KR102038229B1 - 하폐수 처리공정에서 아산화질소의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하수처리공정에서 아산화질소를 축적하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 메탄산화균과 탈질균의 상호작용을 이용하여 하수 내 질소화합물 제거 및 에너지원인 아산화질소로 전환을 동시에 수행하여 대기로 방출되는 아산화질소를 저감함과 동시에 연료를 회수할 수 있다. 또한 추가적인 화학처리나 에너지 사용 없이 하수에 존재하는 유기물질 및 질산염을 생물학적 반응에 의해 아산화질소를 생산 및 포집하는 것으로 경제성을 향상시킬 수 있다.

Description

하폐수 처리공정에서 아산화질소의 생산방법 {Method of producing nitrous oxide in the sewage treatment process}
본 발명은 하수처리공정에서 아산화질소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
아산화질소(nitrous oxide: N2O)는 적외선을 흡수하여 대기 중 온실효과를 유발하며 지구 온난화 지수(global warming potential: GWP)가 CO2보다 310배 높은 강한 온실 가스(greenhouse gas: GHG)이다. 오존층을 파괴시키는 가장 큰 주범이며 대기 중의 농도는 꾸준한 증가세를 나타내고 있다. N2O는 화석연료의 연소, 생물학적 하수 처리 과정 등에서 발생되며 특히 하수 처리장의 N2O는 시설전체의 온실가스 배출량의 10%에 해당한다.
N2O는 대기 중으로 배출될 때 환경에 악영향을 끼치지만 고농도로 포집할 수 있을 때에는 마취가스, 산화제, 로켓 추진제 등의 용도로 가치를 갖는다. 최근 아산화질소(N2O)는 반도체, LCD와 OLED 분야의 미세전자공정에서도 수요가 크게 증가하고 있다.
아산화질소는 하폐수 처리과정에서 생물학적 반응에 의해서 배출되는 비중이 절대적으로 높고 주로 농지, 매립지, 하수처리장 등에서 저농도로 배출되게 되며, N2O는 탈질화 반응, 질산화 반응 등을 통해 지속적으로 다량 생성되지만 N2O 환원 반응(N2O reduction) 등의 반응에 의해서 N2로 환원되기에 일부만이 대기 중으로 배출되게 된다.
1990년대 이후로 대부분의 하수처리장은 활성슬러지 공법을 이용한 BNR(생물학적 질소 제거 공정) 방식을 적용한 2차처리를 택하고 있다. 하수의 질소는 대부분 암모니아 상태로 방류가 되는데 BNR 공정을 거치면서 질산화 -> 탈질화를 거쳐서 제거된다. 이 때 탈질화 반응의 마지막 단계인 N2O 환원반응을 억제하여 하수 중의 질소화합물의 대부분을 아산화질소로 전환할 수 있다면, 질소화합물의 제거를 지속적으로 유지하면서 동시에 질소 연료(에너지원)를 생산할 수 있다.
일본 공개특허 2012-148217호는 하폐수의 생물학적 처리방법 및 폐수 처리 장치에 관한 것으로, N2O의 대기로의 방출을 효과적으로 억제하기 위해 페수 처리중 생물학적 처리 과정에서 발생한 N2O를 포함한 가스를 가스수집 기구로 수집하는 장치를 개시한다. 그러나 이는 추가 적인 장치가 필요하며, 소량의 N2O만을 회수 할 수 있다.
따라서, 하폐수 처리과정에서 탈질화 반응의 마지막 단계인 N2O 환원반응을 억제하여 질소화합물을 지속적으로 제거하면서 동시에 질소 연료(에너지원)로 사용될 수 있는 아산화질소를 생산할 수 있는 공정의 개발이 필요하다.
본 발명은, 상기 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 기존의 공정과는 상이하게, 하폐수 처리과정에서 탈질화 반응의 마지막 단계인 N2O 환원반응을 억제하여 질소화합물을 지속적으로 제거하면서 동시에 아산화질소를 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
한 양태에서 본원은 하폐수에서 분리된 상등수 및 슬러지를 각각 처리하는 수 처리 공정 및 슬러지 처리 공정을 포함하는 하폐수처리 공정에서 아산화질소의 생산 또는 축적 방법을 제공하며, 상기 수 처리 공정에서 상기 상등수를 무산소 상태에서 배양하여 탈질화균에 의한 탈질화 반응을 수행하는 단계; 상기 슬러지 처리 공정에서 상기 슬러지를 혐기 상태에서 메탄발효하는 단계; 상기 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 메탄산화균을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 메탄산화균의 배양물을 상기 수 처리 공정의 탈질화 반응에 추가하는 단계를 포함하며, 상기 메탄산화균의 배양물의 추가는 상기 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소의 환원 반응을 억제하여 하수처리공정에서 아산화질소가 축적 된다.
