의 영역, 더 진하게 염색된 멜라닌 농도 및 보다 약하게 염색된 기질 영역의 조직 및 형태를 도시한다. B. 선택된 역치를 초과하는 66Zn 수준을 흰색/회색으로 표시하고, 이 역치 이하의 기질 구성 성분이 검은색으로 표시된 동일한 절편의 2D 릴리프 이미지.
도 31: 유방암을 가진 15명의 환자의 종양으로부터의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시한 중간 55Mn 함량의 히스토그램. 각각의 회색 사각형은 단일 환자의 종양의 약 1,800 개 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. 상단 히스토그램은 HMR(55Mn)이 없는 네 가지 종양을 도시한다. 하단 히스토그램은 2배 중간값의 표준 T4 역치에서 결정된 HMR(55Mn)을 가진 11개의 종양을 나타낸다. 검은색 사각형은 11명의 환자의 각 종양에서 발견된 HMR(55Mn)의 중간값이다. HMR(55Mn) 값은 점선을 통해 그 종양의 벌크 중간 55Mn 값에 합류된다. 히스토그램 내 빈은 200 CC/S 단위이다.
도 32: 39세 여성으로부터 취한 유방의 잘 분화된 암에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지로, 조직 및 세포 형태를 도시한다. B. LA-ICP-MS 후 이 절편의 개별 복셀 내 55Mn 수준의 2D 릴리프 이미지. 높은 55Mn 함량의 연속적인 복셀의 다중 클러스터는 검은색 영역으로 나타낸다.
도 33: 도 32의 39세 여성과 다른 역치 기준을 사용하여 LA-ICP-MS를 통해 생성된 복셀 매트릭스 내 HMR(55Mn)의 분포 및 출현의 2차원 표현이지만, HMR(66Zn)는 출현하지 않았다. 네 개의 왼쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 다른 표준 역치 (T1, 0.5x 중간값, T2, 1x 중간값, T3, 1.5x 중간값, T4, 2x 중간값)에서 유방의 암종으로부터의 31x31 복셀 영역의 레이저 절단으로부터의 55Mn 데이터이다. 네 개의 오른쪽 패널 (T1, T2, T3 및 T4)은 동일한 31x31 복셀 영역의 레이저 절단 및 동일한 역치 기준으로부터의 66Zn 데이터이다. 각 패널의 어두운 복셀은 55Mn 또는 66Zn 값이 해당 패널에 대한 역치를 초과한 것이다.
도 34: 도 33의 2D 데이터가 제시된 39세 여성의 유방암 샘플 내 55Mn 및 66Zn 복셀 값의 분포 변화 분석. 패널 A는 Y 축 상의 특정 빈 내의 복셀 빈도와 X 축 상의 복셀 값을 가진 55Mn 복셀의 오른쪽 스큐 (Skew)를 나타낸다. 패널 B는 동일한 샘플로부터의 66Zn 복셀 값의 근사 대칭 분포를 도시한다.3
도 35: 48세 여성의 유방의 침윤성 도관 암종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지는 비균질적 조직 및 세포 형태를 도시한다. B. 상기 이미지의 주요 형태학적 특징의 설명; 림프관 (C1 ~ C5), 관련 지방 세포로 둘러싸인 정상 도관 (N) 및 다른 기질 성분과 같이 포함한 면역 세포의 농도 (면역) 내의 암세포를 나타낸다.
도 36: 상단 두 개의 패널은 도 35의 48세 여성의 유방의 침윤성 도관 암종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지로, 비균질적 조직 및 세포 형태를 도시한다. 하단 4개의 패널. 지방 세포를 포함하는 영역 및 기질 영역의 일부에서의 4개의 금속 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu의 차등 분포의 2D 릴리프 이미지.
도 37: 전립선 선암 및 8.1의 PSA를 가진 환자 X로부터의 임상 데이터의 도시는 약간의 유의성 변화를 나타내는 12개 영역 중 7개의 전립선의 상이한 영역의 비정상과 글리슨 등급 (Gleason score)에 의해 정의된 "암"을 가진 5개 영역은 7 보다 높지 않다 (상단 패널). B. 환자 X의 12 코어 천자 조직 검사(twelve core needle biopsie)의 관련 정도에 대한 진단 요약 (파트 A부터 파트 L까지).
도 38: 전립선 암을 가진 10명의 환자의 종양의 레이저 절단된 샘플 내 55Mn의 초당 교정 카운트 (CC/S)로 표시되는 중간 55Mn 함량의 히스토그램. 각각의 회색 사각형은 단일 환자의 종양으로부터의 약 1,800 개 복셀의 총 면적으로부터 계산된 중간값을 나타낸다. HMR(55Mn)은 본원에 적용된 2x 중간값의 표준 역치 조건 하에서는 존재하지 않는다.
도 39: 70세 남성, 환자 Y 뇌의 자기 공명 이미지. A. 약물 치료 및 방사선 치료 전에 뇌의 중막 주위의 왼쪽 두정엽의 조영 증강 병변의 존재 (화살표). B. 방사선 및 면역 치료의 약물 치료 이후 동일한 뇌 영역의 MRI. C. 뇌 스캔 전에 여러해 절제된 동일한 환자의 원발성 흑색종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편의 사진 이미지. D 및 E. 관심 영역의 높은 전력 그림은 LA-ICP-MS로 분석했다.
도 40: 환자 Y의 원발성 흑색종의 암세포의 5개 분리된 영역으로부터 55Mn의 교정된 신호 트랙 (화살표 ->). 선택된 각 영역 내 표준 35 미크론x35 미크론x5 미론 복셀의 6개의 연속적인 절단 트랙은 각각 19, 19, 13, 19 및 19 복셀의 트랙 길이를 갖는다. 55Mn에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치 값은 6개의 절단 열의 각각에 인접한 복셀 각각에 대해 나타낸다.
도 41: 상단 패널. 방사선 치료 전에 구강 내 편평 상피암을 가진 환자 Z. 하단 패널. 방사선 치료 6개월 후의 환자 Z.
도 42: 고형 종양을 가진 흑색종 환자에 대한 흐름도를 LA-ICP-MS로 분석하였다. 환자에게 방사선 치료를 권고할지 또는 그러한 양상을 사용을 삼가할지 의사에게 증거를 제공하는 선택적 경로는 ATI의 균질성 또는 이질성에 근거한다. 주요 결정 사항은 55Mn 복셀 값이 특정 지정된 역치보다 위 또는 아래로 떨어지는지, 및 금속 결합의 관점에서 종양의 멜라닌화 정도에 관계한다.
도 43: 고형 종양을 가진 비-흑색종 환자에 대한 흐름도를 LA-ICP-MS로 분석하였다. 환자에게 방사선 치료를 권고할지 또는 그러한 양상을 사용을 삼가할지 의사에게 증거를 제공하는 선택적 경로는 ATI의 균질성 또는 이질성에 근거한다. 주요 결정 사항은 55Mn 복셀 값이 특정 지정된 역치보다 위 또는 아래로 떨어지는지에 관계한다.
본 발명에 이르는 연구에서, 발명자는 많은 종양, 특히 흑색종의 2D 공간적 특성이, 예를 들어 비교 목적으로 도 1에 나타낸 바와 같이 크게 변한다는 것을 주목했다. 도 1은 T2aN0M0의 TNM 스테이징 기준에 따라 48세 남성의 경부의 스테이지 Ib 악성 흑색종에서 유래한 포르말린-고정 파라핀-포매된 (FFPE) 블록의 표준 5 미크론 H&E 염색 조직 절편을 나타내고, T2는 근육층의 침략을 나타내며; N0는 림프절 전이가 없는 것을 나타내고, M0는 원격 전이가 없음을 나타낸다. 이 절편의 오른쪽 상단은 옅은 무멜라닌 종양 세포로 구성되어 있는 반면, 도면의 왼쪽과 아래쪽의 어두운 영역은 진하게 염색된 멜라닌을 포함하는 세포로 구성되어 있고, 멜라닌의 더 큰 패치는, 세포 내 및 세포 외 모두 이미지의 아래 부분에 검은 점으로 나타낸다. 본원에서 전술한 바와 같이, 치료 양상을 결정하고, 방사선의 사용 여부에 대한 결정이 내려지는 종양의 병리학적 진단은 그러한 H&E 염색 슬라이드의 주관적 분석이다. 병리학적 진단은 또한, 하나의 종양 유형으로부터 다음 유형의 종양으로 변화하는 항체 패널을 가지는 그러한 조직 절편을 탐색함으로써 도움이 되지만, 그러한 결과 또한 주관적이고 정량적이지 않다. 본 발명까지는 치료법의 일부로서 방사선을 사용할지 여부를 결정할 때 종양 전문의가 도움을 주는 정량적 검사 또는 방사선에 대한 민감성 또는 내성을 예측하는 검사가 없었다.
특히, 란셋 종양학 위원회 (Lancet Oncology Commission)는 최근에 방사선 치료에 대한 세계적 접근을 확대하는데 관련된 문제에 대한 새로운 증거를 제시했다 (Atun et al., Lancet Oncology 2015, 16, 1153-1186). 이는 효과적인 암 치료 및 제어의 기본적인 요소로서의 방사선 치료를 강조하고, 일반적으로 방사선 치료가 차선책으로 사용되고 있다고 강조했다. 란셋 편집자는 방사선 치료가 다른 치료법보다 더욱 확장성이 있고, 효과적인 치료 및 완화 치료를 제공하는 독창적인 위치에 있다고 지적했다 (Coburn & Collingridge, Lancet Oncology, 2015, 16, 1143). 그러나, 개별 환자의 필요에 맞게 방사선 치료를 조정하는 데는 두 가지 지속적인 장애가 존재한다.
·첫째, 본 발명까지지는 아니지만, 주어진 환자에 있어서 주어진 종양이 주어진 방사선 치료 요법에 반응하는 정도를 측정하는 "정량적 검사"가 없었다.
·둘째, 방사선 치료 후에 종양이 재발할 가능성이 있는 정도를 측정하는 "정량적 검사"가 없었다.
본 발명까지는, 임상적 결정은 방사선 반응도을 결정하기 위한 정량적 특정이 아닌 의학 기술에 기초하였다.
어떤 특정 이론에 구애되지 않고, 발명자는 ATI가 방사선 반응도를 예측하는데 사용될 수 있다는 예상치 못한 발견에 대해 다음의 설명을 진행한다:
- 감마선 및 X-선과 같은 이온화 방사선은 물의 방사선 분해를 이끌어 박테리아, 조류, 곰팡이, 무척추동물세포, 또는 인체 내 수 백가지의 세포 유형, 또는, 암세포로 유도하는 섭동의 결과로서 발생하는 비정상적인 세포 유형이 되는 모든 세포에서 동일한 유형의 화학 물질을 형성하게 한다.
방사선 분해는 보편적으로 동일한 유형의 반응성 분자를 생성하고, 3개의 주요한 것이 존재한다;
- 하이드록시 라디칼 OH·, 슈퍼옥사이드 라디칼 O2 ·- 및 과산화수소 (H2O2) (Daly,M; Nature Reviews Microbiology, 7, 237-245. 2009).
조사되지 않은 정상적인 건강한 포유동물 세포에서, 동일한 3개의 분자는 또한 미토콘드리아 전자 전달 사슬을 통해 일어나는 정상적인 미토콘드리아 호흡 프로세스의 일부로서 형성된다. 산소가 전자의 완전한 보충보다 적게 받는다면 결과는 O2 ·- 및 H2O2의 형성이다. H2O2가 즉시 처리되지 않으면, 부유하는 Fe2 + 원자가 그것과 반응할 것이고, 매우 위험한 하이드록실 라디컬 OH·를 생성한다.
포유동물 세포에서, 슈퍼옥사이드 라디컬 O2 ·-는 미토콘드리아, 세포질 및 세포 외 효소 시스템, 즉 미토콘드리아에 위치한 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제인 MnSOD, 세포질 내의 구리-아연 슈퍼옥사이드 CuZnSOD 및 내피 세포에 우세하게 고정된 세포 외 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제인 ecSOD에 의해 처리된다.
H2O2는 카탈라아제 및 글루타티온 퍼옥시다아제에 의해 제거되어 물 및 산소 분자를 생성한다.
매우 위험한 하이드록실 라디컬 OH·는 효소학적 프로세스에 의해 처리되지 않는다. 높은 수준의 산화 대사의 결과 중 하나의 예는 포유동물의 뇌에서 일어나고, 이는 뇌 세포가 OH·로부터의 지질 과산화에 매우 취약하게 만든다.
본 발명자는 예를 들어, 망간과 같은 화학적 원소 및 원소의 수준이 방사선-반응도에 기여한다고 추론했다. 발명가는 10 Grey (Gy)의 전신 노출은 대부분의 척추 동물에게 치명적이지만, 데이노코쿠스 라디오두란스 (D. radiodurans ) 와 같은 일부 박테리아는 17,000 Gy를 초과하는 선량에도 생존한다는 것에 주목했다. 이를 달성할 수 있는 하나의 기여 메커니즘은 방사선 민감성 박테리아 종보다 150배 많은 망간 및 3배 적은 철 (Fe)을 축적한다는 것이다 (Daly,M; Nature Reviews Microbiology, 7, 237-245, 2009). 망간/철 비가 가장 높은 박테리아 종은 가장 방사선 내성이 강한 반면, Mn/Fe 비가 가장 낮은 박테리아 종은 과민 반응을 보인다. 방사선- 반응도의 기계적 토대는 망간 축적이 조사 중에 형성된 (O2 ·-)과 같은 수퍼옥사이드 라디컬로부터의 철-황 (Fe-S) 복합체로 단백질을 차폐한다는 것을 보여준다. 망간에 의한 이런 차폐는 철-황 함유 단백질로부터 철 이온 (Fe2 +)의 방출을 막아, Fe2 +와 과산화수소의 매우 유해한 상호 작용을 방지한다. Fe2 +가 H2O2와 반응하면 그 결과 하이드록실 라디컬 OH·를 생성하고, 이는 위험하며 거의 모든 유형의 생물학적 분자를 산화시킨다.
과산화수소와는 반대로, O2·-는 막을 쉽게 가로지르지 않으므로 세포 구획에 축적된다. 따라서, 팬톤 반응 (Fenton reaction)에 사용 가능한 Fe2 + 의 양을 최소화할 뿐만 아니라, O2 ·- 에로의 노출로부터 Fe-S 함유 단백질을 효과적으로 차폐할 수 있는 세포계는 조사 후의 손상을 최소화하고 방사선-내성을 높인다. 발명자는 박테리아 데이터에 의하면 망간 이온은 보호 금속이며, 심지어 고농도에서도 박테리아 세포에 거의 무해하고, 많은 세포 유형의 다세포 유기체에 잘 견딜 가능성이 높음을 추론하였다. 반대로, 망간이 적고 유리 철이 많은 박테리아 시스템은 단백질과 지질을 손상으로부터 보호할 가능성이 적으며, 팬톤 반응은 손상을 주는 OH·가 단백질과 지질의 손상과 세포의 사멸을 이끄는 수준을 증가시키고, 세포의 방사선-민감성임을 보증한다. 유사한 상황이 진핵 생물에 관계한다.
유리 철의 세포 내 가용성은 단백질 카르보닐화를 통한 불가역적 단백질 손상에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 효모에서, 카르보닐화 수준은 효모가 특정 철 저장 단백질이 결핍되면 증가하는데, 이의 상동체는 인간 미토콘드리아에 위치한 프라탁신 (frataxin) 단백질이다. 이러한 결함이 있는 효모 균주에 인간 페리틴의 도입은, 그러한 효모의 철 저장 능력을 부분적으로 회복시키고, 유리 철 수준을 감소시키며, 상승된 카르보닐화 수준을 저해한다. 따라서, 철 저장 단백질은 이온화 방사선에 따른 세포 손상을 예방하는 중요한 역할을 할 것으로 보인다.
비록 슈퍼옥사이드 라디칼 O2 ·-는 고도로 충전되었지만, DNA와 반응하지 않는다는 것을 알아야 한다. 오히려, 특정 단백질의 임의의 노출된 철-황 (Fe-S) 그룹이 선택된 표적과 반응한다.
요약하면, OH·는 모든 세포 성분에 극도로 손상을 주지만, 부수적인 손상은 수명이 짧기 때문에 형성 부위로부터 수 옹스트롬 (Angstrom)으로 제한된다. 반대로 H2O2는 세포 전체로 확산되어 Fe2 +와 반응하기 때문에, 알려진 가장 강력한 산화 반응 중 하나를 일으킨다. 이 반응은 더 많은 OH·를 생성한다. 박테리아 데이터는 이온화 방사선에 대한 반응도는 세포질 망간 농도 및 라디칼 제거, 유리 철 격리, 과산화수소 감소, 및 단백질 최소화 및 재생산과 관련된 효소학 등 여러 입력을 갖는 지속적인 생물학적 변수임을 나타낸다.
시험관내 시스템은 인간 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제가 슈퍼옥사이드 라디컬 O2 ·-를 H2O2 및 O2로 전환시키는 것을 입증하였다. 수많은 인간 시험관내 시스템에서 인간 MnSOD 단백질 수준 및 활성은 이온화 방사선에 대한 내성 증가와 관련이 있다. 마찬가지로, 세포 시스템에서 MnSOD 단백질 및 활성의 수준을 낮추면 결과적으로 방사선-내성이 감소한다.
따라서, 실험 및 대조군 세포의 유전적 배경이 일정하게 유지되고, 유일한 변수가 도입된 유전자, 이의 안티센스 생성물 또는 빈 벡터인 신중하게 통제된 실험 환경에서 미토콘드리아에 위치한 MnSOD 단백질이 이온화 방사선의 영향으로부터 세포를 보호하는 데 도움이 된다.
슈퍼옥사이드 라디컬 O2 ·-를 처리하는 인간 세포에는 단 3개의 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제가 존재하며, 이들 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제는 모두 상이한 세포 위치를 갖는다. 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 MnSOD는 미토콘드리아에 위치하고, 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 CuZnSOD는 시토졸 및 핵에서 발견되는 반면, 세포 외 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 ecSOD는 주로 내피 세포에 고정되어 있다. 3가지 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제는 이들 세 가지 상이한 위치에서 O2 ·-를 다룬다.
많은 관심이 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제스에 집중되어 왔지만, Mn 및 Cu와 같은 화학 원소의 기본 화학 및 생화학은 세포 내에서의 그들의 위치 및 용도가 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 특이성보다 훨씬 광범위하게 퍼져있으며, 예를 들어, Mn은 복합체 형성에 존재한다 (Daly et al., PLoS ONE, 5, e12570, 2010; Slade and Radman, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 75, 133-191, 2011).
도 2는 3개의 상이한 망간-결합체를 도시한다. 망간은 오르토인산염과 복합체를 형성하고 O2 ·-를 소거한다. 망간은 또한 과산화수소, 히드록실 라디컬 (OH·) 및 O2 ·-를 제거하고 분해하기 위해 유리 아미노산 또는 펩타이드와 복합체를 형성한다. 뉴클레오시드, 유리 아미노산 및 잡다한 유기 대사 산물은 히드록실 라디컬을 제거합니다 (Slade and Radman, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 75, 133-191, 2011).
철, 구리, 아연 및 망간과 같은 무기 금속은 단백질에 대한 촉매 보조 인자로서 가장 일반적으로 생각된다.
금속이 방사선-내성에 역할을 한다는 전술한 제안에도 불구하고, 본 발명에 이르기까지 망간은 정상에 비해 종양의 2D 암의 맥락에서 정량화되지 않아, 방사선-민감성/방사선-내성이 결정되고, 이어서 방사선 치료에 관한 의사 결정을 첫번째로 내리고, 두 번째로 방사선 치료 후 종양 재발의 가능성을 예측하는 데 활용된다.
본 발명을 수행하기 위한 모든 하드웨어 및 소프트웨어는 현재 상업적 및 임상적으로 이용 가능하다. 기술적 변화가 유용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백 할 것이다. 본 발명에 따른 분석을 위한 조직 절편, 세포 또는 세포 집단의 제조는 당업계의 임의의 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 염색되지 않은 조직 절편, 염색되지 않은 동결 절편, 또는 SurePath 시스템을 통해 단층으로 침착 된 세포는 당업계에 따라, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 제조된다. 당업계의 이용가능한 임의의 시스템, 예를 들어, SurePath 시스템이 소형 원형 영역의 슬라이드 상의 세포의 단층을 생성하고, 이러한 방식으로 제조된 물질은 LA-ICP-MS 방법에 적합할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 방법은 2D 무결성이 손실되지 않았다면 본 발명의 시험 샘플 및/또는 대조 샘플을 준비하는데 사용될 수 있다. 다수의 절단 트랙이 만들어 질 수 있으며, 예를 들어 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (LA-ICP-MS), 레이저 절단-비행시간-질량 분석법 (LA-TOF-MS), 유도 결합 플라즈마-광학 발광 분광법 (ICP-OES), 마이크로웨이브 플라즈마-원자 방출 분광법 (MP-AES), 레이저 유도 브레이크 다운 분광법 (LIBS), 2차 이온 질량 분석법 (SIMS), X-선 흡수 근처 엣지 구조 (XANES), 원자 흡수 분광법 (AA) 또는 X-선 형광법 (X-ray fluorescenc: XRF)이다.
단일 또는 다중 절단 트랙 내의 값이 모두 지정된 역치보다 높거나 낮은 경우, 병리학자의 검사를 필요로하지 않는다. 반대로, 컴퓨터 소프트웨어에 의해 플래그된 임의의 트랙에 대해, 동반 스테인드 슬라이드는 병리학자가 검사한다.
대안적으로, 슬라이드는 우선적으로 절단 트랙이 어디서 수행되어야 하는지를 지시하는 병리학자에 의해 먼저 검사된다.
단일 절단 트랙 (110 미크론 미만의 너비)는 약 70초 내에 종양 조직의 1 cm 트랙을 제거할 수 있다는 것을 알아야 한다. 이와 관련하여, 이후의 절단 분석을 위해 병리학자에 의해 위치하고 지정된 종양 샘플 또는 종양 내의 다수의 분산된 영역을 가로지르는 다수의 트랙이 현재의 기술로 수분 내에 실행될 수 있다.
레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (LA-ICP-MS)은 루비 레이저를 사용하는 Gray, Analyst, 110, 551-556. 1985에 처음 소개되었다. 이어서 고체 상태 Nd:YAG 및 엑시머-기반 레이저로 대체되었다. 전자의 사용은 Hare, D, et al., Analyst 134, 450-453. 2009에 기재되어있다 (작동 파라미터에 대해서는 Hare et al.의 표 1). 엑시머 레이저와 관련하여, 상기 빔은 영족기체 (noble gas) (아르곤, 크립톤 또는 크세논)와 염소 또는 불소와 같은 반응성 가스의 조합인 가스 혼합물에 의해 발생된다. 고압 및 전기 자극 하에서, 엑시플렉스 (exciplex)라고 불리는 가짜 분자 (XeCl, KrF 또는 ArF)가 생성되어 자외선에서 레이저 광을 발생시킨다.
LA-ICP-MS와 관련하여 널리 사용되는 엑시머-기반 시스템은 193 나노미터 파장을 생성하는 뉴 웨이브 엑시머 (New Wave excimer)에 결합된 Agilent 7700 ICP-MS이며,이 레이저는 Gunther et al., J. Anal. At. Spectrom.12, 939-944, 1977에 의해 처음 사용되었다. 자유 이온의 원소 분석은 뉴 웨이브 리서치 엑시머 193 레이저 절단 유니트 (New Wave Research Excimer 193 laser ablation unit) (Micro Wave Research Excimer 193 laser ablation unit)와 인터페이스로 연결되는, 예를 들어 ICP-MS 기기 Agilent Technologies 7700 시리즈를 사용하여 LA-ICP-MS에서 실행된다. 또한, 상기 ICP-MS 기기는 팔중극 충돌 (octopole collision)/반응 셀이 장착되어 있다. 다른 ICP-MS 기기는 또한 Thermofisher's iCAP™ Q ICP-MS, Perkin Elmer's Nexion Series, Shimadzu ICP-MS 2030 및 Tofwerk's ICP-TOF-MS를 포함하여 사용할 수 있다. ICP-MS 시스템 대신, ATI는 또한 유도 결합 플라즈마-광학 발광 분광법 (ICP-OES), 마이크로웨이브 플라즈마-원자 방출 분광법 (MP-AES), 레이저 유도 브레이크 다운 분광법 (LIBS), 2차 이온 질량 분석법 (SIMS), X-선 흡수 근처 엣지 구조 (XANES), 원자 흡수 분광법 (AA) 또는 X-선 형광법 (X-ray fluorescenc: XRF)과 같은 원자 방출 분광 기술로 결정될 수 있다.
초 고순도 (99.999 %) 수소 (H2)가 반응 가스로서 사용되는 반면에, 고순도 액체 아르곤 (Ar)은 캐리어 가스 및 플라즈마 공급원으로서 사용된다. LA-ICP-MS 시스템은 최대 감도와 낮은 산화물 형성을 보장하기 위해 NIST 612 Trace Elements in Glass를 사용하여 표준 모드와 반응 모드에 대해 매일 조정된다. 낮은 산화물 생산은 248/232의 단위질량 당 전하량 (m/z) (232Th16O+/232Th+를 나타냄)을 측정함으로써 보장되며, 일관되게 0.3% 미만이다. 이 기기는 매트릭스-매치 조직 표준을 사용하여 조직 분석을 위해 미세 조정된다.
LA-ICP-MS 시스템에 대한 통상적인 작동 파라미터가 하기에 주어지며, 명확하게 하기 위해, 이들은 7700 ICP-MS 및 레이저에 대해 개별적으로 나타낸다.
ICP-MS 파라미터
고주파 전력은 1250.0 Watt; 냉각 가스 유속은 15.0 ℓ/분; 캐리어 가스 유속은 1.2 ℓ/분이고, 샘플 깊이는 4 mm; 사중극 바이어스는 -3.0 볼트; 팔중극 바이어스는 -6.0 볼트; 체류 시간은 m/z 당 62 ms; 추출 렌즈 (1)은 5.0 볼트; 추출 렌즈 (2)는 -100.0 볼트이고, 수소 충돌 가스는 3.1 ㎖/분이다.
뉴 웨이브 193 엑시머 레이저의 파라미터
파장 193 ㎚; 반복 주파수 40 Hertz; 레이저 에너지 밀도 0.3 ~ 0.5 J/cm2; 스팟 직경 35 ㎛; 라인 간격 35 ㎛; 모니터 질량/전하 비 (m/z), 55(Mn), 56(Fe), 63(Cu) 및 66(Zn)이다. 래스터 속도는 140 ㎛/s (35 ㎛의 4배)이다.
요약하면, 특정 조직으로부터 염색되지 않은 절편의 유리 현미경 슬라이드는 절단 챔버에 위치하고, 고 에너지 레이저 빔 (가변 직경의)이 절편 위에 초점을 맞추고, 생물학적 물질의 일부는 레이저 빔으로부터의 에너지 전달의 결과로서 증발된다. 생성된 미립자 물질은 통상적으로 아르곤, 헬륨 또는 아르곤+헬륨 (본 발명의 일 실시양태에서 사용되는 시스템에서는, 아르곤) 인 캐리어 가스에 의해 유도 결합 플라즈마로 이동되고, 이 유도 결합 플라즈마는 섭씨 7,000도 초과, 섭씨 10,000도 이하에서 미립자 물질을 그 구성 원소로 원자화하고, 이온화한다. 충돌/반응 셀 (Tanner et al., Spectrochim . Acta. Part B, 57, 1361-1452, 2002)은 스펙트럼 간섭을 최소화하고, 산소:아르곤 종 (16O40Ar+) 과 같은 다원자 이온을 "제거"하고, 그렇지 않으면 56 신호로서 나타나 56Fe으로 잘못 표시된다. 역동적인 반응 셀에서, 간섭하는 다원자 이온은 더 높은 m/z에서 다른 종으로 전환되고 더 이상 타겟 이온에 간섭하지 않는다. 충돌 셀에서의 출현에 따라, 상기 이온은 사중극 질량 필터에 초점을 맞춰 그들의 m/z 비율에 의해 분리되고, 검출되고 정량화된다.
ICP-MS 시스템은 사중극 시스템 대신에, 이중 포커싱 섹터 필드 질량 분광계 또는 비행시간 (TOF) 분석기를 통합할 수 있다. ICP-TOF-MS는 초당 30,000개의 전체 질량 스펙트럼의 매우 높은 처리량 획득 용량을 가지고 있다 (Resano et al., Mass Spectrom. Rev. 29,-55-78, 2010).
현미경 슬라이드 상에 물질의 2D 원소 지도를 생성하기 위해, 레이저는 샘플을 가로 질러 좌우로, 한 번에 하나의 트랙을 위에서 아래로 래스터)하여 상기 트랙이 선택된 너비를 갖는다. 결과 이미지는 인접한 픽셀로 시각화되지만, 절단된 물질은 깊이가 있기 때문에, 각 픽셀은 조직의 체적, 복셀을 나타낸다.
본 발명이 다음의 이점을 제공한다는 것은 당업자에게 명백할 것이다:
a) 도입된 인공물을 피하기 위한 최소한의 샘플 준비;
b) 다-원소 데이터를 동시에 신속하게 추출할 수 있는 능력;
c) 종양 세포, 기질 세포, 비정상적인 혈관 구조, 전이성 면역 세포 및 콜라겐 번들과 같은 비-세포 물질의 관점에서 종양의 구조에 관한 2D 정보의 디콘볼루션 (deconvolution), 이들 모두는 종양을 구성하고 방사선 민감성의 하부 경계와 방사선 내성의 상부 경계 사이의 위치하고 충돌하는 상호 작용하는 환경을 형성한다.
d) 치료 양식, 즉 임의의 조직 또는 기관 유형의 이온화 방사선의 사용 또는 회피로 직접적으로 변환된다. 방사선 치료가 사용되는 경우, 본 발명은 종양 재발의 확률을 결정한다.
e) 이는 특정 유형의 종양에 대해 특이적이지 않다. 이는 임의의 종양, 국소화되거나 전이성, 양성 또는 악성 종양에 적용 가능하다. 이와 같이, 이는 팬-진단 (pan-diagnostic)이다. 예를 들어, 전립선-특이 항원 검사는 양성 또는 악성 종양의 존재를 나타내는 혈류 중의 단일 순환체를 측정하거나, 단순한 양성 전립선 과형성 또는 심한 운동을 측정한다. 이와 같이 필요로 한 치료적 개입의 유형을 제시하지 못한다. 또한, 남성에게도 특이적이다. 반대로, 본 발명은 성 또는 종양 유형의 특이성에 의해 제한되지 않으며, 따라서 비-소세포 폐암에 대한 타세바 (Tarceva)와 같은 특정 종양 유형에 대한 특정 항체 또는 약물을 개발할 필요가 없다.
f) 외부 빔 또는 이식된 "종자"일 수 있는 방사선은 모든 조직에 퍼지면서 혈관계를 통해 전달되는 저분자 약물, 화학 치료제 또는 항체 기반 생물학적 제제와는 달리 국소화된 해부학적 영역으로 전달되고, 언제나 정상 조직에서 부정확한 영향을 가지고 있으며, 각질화를 유도하는 흑색종의 베무라페닙 (vemurafenib)과 같은 다양한 수준의 독성을 일으킨다.
g) 본 발명은 직접적이다. 샘플을 위한 여러 준비 단계와 관련하여 중간 단계가 없다. 이 분석은 PCR과 같은 프로세스에서 신호 증폭에 의존하는 방법에 내재 된 잠재적인 편향에 의해 혼동되지 않으며, 이러한 과정에서 일반적으로 사용되는 효소는 상이한 서열의 차동 증폭율을 통해 체계적인 편향을 도입할 수 있다. 혼성화 및 증폭 신호 측정의 다양한 특이성을 가진 조직 절편에 대한 항체의 혼성화는 없다. 본 발명은 다중 단계 프로세싱의 결과로서 발생하는 왜곡 없이 샘플 내의 것을 측정한다.
h) 측정이 이루어질 수 있는 7차 선형 동적 범위가 있다. 범위 및 선형성 모두 독립체의 변환 또는 증폭을 필요로 하는 종래 기술의 방법에 의해 잠재적인 오류를 유발하지 않으면서 세포 집단에서 입자 존재량을 실제로 측정할 수 있기 때문에 중요하다.
본 발명은 특히 질병 상태, 줄기세포 및 유도 세포 집단의 분화 상태, 세포 상태에 대한 약물 치료의 영향의 검출 또는 측정, 및 세포 상태의 정확한 표시가 유용한 임의의 다른 상황의 검출에 특히 적합하다.
본 발명은 이제 특정 조성물 및 사용 방법을 기술하는 특정적이지만, 비 제한적인 예를 참조하여 더욱 상세히 기술될 것이다. 그러나, 특정 과정, 조성물 및 방법의 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 개념에 대한 광범위한 설명에 대한 제한으로서 어떤 식으로든 이해되어서는 안된다.
실시예 1
조직 표준 제조
표준화 및 교정 실험은 매트릭스-매칭 조직 표준의 30 μm 두께 절편을 사용하여 실행하였다. 이러한 표준은 임의의 지방 또는 결합 물질을 제거한 닭 가슴 조직으로 제조하고, 폴리카보네이트 프로브 (Kelly Scientific, North Sydney, New South Wales, Australia)가 장착된 OmniTech TH 조직 균질기를 사용하여 부분적으로 균질화한 후, 표준 Ca, Mn, Fe, Co, Cu 및 Zn 용액으로 스파이크시켰다. 용액은 1% HNO3 (Choice Analytical, Thornleigh, New South Wales, Australia)에 용해된 고순도 (최소 99.995%)의 가용성 염화물, 황산염 또는 질산금속염 (Sigma-Aldrich, Castle Hill, New South Wales, Australia)을 사용하여 제조하고, ca. 100,000 μg mL-1 및 10,000 μg mL-1의 농도로 희석하였다. 그런 다음, 닭 가슴살의 분액은 각 성분의 농도를 다양하게 하여 첨가하고 5분 동안 저속으로 균질화시켰다. 각각의 균질화된 조직 표준의 6 ca. 250 mg 분액을 Milestone MLS 1200 밀폐 용기 마이크로파 다이제스터 (Kelly Scientific)에서 5:1 Seastar Baseline grade HNO3/H2O2 (Choice Analytical)로 분해시키고, 용액 ICP-MS로 분석하여 조직 표준 중의 각 원소의 농도 및 균질성을 확인하였다. 스파이크된 조직을 동결시키고, 30 μm 절편으로 절단하여 분석을 위해 유리 현미경 슬라이드에 두었다. 이 방법론은 5 미크론으로 절단한 절편에 간단하게 적용할 수 있으며, 일부는 각 종양 슬라이드에 추가된다.
교정 및 백그라운드 분석
제조된 매트릭스-매칭 조직 표준은 LA-ICP-MS를 실행하기 위한 후술하는 조건하에서 분석물의 민감도 표준화를 위한 검정 곡선을 구성하는데 사용되었다. 조직의 절단 전에 10초 동안의 데이터를 수집하여 가스 블랭크로부터 각 m/z에 대한 백그라운드 신호를 얻었다. 이 방법론은 다른 종양의 다른 실행 사이를 비교하는데 사용되었다. 예를 들어, 2K 교정 카운트/초가 달성되었다.
민감도 역치
방사 민감성 제어의 평균 및 중간값 또는 임의의 종양 유형으로부터의 경험적으로 결정된 값에 대한 표준 편차로서의 역치를 앞에서 기술한 것으로 설정하는 대안적인 방법은, 예를 들어, 도 11의 상단 히스토그램의 고환 샘플을 분석함으로써 민감도 역치를 설정하고, 역치는 히스토그램의 백분율로 정의된다. 예를 들어, 도 11의 생식세포종 (seminomas)은 55명의 환자로부터 유래되었으며, 이들 환자의 41/55는 75% 역치 이하로 떨어지는 히스토그램의 75%를 구성하고, 이 모든 환자는 방사선에 민감하다. 다음으로, 47/55명의 환자가 히스토그램의 85%를 구성하고 방사선에 민감하다. 마지막으로, 52/55명의 환자가 히스토그램의 거의 95%를 구성하지만 이를 벗어난 값의 환자의 일부는 어느 정도 방사선에 내성이 있을 수 있다. 히스토그램의 비율을 나타내는 이러한 백분율 수치는 방사선-반응도를 위해 선택할 수 있는 가변적인 역치를 표현하는 또 다른 방법이다.
실시예 2
일 실시예에서, 본원에 기술된 바와 같이 현미경 슬라이드상의 정상 뇌 조직 절편을 레이저 절단하고, 그의 금속 함량을 LA-ICP-MS 시스템으로 분석하였다.
도 3A는 정상 피질 조직의 특성을 보여주는 50세의 인간 여성으로부터의 정상 인간 피질 블록의 H&E 염색된 5 미크론 조직 절편을 나타낸다. 이 도면은 동일한 블록에서 인접한 염색되지 않은 절편에서 수행되었지만 다른 슬라이드에서는 수행되지 않은 3-트랙 절단 (더 큰 멀티 트랙 조직 절제에서 가져옴)의 위치를 나타낸다. 도 3A에 나타낸 H&E 염색 영역은 다른 슬라이드에서 LA-ICP-MS에 의해 분석된 동등한 염색되지 않은 영역에 해당한다. 염색되지 않은 5 미크론 조직 절편을 동일한 블록에서 절단하고, 상술한 자세한 작동 매개 변수를 사용하여 Agilent technologies 7700 LA-ICP-MS 시스템을 사용하여 레이저로 절단하고 분석하였다. 염색되지 않은 조직 절편은 일반적으로 염색, 염색 용액 또는 가공중 용기에서 침출되는 임의의 화학 원소의 도입을 피하기 위해 사용된다. 염색된 절편도 사용될 수 있다.
별개의 현미경 슬라이드 상에 염색되지 않은 물질의 원소 지도를 생성하기 위해, 레이저는 슬라이드를 가로 질러 측면으로 래스터시키고, 위부터 아래까지 한번에 하나씩 절단 트랙한다. 일반적으로, 이는 조직 샘플의 크기에 따라 수백 개의 수평 트랙을 생성하고, 각 트랙의 너비는 35 미크론이다. 횡방향 해상도는 사극 질량 분석기의 노출 시간의 함수이고, 이 데이터 세트에서 35 미크론의 분해능을 제공하도록 선택되었다. 전체 이미지는 35 미크론 픽셀에 의해 35 미크론 기본 단위로 구성되어 생성되었다. 조직 절편이 5 미크론 두께이기 때문에, 각 픽셀은 35 x 35 x 5 체적의 조직, 즉 6125 입방 미크론의 복셀을 나타낸다. 각 절삭 트랙이, 예를 들어 70개의 복셀로 구성된 50개의 수평 트랙의 절삭은 3500개의 복셀로 구성된 2D 이미지를 생성하였다.
55Mn, 66Zn 및 56Fe 3개의 금속 각각의 교정된 신호가 결정되었다. 결과는 트랙당 절삭된 70개의 복셀의 조직 절편으로부터 3개의 연속한 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타낸다(도 3B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 3,409, 6,651 및 441,317이다. 63Cu의 측정은 기술적 이유로 인해 이용할 수 없었다.
이들 미가공 데이터는 도 3C에서 그래프 형태로 나타나며, 여기서 각 트랙은 70개의 복셀로 구성된다. 도 3C는 3개의 절삭 열의 각각에 인접한 복셀에서의 3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe에 대한 초당 교정 카운트 CC/S의 미가공 수치의 그래프를 나타낸다. 염색되지 않은 5 미크론 조직 절편을 동일한 블록으로부터 절단하고, Agilent technologies 7700 LA-ICP-MS 시스템을 사용하여 레이저로 절단하고 분석하였으며, 자세한 작동 매개 변수는 하기에 설명하였다.
슬라이드 상의 염색되지 않은 조직 절편을 가로지르는 레이저 래스터로서, 각 금속에 대한 값은 백그라운드 수준에서 그들의 조직 샘플의 특성으로 변한 후, 다시 백그라운드 값으로 돌아간다. 값의 변화는 일반적으로 염색된 조직 절편에서 보이는 종양 구조의 형태학적 변화 및 변형를 따른다.
본 실시예에서, 상단 패널의 미가공 자유 이온 망간값은 절삭 열 2에서 복셀 55에 스파이크가 있음을 밝혔으나, 연속하는 8개의 복셀 중 어느 것도 중간값으로부터 큰 편차를 보이지 않는다 (도 3B의 데이터로부터 알 수 있음). 개별 복셀에 대한 이러한 큰 단일 스파이크는 기계적 "지터(jitter)"로 인한 것이며, 이러한 스파이크는 거의 항상 중간값에서 3 표준 편차 이상이다. 미가공 데이터 표시의 목적을 위해 여기에 나타내었지만, 이들은 기계적 "노이즈"를 나타내기 때문에 통계적 분석 전에 제거된다. 이들이 데이터 분석의 일부로 남아 있더라도 중간값과 같은 중요한 결과에 대한 영향은 미미하다.
실시예 3
대비되는 방사선 내성 및 민감도를 갖는 신생물 샘플
전술한 바와 같이, Lancet Oncology Commission은 방사선 치료를 효과적인 암 치료 및 제어의 기본 요소로 강조하였고, 일반적으로 이를 차선적으로 사용하고 있다 (Atun et al., Lancet Oncology 2015, 16, 1153-1186. 본 발명에 이르기까지, 임상적으로 허용되는 규범은 교모세포종, 중피종 및 흑색종과 같은 일부 종양 유형이 대부분 방사선 내성인 반면, 대부분의 림프종, 폐의 소세포종양 및 전형적 정상피종인 고환 종양은 방사선에 민감하다. 유방암 및 전립선암과 같은 다른 주요 종양 유형은 일반적으로 "중간" 방사선-반응도으로 생각되지만, "중간"은 상황에 따라 다르며 결정하기 어렵다. 임상 현실은 방사선 치료 단독으로 박멸할 수 있는 원발성 암의 백분율과 필요한 용량, 절제 방사선 치료에 대한 다양한 전이 교훈의 감수성 비율과 관련된다. 따라서 대형 정상피종 및 림프종 종괴는 방사선 치료로 쉽게 박멸되지만, 육종과 췌장암은 투여량에도 불구하고 거의 박별되지 않는다. 또한, 방사선 치료는 일부 "저/중간" 위험의 전립선암 및 뼈로의 일부 전립선암 전이의 경우 "치료제"로 간주되므로, 이러한 전립선암은 확실히 방사선 민감성으로 분류할 수 있다.
상기한 임상적 변화를 고려하여, 최초의 3종은 방사선 내성에 대한 북엔드(bookend)를 제공하고, 두 번째의 3종은 방사선 민감성에 대한 북엔드를 제공하기 때문에, ATI를 평가하기 위해 6종의 종양 유형을 선택하였다. 그러나, 이러한 6종의 종양 유형 각각에서도 예상되는 방법으로 방사선 치료에 반응하지 않는 소수가 존재한다는 것이 임상적으로 인정된다. 이는 본 발명 전에 사용된 방법, 예를 들어, H&E 염색 병리학적 물질의 낮은 분해능 및 임의의 종양 유형 내 분류학의 병리학자 간의 상당한 불일치 때문이다. 포르말린-고정 파라핀-포매 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 조직 절편의 항체 염색을 추가한 경우에도, 종양 유형 내의 변형의 해석은 주관적이며, 병리학자 간의 일치는 가변적이다 (Elmore et al., JAMA, 313; 1122-1132. 2015).
흑색종은 맞춤 방사선 치료의 문제점을 예시한다. 역사적으로 초기의 세포 배양 연구와 생존 곡선의 분석에서 비롯된 인식은 본질적으로 방사선-내성이 있는 것으로 간주되었다. 이러한 믿음은 최근 흑색종 환자에서 40년 동안의 방사선 치료의 임상적 사용 데이터를 토대로 평가되었다 (Mahadevan et al., Oncology, 29, (10): 743-751, 2015). 더 새로운 해석은 흑색종의 방사선-반응도이 다양하다는 것이다. 이는 Burmeister에 의해 정확히 요약되었다. "나는 25년 이상 흑색종에 대한 연구를 해왔고, 어떻게 일부 환자들에서 병이 사라지고, 다른 환자들에서 당신을 비웃고 몇 주 또는 몇 달 만에 환자를 죽이는 것인지에 대해 여전히 놀란다... 각각의 환자의 이 병의 행동에는 놀라운 변화가 있다"
본원에 제시된 원자 데이터가 밝혀지면서, 처음으로 (i) 흑색종 환자 (뿐만 아니라 다른 유형의 종양)는 방사선 치료에 적합한 후보가 되는 정량적 토대이고,(ii) 방사선 치료 후에 암이 재발할 가능성이 있는 환자를 결정하기 위한 정량적 기준이며, (iii) 종양 변이에 대한 측정 가능한 근거이다. 또한, 이러한 이질성은 흑색종에만 국한되지 않는다는 점에 유의해야 한다. 유방암과 전립선암 환자 및 종양도 여러 수준에서 이질적이며 하나는 방사선 치료에 대한 이들의 반응이다.
1. 방사선 내성 종양
또 다른 실시예에서, 임상 스펙트럼의 방사선 내성 말단에 있다고 여겨지는 신생물의 금속(metallomic) 값을 분석하였다. 예를 들어, 임상적 스펙트럼의 방사선 내성 말단에 있다고 여겨지는 치명적인 뇌종양인 다형성 교모세포종을 실시 예 2에 기재된 바와 같이 분석하였다. 이 예는 정상 및 신생물 샘플 모두 동일한 슬라이드 상에 존재하고 동일한 실험 실행 조건하에서 동일한 LA-ICP-MS 시스템으로 평가될 때, 뇌종양의 금속 값이 정상 뇌 조직의 값과 어떻게 다른지 나타낸다.
도 4A는 다형성 교모세포종으로 분류된 뇌종양을 가진 19세 인간 여성의 블록으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다. 도면에 나타난 H&E 염색 영역은 다른 슬라이드 상에서 LA-ICP-MS로 분석한 동등한 염색하지 않은 영역에 해당한다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 68개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 4B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 3,198, 5,066 및 219,905로 나타났다. 다형성 교모세포종을 가진 인간 여성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속, 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 4C에 나타내었다.
다형성 교모세포종을 가진 동일한 인간 개체의 동일한 블록으로부터 취한 상이한 절편 간 변화를 측정하기 위해, 동일한 슬라이드 상에서 2개의 염색되지 않은 영역을 동일한 기계를 작동하여 LA-ICP-MS로 분석하였다. 그 결과를 도 5A, 5B 및 5C에 나타내었다.
도 5A는 도 4에 나타낸 다형성 교모세포종 가진 19세 인간 여성의 동일한 블록의 상이한 영역으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 69개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 5B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 2,980, 4,155 및 190,127로 나타났다. 다형성 교모세포종을 가진 인간 여성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속, 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 5C에 나타내었다.
이러한 결과는 동일한 개체의 동일한 블록으로부터 취한 상이한 조직 절편에 대해, 동일한 LA-ICP-MS 기계 작동에서 백그라운드를 뺀 중간값의 교정된 초당 카운트의 변화가 우수함을 입증한다. 55Mn에 대한 CC/S 값은 3,198 및 2,980이고; 66Zn에 대한 CC/S 값은 5,066 및 4,155이고; 56Fe에 대한 CC/S 값은 각각 219,905 및 190,127이었다.
다음 예는 상이한 신생물에 관한 것이며, 이는 또한 임상 스펙트럼의 방사선 내성 말단에 있다고 여겨진다. 이 예는 중피 혈관 기원의 신생물이며, 복강 내 악성 중피종이 있는 60세 남성으로, 그 특징은 도 6A, 도 6B 및 도 6C에 나타내었다.
도 6A는 악성 중피종을 가진 60세 인간 남성으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
4개의 금속 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 67개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 6B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 4,522, 8,805, 112,772 및 1,097로 나타났다. 악성 종피종을 가진 60세 인간 남성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 4개의 금속, 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 6C에 나타내었다.
또 다른 예는 상이한 신생물에 관한 것이며, 이는 또한 임상 스펙트럼의 방사선 내성 말단에 있다고 여겨지며, 식도 악성 흑색종 (스테이지 IIa, T3N0M0)을 가진 50세 남성에게서 유래한다. 금속 특징은 도 7A, 도 7B 및 도 7C에 나타내었다.
도 7A는 식도의 악성 흑색종을 가진 50세 남성으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 68개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 7B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 10,565, 6,961 및 121,495로 나타났다. 식도의 악성 흑색종을 가진 인간 남성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속, 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 7C에 나타내었다.
일부 흑색종에서 정상 조직 및 다른 신생물에서보다 복셀들 간 금속 함량이 훨씬 더 다양함을 유의해야 한다. 이러한 증가의 주요 원인 중 하나는, 멜라닌 분포 중의 세포 내 및 세포 외 이질성의 존재이며, 이는 상이한 화학 원소, 특히 금속에 대한 저장 능력을 가지는 독립체이다. 이 형태학적 이질성은 48세 남성 (도 1)의 목의 스테이지 Ib 악성 흑색종으로부터의 H&E 염색 절편의 일부가 이 출원에 제시된 첫 도면에 명확히 보인다. 동일한 종양 내에, 무멜라닌 계 (amelanotic lineage)와 고도로 멜라닌화된 별도의 영역이 있다. 이 종양의 금속의 특성은 본원에서 추가로 기술된다 (실시예 5 참조).
2. 방사선 민감성 종양
임상 스펙트럼의 방사선-민감도 말단에 있다고 여겨지는 3종의 상이한 신생물 유형의 특성을 이제 설명할 것이다. 이들은 확산성 B-세포 림프종, 폐의 소세포암 및 고환 종양이다.
림프종 : 임상 스펙트럼의 방사선 민감성 말단에 있다고 여겨지는 신생물의 첫 번째 예는, 고환에 확산성 B-세포 림프종을 가진 57세의 남성에게서 유래한다. 이의 금속 특성은 도 8A, 8B 및 8C에 나타내었다.
도 8A는 확산성 B-세포 림프종을 가진 57세 남성으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 79개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 8B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 776, 18,892 및 247,923로 나타났다. 고환에 확산성 B-세포 림프종을 가진 57세 인간 남성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 8C에 나타내었다. Y 축은 해당 금속 이온의 초당 교정 카운트 (CC/S)를 나타내고, X 축은 3개의 절삭 트랙의 복셀 수를 나타낸다.
악성 종양: 임상 스펙트럼의 방사선 민감성 말단에 있다고 여겨지는 신생물의 두 번째 예는, 소세포 미분화의 악성 폐암 (스테이지 IIIb, T4N1M0)을 가진 38세의 남성에게서 유래한다. 이의 금속 특성은 도 9A, 9B 및 9C에 나타내었다.
도 9A는 소세포 미분화의 악성 폐암을 가진 38세 남성으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 65개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 9B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 1,749, 4,836 및 88,317로 나타났다. 소세포 미분화의 악성 폐암을 가진 38세 남성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 9C에 나타내었다.
정상 피종 (Seminoma): 임상 스펙트럼의 방사선 민감성 말단에 있다고 여겨지는 신생물의 세 번째 예는, 정상 피종을 가진 52세의 남성에게서 유래한다. 이의 금속 특성은 도 10A, 10B 및 10C에 나타내었다.
도 10A는 정상 피종을 가진 52세으로부터의 대표적인 H&E 염색 5 미크론 조직 절편을 나타낸다.
3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 각각의 교정된 신호가 결정되고, 트랙당 79개의 복셀을 절제한 조직 절편으로부터 3개의 인접 절삭 트랙의 각 복셀에 대해 나타내었다 (도 10B). 이들 금속에 대한 복셀 당 백그라운드를 뺀 중간값은 초당 교정 카운트로 표시되고, 각각 1,565, 13,528 및 52,115로 나타났다. 정상 피종을 가진 52세 남성으로부터의 3개의 절삭 열 각각 내의 인접한 복셀 중 3개의 금속 55Mn, 66Zn 및 56Fe 에 대한 초당 교정 카운트의 미가공 수치의 그래프를 도 10C에 나타내었다.
상기 실시예는 임상 스펙트럼의 방사선 내성 말단 (교모세포종, 중피종 및 흑색종)에 있는 세 가지 유형의 신생물, 및 임상 스펙트럼의 방사선 민감성 말단 ( (B-세포 림프종, 소세포 폐암 및 고환 종양))에 있는 세 가지 유형의 신생물의 금속 특성을 입증한다.
실시예 4
환자 코호트에 LA-ICP-MS 방법의 적용
상기 실시예는 암 환자의 각 카테고리에서 단일 개체의 금속 특성을 입증하지만, 정상 피종 55명, 림프종 10명, 소세포 폐암 20명, 흑색종 64명, 다형성 교모세포종 또는 성상 세포종 25명 및 중피종을 가진 10명의 개인에 대한 심층 분석은, 이들의 총 망간 함량과 이들 암 유형의 방사선 치료의 임상 결과에 대한 이분법이 결정되었고, 이는 도 11에 나타내었다. 고환암(정상 피종), 림프종, 소세포 폐암, 중피종, 뇌 (다형성 교모세포종 및 성상세포종) 및 흑색종의 암을 가진 환자의 총 망간 자유 이온 함량 (초당 교정 된 카운트로 표시, 55Mn의 CC/S) 이 결정되었으며, 표시되었다. 각 사각형은 두 명의 흑색종의 경우를 제외하고는 64명의 환자 중 2명이 그들의 종양 내에서 2개의 주요 계통을 가지고, 각 계통은 사각형의 히스토그램에서 개별적으로 나타내었다.
수용된 임상 상황은 정상 피종, 림프종 및 소세포 폐암의 약 85%가 방사선에 민감하기 때문에, 종양의 큰 감소 및 때로는 완전 제거 결과를 가져 오며 기대 수명을 증가시킨다. 이러한 값과 일치하여 본원에서 결정된 바와 같이, 정상 피종 환자의 89%, 소세포 폐암 환자의 80% 및 림프종 환자의 90%가 2,000 CC/S 미만의 총 종양 망간 함량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여, 이는 2,000 CC/S의 역치 미만의 값을 가지는 방사선-민감도 종양의 상관 관계를 최초로 입증한 것이다.
상기와 대조적으로, 방사선에 큰 내성을 가진다고 여겨지는 3종의 종양 (중피종, 다형성 교모세포종, 성상세포종 및 흑색종)은, 그것에 선택적으로 민감한 비율을 가지므로 다른 결과를 나타낸다. 이 3종의 종양 유형 각각의 변화가 크게 증가했을 뿐만 아니라, 중피종의 90%, 다형성 교모세포종의 85%, 성상 세포종 및 흑색종의 59%가 2,000 CC/S 망간 값 이상으로 떨어진다.
상기 이분법을 감안하면, 금속 함량, 예를 들어, 종양의 망간 함량은 본 발명에 이르기까지 실제 임상 치료의 관점에서 단순히 이전에는 인식되지 않았던 방사선 치료에 대한 중요한 지표가 된다. 35 미크론 픽셀을 사용하는 이러한 예에서, 총 망간 함량이 낮은 종양을 가진 환자 (예: 2,000 CC/S 미만)는 방사선 치료로 인해 유익할 가능성이 높지만, 망간 함량이 높은 종양을 가진 환자 (예: 현저한2,000 CC/S 이상)는 방사선 치료를 피함으로써 이득을 볼 것이다. 픽셀 크기가 증가함에 따라, CC/S는 증가할 것이고, 따라서 더 높은 역치가 고려된다. 값의 범위가 선형 내에서 잘 유지됨에 따라, 문제가 되는 통계적 이슈는 없다.
암 환자의 대다수가 종양 특성과 관련된 정량적 데이터보다는 의학적 기술에 기초한 방사선 치료를 받는다는 것을 감안하면, 그러한 데이터는 예를 들어, LA-ICP-MS를 사용하여 임상적 실용성에 대한 정량적 데이터의 사용을 지원한다. 의학적 기술은 방사선 치료 단독으로 박멸될 수 있는 원발성 암의 비율과, 이를 실행하는데 필요한 투여량 뿐만 아니라, 방사선 투여에 대한 다양한 전이성 병변의 감수성 비율과 관련된다. 인구-기반 접근법으로서, 특정 환자의 종양에는 적용되지 않으며, "맞춤 의약"이 아니다.
통계 분석
2가지 샘플의 비모수적 (nonparametric) Kolmogorov-Smirnov (K-S) 테스트는 2개의 데이터 세트의 누적 분포를 비교한다. 귀무가설은 두 데이터 세트가 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
상기 데이터로부터, 고환암 (정상 피종) 대 림프종에 대한 값의 분포를 비교하여 0.2182의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.762 였다; 정상 피종 및 림프종은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
고환암 (정상 피종) 대 소세포 폐암에 대한 값의 분포 비교는 0.3182의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.081 이었다; 정상 피종 및 소세포 폐암은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
소세포 폐암 대 림프종에 대한 값의 분포 비교는 0.5000의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.3000 이었다; 소세포 폐암 및 림프종은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
결론: 정상 피종, 림프종 및 소세포 폐암으로부터의 데이터는 통계적으로 유효한 단일 그룹을 나타내었다.
뇌암 (교모세포종 및 성상세포종) 대 중피종에 대한 값의 분포 비교는 0.3250의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.371이었다; 뇌암 및 중피종은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
뇌암 (교모세포종 및 성상세포종) 대 흑색종에 대한 값의 분포 비교는 0.2226의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.277이었다; 뇌암 및 중피종은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
흑색종 대 중피종에 대한 값의 분포 비교는 0.4303의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.056이었다; 흑색종 및 중피종은 유의한 차이가 없었으며 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
결론: 뇌암, 중피종 및 흑색종은 통계적으로 유효한 단일 그룹이다.
그룹 간 비교
고환암 (정상 피종) 대 뇌암에 대한 값의 분포 비교는 0.7712의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 정상 피종 및 뇌암은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
고환암 (정상 피종) 대 중피종에 대한 값의 분포 비교는 0.8455의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 정상 피종 및 중피종은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
고환암 (정상 피종) 대 흑색종에 대한 값의 분포 비교는 0.6879의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 정상 피종 및 흑색종은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
림프종 대 뇌암에 대한 값의 분포 비교는 0.7750의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 뇌암은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
림프종 대 중피중에 대한 값의 분포 비교는 0.9000의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 중피중은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
림프종 대 흑색종에 대한 값의 분포 비교는 0.6727의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 흑색종은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
소세포 폐암 대 뇌암에 대한 값의 분포 비교는 0.7333의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 뇌암은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
소세포 폐암 대 중피종에 대한 값의 분포 비교는 0.9000의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 중피종은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
소세포 폐암 대 흑색종에 대한 값의 분포 비교는 0.6273의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의한 P 값은 0.000이었다; 림프종 및 흑색종은 유의한 차이를 가지며, 상이한 분포를 갖는 집단으로부터 표본 추출되었다.
결론: 정상 피종, 림프종 및 소세포 폐암은 뇌암, 중피종 및 흑색종의 단일 그룹과는 통계적으로 구별되는 단일 그룹임이 밝혀졌다.
통계 분석에 의하면, 림프종, 소세포 폐암, 뇌암 및 중피종은 정규 분포로부터 유도된 것으로 나타났지만, 흑색종 및 정상 피종은 그렇지 않으며, 둘 다 정규 분포 또는 로그 정규 분포를 따르지 않는다.
Kolmogorov-Smirnov 테스트를 이용한 통계 분석은 도 11에 도시된 흑색종 값의 분포가 정규 분포 또는 로그 정규 분포를 모두 따르지 않음을 나타낸다. 이후 예에서 볼 수 있듯이, 흑색종은 멜라닌의 세포 내 및 세포 외 침착물, 여러 금속에 결합하는 폴리머의 이종(heterogeneous) 세트, 그리고 많은 흑색종 내에 분포하는 높은 금속 영역 (HMR)의 존재에 의해 증가되는 이질성을 나타낸다. 이러한 HMR은 이 출원에 기재된 기술로 인해 처음으로 발견된 숨겨진 원자 변화의 원천이다. 그러한 영역은 통상적인 병리학적 검사로는 검출 할 수 없다.
도 11의 정상 피종은 2개의 집단으로 구성되고, 하나는 개체의 대부분을 구성하는 작은 분산이고, 다른 하나는 보다 다양하며 2K에서 4K CC/S까지 확장한 것일 수 있다. 도 11의 정상 피종의 대부분은 방사선에 대한 우수한 반응을 가지는 임상 그룹에 해당할 가능성이 있는 반면, 나머지 서브그룹은 비교적 보다 방사성 내성이다. 이 발견은 임상 데이터 (아래)와 일치한다. 또한, 도 11에 도시된 정상 피종은 병리학적 맥락에서, 이른바 "고전적" 정상 피종인 단일 그룹이다. 이러한 외형적으로 나타나는 형태학적 동질성에도 불구하고, 금속 분석은 종래의 분석에서 숨겨져 있는 근본적인 이질성을 밝혀냈다.
1. 고환암
고환 종양의 경우, 주요 부분은 고환 생식 세포 종양 (GCT)이 정상 피종 및 비 정상 피종의 두 개의 큰 카테고리로 분류되며, 비교적 세미 양 종양 및 비 종양 두 개의 큰 카테고리로 분류되어 비교적 간단하다. 고환 "암"을 앓고 있는 환자의 경우, 약 50%가 정상 피종으로 진단된다. 이 중 약 85%는 스테이지 I의 질환이고, 나머지는 임상 스테이지 IIA 및 IIB 질환이다. (스테이지IIA 및 스테이지 IIB의 구분은, 전자는 림프절이 2 cm 이하이고, 후자는 2 내지 5 cm 이다).
고환 정상 피종에 대한 수술 후 방사선 치료는 반세기 이상 동안 보조 치료의 중심이였다. 정상 피종은 방사선에 가장 민감한 종양 유형 중 하나로, 스테이지 1 고환 정상 피종의 임상 시험은 2주 동안 10회 분량으로 주어지는 20 Gray의 치료 투여량이 5년에 거의 98%의 치료율을 유도하기에 충분함을 밝혔다 (Jones et al., Journal of clinical Oncology, 23, 1200-1208, 2005; Medical Research Council Trial TE18/European Organisation for the Research and Treatment of Cancer Trial 30942 (ISRCTN18525328)). 이 방사선량은 다발성 교모세포종과 같은 높은 등급의 신경교종에서는 전체 생존율이 수개월만 증가하는 60 Gy (최대 90 Gy)와 비교된다.
초기 단계의 정상 피종의 극도의 방사선-민감도이 잘 기술되어 있으며, 침윤성 형태의 암의 전구체인 고환 상피성 신생물에 대한 투여량 감량은 13 Gy 정도로 낮다 (Sedlmayer et al., Int J Radiat. Oncol. Biol. Phys. 50, 909-913, 2001; Classen et al., Br J Can. 88, 828-831, 2003). 유럽 생식 세포 컨센서스 그룹 (European Germ Cell Consensus Group)은 2008년에 2 Gy의 단일 투여량으로 20 Gy를 권장 방사선 치료로 배치했다 (Krege et al., Eur . Urol. 53, 478-496, 2008). 저자들은 스테이지 II 고환 정상 피종의 경우, 스테이지 IIA에 대한 총 투여량이 30 Gy이고, 스테이지 IIB에 대한 총 투여량이 36 Gy인 것은 "합리적인 것 같다"고 지적했다. 이 2가지 투여량이 "합리적인 것 같다"라고 하는 진술은 선행 기술 (Krege et al., Eur . Urol. 53, 497-513, 2008) 부정확성을 강조한다. 또한, 비록 36 Gy가 권장 투여량이지만, Classen et al., J Clin Oncol 21, 1101-1106, 2003에 의해 스테이지 II에 대해 이미 지적되었으므로 투여량 감소에 대한 가능성이 있다. 이는, 또한, 스테이지 IIA에 대한 재발 없는 생존율은 95%이며, 스테이지 IIB에 대해서는 89%이다. 전체 생존율은 100 %에 가깝다.
스테이지 I 및 스테이지 II 정상 피종에 대한 미국의 권고는, 상술한 유럽의 것과 일치한다. Mead et al.,은 2015년까지 Mead et al., Journal of the National Cancer Institute, 103, 241-249, 2011 임상 시험에서 얻은 결과를 평가했으며, 스테이지 I 정상 피종에 대한 권장 사항은 상기와 같다. 스테이지 IIA 정상 피종의 경우, 대동맥 림프절과 우수한 동측 골반(ipsilateral pelvis)에 대한 저용량 방사선 치료가 선증 영역에서 25 내지 35 Gy의 총 투여량으로 권장된다.
고환암의 방사선-민감도를 뇌암의 방사선-민감도와 비교함으로써, 생식선 종양의 절묘한 민감성을 시야에 둔다.
2. 뇌암
호주 및 뉴질랜드에서 다음과 같은 빈도로 발생하는 성인 신경교종의 관리 및 치료를 위한 임상 진료에는 상당한 차이가 있다; 성상세포종 그레이드 I가 4%; 성상세포종 그레이드 II가 10%; 성상 세포종 그레이드 III가 22%; 다형성 교모세포종 그레이드 IV가 52%; 및 희소돌기교종 (oligodendrogliomas) 및 과증식세포종 (oligoastrocytomas)가 나머지를 구성한다 (Cancer Council Australia/Australian Cancer Network/Clinical Oncological Society of Australia, ISBN 978-0-9775060-8-8; 2009). 본 발명에 대한 관심은 다형성 교모세포종이며, 이는 방사선 학자들에 의해 방사선 내성이 있다고 간주되기 때문에, 이들 신경교종 중에서 가장 진보된 것이다. 또한, 교모세포종과 스테이지 III의 성상세포종의 비교는 임상 비교 (아래 참조)와는 반대로, 그들의 금속의 관점에서 밝혔다. 높은-등급의 성상세포종에 대한 표준 방사선 치료는 2 Gy 분획으로 60 Gy (때때로 10 Gy로 증가)이지만, 다형성 교모세포종과 같은 그레이드 IV 신경교종에 대한 최적 투여량이 결정된 데이터는 없다. 그레이드 III 신경교종의 경우 많은 방사선 학자들은 그레이드 III 신경교종의 경우 2.0 Gy부터 1.8 Gy까지의 분획 당 10% 감소가 조직 손상을 덜 일으킬 수 있다는 "기대"에 따라 1.8 Gy의 분획 절차로 59.4 Gy를 사용한다.
두 곳의 제3상 임상 시험이 이들 데이터를 참고한다; 방사선 치료 종양학 그룹 (Radiation Therapy Oncology Group: RTOG7401) 및 동부 협동 종양학 그룹 (Eastern Cooperative Oncology group: ECOG1374) (Nelson et al., NCI Monogr. 6, 279-284, 1988 and Chang et al., Cancer, 52, 997-1007, 1983). 치료군 (방사선; 방사선 + 방사선 부스트; 방사선 + BCNU 및 방사선 + CCNU) 사이에는 생존의 차이가 없었고, 역형성 성상세포종 (anaplastic astrocytoma)과 교모세포종 사이에는 조금의 차이가 있었다. 이는 역형성 성상세포종과 교모세포종 사이의 생존 결과의 미세한 차이에 있어서 현저한 것이며, 이들 카테고리에 대한 금속 데이터는 이질적이고 분포가 중복되며, Kolmogorov-Smirnov 테스트를 사용하여 시험했을 때 서로 크게 다르지 않다 (P = 0.581).
전체 뇌에 대한 방사선 치료의 주요 이슈는 신경인지 장애, 백질 뇌증 (leukoencephalopathy) 및 내분비 병증 (endocrinopathy)과 같은 다중 합병증의 발생이다. 이들 중 일부는 관련 방사선 치료 (Involved Field Radiation Therapy: IFRT)로 개선되었지만, 재발의 빈도는 변하지 않았으며, 다발성 장애 환자의 비율도 변하지 않았다.
방사선 내성이 될 가능성이 있는 사람들을 지키면서 스펙트럼의 방사선 민감성 말단에 있는 환자에 대한 방사선 치료와 같이, 환자를 위한 치료를 보다 맞춤화할 필요가 있는 것은 분명하다. 방사선 치료와 같은 현재의 획일적인 치료는 금속 데이터를 포함하여 이 출원일까지 제공되는 새로운 지식을 고려할 때 쓸모가 없다.
3. 세로살 세포막 ( serosal membrane)의 암; 중피종
중피종은 방사선 내성으로 간주하고, 치료 프로토콜을 1.8 Gy 분획으로 전달된 약 54 Gy 선량이다.
중피종의 임상 상황은 다른 종양 유형의 의사들과는 조금 다르다. 외과적으로 절제 가능한 종양을 처음으로 검사함에 있어서, 전형적인 세가지 모드: 완결 외과 조치, 방사선 치료 및 전신 화학 요법을 행한다. 중피종의 경우, 완결 수술의 역할에 대해서는 논란의 여지가 있고, 종양의 절제가 특정 환자의 생존율을 향상시킬 수 있는지 여부는 알려지지 않았으며, 이 문제에 대한 전향적인 임상 시험은 없다. 또한, 수술 전후에 방사선 치료와 화학 요법의 통합을 담당하는 적절한 무작위 3상 임상 시험이 없으며, 가장 가까운 단계는 흉막외 폐 절제술 후 54 Gy의 왼쪽 반의 흉부 (hemithoracic) 방사선 치료를 사용하는 제2상 임상 시험이다 (Rusch et al., J Thorac Cardiovasc Surg 122, 788-795, 2001).
4. 소세포 폐암
방사선학자 및 의사는 소세포 폐암은 방사선 치료에 양호한 반응율을 갖는 방사선-민감성 종양인 것으로 간주한다. 유럽 종양 학회 (European Society of Medical Oncology: ESMO)는 변형된 종양 절 전이 분류 및 스테이지 그룹핑을 문서화하고, 진단, 치료 및 추적에 대한 가이드라인을 발표했다 (Fruh et al., Annals of Oncology, 24, (Supplement 6), vi105, 2013; Table 3). 치료적 의도의 가장 좋은 전체 생존 결과는, 화학 요법과 함께 일일 1.5 Gy 분획으로 총 45 Gy 선량이다 (Turrisi et al., N Engl J Med, 340, 265-271, 1999).
5. 림프종
호주 암 위원회 (Cancer Council Australia) 및 호주 암 네트워크 (Australian Cancer Network)는 림프종의 진단 및 관리에 대한 임상 진료 가이드라인을 제정했다 (ISBN: 0-9775060-0-2; 2005). 임상 스테이지 I-III 저등급 여포성 림프종의 경우, 30 내지 36 Gy의 관련 방사선 치료를 권장한다. 성인의 비-호지킨 림프종의 경우, 미국 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)는 25 Gy와 50 Gy 사이의 선량을 권장한다. 본원 기재된 확산성 B-세포 림프종의 경우, 전국 종합 암 네트워크 (NCCN.org; 2015)는 화학 요법 후 30 내지 36 Gy를 권장하고, 화학 요법에 내성에 대해 1차 치료로서 45 내지 55 Gy, 또는 화학 요법에 대한 비-후보자, 줄기 세포 이식 전후 회수를 위한 30 내지 40 Gy를 권장한다. 비-호지킨 림프종을 포함하는 다양한 스펙트럼에서 일부 환자는 오랜 기간 동안 무통의 종양을 가지며, 다른 종양은 신속하게 진화하여 즉각적인 치료를 필요로 한다. 방사선 치료의 측면에서 볼 수 있듯이, 이는 대부분 획일적인 상황이다.
6. 흑색종
흑색종은 일반적으로 방사선 내성 종양으로 간주 되었지만, 방사선-반응성의 넓은 스펙트럼을 입증한 세포주로부터 유래된 많은 증거의 데이터가 상반된다. 호주와 뉴질랜드의 흑색종 관리에 대한 임상 진료 가이드라인은 호주 암 위원회/호주 암 네트워크/뉴질랜드 보건부 (Ministry of Health New Zealand)에 의해 상세히 제시되었다. 호주는 ISBN 978-0-9775060-7-1, 뉴질랜드는 ISBN (electronic) 978-1-877509-05-6를 참조한다. 임상 데이터는 Wazer 등 UptoDate, 2015 에 의해 검토되었으며, 이 역시 상충 관계에 있다. Wazer 등이 검토한 임상 시험에서 흑색종은 방사선-반응성 종양이라고 결론을 내렸지만, "그러나 최적 선량 및 분획은 여전히 불확실하다". 전이성 질환의 관점에서, 피부, 림프절, 내장 전이 또는 뼈나 뇌로 전이 사이의 방사선-반응성에는 상당한 차이가 있다. (상반되는 임상 시험 데이터는 환자간에 광범위한 망간 값이 있고, 도 1에서 밝혀진 바와 같이 단일 종양 내에서 큰 차이가 있는 금속 데이터의 관점에서 보다 과학적인 의미를 가진다). 흑색종의 부위에 따라, 선량은 32 Gy에서 100 Gy까지 다양하다. 마지막으로, 방사선 치료는 뼈, 뇌 및 내장 전이의 설정에서 완화 치료에 유용하지만, 대용량 선량의 분량이 완화를 개선하는지는 분명하지 않다.
실시예 5
멜라닌과 형태학적 이질성 및 방사선 민감성/ 둔감성
상술한 바와 같이, 상이한 화학 원소, 특히 금속에 대한 저장 용량을 갖는 멜라닌의 분포는 흑색종과 관련된 변형의 주요 원인이 될 수 있다. 도 1은 이 형태학적 비-균질성을 나타내는 H&E 염색 흑색종의 이미지로서, 그 내부에 두 개의 상이한 계통이 확실히 나타나고; 하나의 계통은 옅은색을 띄며 대부분 무멜라닌이고, 다른 계통은 어둡게 염색되고 세포 내 및 세포 외 멜라닌을 모두 포함한다. 또한, 무멜라닌 영역의 세포는 과도하게 멜라닌화된 영역에 있는 세포보다 핵 크기와 형태학적 관점에서 더욱 균일하며, ATI에 영향을 주는 것을 발견하였다. 여러 특성 중 하나에 있는 세포 집단의 분산이 낮을수록, 임의의 perturbogen에 대한 반응이 더 제한적일 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 동일한 조직 절편의 상단의 금속 함량이 측정되었다. 흑색종을 통해 찍은 절단 트랙의 2차원 표현을 도 12에 나타내었다. 이 데이터는 동일한 종양의 다른 부분 내의 망간 수준의 변화를 나타내며, 환자가 방사선 치료를 받아야 하는지 또는 그렇지 않은지에 대해 정보에 근거한 선택을 하기 위해 2D 랜드스케이프를 특성화하는 것의 중요성을 강조한다. 이러한 시각적으로 선택된 영역에서 망간에 대한 백그라운드-보정된 중간값은 초당 31,939 개의 교정 카운트 및 초당 3,045개의 교정 카운트이다.
2D 랜드스케이프는 종양 내에서, 지정된 역치 위에 존재하는 샘플링된 영역의 비율의 추정치를 제공한다. 위의 샘플에서, 이는 예를 들어, 랜드스케이프의 비율이 10번째 백분위 수, 20번째 백분위 수, 30번째 백분위 수, 40번째 백분위 수, 50번째 백분위 수 등 아래로 떨어지면, 그에 따라 정량화할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 샘플링된 영역의 90%가 망간에서 매우 낮을 경우, 종양 전체는 방사선에 민감할 수 있다. 반면에, 방사선이 종양의 대부분을 그대로 두기 때문에, 영역의 90%가 망간이 높은 종양을 조사하는 것에는 거의 의미가 없다. 이러한 백분위 수는 분자 작업을 위한 "토대가 된" 종양 샘플로부터 유래할 수 없다.
도 1의 동일한 종양을 추가로 분석하고 4개의 금속 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu의 함량을 결정하여 도 13에 나타내었다. 형태학적으로 볼 때 이분법은 이러한 결과로부터 볼 수 있다. 절단이, 매우 높은 값을 갖는 좌측으로부터 멀리 낮은 값을 갖는 우측으로 진행됨에 따라, 변곡점은 복셀 (34) 주위에서 발생한다.
반면에, 균일한 형태를 갖는 흑색종은 여전히 매우 다른 금속 함량을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 도 14는 54세 남성의 왼쪽 검지로부터의 흑색종 (스테이지 IV, T4N0M1)의 H&E 염색 조직 절편을 나타낸다. 이 특정 흑색종은 균일한 형태를 가지며, 상기 병리학은 숙련된 병리학자에게는 보기에 드문 것처럼 보일 것이다 (도 14, 상단 패널). 금속 함량은 이 흑생종에서 측정되었으며, 도 14, 하단 패널에 나타내었다. 기본 2D 금속 함량은 매우 다르다. 실제로 망간이 매우 고농도의 2개의 큰 농도의 세포가 있다.
이 종양 샘플의 대부분에 대한 중간 55Mn 값은 초당 817개의 백그라운드로 보정된 교정 카운트로 결정되었으며, 이는 이 종양을 방사선-반응 스펙트럼의 매우 민감한 말단에 두었다. 반면에, 두 개의 약간 하얀 평평한 영역 중 큰 쪽, 즉 HMR은 초당 6,500 개의 교정 카운트를 초과하는 값을 가지며, 스펙트럼의 방사선-내성 말단에 위치한다.
이들 두 영역은 복셀 매트릭스의 육안 검사로부터 명백하다. 그러나 역치의 엄밀한 분석은 이들 두 HMR 영역의 심층 분석을 위해 필요하며, 이 분석은 도 15 및 16에 나타냈다. 본원에서 사용된 바와 같이, 높은 금속 영역 (High Metallomic Region: HMR)의 특정 금속을 언급 할 때, HMR은 예를 들어, HMR(55Mn), HMR(66Zn), HMR(56Fe) 및 HMR(63Cu)로 지정되며, HMR(AM)은 임의의 금속의 일반적인 경우를 나타낸다.
도 15의 패널 A는 표준 H&E 병리학에 의해 가시화된 22 x 60 복셀 (약 1800 개의 복셀 영역으로부터 샘플링됨)의 종양 영역의 균일한 형태학적 성질을 나타낸다. 패널 B는 두 개의 HMR(55Mn) 영역을 각 복셀의 숫자를 육안 검사에 의해 발견된 것으로써 나타낸다. 패널 C는 전체 영역의 복셀 당 중간값에 전체 영역의 복셀의 표준 편차 (St.Dev.)를 가한 역치 (중간값 + St.Dev.)를 사용할 때, 이 22 x 60 복셀 2D 랜드스케이프로부터 드러나는 HMR을 나타낸다. 다른 역치 방법은 또한 이 22 x 60 복셀 2D 랜드스케이프 (패널 D) 내 동일한 두 영역을 확실히 나타내며, 이 두 번째 방법은 전체 영역의 복셀값의 2배 (2x 중간값)를 사용한다.
패널 C 및 D (회색 사각형 배경의 검은색 사각형)에서 역치 위에 나타나는 클러스터된 복셀의 분포에 의해 나타나는 바와 같이, (중간값 + St.Dev.) 대 (2x 중간값)의 결과는 HMR(55Mn)을 찾는 관점에서 거의 동일하다. 6가지 종양 유형의 분석은 HMR(55Mn), HMR(66Zn), HMR(56Fe) 및 HMR(63Cu)을 검출하는데 있어서 2x 중간값 방법이 중간값 + St.Dev 보다 더 일관성이 있음을 밝혔다. 당업자는 어느 방법이라도 본 발명에 따라 사용될 수 있지만, 비-한정적인 예로서 2x 중간값 방법론은 본원에 나타난, 이후의 분석에 사용되었다.
동일한 원자 랜드스케이프에서 HMR(55Mn) 및 HMR(66Zn) 분포에 관한 또 다른 중요한 발견이 도 16에 도시되었다. 상단 패널은 도 15의 동일한 H&E 종양 랜드스케이프를 나타내고, 중간 패널은 두 개의 검출된 HMR(55Mn) 영역을 나타내며, 하단 패널은 패널 B의 복셀 매트릭스의 것과 동일한 복셀 중의 아연의 분포를 나타냅니다.동일한 복셀에서 아연 분포가 패널 B의 복셀 행렬에 대한 분포를 밝혔다. 두 HMR(55Mn)과 대조적으로, HMR의 작은 영역 (66Zn )은 아연 역치의 2x 중간값 이상으로 나타난다. 아연, 철 및 구리값은 일반적으로 HMR(55Mn)의 영역 내 대부분의 종양 영역의 값에 머문다. 이런 일반화는 멜라닌 종양의 멜라닌-리치 영역에서는 유지되지 않으며, 4개의 모든 금속이 멜라닌 과립과 같이 고농도에서 같이 발견된다.
당업자는 방사선 치료를 위한 임상적 의사 결정을 위한 대부분의 용도의 종양에서 금속학적 관심의 영역을 밝히는데 유용한 역치에 도달하는 수학적 및 통계적 방법이 다수 있음을 인정한다.
도 17은 HMR(55Mn)이 방사선 감수성 대 방사선 내성과 같은 상이한 종양 유형에서 발생하는 정도의 예를 제공한다. 이 비교는 왼쪽 검지에 흑색종 (스테이지 IV, T4N0M1)을 가진 54세의 환자와 폐의 미분화된 암종 (스테이지 I, T1N0M0)을 가진 51세 여성 환자의 비교이다. 설명의 목적으로 본원에 사용된 영역은 2종의 종양 (31 x 31 복셀의 총 961 복셀) 각각의 약 1 mm x 1 mm 샘플에 해당한다. 도 17의 8 개 패널은, (i) 중간값의 0.5배 이상인 역치, T1, (ii) 중간값의 1.0배 이상인 역치, T2, (iii) 중간값의 1.5배 이상인 역치, T3, 및 (iv) 중간값의 2.0배 이상인 역치, T4의 4개의 상이한 역치를 사용하여 55Mn 농도의 영역을 밝혔다.
폐의 소세포 암종의 경우, 중간값의 2배인 최고 역치 이상인, T4를 초과하여 남아 있는 복셀은 일반적으로 샘플 전체에 흩어져있는 비-연속적인 것 (싱글톤) 이다. 이 방사선에 민감한 종양 샘플에서 HMR(55Mn) 복셀의 인접하거나 거의 근접한 농도는 거의 없다. 대조적으로, 흑색종 환자로부터의 4개의 우측 패널은 중간값의 1.5 배인 T3에서 쉽게 식별할 수 있는 연속적인 HMR(55Mn) 복셀의 출현을 나타내며, 이들 HMR(55Mn)은 중간값의 2배의 보다 엄격한 T4 수준에서도 유지된다.
비제한적인 예로서 도 18의 데이터는 동일한 역치 기준이 이들 두 종양의 동일한 복셀에 적용되지만, HMR(66Zn), HMR(66Zn) 을 동시에 분석하지 않는 경우, 이 영역은 특정 환자의 작은 세포 암종 및 Zn으로 인접 복셀의 작은 농도 T1, T2, T3 및 T4의 역치에서 발견되는 것은 흑색종 환자의 종양에서 명백하다. 66Zn 복셀 값의 분포는 이들 두 종양에서 비교적 일정하게 유지되는 반면, 도 17에 나타난 바와 같이 R (55Mn)은 흑색종에서 우세하다.
하나의 방사선 민감성 및 다른 하나의 방사선 내성인 두 종양 유형의 비교는 비제한적인 예로서 다음 7개의 도면 (도 19 내지 도 25)에서 더욱 강조하였다. 이는 종양이 방사선 반응성의 두 가지 스펙트럼 말단; 소세포 폐, 스펙트럼의 방사선-민감성 말단의 림프종 및 고환, 및 중피종, 스펙트럼의 방사선-내성 말단의 뇌 및 흑색종의 종양의 예가 되는 184명의 환자의 데이터를 나타낸다.
비제한적 예로서, 높은 금속 농도를 갖는 종양 영역의 개요 및 이의 임상 결과를 하기에 제공한다.
도 19는 약 1,800개 복셀의 종양 영역이 샘플링될 때, 폐의 소세포 암종을 갖는 20명의 환자 각각으로부터의 55Mn 복셀 데이터를 나타낸다. 각 환자의 종양 대부분의 중간 55Mn 값은 사각형으로 표시되며, 0 CC/S에서 7,000 CC/S까지의 범위에서 초당 200회의 통합 카운트로 저장된다. 모든 20명의 환자는 대부분 55Mn 값이 3,000 CC/S (회색 사각형) 미만이 되는 종양을 가진다. 톱 라인 위의 회색 사각형으로 표시된 20명의 환자 중 14명은 중간값의 2배인 역치 T4가 사용될 때, HMR(55Mn)을 가지지 않는다. 반대로, 6명의 환자 (t1 ~ t6)의 종양은 단일 HMR(55Mn)을 포함한다 (점선으로 표시된 회색 사각형에 연결된 검은색 사각형). 구체적인 실시예에서, 환자 t6의 종양 대부분은 2,400에서 2,600 빈 (회색 사각형)에 속하는 중간 55Mn 값을 갖지만, 이 종양 역시 6,400에서 6,600 빈 (검은색 사각형) 에 속하는 HMR(55Mn)을 포함한다. 환자 샘플 t1~t6의 6개의 HMR(55Mn)의 상기 역치의 연속적인 복셀 수는 각각 샘플링된 종양 영역의 4.9%, 3.1%, 2.1%, 12.3%, 12.6% 및 5.2%이다. 이들 환자 중 3명 (t2, t5 및 t6)에서 HMR(55Mn)의 55Mn 수준이 4,000 CC/S를 초과한다. 이러한 영역은 어느 정도의 방사선-내성을 나타내는 세포를 포함할 가능성이 있다.
비제한적인 예로서, 8x8 복셀의 최소 크기는 높은 금속 함량의 영역을 효율적으로 나타낸다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이 크기 이하 및 사용된 기구의 민감도에 따라 도 17의 소세포 폐 암종에서 나타난 바와 같이, 최종적으로는 랜덤으로 생성된 단독체의 백그라운드와 구별할 수 없을 때까지 보다 작은 HMR이 선택된다는 것을 이해할 것이다. 8x8 HMR-포함 랜드스케이프는 X '및 Y' 방향 모두에서경계가 있다. X8 x Y8 복셀 위의 HMR은 X' 및 Y' 방향으로 정수만큼 개별적으로 증가할 수 있으며, X[8+1] x Y[8] : X[8] x Y[8+1] : X[8+1] x Y[8+1] : X[8+2] x Y[8] : X[8+2] x Y[8+1] : X[8+2] x Y[8+2] : X[8+1] x Y[8+2] : X[8] xY [8+2] ~ X[8+n] x Y[8+n]의 HMR을 산출할 수 있으며, n은 1부터 1000까지의 정수일 수 있다. 바람직하게는, 상기 정수는 30 x 30 복셀 (1 mm2가 샘플링됨)의 샘플 일 때, 1 내지 100, 보다 바람직하게는 1 내지 22일 수 있다. 당업자라면 최소 8개 복셀보다 낮은 역치를 설정하는데 장애가 없다는 것을 이해할 것이다. 8의 값은 경험적으로 유도되고, HMR에 대한 효율적인 검색 도구의 일례로서 제공되기 때문에 여기에서 사용되었다.
HMR의 크기
임의의 HMR의 중요한 디스크립터는 그것의 크기, 형태 및 내용이다. 총 184명의 환자로부터 6가지 유형의 종양을 분석하였다. 당업자는 HMR이 크기, 형태 및 내용이 가변적일 수 있고, 최소 영역을 정의하는 것은 기계 지터 (jitter)에 의존하고, 어떤 경우에는 단일 복셀이 희귀하고, 저주파 전자의 "스파이크" 데이터를 나타낼 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 기계 "stutter"는 X 또는 Y 방향으로 2개 또는 3개의 연속적인 높은 값을 간혹 생성할 수 있지만, 적절한 이미지 필터링 소프트웨어로 쉽게 인식할 수 있다.
상기 관점에서, 임의의 금속 [HMR(AM), 여기서 AM = 임의의 금속]에 대한 HMR은 복셀 연속성의 기준을 충족시키기 위해 2개의 인접한 복셀을 포함할 수 있다. 도 20의 패널 A는 두 개의 인접한 복셀 (더블릿)을 참조 단일 복셀 (별표)로 구성할 수 있는 8가지 이론적 방법을 나타낸다. HMR(AM)의 크기는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등 연속 복셀에서 특정 종양의 분석을 위해 선택된 샘플 크기인 정수까지 다양할 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 HMR(AM)의 크기가 현존하는 기술을 사용하여 측정 가능한 임의의 범위에 있음을 알 것이다. 예를 들어, HMR(AM) 크기는 2 복셀에서 약 800,000 복셀 사이의 임의의 값을 가질 수 있다 (이는 종양 물질이 있는 가장자리에 종래의 슬라이드가 로드되는 경우, 분석할 수 있는 최대수 35 x 35 미크론 픽셀이다). 당업자는 또한 HMR이 종양의 암세포 또는 일반적으로 관련 기질로 지칭되는 세포 및 비-세포 물질의 영역에 적용될 수 있으며, 그 자체가 인접하는 암세포와의 상호작용 때문에 "활성화 된" 상태로 존재할 수 있음을 인식할 것이다.
임상 적용의 경우, 단일 샘플 크기는 전형적으로 1 mm2의 면적이며, 이러한 크기는 일상적인 병리학적 분석에서 선례를 갖는다. 따라서 병리학자들이 예를 들어, 흑색종에서 유사 분열 속도에 대한 종양 절편을 검사할 때, 그들은 고출력 분야 또는 10개의 고출력 분야 당 유사분열의 수를 전형적으로 사용했다 (Burton et al., 2012, Am.J Surg. 204, 969-974). 비제한적 예로서, HMR(AM)와 관련하여, 1 mm2 샘플은 이 출원에서 편리하게 1,000 개의 복셀에 근접한다. 여러 개의 1 mm2 샘플은 유리 슬라이드 상의 단일 조직 절편에서 레이저로 절단할 수 있다. 여러 개의 1 mm2 샘플은 동일한 종양 블록으로부터의 여러 절편에서 레이저로 제거될 수 있다. 여러 개의 1 mm2 샘플은 동일한 종양의 다른 샘플을 대표하는 여러 블록 또는 이의 전이성 유도체에서 레이저로 제거할 수 있다. 여러 개의 샘플로부터 결정된 누적 된 HMR(AM) 크기는 단일 종양에 대해 4개의 복셀 (2 더블릿)에서 수백만 개까지 다양하다. 상한은 분석 및 헬스케어 비용에 필요한 시간의 실용성에 의해 제한된다는 것을 이해할 것이다.
HMR의 형상
비제한적인 예로서, 1 mm2의 샘플 크기 또는 35x35x5 미크론 유형의 ~1000 개의 복셀 내에서, 복셀 인접성의 조건을 따르는 많은 수의 HMR(AM) 형상이 존재할 수 있다. 본원에서 처음으로 기술된 바와 같이, 공통의 형상은 도 14 및 도 15의 흑색종 환자 데이터에 예로서 나타나고, 도 20의 패널 B 및 C에서 문체상으로 표현되었다. 패널 D, E, F, G 및 H에 묘사된 것과 같은 패턴은 다른 종양의 유형으로 나타난다. 예를 들어, 패널 D는 유방 상피 세포는 유방암 및 전립선암과 같은 림프관 또는 도관을 관통하는 것이다. 패널 E와 G는 콜라겐 번들 또는 교모세포종이나 성상세포종에서의 주요 신경관 또는 유방암 절편에서 볼 수 있는 단일 파일 패턴과 같은 종양의 구조적 모티프를 따르는 세포의 고전적인 "일렬종대 (Indian File)" 운동을 대표한다. 패널 F는 암세포가 유방암에서의 상피내암 (Ductal Carcinoma In Situ: DCIS)에서와 같이 혈액 또는 림프관 내에 함유되는 경우를 예시한다. 패널 H는 일부 흑색종에서의 세포 및 멜라닌 침착물의 분포를 대표한다.
임의의 공지된 수학적 및 통계적 방법이 매트릭스 및 관련 소프트웨어의 패턴 및 이질성을 분석하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다. 그러한 방법은 다양한 형상과 크기의 복셀의 농도를 밝힌 다음, 근본적인 병리학적 랜드스케이프에 매핑될 수 있다.
HMR( A M)의 풋프린트 및 그들의 방사선-반응도의 값
2배 중간 역치를 사용하는 1000개의 복셀 샘플 중, 패널 B, C, D, E, F 및 G의 HMR(AM) (도 20의 검은 사각형)은 각각 샘플의 4%, 3.7%, 2.4% 1.5%, 3.7% 및 0.9%를 나타낸다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 종양 t2, t5 및 t6을 갖는 환자가 치료 의도 또는 완화 기준으로 방사선 치료로 치료되는 경우, 암세포의 대부분 (값이 <800, <1,800 및 <2,600)은 사멸되거나 더 많은 세포 분열이 되지 않도록 충분히 손상될 수 있다. 반대로, 이들 종양 (값이 >4,000, >4,200 및 >6,400)의 HMR(55Mn)의 대부분의 세포는 생존하고, 종양 재발의 익숙한 임상 연구 결과를 초래하는, 종양의 새로운 형태를 생성한다.
림프종, 고환 종양, 중피종, 뇌 및 흑색종의 HMR 데이터
도 21은 약 1,800개의 복셀의 종양 영역이 레이저 절단 기술에 의해 55Mn 함량으로 샘플링된 경우의 확산성 B-세포 림프종을 가진 환자 10명의 데이터를 나타낸다. 흑색 사각형이 없는 것이 나타난 것과 같이, 중간값 2배의 역치를 사용할 때 종양 중 어느 것도 HMR(55Mn)을 가지고 있지 않았다. 또한, 모든 평균 55Mn 값은 3,200 CC/S 이하로 떨어졌다. 이들 10명의 환자의 종양이 치료 의도 또는 완화 기준에 따라 방사선 치료로 치료된다면, 세포의 대부분은 사멸되거나 더 많은 세포 분열이 되지 않도록 충분히 손상될 수 있다. 이 분야의 매일의 임상 시험으로부터 대규모 림파종 매쓰는 방사선 치료로 쉽게 근절될 수 있는 것이다.
도 22는 약 1,800개의 복셀의 종양 영역을 샘플링한 경우의 고환 종양을 가진 환자 55명의 데이터를 나타낸다. 이들 55개의 종양은 모두 고전적인 정상 피종이며 병리학적 기준에 기초하여 단일 그룹을 형성한다. 방사선 종양 전문의와 의학 종양 전문의는 대규모의 정상 피종 매쓰가 방사선 치료로 쉽게 근절되기 때문에 매우 방사선에 민감하다고 생각한다. 이들 정상 피종 중 50개는, 상단 선 위에 51 회색 사각형으로 표시된 바와 같이, 중간값 2배 역치를 사용할 때 HMR(55Mn)을 가지지 않는다. 반대로, 4명의 환자, S4, S5, S6 및 S7은 그들의 벌크값 (회색 사각형)과 관련하여 단일 HMR(55Mn) (검은색 사각형)을 가진다. 이들 4개의 HMR(55Mn)의 크기는 샘플링된 영역의 1.8 내지 6.3%였다. 이들 환자 중 2명, S6 및 S7에서 HMR(55Mn)의 CC/S 값은 5,000 CC/S를 초과하며, 그러한 영역은 방사선 내성인 세포가 포함될 가능성이 있다. 이러한 데이터는 이들 2명의 환자가 치료 의도 또는 완화 기준에 따라 방사선 치료로 치료될 확률을 뒷받침하며, 세포의 대부분은 사멸되거나 더 많은 세포 분열이 되지 않도록 충분히 손상될 수 있는 반면, HMR(55Mn)은 생존하고, 시간이 지나면 새로운 형태의 종양을 생성한다.
마지막으로, 이들 정상 피종의 초기 통계 분석으로부터 발견된 바와 같이, 이들은 단일 단위가 아니다. 3명의 종양 환자, S1, S2 및 S3의 종양은 최상위 오른쪽 꼬리 부분에 분포하고, 평균 55Mn 값이 3,000과 4,000 사이이며 어느 정도의 방사선 내성을 가지고 있을 수 있다. 이들 3명의 아웃라이어 (및 종양이 HMR(55Mn)을 보유하고 있는 환자 S4, S5, S6 및 S7)로부터의 데이터는 정상 피종의 작의 비율이 방사선 내성의 징후를 나타내는 것으로 밝혀진 임상 데이터와 일치한다.
도 23은 약 1,800개의 복셀의 종양 영역을 샘플링한 경우 (방사선 내성 독립체로 여겨지는 중피종) 의 중피종을 가진 환자 10명의 데이터를 나타낸다. 9명의 환자는 맨 위 줄 위의 회색 사각형으로 표시된 바와 같이, 중간값 2배의 역치가 사용될 경우 HMR(55Mn)을 갖지 않는다. 가장 낮은 평균 CC/S 복셀값을 가진 한 환자는 CC/S가 5,000을 초과하는 단일 HMR(55Mn)을 가지며, 그 크기는 샘플링된 영역의 3.2 %이다. 중요한 것은, 대부분의 중피종의 55Mn 값은 3가지 민감한 종양 유형의 값을 초과한다.
도 24는 약 1,800개의 복셀의 종양 영역을 샘플링한 경우 (대부분 방사선 내성으로 여겨지는 뇌의 종양) 의 뇌 종양 (교모세포종 및 성상세포종)을 가진 환자 25명의 데이터를 나타낸다. 24명의 환자는 맨 윗줄 위의 회색 사각형으로 표시된 바와 같이, 중간값 2배의 역치가 사용될 경우 HMR(55Mn)을 갖지 않는다. 가장 낮은 평균 CC/S 복셀값을 가진 한 환자는 CC/S가 6,000을 초과하는 단일 HMR(55Mn)을 가지며, 그 크기는 샘플링된 영역의 3.6 %이다. 대부분의 55Mn 뇌 값이 3가지 민감한 종양 유형의 값을 초과하는 반면, 이들 환자 중 8명은 3,000 CC/S 미만의 평균 55Mn 값을 나타냄으로써, 이들 데이터는 일부 교모세포종 및 성상세포종이 방사선 치료에 반응한다는 것을 나타낸다.
도 25는 약 1,800개의 복셀의 종양 영역을 샘플링한 64명의 흑색종 환자의 데이터를 나타내며, 흑색종은 역사적으로 방사선 내성 종양으로 간주된다. 흑색종은 HMR(55Mn)이 없이 종양을 가진 환자 29명과 HMR(55Mn)과 종양이 있는 환자 35명 과 함께, 다른 5가지 종양 유형과 관련하여 광범위한 이질성을 나타낸다. 종양 샘플 내에 HMR(55Mn)이 단일 개체로서 존재했던 이전의 5가지 종양 유형과 달리, 흑색종의 절반은 동일한 종양 내에 여러 HMR이 있다. HMR(55Mn)의 크기는 샘플링된 영역의 1.6에서 21.8%까지 다양하다. 역치 (중간값 2배)에 관한 본원에서 사용된 엄격 성 때문에, 샘플당 HMR(55Mn)의 수는 실제로 최소 추정값이다. 도 25는 또한 종양의 거의 30%에 대한 종양 대부분의 중간값이 2K의 CC/S 역치 (회색 사각형) 미만이고, 종양의 2/3에 대한 다수의 복셀의 중간값이 4K의 CC/S 역치 (회색 사각형) 미만이다.
돌이켜 보면, 이러한 원자 데이터는 많은 흑색종이 방사선-민감성 영역을 가지고 있음을 나타낸다. 전이성 질환의 관점에서, 피부, 림프절, 내장 전이 또는 뼈나 뇌로의 전이 사이의 방사선-반응성에는 상당한 차이가 있다. 방사선 내성인 흑색종에 대한 널리 가지고 있는 견해는 일부 흑색종은 방사선 치료에도 불구하고 환자를 빠르게 죽일 수 있는 반면, 일부 흑색종은 방사선 치료 후에 용해된다는 연구 결과의 상반된 데이터에 근거한다. 본원에 제시된 금속 데이터는 흑색종 종양 내의 이전에 알려지지 않은 HMR(55Mn)의 발견에 의해 전통적으로 상반되는 데이터가 어떻게 부분적으로 해결될 수 있는지를 처음으로 보여준다.
도 25는 또한 흑색종 HMR(55Mn)의 88%가 4,000 CC/S 값 (검은색 사각형)을 초과하고, HMR(55Mn)의 거의 절반이 10,000을 초과하고, 일부는 100,000 부근임을 보여준다. 이러한 새로운 데이터는 많은 흑색종이 실제로 초기에는 방사선 민감성일 수 있지만, 상당한 수준의 망간을 함유하고 있는 대부분의 항만 HMR 때문에, 그러한 세포 집단은 방사선 치료에서 생존할 가능성이 높으며, 종양은 방사선 내성 잔해로부터 재생될 수 있다. 임상 결과는 환자가 암의 재발로 방사선 치료를 다시 시작하며, 이는 초기 종양보다 더욱 내성이다. 둘째, 흑색종의 대부분은 세포 외 및 세포 내 멜라닌을 많이 포함하고 레이저 절단에 의해 분석된 조직 절편에서 처음으로 우리의 데이터에서 나타난 바와 같이, 멜라닌은 하기에 설명된 생화학적 프로세스에 의해 방사선 내성에 기여할 수 있다.
멜라닌은 디하이드록시인돌 및 벤조티아신 고리 및 잡다한 미확인 화학 그룹의 중첩 시트로 이루어진 다층 복합체를 형성하는 불확실한 3D 구조의 이종 폴리머이다 (Zecca et al., Trends in Neurosciences, 26; 578-580, 2003). 뉴로멜라닌 의 경우, 다량의 다가불포화지방산도 존재한다. 뉴로멜라닌은 크롬, 코발트, 수은, 납 및 카드뮴을 포함하여 많은 금속의 흡수원으로서 역할을 하고, 이 출원에서는 Mn, Zn, Fe 및 Cu의 동위 원소도 포함한다 (도 26). 멜라닌은 세포 외로 방출될 수 있으며, 화학적 특성으로 인해 장기간 세포 외 환경에서 생존할 수 있다. 멜라닌은 방사선-방어 특성을 가지며, 체르노빌 원자로의 벽면에 있는 멜라닌화된 곰팡이와 현재 작동 가능한 원자로의 냉각수에서 입증되고 있다. 멜라닌은 X 선을 산란시키고 방사선 차폐물로서 작용한다. 분리된 멜라닌의 특성에 관한 방대한 문헌에도 불구하고, 2007년에만 방사선-방어 특성을 설명하기 위한 최초의 체계적인 시도가 있었다 (Dadachova et al., Pigment Cell Melanoma Res. 21; 192-199, 2007). 본 발명에 이르기까지, 병리학적 암 물질 수준에서의 멜라닌의 방사선-방어 능력에 대한 물리적 설명 및 방사선 치료로 인한 환자 치료에 대한 예측 관련성은 실현되지 않았다. 게다가, 지금까지 대부분의 화학적 및 구조적 연구는 그들의 본래의 (in situ) 분자 성질이 아닌 분리된 멜라닌에 기초하고 있으며, 본원에 기술 된 바와 같은 종양으로부터의 조직 절편에 대한 2D 분석은 없었다. 이는 흉부 벽의 악성 흑색종 (스테이지 II, T4N0M0)을 가진 45세 여성의 흑색종에서 멜라닌 농도 시험에 의해 강조된다 (도 27).
제시의 명료성과 상이한 독립체의 농도 비교를 위해, 패널 A 및 패널 B는 동일한 H&E 염색 절편을 중복하였다. 이 절편 내의 멜라닌 분포는 멜라닌 특이적 항체에 의한 염색이 그것을 밝혀내는데 필요하지 않은 정도로 충분히 높다. 4가지 금속, 66Zn, 63Cu, 56Fe 및 55Mn의 분포는 하기 4개의 패널에 나타나 있으며, 시각적으로 멜라닌 분포와 비교할 수 있다.
패널 C는 66Zn의 2D 분포를 나타내며, 그 중 가장 높은 농도는 (검은색) 주요 멜라닌 트랙과 공존한다. 약간 염색된 영역에서 66Zn의 벌크값은 3,000 내지 18,000 CC/S이며, 멜라닌 트랙 내의 66Zn 수준은 18,000 내지 45,000이다.
패널 D는 멜라닌 분포를 다시 밀접하게 추적하는 63Cu (검은색)의 2D 분포를 나타낸다. 약간 염색된 영역에서 63Cu의 벌크값은 200 내지 1,000 CC/S이며, 멜라닌 트랙의 63Cu 수준은 1,000 내지 4,000이다.
패널 E는 멜라닌 분포를 밀접하게 추적하는 고농도의 56Fe (검은색)를 나타낸다. 약간 염색된 영역에서 56Fe의 벌크값은 20,000 내지 80,000 CC/S이며, 멜라닌 트랙의 56Fe 수준은 80,000 내지 100,000이다.
패널 F는 멜라닌 트랙을 밀접하게 따르는 55Mn의 농도를 나타낸다. 약간 염색된 영역에서 55Mn의 벌크값은 1,000 내지 2,500 CC/S이며, 멜라닌 트랙 내의 55Mn 수준은 2,500 내지 10,000이다. 도 12의 초기 예에서 나타난 바와 같이, 고도로 멜라닌화된 영역으로 구성된 HMR(55Mn)은 100,000의 55Mn 수준에 도달할 수 있다. 따라서 멜라닌은 높은 수준의 금속 저장소이며, 방출되면 방사선-내성의 중요한 요소가 될 수 있다. 우리가 아는한, 이것은 암 조직의 2D 조직 절편 묘사에서의 멜라닌 내의 in situ 55Mn 농도의 최초 입증이며, 방사선 치료에서 환자 치료를 위한 금속과 멜라닌의 공동-지방화에 따른 첫 번째 양적 예측이다. 흑색종은 방사선에 대해 이중 방어를 가진다. 첫 번째는 세포 내 55Mn의 축적이다. 두 번째는 대량의 멜라닌을 생산하는 것으로, 55Mn의 저장 커패시터 역할을 할 뿐만 아니라, 이온화 방사선으로부터 일부 구조적 차폐를 제공하기도 한다.
도 27에서 멜라닌-리치 복셀 트랙의 크기 및 형상은 도 20에 개략적으로 나타낸 바와 같이 (특히, 도 20의 패널 H), 여러 가지 가능한 복셀 집합의 크기 및 형상과 비교할 수 있다.
도 25에 제시된 데이터는 원발성 종양 또는 전이 부위로부터 유래된 흑색종 샘플로 세분될 수 있기 때문에, 흑색종은 추가적인 임상적 의미에서 유익하다. 이들 데이터는 도 28에 나타냈다. 원발성 또는 전이성 흑색종을 가진 다른 환자의 중간 CC/S 값의 분포 비교는, 0.1887의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.557이었다. 따라서 흑색종에서 유래된 중간 55Mn 값의 관점에서, 원발성 및 전이성 흑색종은 동일한 분포를 갖는 집단으로부터 샘플링된 것과 일치한다.
원발성 종양 및 특히 림프절로 이미 전이된 전이성 종양으로부터 55Mn 값의 분포를 통계적으로 비교한 결과, 0.2222의 D 값을 나타내었으며, 관련된 유의하지 않은 P 값은 0.442였다. 따라서 원발성 종양과 림프절로부터 샘플링한 중간 55Mn 값은 동일한 분포를 가진 개체군로부터 샘플링한 것과 일치한다.
HMR(55Mn)의 빈도가 원발성 및 전이성 종양 사이에 상이한지를 결정하기 위해 HMR(55Mn)를 가지는 종양의 분포와 HMR(55Mn)을 가지지 않은 종양의 분포 조사는 이들이 상이하지 않음을 밝혔다 (관련된 유의하지 않은 P 값은 0.457이였다). 따라서, 중간 55Mn 값 분포의 관점에서, 원발성 종양과 전이성 종양은 구별할 수 없다. 이 발견은 원발성 종양과 림프절의 전이 유도체 사이의 상이한 55Mn 축적을 선호하는 선험적 생화학적 세트 (priori biochemical set)가 없다는 점에서 뒷받침된다.
55Mn 수준 및 종양 조직 중의 2D 영역 내 분포가 예시되어 있지만, 55Mn 분석을 위한 최적 영역에 초점을 맞추는 판별자 (discriminator)로서 또 다른 금속인 아연이 비제한적인 예로서 도움이 될 수 있다. 종양의 많은 부위에는 정상 세포 및 비-세포 성분 뿐만 아니라 다른 세포 계통과 섞인 암세포가 포함되어 있다. 종양 환경은 섬유아세포, 세포외 매트릭스 성분, 콜라겐 번들 (collagen bundle), 모세 혈관, 림프관 및 주피세포 및 평활근 세포와 같은 지지 세포, 대식세포, 조골세포, 파골세포 및 뼈 벽감 (bone niche)의 하이드록시아파타이트와 같은 성분을 포함할 수 있다. 첫 번째 사례에서 그것이 ATI에 대해 정량화되도록 선택된 암세포 집단인 경우, 아연은 암세포와 그렇지 않은 세포를 구별하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 아연은 55Mn 값과 그 분포를 결정하는데 가장 관련이 있는 암세포-함유 복셀만 사용되도록 필터를 제공할 수 있다. (아연은 방사선-민감성 세포와 방사선-내성 세포를 구별하지 않는다는 점에 유의한다.) 아연 복셀값은 HMR(55Mn) 식별을 호도할 수 있는 영역을 초기에 피할 수 있게 해준다. 이는 도 29 및 30에 나와 있다.
도 29의 패널 A는 소세포 미분화 폐암 (스테이지 IIIa; T2N2M0)을 갖는 54세의 남성으로부터 H&E로 염색 절편을 도시한다. 대부분 비-암성 및 비-세포성 물질의 약하게 염색된 영역은 H&E 관점에서 명백하다. 이 약하게 염색된 영역은 진하게 염색된 암세포에 비해 66Zn 복셀값이 낮다. 적절한 역치가 66Zn 데이터에 적용되면 패널 B의 결과로서 생기는 이미지는 그 위에 있는 H&E 이미지에 보이는 다른 영역에 대한 우수한 근사치이다. 이는 이 종양 샘플 내 55Mn 값의 분석이 비-암성 영역의 복셀로부터의 기여 없이 패널 B에 나타난 66Zn 복셀에만 더 적절하게 기초한다는 것을 의미한다. 이는 기질 성분의 임상적 중요성을 경시하는 것이 아니라, 단순히 데이터 분석을 구분하는 것이다. 66Zn을 사용하여 조직 절편 랜드스케이프를 사전-스크리닝하는 것은, 비-암성 물질이 암세포-함유 복셀과 훨씬 더 밀접하게 혼합되어있는 유방 및 전립선과 같은 종양에서 특히 유용하다. 상기의 상반하는 점은, 아연이 종양의 어느 부분이 기질 집단의 ATI를 가장 잘 산출할 수 있는지를 결정하는데 유용할 수 있다는 것이다.
유사한 예가 도 30에서 명백하며, 패널 A는 직장의 악성 흑색종 (스테이지 IIB; T4N0M0)을 갖는 66세 남성으로부터의 H&E 염색 절편을 나타낸다. 비-암성 세포 영역은 특히 패널의 하단 6시에서 특히 분명하다. 적절한 역치가 66Zn 데이터에 적용되면, 패널 B의 결과 이미지는 이의 상단의 H&E 이미지에서 보이는 다른 세포 구성을 반영한다. 66Zn을 사용한 이 사전-스크리닝은 비-암성/기질 영역의 복셀에서 "오염"없이 패널 B에 표시된 66Zn 복셀만을 사용하여 55Mn 값의 후속 분석이 보다 정확하게 결정될 수 있음을 다시 보여준다.
당업자라면, 66Zn 이외의 다른 원자 원소 및 이들과 관련된 동위 원소가 암성, 정상, 활성화된 및 기질의 비-세포 성분, 특히 다른 조직 사이의 분화 같은 동일한 유용한 기능을 제공할 수 있음을 인식할 것이다.
실시예 6
유방암
본원에 제시된 데이터는 55Mn 수준과 방사선 감수성 및 방사선 내성과 관련된 종양의 2개의 스펙트럼 말단 사이의 연관성을 처음으로 입증한다. 본원에 제시된 데이터는 또한, 기존의 병리학적 검사에서 감추어져 있으며, 방사선 내성에서 중요한 역할을 하는 HMR의 이전에 알려지지 않은 존재 및 종양이 방사선 치료 후에 재발할 수 있다는 가능성을 나타내는 통찰력도 제공한다. 또한, 이 데이터는 기질 성분과 암세포 집단 사이의 상호 작용으로부터 유래한 금속 기여에 대한 기초를 제공한다.
비제한적인 예로서, "중간" 방사선 민감성, 예를 들어, 유방 및 전립선으로 대략적으로 분류된 종양도 본 발명에 따라 분석하였다.
본원에 기술된 6종의 종양 유형에 사용된 바와 같이, 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법의 동일한 정량적 접근법을 유방의 15개 종양에 적용하였다. 이 데이터의 개요는 도 31에 나타내었다. 이들 유방 종양의 벌크 55Mn 값 (회색 사각형)의 검사는 1,000과 4,400 CC/S 사이의 값을 나타낸다. 이 검사 수준에서 그들은 정상 피종, 소세포 폐 및 림프종에서 발견된 민감한 값과, 교모세포종, 중피종 및 흑색종의 55Mn 값 사이의 딱 중간값이다. 그러나, 이들 유방암의 70% 이상이 HMR (55Mn)을 가지고 있으며, 그 값은 4,000에서 16,000 CC/S (하단 패널의 검은색 사각형)로 확장된다. 게다가, 일부 종양은 엄격한 8x8 검출 역치를 사용하는 이중 및 삼중 HMR(55Mn)을 가진다. 본 발명까지는, 원자 데이터가 "유방암이 매우 이질적이다" 라는 임상 관찰과 일치한다는 것을 깨닫지 못했다.
맞춤 의학의 맥락에서, 유방암을 헤테로지니어스로서 기술하는 현재의 의료 기술은 어느 환자가 방사선 치료로부터 이익을 얻고 어떤 환자가 방사선 치료의 유해한 효과를 피해야 하는지를 결정하는데 도움이 되지 못한다. 임상적 현실은 유용한 예측 척도가 없고 균일한 H&E 병리학이 존재하면 대부분의 유방암 환자는 종양의 외과적 절제술 후 방사선이 조사되고, 예를 들어, 미국에서는 모든 가능한 치료법이 적용되는 것으로 보인다. 유방의 종양에 대한 절제의 경계는 커질 수 있으므로 종양 주변에 있을 수 있는 잔여 암세포를 수술적으로 제거할 기회가 증가한다. 방사선 치료는 절제술을 피한 세포를 파괴할 확률을 더욱 증가시키지만, 원자 데이터가 매우 높은 수준의 55Mn을 나타내는 경우, 방사선의 해를 피할 수 있다. 이러한 높은 55Mn 의 경우, 치료 의도 상황에서의 방사선 치료는 대체로 쓸모가 없다.
도 32의 상단 패널은 39세 여성으로부터 유방의 잘 분화된 침윤성 도관 암종 (스테이지 IIIa T3N1M0)을 도시한다. H&E 절편은 병리학적 검사를 통해 특별할 것 없이 균일하다. 대조적으로, 하단 패널에 보이는 원자 데이터는 HMR(55Mn) (큰 검은색 영역) 의 숨겨진 이질성 및 그들의 중요한 임상적 함의를 나타낸다. 이 유방 절편은 1 mm2 면적으로 조사되었고, 유사 분열율 측정 사용되는 표준 샘플 크기와 일치하도록 유지된다.
도 33은 이전에 적용된 표준 역치 (T1, 0.5배 중간값, T2, 1배 중앙값, T3, 1.5배 중간값 및 T4, 2배 중간값)를 사용하여 2개의 원자 요소 55Mn 및 66Zn에 대해 동시에 분석된 31x31 복셀의 약 1 mm2 면적 분석을 도시한다. 두 HMR(55Mn)은 T4 역치를 사용하는 Mn 분석에서 분명해지는 반면, 66Zn에 대한 동일한 복셀은 벌크 종양 수준에서 유지된다. 55Mn 수준은 이들 HMR의 중요한 특징이다. 8x8 역치보다 작은 크기를 가진 잠재적 HMR(55Mn)은 패널 T3 및 T4에서 다른 두 개 위에 표시된다.
이러한 약 1 mm2 면적에 대한 추가 분석은 데이터를 "풀 (pool)" 하는 겉보기에 균질한 병리학적 샘플의 벌크 분석과 비교하여 HMR을 분석하는데 유용함을 입증한다. 히스토그램 형태의 이 샘플 중의 모든 961개의 복셀의 분석을 55Mn 및 66Zn 값으로 도 34에 나타내었다. 상단 패널에서 복셀 내 높은 55Mn 수준의 균질성은 5000 CC/S 값을 초과하는 값의 피크 및 스미어 (smear)로 표시되며, 약 15,000 값에 도달한다. 이러한 이질성은 예를 들어, Bowley의 Non Parametric Skew Statistic (NPSS) (Bowley, 1901, Elements of Statistics, P S King and Son, publishers, Westminster, London, UK)를 사용하여 복셀 함량 분석에 의해 엄격한 통계적 방식으로 검사될 수 있다. 비제한적인 예로써, 이는 55Mn 데이터 및 NPSS 값 [평균-중간값] / [St.Dev]에 적용되었고, 0.25인 것으로 밝혀졌지만, 보다 대칭적인 66Zn 데이터에 대해서는 0.02로 밝혀져, 큰 차이를 나타냈다. 당업자에게는, 이질성을 측정하기 위한 다수의 통계학적 접근법이 존재하는 것은 명백한 것이며, 본원에 나타난 비대칭도 (Skewness)와 함께 사용될 수 있다.
추가적인 영역 분석은 샘플 전체에 균일하게 분포된 복셀 또는 그들의 응집물로서 존재하는 높은 55Mn 값의 분포를 밝혔다. 마지막으로, 55Mn 수준에서 보이는 균질성과 비교할 때, 하단 패널은 동일한 Zn 복셀이 값이 보다 균일함을 나타낸다. 이는 피크의 부족 또는 하단 패널의 주요 피크 오른쪽으로의 스미어에 의해 연관된다.
전이 과정에서 림프 관 (vessel)/"도관 (duct)"의 암성 세포
상기 기술된 침습성 암종에서 보이는 병리학의 형태학적 균질성의 실시예와 대조적으로, 도 35의 상단 패널은 H&E에 의해 가시화된 48세 여성의 유방의 침윤성 도관 암종 (스테이지 IIa, T2NOM0)의 형태학적 이질성을 도시한다. 이는 ATI의 관점에서 유용한 샘플로, 이 절편은 (i) 연관된 지방 세포와 함께 3시 방향의 정상 유방 소엽 (N으로 표시)의 영역, (ii) C1~C5로 표시된 다섯 영역의 암세포 (C로 표시)는 림프관 내부에서 볼 수 있으며, 따라서 전이 과정 중, (iii) 시료의 가운데와 오른쪽에 퍼진 지방 세포를 포함하여 기질 성분과 함께 집중 면역 세포 영역 (면역으로 표시)를 포함한다.
유방의 정상 부위에서 N으로 표시된 정상 림프관의 55Mn 값은, 3,204, 3,104 및 3,155의 CC/S 값을 산출하였다. 암성 세포를 포함하는 림프관은 유용하다. 림프관 C1은 2,904, C2 및 C3은 2,804, C4는 2,771을 산출한다. 따라서, 이러한 전이성 전이 세포의 55Mn 함량은 유방의 정상관을 구성하는 그들의 전구 세포와는 조금 다르다. 반대로, 림프관 5의 전이 세포는 8612의 중간 CC/S를 가지고 있으며, 방사선-내성일 것으로 예측된다. 이 예는, 작은 단일 유방 샘플에서 발생하는 원자 미소불균일성 (atomic microheterogeneity)을 설명한다. 이 미소불균일성은 미시적인 수준에서는 구분할 수 없기 때문에, 전이 과정에 있는 C1-C5 암세포의 병리학으로부터는 추출할 수 없다.
금속 데이터는 네 가지 모든 금속, 55Mn, 66Zn, 63Cu 및 56Fe이 H&E 염색 절편에서 관찰되는 세포 및 무세포 영역에 대하여 지방 세포로 구성된 영역을 용이하게 분해한다는 것을 나타낸다 (도 36). 지방 세포의 금속 함량은 그러한 세포에서 지질의 큰 농도에 의해 희석된다.
형태학적 및 금속 수준 모두에서 이 유방암 절편에서 매우 명확하게 나타난 이질성 문제는 심지어 동일한 장기 내의 상이한 큰 영역일지라도 다른 암 유형에서도 만연한다.
수술, 화학 요법, 약물 치료, 면역 치료 또는 방사선이 선택 사항인지 여부 및 치료가 의도적 치료인지 완화인지에 따라, 환자의 나이, 환자의 현재 건강 상태, 합병증, 종양 (원발성 또는 전이성)의 위치를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 암을 가지는 환자의 치료에 관하여 의료 전문가에 의해 고려되는 다수의 중요한 문제가 있다. 이 목록은 최선의 선택을 하기 위해 해야 하는 임상적 결정 네트워크를 예시한다. 혈액 검사 및 스캔이 완료된 후 중앙 결정 노드는 종양의 병리학이다. 종양이 양성인지 또는 진행될 가능성이 있는지에 대한 추론이 이루어지기 때문에, 다른 모든 결정은 이 노드에서 얻은 정보를 따른다. 유사 분열 속도를 측정하는 경우를 제외하고, 본 발명에 이르기까지, 상기 추론은 현재 정량적 데이터에 근거하지 않고, 특정 종양 유형에 대한 일반적인 경험에 근거한다. 비교적 흔하지 않은 종양의 경우, 치료적 단계가 최선의 선택인지에 대한 지침을 제공하는 임상 시험은 거의 없다. 심지어 유방, 전립선, 뇌, 피부 및 난소와 같은 일반적인 종양 유형의 경우에도, 존재하는 수많은 임상 시험의 단점은 계속되는 논란으로 이어진다. 주요한 문제는 특정 종양 유형의 중추적인 병리학적-결정 노드에서 수집된 데이터가 필수적인 정량적 품질이 아니며, 이 출원 이전까지 모든 종양 유형에 일반화될 수 없다는 것이다.
중대한 병리학적 정보의 임상적 "가치" (즉, 방사선과 같은 주요 치료 옵션이 실행되어야 하는지 여부에 대한 포인터)는 주로 항체 정보 또는 보다 새로운 게놈 및 프로테옴 기술에 의해 더욱 보완되는 여러 형태의 in situ 혼성화와 병용된 염색 방법의 주관적 해석에 크게 의존한다. 하기 추가 예제에 의해 강화된 바와 같이, 원자 데이터는 이 주요 병리/방사선-치료, 결정 노드에서 지금까지 부족한 새로운 정량적 척도를 제공한다. 임의의 종양 유형의 원자 치료 지수는 처음으로 환자가 방사선 치료에 적합한 후보자이고, 방사선 치료 후에 종양이 재발할 가능성이 있는 정량적 근거를 제공한다.
실시예 7
전립선 암
도 37은 조직 또는 장기, 이 경우에는 전립선의 상이한 부분에서 병리학적 상태의 이질성의 임상 예를 나타낸다. 미국의 최종 전립선 조직 검사 보고서 (Final Prostate Biopsy Report) (환자의 공개 허가가 있음)에 의해 도시된다. 상기 환자 (이하 환자 X라고 표시함)는 PSA 수준이 8.1 ng/ml인 전립선의 선암을 가지고 있다. 상기 조직 검사 보고서는 전립선의 다른 영역의 이상을 문서화한 것으로, 12개 중 7개 영역에서는 유의성 변화를 나타내고, 글리슨 (Gleason) 스코어로 정의된 "암"을 가진 5개 영역은 7 (상단 패널) 이하이다. 열두 개 핵심 조직 검사 각각의 관련 정도에 대한 진단 요약도 나타낸다 (하단 패널; 파트 A - 파트 L). 본 발명 전에, 이 환자는 그러한 치료가 보장될 것임을 나타내는 어떠한 정량적 조치없이 방사선 치료에 대해 평가될 것이다. 이 환자는 주치의와의 얘기 후, 개인적 취향에 따라 방사선 치료를 받았고, 다른 옵션은 급진적인 전립선 절제술이었다. 본 발명에 따르면, 이들 영역 각각 내의 요소의 화학적 분포가 측정되며, 예를 들어, 55Mn 수준, 2D 분포 및 HMR(AM)은 레이저 절단에 의해 결정된다. 결과는 중심 경향의 측정 값을 계산하는 것이 포함되는 사용 가능한 통계 방법과 통계 이론을 사용하여 분석되었고, 여기서 중앙 경향의 일반적인 측정값은 중간값, 산술 평균 및 모드이다. 기하 평균, 메디민 (medimean), 윈소라아이즈드 k-배 평균 (winsorized k-times mean), K-배 트림드 평균 (K-times trimmed mean) 및 가중 평균을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다른 중심 경향의 임의의 다른 척도가 또한 사용될 수 있으며, 상기 데이터는 또한 중심 경향을 계산하기 전에 전환될 수도 있다. 상기 데이터는 예를 들어, Kolmogorov-Smirnov 테스트를 포함한 비-모수 통계 분석 (non-parametric statistic)를 사용하여 테스트하며, 이는 데이터 분포에 대한 가정을 하지 않는다. 다른 통계 방법에는, 베이지안 (Bayesian)과 더 많은 표준 통계의 조합이 포함되며, Lee와 공동 저자가 통계적 유의성의 해명-P 값으로부터 베이지안 분석에 이동하는 시간 (Demystify Statistical Significance-Time to Bayesian Analysis) (Lee, J Journal of the National Cancer Institute, 103, 2-3, 2010) 및 Berry, Carlin, Lee & Muller의 임상 시험을 위한 베이지안 적응 방법에 의해 확실히 밝혀졌다. Chapman 및 Hall/CRC Biostatistics 시리즈: ISBN 9781439825488. 2010; Nuzzo, Nature, 506, 150-152. 2014.
다른 통계 방법은 다음의 것을 포함한다: Talfryn et al., British Medical Journal, 316, 989-991, 1998; Sterne & Smith, British Medical Journal, 322, 226-231, 2001; Bland & Altman, British Medical Journal, 328, 1073, 2004. 임상 환경에 있어서 다른 방법은 다음의 것을 포함한다:Rubinstein et al., Journal of the National Cancer Institute, 99, 1422-1423, 2007; Krzywinski & Altman, Nature Methods, 10, 1041-1042, 2013.
통계 분석이 완료되면, 종양의 상이한 부위의 방사선-민감성 또는 방사선-내성 및 가장 적절한 치료에 대한 결정이 이루어진다. 예를 들어, 벌크 수준에서 방사선-민감성으로 여겨지는 종양 및 이의 암 세포-함유 HMR(55Mn) (있는 경우)가 조사된다. 방사선-내성이거나, 큰 HMR(55Mn)을 가지는 것에 대해서는 방사선 치료는 권장하지 않는다. 선택적인 방사선 치료는 방사선-내성인 종양의 특정 영역에 대해 권장된다. 예를 들어, 종양의 특정 영역을 선택적으로 타겟으로 하는 임의의 방사선 치료가 권장된다. 당업계에서 이용 가능하고 공지된 그러한 선택적 방사선 치료가 고려된다. 당업자는 어느 선택 치료가 보장되는지 용이하게 결정할 수 있다.
LA-ICP-MS의 동일한 정량적 접근법이 지금까지 기재된 이전의 7가지 종양 유형에 사용된 바와 같이 전립선 10개 종양에 적용되었다. 이들 데이터의 개요는 도 38에 나타내었다.
결론: 종양은 높은 HMR(55Mn)을 가지지 않으며, 그들의 복셀값은 일반적으로 ATI 스펙트럼의 낮은 끝점 (즉, 낮은 범위 CC/S)에 있었고, 따라서, 이 샘플에서 상기 종양은 대부분 방사선 민감성임이 예상된다.
실시예 8
뇌로 전이한 피부의 원발성 흑색종
도 39 및 도 40은 상세한 임상 데이터 및 처음에 원발성 흑색종을 나타내고 이어서 뇌종양으로 진단된 70세 환자 (이하 환자 Y로 표시함)로부터의 정량적 원자 데이터에 대한 이들의 비교를 나타낸다. 상기 환자는 전뇌 방사선, 잡다한 약물, 면역 치료 (펨브롤리주맙, pembrolizumab)로 치료를 받았고, 마지막으로 정위 개두술 (stereotactic craniotomy)을 받았다. 이 예는 ATI를 일상적인 의료 행위에 둘때 필요한 원자 데이터와 임상적 기준을 일치시키는 데 필요한 임상 세부 수준을 나타낸다. 상기 환자는 공개의 모든 허가를 제공하였다.
환자 Y는 초기에 상부 등의 원발성 흑색종, 명확한 감시 림프절 (sentinel lymph nodes) 및 다수의 기저 세포 암종 및 편평 세포 암종 (squamous cell carcinomas)으로 진단되었다. 몇 년 후, MRI 스캔은 왼쪽 두정엽의 대뇌 신생물을 나타냈다 (도 39, 패널 A, 화살표). 방사선 치료 후, MRI 스캔은 해석의 모호성을 가지는 종양 부위에 잔여 물질의 존재를 나타내었다 (도 39, 패널 B).
상세한 병리학적 보고서는 원발성 흑색종의 피부로부터의 절편이 종양 세포가 MelanA에 대해 양성이고, 34Be12에 대해 음성인 궤양성 결절 흑색종을 나타내 었고, 이는 흑색종과 일치한다 (도 39, 패널 C). Breslow 두께는 3.8 mm; Clark level 4; 궤양화, 3 mm; 피부 침윤성 종양 폭 약 50%; 피부 유사분열 mm2 당 9번 이였다 (높은 유사 분열율로 간주; 우성 세포 유형, 결장 및 상피 세포증; 혈관 내 및 림프계 침윤은 보이지 않았고 화학선/일광탄력섬유증은 경미하였다).
멜라닌성 영역은 상단 등에서 광범위하게 절제하였고, 4개의 감시 림프절 절제가 수행되었다. 병변을 원발성 흑색종으로 확인하기 위해 절편을 S100, HMB45 및 MelanA로 치료했다.
제1 타원이 흑색종을 나타내지만, 더 넓은 절제에서 종양이 더이상 나타나지 않았다. 인접한 표피는 반응 변화를 나타냈다. 감시 림프절 1, 2, 3 및 4는 H&E 및 면역퍼옥시다제에 의한 염색에 기초한 추가 악성 종양의 증거를 나타내지 않았으나, 노드 3의 상태는 보고되지 않았다. 절제 이후, 상기 환자는 "암이 없다"고 선언되었고, 6개월 후 재발하는 흑색종의 징후는 보이지 않았다.
3년 후, 환자는 쓰러졌지만 회복되었고, 걸을 때 좌측 다리의 불일치의 징후를 나타냈다. 다리의 무의식적인 운동의 비슷한 에피소드는 하루에 20번까지 반복되었고, 초기에는 머리 왼쪽에 이상한 느낌이 동반되었다. 대뇌 MRI는 중심전회 주위의 정중옆의 왼쪽 두정엽에서 14 mm의 콘트라스트 (contrast) 증강 병변을 나타 냈다 (도 39). 방사선 전문의는 저 등급 신경교종의 감별 진단을 했지만, 3년 전에 흑색종이 있었기 때문에 두개골 병변이 재발성 흑색종일 수 있다는 가능성이 있었다. 이러한 모호성은 MRI의 한계에 반영된다. 상기 방사선 전문의는 "이 병변의 성질"이 불확실하다. 병변과 관련된 매쓰 효과 (mass effect) 또는 부종이 없기 때문에, 특히 저등급인 뇌의 신생물을 나타낼 가능성이 있다. ADC (겉보기 확산 계수, Apparent Diffusion Coefficient)지도에서 저 신호의 확산 가중 스캔에 대한 결과는 신경절교세포종과 같은 저 등급 병변을 유발할 수 있지만, 어떠한 낭포성 성분도 없는 DNET (Dysembryoplastic Neuroepithelial Tumor) 또는 다형성 황색성상세포종을 고려해야 한다. 작은 핍지교종일 가능성 남아있다 "고 결론지었다.
정위 방사선 수술이 적절한 선택인 경우, 신경 외과 수술을 시행하지 않는 것이 바람직하다. 상기 환자가 원발성 흑색종으로 진단되었다면, 뇌 병변은 전이성 흑색종일 가능성이 있었다. 상기 환자는 전이성 흑색종에 대해 총 방사능 선량이 25 Gy인 방사선 치료를 받았고, 또한 방사선 치료 후 2개월 간 펨브롤리주맙 면역 치료 과정을 시작했다. 그로부터 1개월 후, MRI에서 정중선 전두엽 전이가 직경 16 mm에서 11 mm로 줄어들었다. 액면 그대로, 종양은 민감하고 내성인 성분을 가지고 있었다. 상기 종양은 더 가늘어지는 마진과 보다 분리된 저강도 중심을 가지고 더 잘 정의되었다. 이러한 종양 크기의 감소는 대부분 방사선에 의한 것이며, 면역 치료 약물 펨브롤리주맙에 의한 것이 아니며, 이 약물 치료 1개월 후의 종양 퇴화는 평균 6%에 불과하다 (Hamid et al., 2013, New England Journal of Medicine, 369, 134-144). 이 환자의 종양은 16 mm:16 mm:16 mm에서 11 mm:11 mm:11 mm까지 직경이 축소되었다. 이는 (5+5+5)/(16+16+16)의 31%의 감소이며, 그 중 6%는 약물에 기인 할 수 있으며, 25%는 방사선에 기인한다. 이는 종양의 초기 퇴행의 80% (25/31)가 방사선으로 인한 것임을 의미한다. 3개월 후 추가 MRI 스캔을 실시한 결과, 종양 기저부에 인접한 흰 물질에서 주변부 조영 증강의 홍조가 나타났으며, 마지막 검사 이후 종양의 진행이 나타남을 암시한다. 상기 종양은 2개월 후에 여전히 11 mm의 가장 긴 직경이였다. 후에 MRI에서도 종양 주변에서 현저한 진행을 나타내었으며, 가장 긴 직경에서 23 mm를 측정했으나 (도 39 패널 B), 이것이 방사선-괴사 또는 진행성 종양인지는 알 수 없었다. 상기 환자는 또한 아바스틴 (Avastin)으로 치료를 시작했으며 개두술로 진행하기로 결정되었다. 개두술 전에, 고강도 중심적 괴사성 종양이 나타났는데, 높은 등급 종양과 일치하는 약 18x33 mm 축경유 (transaxial)와 33 mm 상사근 (superior oblique)이 특징을 보였다. 상기 환자는 이 좌 정면 병변을 제거하기 위해 정위 개두술을 받았다.
절제된 뇌종양의 조직 병리학은 15 mm x 10 mm x 5 mm 및 9 mm x 6 mm x 5 mm을 측정한 황갈색 및 갈색의 부서지기 쉬운 연한 조직 2개를 나타냈다. 얼룩진 핵을 가지는 굉장히 소수로 잔존한 실활된 "흑색종" 세포가 있으며, 이 물질 중에 잔존하는 생존 가능한 악성 종양의 확실한 증거는 없었다. 상기 물질은 흑색종 마커 melanA 및 HMB45에 대해 음성이었고, 명확한 색소는 보이지 않았다. 마커 확인이 없는 경우, 병리학자가 흑색종 쪽으로 기울어졌어도 이것이 전이성 흑색종 또는 독립적인 뇌 병변이라는 사실을 명확하게 밝히기에는 불충분하다.
원발성 종양 조직 검사의 원자 분석
방사선 전에 뇌 병변의 조직 검사를 하지 않았기 때문에, 종양 동일성 및 방사선-반응도에 대한 이용 가능한 유일한 증거는 원발성 종양에서 유래한다 (도 39, 패널 C, D 및 E). 표준적인 염색되지 않은 5 미크론 조직 절편이 얻어지고 (모든 윤리적, 법적 및 환자의 동의 여부가 충족된), 도 39 패널 C의 전 영역이 레이저 절단 되고, 이어서 정상 기질 이질성 간의 암성 세포의 둥지 존재 여부를 검사하였고, 패널 C의 대부분에서 보였다.
레이저 절단으로부터 수득한 수치 데이터를 도 40에 나타내었으며, 원발성 종양의 상이한 다섯 개의 영역을 분석하였다. 백그라운드를 뺀 후의 다섯 개의 모든 트랙의 중간 55Mn 값은 방사선-반응도의 중간 범위에서 원발성 종양을 3.747 CC/S (ATI)로 두었다.
상기한 바와 같이, 환자는 또한 PD-1을 표적하는 펨브롤리주맙의 면역 치료로 치료되었기 때문에, 이는 최종 결과에 기여한 이러한 모든 요인의 조합이다. 그러나, 상기에서 지적한 바와 같이, 초기 종양 사이즈의 감소의 80%는 방사선 치료에 기인할 수 있다.
실시예 9
눈에 보이는 종양의 방사선 조사 후의 종양 상태
ATI의 측면에서보다 정량적 인 접근에 유리한 종양의 원천이 있으며, 이들은 "외부에서 볼 수있는"종양으로 방사선 치료 후 상태, 진행 및 상태가 "내부"종양보다 더 쉽게 측정 될 수 있습니다. 환자 Z는 이러한 경우의 예입니다 (그림 41). 사생활 보호의 이유로이 사례는 외부에서 볼 수있는 종양의 방사선의 직접 측정 가능하고 모호하지 않은 결과에 대한 예시이며 환자 Y의 뇌 병변에서 경험 한 내부 종양 이슈와 경험 한 모호성의 차이를 강조합니다.
환자 Z는 방사선 치료 후 6 개월 이내에 거의 완전하게 분해 된 편평 세포 암종 (도 41 상부 패널)에 대해 방사선 치료되었다 (하부 패널). 생체 검사가 원자 분석에 사용 가능했다면 임상 반응과 ATI의 비교가 유용했을 것입니다.
환자가 특정 종양 유형을 가졌는지에 대한 정보를 제공하지만 그 환자에게 특화된 다음 치료 단계를 제공하지 않는 다른 진단법과는 달리, ATI는 모든 종양 유형에 적용 가능하다. ATI는 팬 진단입니다. 예를 들어 PSA 검사의 방식으로 제한되지는 않습니다. 4 ng / ml 이상의 값을 얻은 경우 다음 질문은 다음과 같습니다. 치료 적 개입이란 무엇인가? 급진적 인 전립선 절제술, 방사선 (외부 광선, 근접 치료 또는 양성자 광선),주의 깊은 대기, 냉동 요법 또는 안드로겐 박탈 치료입니까? ATI와 달리 PSA 테스트 자체는 치료 지침을 제공하지 않습니다.
유방암의 경우, 광범위한 마진을 가진 종양의 완전한 절제가 수행 되더라도, 화학 요법, 방사선 치료, 호르몬 요법 및 허셉틴 및 / 또는 아바스틴 및 / 또는 면역 체크 포인트 억제제에 의한 약물 치료가 수행된다 및 / 또는 면역 작용제 및 / 또는 백신의 잠재적 인 방사성 반응성과 관련하여 1 차 원인에 관한 정보가 없으면 종양이 재발 할 확률은 얼마인가? 예를 들어, 유방 종양 조직 검사이 임계치 이하의 ATI를 갖는 경우, 방사선 후 재발 가능성은 조직 검사의 ATI가 임계치를 초과하는 경우보다 낮을 것이며 종양이 하나 또는 여러 개의 HMR (55Mn)을 갖는 경우보다 낮을 것입니다 셀이 이미 이전되었을 수 있습니다. 종양 세포가 이미 유방에서 가까운 림프절로 전이 된 경우, 이러한 노드에서 ATI (높거나 낮음)를 측정하면 임상의에게 환자를보다 면밀히 모니터링해야하는지 여부가 표시됩니다.
마찬가지로 흑색종에서의 BRAFV600E 돌연변이 및 많은 게놈 검사에서 표적 가능한 "운전자"돌연변이의 존재는 세포 샘플 또는 혈관계 내의 순환 핵산으로부터 유추된다. 전자가 종단 그룹의 풀링 된 그룹이므로 종양 환경의 2D 시각화가 중요하지 않습니다. 이것은 ATI와 풀 샘플의 사용 사이의 중요한 차별화 요소입니다. 후자의 경우, 작은 수치의 암세포 또는 활성화 된 간질 세포의 결과에서 높은 수치가 유래하는지 여부를 알 수 없으며, 대부분의 세포 표본에서 독서에 기여한다. 치료에 대한 임상 적 의미는 매우 다릅니다. 예를 들어, vemurafenib로 치료 한 흑색종 환자는 종양에 소수의 세포를 가지고있어 변형 된 단백질을 생산할 수 없으며 치료 효과는 거의 없을 것이다. 그러나 흑색종 환자에서 많은 양의 세포가있는 흑색종 환자에서 훨씬 효과적이다. 종양이 결함이있는 단백질 생성물을 생성하고 있습니다. 이 구별은 2D 조경이 가능하지 않으면 어렵습니다.
실시예 10
방사선 증감제/ 시너지제를 이용한 측정
10붕소
종양의 방사선-반응도는 55Mn 및 본 발명에 따른 이의 교정된 신호를 측정함으로써 결정되며, 상기 방사선-반응도는 또한 증감제의 첨가에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 경우, 붕소 중성자 포획 치료 (Boron Neutron Capture Therapy)의 성공은 총 55Mn 교정 신호와 증감제 모두에 의존한다. 망간이 많은 종양 세포 집단에 p-보로노페닐알라닌과 같은 증감제를 첨가하는 것은, 망간이 적은 세포 집단에 첨가하는 것보다 유용하지 않을 수 있다. 이 예에서, 종양에 대한 ATI는 붕소 중성자 포획 치료를 사용하기 전에 LA-ICP-MS를 사용하여 결정된다.
종양 샘플은 FDA가 승인한 증감제, 예를 들어 p-보로노페닐알라닌과 같은 10붕소 유도체 또는 이전에 기술된 바와 같은 붕소 유도체를 함유하는 리포솜의 정맥 내 주입 (Heber et al., Proc . Natl . Acad , Sci . USA, 111, 16077-16081. 2014), 또는 이전에 기술된 바와 같은 붕소 나노입자 (Petersen et al., Anticancer Research, 28, 571-576, 2008)가 미리 정맥 내로 주입된 환자로부터 취한다. 그런 다음, 상기 종양 샘플은 이의 수준 및 분포가 방사선 측면에서 유익한지 여부를 결정하기 위해 10붕소의 2D 분포에 대해 검사한다. 동시에 또는 개별적으로 Mn의 분포 및 수준이 결정된다. 55Mn 및 10B의 상대적인 양은 방사선에 대한 환자의 적절한 종양을 결정한다.
붕소 중성자 포획 치료 (BNCT)를 간단히 기재하였다. 종양을 방사선에 대해 더욱 민감하게 만드는 많은 외부 독립체, 예를 들어 붕소, 10B가 알려져 있다. 열 중성자는 10B의 핵에 의해 포착되고, 핵분열 반응은 반동, 알파 입자, 약한 감마선 (0.5 MeV 감마 광자), 및 2.4 MeV의 운동 에너지로서 7리튬을 생성한다. 상기 7Li 이온 및 알파 입자는 고 선형 에너지 전달 방사선으로 분류되며, 매우 파괴적이다.
마우스 연구에서, 마우스에 붕소 나노 입자로 전-배양된 세포를 피하 주사하고, 중성자 방사선으로 조사하면, 종양의 성장이 지연되기 때문에 더 긴 생존을 유도한다 (아마도 붕소가 있는 종양이 중성자 조사에 보다 민감해졌기 때문일 것이다.) (Petersen et al., Anticancer Research, 28, 571-576, 2008). 두경부 종양의 치료를 위한 임상 시험은 Boneca Corporation (ClinicalTrials.gov identifier; NCT00114790)에 의해 시작되었다. 또한, p-보로노페닐알라닌 및 중성자 방사선으로 치료받은 아르헨티나 환자 (흑색종의 다중 피하 전이를 동반하는)에 대한 I/II 상 임상 시험에서 거의 70%의 반응률을 보였다 (Menendez P Appl. Rad. Isot. 67, (7-8 Suppl.)S50-S53). 2009). 붕소 중성자 포획 치료는 비-소세포 폐암에도 사용되었다 (Farias et al., Phys. Med. 30,888-897. 2014).
2 데옥시 -D- 글루코스 , 2-DG
다른 유용한 방사선 증감제는, 예를 들어, 문헌 (Shenoy & Singh, Cancer Investigation 10, 533-551, 1992)에 요약된 것들을 포함한다. 이들은 2 데옥시-D- 글루코스, 2-DG를 포함하는데, 이는 글루코스의 아날로그와 유사하지만 2번 위치의 하이드록실 그룹을 갖지 않는다.
2-DG는 가용 연료로서 글루코스를 우선적으로 사용하는 종양 세포에 의해 적극적으로 흡수되지만, 헥소키나제에 의한 인산화되면, 2-DG는 더 이상 대사되지 않는다. 따라서, 포도당 흡수 및 후속 단계와 경쟁함으로써, 2-DG는 대사성 스트레스를 유발하고 세포를 방사선에 보다 민감하게 만든다. 이온화 방사선에 노출되어 동시에 2-DG로 처리된 세포주에서는, 일부에서는 방사선 손상이 증가하였고, 세포주 사이의 일반적인 이질성이 관찰되었다 (Dawrkanath et al., Int. J Radiat. Oncol. Biol . Phys. 50, 1051-1061, 2001). 일부 종양 세포 집단의 방사선 증감작용은 티올 대사의 교란을 통해 발생한다고 생각된다 (Lin et al., Cancer Research, 63, 3413-3417, 2003).
진행된 뇌종양 환자에 대한 초기 I/II 상 임상 시험에서는, 2-DG를 대부분의 분획, 5Gy, 방사선 치료 (2-DG + RT)와 병용하는 경우의 독성 및 실행 가능성이 용인된 것으로 밝혀졌다 (Mohanti, B, Int. J. Radiat. Oncol, Biol. Phys, 35, 103-11, 199).
2-DG 및 방사선의 증가된 경구 투여량으로 다형성 교모세포종 환자의 치료는 정상적인 뇌에 심각한 손상을 주지 않으면서 250 mg/kg까지의 체중이 잘 견딜 수 있음을 나타내었다. 또한, 이 코호트에서 60명 환자 중 일부는 방사선 치료만을 받은 환자의 중간 생존율을 초과한 것으로 나타났다 (Singh et al., Strahentherapie und Onkologie, 8, 507-514, 2005). 환자 치료 및 결과에 대한 요약은 Dwarakanath, J. Cancer Research and Therapeutics, 5, 21-26, 200에 나와 있다.
마지막으로, 이소성 췌장 종양을 갖는 누드 마우스에서, 2-DG + 방사선으로 처리하면 대조군에 비해 종양 성장을 억제하고 생존율을 증가시켰다 (Coleman et al., Free Radical Biology and Medicine, 44, 322-331, 2008).
따라서, 방사선에 전에 종양을 55Mn (및 임의의 다른 관련 금속 데이터)에 대해 시험하는 것은 2-DG뿐만 아니라, 방사선 증감제에 본 발명의 기술을 적용한 또 다른 실제 적용이다.
면역 치료
방사선 및 이어지는 항암 면역 반응은 암세포의 표면상의 항원의 증가된 제시 및, 단백질 및 펩타이드 (와 단백질 및 펩타이드에 결합된 금속)의 숙주의 방출과 상호 작용하는 시스템을 형성하고, 이는 항원-제시 세포의 반응에 영향을 미친다. 따라서 조사된 원발성 종양 (또는 조사되지 않은 동일한 개체 내에서 먼 전이성 증식)은 다양한 면역 세포에 의한 공격에 민감해질 수 있다. 이 증가된 민감성에 대한 기계론적 근거는 적극적으로 논의되었지만 해결되지 않은 상태이다 (Sharabi et al., 2015, Oncology [Williston Park] 2015, 29(5), pii:211304; Formenti, J Natl Cancer Inst . 105, 256-265, 2013). 방사선에 대해 내성이 강한 흑색종은 높은 수준의 멜라닌 (많은 금속을 저장함)을 가진다. 본 발명의 맥락에서, 면역 치료의 효능이 또한 다루어진다. 특정 이론에 구애받지 않고, 방사선 내성 암세포의 광범위하고 매우 상이한 대사 특성은 민감성 암세포와 비교하여 방사선 치료 전후에서도 면역계에 의해 똑같이 처리되지 않을 것이다. 따라서 방사선은 면역 치료와 병행한다; 면역 치료 이전 방사선, 또는 방사선 이전 면역 치료는 차별적 선택 때문에 종양 내에서 매우 다른 세포 집단을 산출할 것이다. 이 예에서, 종양은 본원의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예의 방법에 따라 그의 ATI에 의해 먼저 특징화되고, 이어서 유용한 면역 치료가 적용된다. 면역 치료의 효능 및/또는 예를 들어 면역 치료 전, 치료 중 또는 치료 후 방사선 치료를 투여할 때, 본원의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예에 따른 본 발명의 방법을 수행함에 따라 고려된다. 면역 치료의 다른 유형은 동일한 유형의 방사선으로 다르게 작용한다고 생각된다. 예를 들어, 거세-저항성 전립선암에 대한 Sipuleucel-T (전립선 포스파타아제에 대한 면역 유도를 위해 설계된 수상 돌기 세포 백신), 절제 불가능 전이성 흑색종에 대한 이필리무맙 (ipilimumab) (항 CTLA4), 흑색종에 대한 pembrolizumab 및 nivolumab (항-PD-1), 흑색종 및 진행성 편평 비-소-세포 폐암에 대한 니볼루맙 (nivolumab), 및 트레멜리무맙 (tremelimumab) 및 리릴루맙 (lirilumab)은 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T 기반 면역 치료)와 관련된 면역 치료보다 방사선에 대한 다른 반응을 일으킬 수 있다. 교모세포종의 치료를 위해 체크포인트 차단 면역 치료 (Checkpoint Blockade Immunotherapy) 와 정위 방사선 전달이 병용되고 있지만, 교모세포종은 단일체로서 처리되고 있다. 따라서, 임의의 교모세포종은 본원의 임의의 양태, 실시양태 또는 실시예의 방법에 따라 특징화되며, 면역 치료에 가장 잘 반응하는 환자에 대한 평가가 제공된다.
로즈 벵골 및 흑색종
로즈 벵골 (4,5,6,7-테트라클로로 -2', 4', 5', 7'- 테트라요오드-플루오레세인)은 1882년에 특허된 공업용 화학 물질로, 실 및 식용 적색으로 전환한다. 피부 흑색종에 병변 내로 적용하면 일부 종양의 상당한 수축이 있을 수 있다 (Thompson et al., Melanoma Research, 18, 405-411, 2008; Thompson et al., Ann. Surg. Oncol. 22, 2135-2142, 2015).로즈 뱅골 병변 내 치료 후 치료된 피부 병변의 부피는 감소한 반면, 동일한 환자의 원거리 치료되지 않은 종양 중 일부 또한 줄어들어 면역 반응이 관련되어 있음을 나타낸다. 로즈 뱅골 (RB) 치료에 방사선 치료 (RT)를 추가하면, RB와 RT 모든 치료를 받은 3명의 환자에서 나타난 것처럼 종양 제거가 더욱 향상될 수 있다 (Foote et al., Melanoma Research, 2010, 20, 48-51, 2010). 그러나, 이들 환자의 방사선 치료는 이 출원 이전에 방사선 반응도를 측정할 수 없었기 때문에 그들의 다중 종양의 방사선-민감성 또는 방사선-내성에 대한 어떠한 선험적 지식에 근거하지 않았다. 실제로 "흑색종의 최적 용량 및 분획 화에 대한 합의가 아직 없다"는 것이 지적되었다 (Foote et al., Melanoma Research, 20, 48-51, 2010).
로즈 벵골은 방사선에 대한 세포의 증감제, 면역계의 증강을 통한 증감제, "부가 세포 사멸"제 또는 시너지제와 같은 다중 작용 방식을 갖는 제제로 간주될 수 있다. 이들 상호 작용 물질의 분자 메커니즘이 알려지지 않았기 때문에 이들을 구별하는 것이 불가능하며, RB를 받아들인 암성 및 기질 세포의 공간적 배열은 알려지지 않았다. 따라서 임상의에게는, 특히 지방, 위성 및 전이 중 재발과 같은 영역 전이성 영역을 가진 흑색종 환자 관리의 어려운 과제가 남아 있다. 현재 치료 가이드라인은 주로 외과적 절제, 국소 절제, 병변 내 화학 치료 및 베무라페닙 (vemurafenib)과 같은 표적 약물을 포함한다. 이 모든 것은 "병의 이질성과 병변의 빈번하고 지속적인 증식 때문에 도전적이다" (Thompson et al., 2015, Ann. Surg. Oncol. 22, 2135-2142, 2015).
로즈 벵골과 치료 옵션에 대한 현재 출원과의 관련성은, 로즈 벵골 분자가 LA-ICP-MS에 의해 조직 절편에서 쉽게 측정되는 4개의 요오드 원자를 함유한다는 점이다. 따라서 로즈 벵골에 의해 병변 내 주사된 임의의 종양의 절편을 방사선 치료 전에 요오드, 55Mn 또는 기타 원자에 대한 각 복셀에서 동시에 분석하여 어떤 세포 집단이 방사선에 민감한지를 결정할 수 있다. 이 방식으로 민감한 병변을 보다 정확하게 표적화 할 수 있다. 방사선에 이어 RB, 또는 RB에 이어 방사선의 상대적인 임상적 유효성을 결정하는 데이터는 아직 없다. 명확한 것은 RB의 병변 내 주사가 가능한 임의의 종양이 방사선 치료 옵션에 대한 정량적 데이터를 제공하기 위해이 출원의 방법으로 분석될 수 있다는 것이다.
비제한적인 예로서, 다중 코어 니들 접근법을 통한 전립선 내로의 RB의 주입 및 조직 절편으로부터의 요오드 및 55Mn의 동시 레이저 절단 분석은 정상, 암성 및 기질 집단의 어떤 세포 유형이 우선적으로 RB를 보유하는지에 관한 정보를 제공한다. 이러한 공간적 분포는 방사선 치료와 관련된 의사 결정을 향상시킬 것이다.
유사하게, 유방 종양 영역 내로의 RB의 병변 내 침착은 조직 절편으로부터 요오드 및 55Mn의 동시 레이저 절단 분석을 허용하고, 정상, 암성 및 기질 집단의 어느 세포 유형이 우선적으로 RB (이 출원의 도 35 및 36에서 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu에 대해 표시한)를 보유하는지에 대한 정보를 제공한다. 이러한 공간적 분포는 방사선 치료와 관련된 의사 결정을 향상시킬 것이다.
실시예 11
원자 치료 지수의 임상 실행
8가지 상이한 종양 유형으로부터의 데이터의 분석은 ATI의 기술적 및 임상적 양상을 전망적이게 하는 다수의 발견을 나타냈다. 예기치 않게도, 멜라닌은 다른 종양 유형은 멜라닌을 합성하지 않기 때문에 다른 모든 상피 종양과는 다르다 (관련없는 세포 유형에서의 멜라닌 생성을 최대로 하는 모든 경로의 우연적 활성화 또는 면역 세포와 윽색종 세포 사이의 세포 융합의 결과가 아닌 한). 게다가, 흑색종은 상이한 배아 구조를 이주시키고 셋업하는 이동 세포인 신경능선 세포 (neural crest cell)의 초기 발생학적 유도체로부터 유래한다. 생식 세포의 초기 이동 특성을 제외하면, 신경능선 세포는 장거리로 이동하는 유일한 일시 세포 유형이다. 다양한 멜라닌성 종양에 대해 본원에 기술된 바와 같이, 멜라닌은 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu의 고농도로 공동 국소화 된다. 이 중 55Mn은, 55Mn이 다양한 화학 물질 (도 2)에 결합할 때 O2·-, H2O2 및 매우 위험한 하이드록실 라디컬 OH·를 결합하는 능력에 의해 방사선 방호를 제공할 가능성이 가장 큽크다. 또한, 종양 전체에 걸친 높은 멜라닌 농도는 다른 종양 유형에는 이용할 수 없는 방사선으로부터 물리적 차폐도를 제공할 수 있다. 다른 모든 종양 유형으로 합리적으로 배치할 수 있는 유일한 흑색종은 멜라닌 생산을 유도하는 단계의 불활성화를 통해 완전히 무멜라닌화 된 흑색종이다. 이와 관련하여, 본원에서 검사되었고, 현미경 검사 (정량적이지 않음)에 의해 멜라닌 색소 과립의 농도가 명백하게 낮은 흑색종은 55Mn CC/S 값이 낮았다 (1,939, 1,239, 817, 1,439, 1,278, 939, 1,617 및 1,678 CC/S의 중간 복셀값). 이들 모두 도 11에 도시된 2K ATI 역치 이하로 떨어진다. 이 발견이 이어서 정량적으로 확인되면, HMR의 부재에서 무멜라닌화 상태는 낮은 55Mn ATI 및 방사선 민감성을 나타낼 수 있다.
임상적 맥락에서, 종양 조직 검사에 대한 ATI의 적용을 위한 하나의 방식은도 42 및 도 43에 도시된 흐름도이다. 전자의 경우, 쉽게 접근되는 흑색종은 환자 Y에 의해 예시된 바와 같이 넓은 절제를 하는 수술에 의해 제거될 것이다. Bowley의 Non Parametric Skew Statistic (Bowley, 1901, Elements of Statistics, P S King and Son, publishers, Westminster, London, UK)을 통한 복셀 함량의 분석은 균질성 또는 이의 결핍의 첫 번째 표시를 제공한다. 둘째, 균질성 조건은 (i) 55Mn, 66Zn, 56Fe 및 63Cu에 대한 NPSS 값이 모두 낮고, (ii) 암세포 또는 기질 구획 모두에서 HMR(55Mn)을 가지지 않고, (iii) 명백한 멜라닌화이다. 샘플이 균질하다는 것이 밝혀지면, ATI는 임상적으로 중요한 선택된 역치보다 높거나 낮을 것이다. 원발성 종양이 절제된 경우, 균질성 및 역치 위 또는 아래에 대한 데이터는 환자 Y의 두개골 전이와 같이 이미 전이된 임의의 세포의 가능한 특성에 대한 정보를 제공한다. 원발성 흑색종이 제거된 환자의 절제된 림프절 분석은 상기와 동일한 방식으로 분석될 것이다. ATI는 나중에 원발성 종양의 전이 유도체가 발생할 경우 방사선 시작 여부에 대한 지침을 제공한다. 전이성 부위의 조직 검사가 가능하다면, 도 42의 흐름도가 새로 시작된다.
도 42의 오른편 패널은 또한 조직 검사가, 복셀 특징에 관해 이질성인 샘플로 돌아갈 때, 및 종양이 절제될때의 상황을 도시한다. 상기 이질성은 다수의 기여 요인, (i) 주요 랜드스케이프 내에서의 이질성, (ii) 암세포 및 기질 구획에서의 HMR(55Mn)의 존재, 크기 및 함량, 그리고 (iii) 멜라닌 과립의 존재 및 세포 내 멜라닌 농도의 정도로부터 유래될 것이다. 모든 HMR(55Mn)의 평가는 원거리 종양의 재발 가능성을 나타낼 것이다 (어떤 세포가 원발성 종양의 절제 전에 이미 전이된 경우).
도 42의 흐름도는 또한 수술로 절제가 불가능한 부위로부터 취해진 임의의 조직 검사에 적용되며, 방사선이 방사선에 의한 치료 의도에 관해서 유용한 선택인지 여부에 따라 ATI를 결정함으로써 확인될 필요가 있다.
흑색종 이외의 다른 모든 종양 유형의 경우, 도 43의 흐름도는 방사선의 사용 또는 예비 여부에 대한 임상적 결정 포인트를 유도할 것이다. 조직 검사는 동질성 또는 이질성 (후자는 임상적 의미에서 불가피한 회색 영역)을 나타낸다. 종양은 절제 가능하거나 불가능하며, HMR(55Mn)의 부재로부터 유래된 ATI가 역치 이하일 경우 방사선이 사용된다. 종양이 이질적이고 절제 가능한 경우, ATI는 환자의 삶에서 나중에 원격 전이가 발생할 경우 기대할 수 있는 지수가 될 것이다. 종양이 절제 불가능하다면, 방사선 조사 여부는 역치 값을 기준으로 결정된다.
주치의와 환자 모두에 의해 ATI와 무관한 다수의 다른 인자가 고려될 것이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 여기에는 환자의 나이, 환자의 현재 건강 상태, 합병증, 종양의 위치 (원발성 또는 전이성) 및 환자를 방사선-민감성으로 만드는 모든 유전 조건이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 뇌 병변의 경우, 암세포는 미세 튜브를 통한 상호 연결의 새로운 메커니즘을 사용하기 때문에 손상된 암세포가 종양 내의 다른 것에 의해 복구될 수 있기 때문에, 일부 종양은 다른 종양 유형보다 방사선 내성이 강하다 (Osswald et al., Nature, 528, 93-98, 2015).
실시예 12
다른 개체와 결합된 원자 치료 지수의 임상 실행
이 출원의 핵심 토대는 조직 절편에 가로질러 조사된 높은 방사 조도 레이저 에너지의 집중된 펄스, 및 질량 분석을 통한 기화된 물질의 분석이 ATI를 통해 암 환자의 방사선 치료에 관해 즉각적인 치료적 중요성을 갖는 2D 공간 원자 지도를 제공한다는 것이다. 이 ATI/H&E 지도는 다른 지도를 겹쳐 쓸 수 있는 기반이다. 당업자는 다층/중첩 정보를 제공하는 생물학적 개체를 신중히 선택하면 ATI의 임상적 영향을 더욱 증가시킬 수 있다는 것을 인식할 것이며, 이는 이 출원 이전에 이용 가능하지 않은 상황이다. 우리는 이하에 원소 분석법을 사용하여 금속-표지 항체를 사용하는 추가 지도를 어떻게 통합하는지 설명하였으며, 즉, 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (LA-ICP-MS), 레이저 절단-비행시간-질량 분석법 (LA-TOF-MS), 유도 결합 플라즈마-광학 발광 분광법 (ICP-OES), 마이크로웨이브 플라즈마-원자 방출 분광법 (MP-AES), 레이저 유도 브레이크 다운 분광법 (LIBS), 2차 이온 질량 분석법 (SIMS), X-선 흡수 근처 엣지 구조 (XANES), 원자 흡수 분광법 (AA) 또는 X-선 형광법 (XRF)은 임상적 결정 과정의 힘을 높일 수 있다.
추가 지도
유전자 발현은 배열된 역-전사 올리고 (dT) 프라이머 및 형광 표지된 뉴클레오타이드를 사용하여 "공간적 전사체학"을 통해 조직 절편에서 측정할 수 있다 (Stahl et al., Science, 353, 78-82, 2016). 이것은 조직 절편의 H&E 지도에 대한 유전자 발현의 공간 지도를 제공하지만, 이는 라이브러리 구축, 증폭 단계, 시간에 따른 형광의 강도 손실, 염색된 인공물 및 자가형광은 물론 알려지지 않은 임상적 의의의 개체의 대규모 데이터 세트의 데콘볼루션 (deconvolution)을 포함하는 노동 집약적인 비용이 따른다. 우리가 아는 한, 조직 절편에 대한 이전의 공간 유전자 발현 지도는 방사선이 환자에게 선호되는 치료 옵션인지 여부에 대한 임상적 질문에 대해서는 보고하지 않았다.
본 출원까지는 이용할 수 없었던 것은 단백질 또는 세포 수준에서 특별히 선택된 생물학적 파라미터와 함께 ATI의 동시 측정으로부터 생성된 임상적으로 유용한 2D 지도이다. 이들 파마미터는 방사선 치료에 관여할 것으로 추정되며, 현재의 병리학적 및 분자적 기술로 즉시 구현할 수 있어야 한다. 이러한 지도의 수많은 인스턴스화는 하기와 같다.
많은 종양은 사실상 방사선에 내성인 "암 줄기세포" (CSC) (Clevers, Nature Medicine, 17, 313-319, 2011)를 함유하고 있다고 주장되고 있다 (Ogawa et al., 2013, Anticancer Research, 33, 747-754). 이 CSCs의 방사성-내성은 그들의 우수한 DNA 복구 능력과 반응성 활성 산소에 대한 방어력 증가를 포함하는 여러 가지 요인으로 인한 것으로 생각된다. 이러한 CSC는 자기 갱신하고, 천천히 분활하며, 종양을 재구성할 수 있다고 생각된다. 그러한 것이 사실이라면, ATI/H&E 지도에 "암 줄기 세포의 특성" 지도를 작성하고 중첩하는 것이 임상적으로 유리하다. 이것은 금속-표지 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
포르말린-고정 파라핀-포매된 조직 절편에 대한 현재의 기술은 일반적으로 관심 항원에 대한 항체를 사용하지만, 동일한 조직 절편 상에 공동 국소화할 수 있는 여러 단백질 종양 마커, 예컨대 4 또는 5를 다중화하기 위해 현재 면역 조직 화학을 사용하는 것은 거의 불가능하다. 항원 특이적인 1차 항체의 사용은 2차 항체로 표지된 효소를 포함하는 증폭 단계를 거친다. 상이한 시간 및 상이한 염색 조건에서 처리된 5개의 순차적 조직 절편을 염색하는 시간 인자는 신속하고 정확한 처리량 또는 해석에 도움이 되지 못한다. 그러나, 금속 (특히 란탄족 및 이들의 쉽게 구별되는 동위 원소)을 이용한 항체 표지의 적용은 LA-ICP-MS를 통해 직접 검사된 동일한 조직 절편에 다른 동위 원소로 표지된 다른 항체를 적용할 수 있음을 의미한다 (Giesen et al., 2011, Anal. Chem. 83, 8177-8183). 여기에는 공동 국소화된 염색 절차, 형광 문제 또는 정량화에 대한 모호함이 없다. 이 방법은 란탄족 홀뮴, 툴륨 및 테르븀을 사용하는 1차 항체, 항-Her2, 항-CK-7 및 항-MUC1의 라벨링 및 LA-ICP-MS를 통해 검사된 유방암 조직 절편에서의 이들의 위치에 대한 진단학적 맥락에서 적용되었다 (Giesen et al., 2011, Anal. Chem. 83, 8177-8183). 또한, Ytterbium-173, Paul et al., 2015, Chemical Science, DOI:10.1039/c5sc02231b, 2015에서 항-티로신 하이드록실기 (TH)를 직접 표지하기 위해 적용되었다.
상기 데이터는 원소 분석을 통해 분석된 다수의 란탄족-표지 항체가 동일한 조직 절편 내의 항원의 공간 분포에 대해 보고하고, 약물-기반 환자 치료를 위한 사용에 대한 임상적 정보를 제공할 수 있음을 입증한다. 그러나, 방사선 치료 정보의 맥락에서의 요구 사항은 다르다. 동일한 조직 절편 또는 순차적인 연속 절편에서 ATI와 방사선 치료의 중요성의 실체를 측정하는 것이다 (예를 들어, 림프관에 암종 세포가 있고, 그 전이 세포가 있는 다른 55Mn 수준을 가지는 도 35에 예시된 유방암 절편에서). 이것은 다음과 같이 구현 될 수 있다.
15개의 란탄족; 란탄, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨, 이테르븀 및 루테튬이 스칸듐 및 이트륨과 함께 LA-ICP-MS에 의해 쉽게 구별되는 여러 동위 원소를 가진다. 따라서 17가지 원소 대신에, 하나는 선택된 항체를 표지하는 것을 선택한 약 32가지 표지 최소 팔레트를 가진다. 이 출원의 맥락에서, 다음 단계는 "줄기", DNA 복구, ROS, 세포 분열 및 암세포의 종양 억제자의 억제에 관여된 메틸화 효소 및 탈메틸화 효소에 대한 마커인 항원을 선택하고, 이 모두는 방사선 치료 관련성에 영향을 미친다..
비제한적인 예로, 제1단계는 다음을 포함한다:
(i) Clevers에 의해 제시 (Nature Medicine, 17, 313-319, 2011)한 바와 같이 CD44 (유방, 간 및 췌장), CD133 (뇌, 결장 직장, 폐, 간), EpCAM (결장 및 췌장)과 같은 종양의 공격성/전이 잠재성에 관련한 "줄기 세포" 네트워크에 관여하는 단백질을 선택하는 것 뿐만 아니라, NOTCH, DLL4, FAK, STAT3 및 NANOG와 같은 암 줄기세포에서 약물로 겨냥함으로써 표적화된 단백질 (Kaiser, Science, 347, 226-229, 2015)을 선택하는 것.
(ii) Wood 등이 검토한 바와 같이, BRCA1, BRCA2 및 ATM과 같은 DNA 복구에 관여하는 단백질을 선택하는 것 (2001, Science 291, 1284-1289 및 후속 업데이트).
(iii) 저산소증 유도 인자, HIF (Simon and Keith, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 9, 285-296, 2008), 탄산 탈수 효소 IX 및 카탈라아제와 같은 종양 벽감에서 중요한 역할을 하는 활성 산소의 대사 네트워크에 관여하는 단백질을 선택하는 것.
(iv) Ki-67 (Inwald et al., Breast Cancer Res Treat. 139, 539-552, 201)과 같은 세포 분열 네트워크에 관여하는 단백질을 선택하는 것.
(v) DNA 메틸화 효소 TET1 및 TET3 (Forloni et al., Cell Reports, 16, 1-15, 2016), 게놈 영역을 억제 또는 활성화시키고 종양 내 세포의 발암 가능성에 영향을 미치는 DNMT1, DNMT3a 및 DNMT3b와 같은 DNA 메틸화 효소와 같은 단백질을 선택하는 것.
제2단계는 이들 단백질 생성물에 대한 1차 항체를 사용하고, 이어서 적절한 란탄족으로 1차 또는 2차 항체를 표지하고 이들 항체를 조직 절편에 혼성화 하는 것을 포함한다.
제3단계는 이러한 항체가 풍부한 절편에 원소 분석을 적용하는 것을 포함한다. 이는 Mn, Zn, Fe 및 Cu와 같은 이 출원에서 사용된 내인성 금속을 동시에 판독하여 ATI를 생성하고, HMR을 찾아 내고, 란탄족이 부착된 관련한 단백질의 ATI/H&E 지도에서의 위치를 강조한 여러 란탄족의 공간 판독을 제공한다. 이것은 임상적 중요성이 있는 다중화된 신속한 지도 제작법이다. 도 35에서와 같이 조직 절편에 적용하면, 유방 (및 임의의 다른 종양)의 림프관 및 모세 혈관에서의 세포 집단의 특성, 1차 및 2차 종양 내의 이질성을 보다 완벽하게 이해할 수 있으며, 전립선의 코어 니들 조직 검사의 경우, 현재의 병리학적 통찰력을 훨씬 웃도는 광대 한 견해이다.
ATI/H&E 지도 상에 중첩된 다층 정보의 논리적인 확장은 방사선 치료에서 평가될 수 있는 동일한 또는 연속적 조직 절편으로부터 신속하고, 정량적이며, 임상적으로 관련있는 정보를 생성하는 새로운 병리 분류학을 제공한다.
본 발명의 이점
본 발명의 2D 지도 제작의 본질은 종양을 균질화하고 조직 질량 당 망간의 양을 측정하는 비-지도 제작의 대안에 비해 수행될 수 있는 임상적 방사선 치료에 관련되는 다수의 중요한 속성을 갖는다.
·첫째, 모든 종양은 기질 물질의 양과 유형의 관점에서 이질적이기 때문에 2D 지도를 기준으로만 보이고 측정할 수 있는 기질 물질에 대한 종양 세포의 상대적 양은 중간 ATI에 영향을 미친다.
·둘째, 2D 영역이 거의 모든 암세포로 이루어져 있어도, 그들의 Mn 수준의 관점에서 그들은 매우 다를 수 있다. 도 1은 이를 완벽하게 보여주는데, 절편의 3분의 1 정도가 중간 CC/S 값이 3,000 정도인 무멜라닌성 종양 세포로 구성되며, 절편의 나머지는 Mn 수준이 15,000-45,000 CC/S 사이에서 변하는 영역으로 구성되고, HMR(55Mn)은 45,000-150,000 CC/S 사이에서 변한다. 이 절편을 균질화한 경우, 중간 ATI는 10,000 CC/S를 훨씬 초과한다. 임상적 의미에서 잃은 것은, 이 환자의 방사선 치료가 낮은 ATI를 가진 종양의 3분의 1을 죽였을 것이므로, 종양 부담이 줄어들어 환자에게 임상적 이점이 있다는 것이다.
·더 중요한 것은, 절편이나 종양 샘플을 균질화하면 본 발명의 중요한 측면 중 하나, 종양 재발을 예측할 수 있는 HMR(55Mn)를 잃는 것이다. 대부분의 HMR은 절편의 10% 미만을 나타내므로, 중간 ATI는 거의 이동하지 않기 때문에 균질화는 HMR(55Mn)의 존재 정보를 손실한다.
유방암의 예에서, 정상적인 유방 도관, 면역 세포, 지방 세포 및 기질 세포의 영역이 혼합된 도 35의 예에서, 가장 위험한 임상적으로 관련된 세포는 단지 하나의 림프관 C5에만 있는 것들이다. 그들은 전이 과정에 있으며, 중간값은 8,612 CC/S를 가진다. 전체 절편이 균질화 되었다면, 균질화 된 절편의 중간값이 현재 약 1,669 CC/S이고, 지방 세포 집단의 비율, 정상적인 도관에서 기질 및 상대적으로 낮은 값에 의해 영향을 받는 낮은 값이므로, 임상적으로 관련 있는 정보는 완전히 손실된다.

Claims (37)

  1. 암의 방사선-반응도를 결정하기 위한 정보제공 방법으로서, 암으로부터의 시험 샘플 중 망간 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기서 시험 샘플 중 망간 수준이 낮을수록, 암은 방사선에 대해 더욱 민감하고, 시험 샘플 중 망간 수준이 높을수록 암은 방사선에 대해 더욱 내성인 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시험 샘플의 원자 치료 지수 (Atomic Therapeutic Indicator: ATI)를 생성하는 단계를 포함하고,
    여기서 ATI를 생성하는 방법은 시험 샘플의 3D 영역 내 복셀 (voxel) 중의 망간 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 상기 방법은
    (a) 상기 시험 샘플의 2D 영역을 선택하는 단계로서, 상기 2D 영역은 X':Y' 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 여기서 X'는 2D 영역의 길이이고, Y'는 2D 영역의 너비이며, 상기 3D 영역은 상기 2D 영역에 대응하고 Z로 표시되는 선택된 높이를 가지며, 상기 3D 영역은 미리 정의된 체적의 복셀로 분할되고, 각 복셀의 체적은 X×Y×Z에 의해 정의되며, 여기서 X는 복셀의 길이이고, Y는 복셀의 너비이며, Z는 복셀의 높이인 단계;
    (b) 각 복셀 중의 망간 수준을 정량화하는 단계; 및
    (c) 선택된 복셀 중의 망간의 중심 경향 수준 (central tendency level)을 계산하는 단계로서, 상기 선택된 복셀 중의 망간의 중심 경향 수준이 ATI를 정의하는 것인 단계;
    를 포함하고;
    여기서 상기 ATI가 낮을수록 암이 방사선에 대해 더욱 민감하고, 상기 ATI가 높을수록 암이 방사선에 대해 더욱 내성인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시험 샘플의 복셀 중의 망간 수준의 정량화가 하나 이상의 참조 복셀을 포함하는 참조 표준을 사용하여 교정되고, 여기서 각 참조 복셀은 공지된 양의 망간을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 참조 표준이 공지된 양의 내인성 또는 외인성 망간을 포함하는 생물학적 샘플인 것인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 중심 경향 수준이 중간값, 산술 평균 또는 모드인 것인, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 하나 이상의 대조 샘플에서 정량되는 망간의 수준이, 시험 샘플이 정량될 때 동시에 또는 임의의 순서로 연속적으로 정량되거나, 시험 샘플과 나란히 정량되는 것인, 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 ATI가 미리 결정된 ATI 역치와 비교되고, 상기 암의 방사선-반응도는 상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
    상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 낮으면 상기 암은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
    상기 ATI가 상기 ATI 역치보다 높으면 상기 암은 방사선에 내성인 것으로 결정되는 것인, 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 ATI가 2개의 미리 결정된 ATI 역치와 비교되고, 상기 암의 방사선-반응도는 상기 ATI가 상기 2개의 역치보다 높거나 낮은지를 평가함으로써 결정되며,
    상기 ATI가 낮은 ATI 역치보다 낮으면 상기 암은 방사선에 민감한 것으로 결정되고;
    상기 ATI가 2번째 ATI 역치보다 높으면 상기 암은 방사선에 내성인 것으로 결정되고;
    상기 ATI가 상기 2개의 ATI 역치 사이이면 상기 암은 방사선에 부분적으로 민감한 것으로 결정되는 것인, 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 선택된 복셀이 암세포가 검출된 복셀이고, 상기 암세포가 암세포를 다른 세포와 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 2D 영역의 육안 검사로 검출되고, 바람직하게는 상기 염색이 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색인 것인, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시험 샘플은 개체로부터의 임의의 장기 또는 조직으로부터의 조직 샘플, 종양, 세포의 고체 매쓰 또는 세포의 "액체" 집단, 백혈병 세포를 포함한 조혈 계통의 임의의 암의 세포, 고형 종양의 순환 세포 유도체, 및 전이된 세포 또는 세포 집단인 것인, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 대조 샘플은 세포, 세포 집단, "정상" 조직 샘플, 고환암, 림프종, 소세포 폐암, 뇌암, 중피종, 흑색종 및 유방 및 전립선 암의 종양/신생물의 조직 샘플을 포함하거나 이로부터 유래한 것인, 방법.
  12. 비-인간 포유류인 개체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 개체로부터의 시험 샘플에 대해 제1항 또는 제2항의 방법을 수행하는 단계, 및 상기 암이 방사선에 민감한 것으로 결정되면 상기 암을 치료하는 데 방사선 치료를 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 비-인간 포유류인 개체의 암을 치료하는 방법으로서, 상기 개체로부터의 시험 샘플에 대해 제1항 또는 제2항의 방법을 수행하는 단계, 및 상기 암이 방사선에 내성인 것으로 결정되면 상기 암을 치료하는 데 방사선 치료를 포함하지 않는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 방사선 치료 후 암의 재발 가능성을 결정하기 위한 정보제공 방법으로서,
    (a) 암으로부터의 시험 샘플의 2D 영역을 선택하고, 각 복셀 중의 망간 수준을 정량화함으로써 상기 시험 샘플의 3D 영역 내 망간 수준을 정량화하는 단계로서, 상기 2D 영역은 X':Y' 좌표계에 의해 지형적으로 정의되고, 여기서 X'는 2D 영역의 길이이고, Y'는 2D 영역의 너비이며, 상기 3D 영역은 상기 2D 영역에 대응하고 Z로 표시되는 선택된 높이를 가지며, 상기 3D 영역은 미리 정의된 체적의 3개 이상의 복셀로 분할되고, 각 복셀의 체적은 X×Y×Z에 의해 정의되며, 여기서 X는 복셀의 길이이고, Y는 복셀의 너비이며, Z는 복셀의 높이인 단계;
    (b) 상기 복셀의 X 및 Y 좌표에 대응하는 2D 영역에서, 망간 수준이 주위 영역보다 높은 암 영역인 높은 금속 영역 (high metallomic region: HMR)을 중심 경향의 배수 또는 정수 사이의 임의의 근사치인 통계적 역치에 의해 확인하는 단계
    를 포함하고;
    여기서 상기 HMR의 빈도가 높을수록 암이 재발할 가능성이 높고, HMR의 빈도가 낮을수록 암이 재발할 가능성이 낮은 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 HMR이 또한 기질 성분으로부터 암세포를 구별하는 염색으로 염색된 시험 샘플의 2D 영역에서 확인되고, 바람직하게는 상기 염색이 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색인 것인, 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 망간 수준은 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry: LA-ICP-MS), 레이저 절단-비행시간-질량 분석법 (laser ablation-time-of-flight-mass spectrometry: LA-TOF-MS), 유도 결합 플라즈마-광학 발광 분광법 (inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy: ICP-OES), 마이크로웨이브 플라즈마-원자 방출 분광법 (microwave plasma-atomic emission spectroscopy: MP-AES), 레이저 유도 브레이크 다운 분광법 (laser induced break down spectroscopy: LIBS), 2차 이온 질량 분석법 (secondary ion mass spectrometry: SIMS), X-선 흡수 근처 엣지 구조 (X-ray absorption near edge structure: XANES), 원자 흡수 분광법 (atomic absorption spectroscopy: AA) 또는 X-선 형광법 (X-ray fluorescence: XRF)에 의해 결정되는 것인, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 방법은
    (A) (1) 1000×1000×5 입방 미크론 이상의 전체 샘플 체적에 해당하는 종양 샘플인 암의 시험 샘플을 얻는 것;
    (2) 원자 치료 지수 (Atomic Therapeutic Indicator: ATI)를 생성하여 상기 종양 샘플 내 망간 수준을 정량화하되, 상기 ATI는 레이저 절단-유도 결합 플라즈마-질량 분석법 (laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry: LA-ICP-MS)으로 측정되는 교정 카운트/초(CC/S)로 표현되는 종양 샘플의 미리 정의된 체적과 관련된 망간의 중간값 수준에 해당하고, 상기 미리 정의된 체적은 35×35×5 입방 미크론에 해당하는 것; 및
    (3) 상기 생성된 ATI를 미리 결정된 ATI 역치와 비교하되, 상기 미리 결정된 ATI 역치는 35×35×5 입방 미크론의 체적에 대해 2000 CC/S에 해당하는 것
    에 의해 방사선 치료에 민감한 암을 확인하는 단계를 포함하고,
    상기 종양 샘플의 ATI가 상기 미리 결정된 ATI 역치보다 낮으면 상기 암은 방사선 치료에 민감한 것으로 결정되거나, 상기 종양 샘플의 ATI가 상기 미리 결정된 ATI 역치보다 높으면 상기 암은 방사선 치료에 내성인 것으로 결정되는, 방법.
  18. 개체로부터의 암의 시험 샘플에 대해 제1항 또는 제17항의 방법을 수행하는 것을 포함하는, 암을 갖는 개체에 대한 치료 계획을 수립하는 방법으로서,
    상기 암이 방사선에 민감한 것으로 결정되면 치료 계획에 방사선 치료를 포함하고, 상기 암이 방사선에 내성인 것으로 결정되면 치료 계획에 방사선 치료를 포함하지 않는 것인, 방법.
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