본원에 따른 방법에 사용되는 메탄산화균은 본원에 따른 목적을 달성하는 한 본원에 실시예에 사용된 균주를 근거로 적절한 것을 선택할 수 있으며 메틸로사이너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain SB2), 또는 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain LW5)가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에 사용되는 탈질화균은 본원에 따른 목적을 달성하는 한 본원에 실시예에 사용된 균주를 근거로 적절한 것을 선택할 수 있으며, 탈질화균은 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas spp.), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 데클로로모나스 아로마티카(Dechloromonas aromatica strain RCB) 또는 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 상기 배양물은 배양액, 또는 배양균 및 배양액을 포함하며, 상기 배양액에는 메탄산화균 유래의 메타노박틴(methanobactin)을 포함하며, 상기 메타노박틴은 상기 탈질화균의 NosZ (Nitrous oxide reductase genes) 효소를 억제하여 상기 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소의 환원 반응을 억제한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 메타노박틴은 특히 약 0.1μM 내지 약 1.0μM 농도로 포함될 수 있다.
본원에 따른 방법의 일 구현예에 따르면 상기 탈질화균을 배양하는 단계에서, 상기 메탄발효에서 생성된 메탄은 메탄:공기의 부피비가 20:80이 되도록 공급되어, 메탄발효를 효율적으로 수행할 수 있다.
본원에 따른 방법의 일 구현예에 따르면 상기 메탄산화균을 배양하는 단계에서, 상기 배양은 pH7.0, 30℃의 조건에서 수행되는 것인, 메탄발효를 효율적으로 수행할 수 있다.
본원은 하폐수 처리 공정에서 탈질화 반응의 마지막 단계인 N2O 환원반응을 억제하여 질소화합물을 지속적으로 제거하면서 동시에 질소 연료(에너지원)로 사용될 수 있는 아산화질소를 생산/축적할 있다. 특히 탈질화 반응에서 작용하는 탈질균과, 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 배양된 메탄산화균의 공배양을 통해, 하폐수 내 부영양화의 주원인인 질소화합물 제거 및 에너지원인 아산화질소를 동시에 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명의 한 구현예에 따른 수 처리 공정 및 슬러지 처리 공정을 포함하는 하수처리공정에서 아산화질소의 생산 방법을 나타내는 개략도이다.
도 2a는 본 발명의 한 구현예에 따른 탈질화균 및 메탄산화균의 공배양 시간에 따른 아산화질소의 생성량을 나타내는 그래프로, 공배양에 의해 아산화질소의 생성량이 증가하는 것을 나타낸다.
도 2b는 본 발명의 한 구현예에서, 메타노박틴을 생성하는 유전자(mbnA gene)를 제거한 mbnA - M.trichosporium 돌연변이 탈질화균과의 공배양 시간에 따른 아산화질소의 생성량을 나타내는 그래프로, 메타노박틴이 아산화질소의 생성에 기여함을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 한 구현예에 따른, 탈질화균 배양시 정제된 메타노박틴을 농도별로 첨가한 후, 배양 시간의 경과에 따른 아산화질소의 생성량을 나타내는 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 한 구현예에 따른, 메탄과 반응성 질소(NO3 -, NH4 + 등)가 동시에 검출되는 환경시료를 채취하여 메탄 산화균 배양액과 메탄 산화균이 없는 배지에서 탈질화 반응을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 붉은 라인: 메탄산화균이 없는 배지에 탈질화균 배양, 녹색 라인: 메탄산화균 배양체(메타노박틴 존재)에서 탈질화균 배양한 것을 나타낸다.
도 4b는 도 4a의 실험에서 탈질화 반응 종료 후의 메탄 산화균 배양액과 메탄 산화균이 없는 배지에서 아산화질소의 발생량을 측정한 그래프이다. 붉은 라인: 메탄산화균이 없는 배지에 4a의 녹색 라인 탈질화균 재배양, 녹색 라인: 메탄산화균 배양체(메타노박틴 존재)에 4a의 녹색 라인 탈질화균 재배양 한 결과를 나타낸다. 도 4b 실험은 도 4a의 녹색 라인에서 배양된 탈질화균을 다시 한번 메탄산화균의 유무에 따라 재배양하여, 일관성있는 결과를 나타내는지 확인한 실험결과이다.
도 4a 및 도 4b에서 OB3b는 메틸로사이너스 트리코스포리움 strain OB3b로 메타노박틴을 생산해내는 메탄산화균주를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명에 앞서, 이하에서 설명되는 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본원은 하폐수 처리 공정에서 탈질화 반응의 마지막 단계인 N2O 환원반응을 억제하여 질소화합물을 지속적으로 제거하면서 동시에 질소 연료(에너지원)로 사용될 수 있는 아산화질소를 생산/축적할 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 특히 탈질화 반응에서 작용하는 탈질균과, 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 배양된 메탄산화균의 공배양을 통해, 하폐수 내 질소화합물 제거 및 에너지원인 아산화질소를 동시에 생산할 수 있다.
한 양태에서 본원은 생물학적 하폐수처리 공정에서 탈질화 반응에서 작용하는 탈질균과 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 배양된 메탄산화균의 공배양을 이용한 아산화질소의 생산 또는 축적 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 하폐수에서 분리된 상등수 및 슬러지를 각각 처리하는 수 처리 공정 및 슬러지 처리 공정을 포함하는 하폐수처리 공정에서 아산화질소의 생산방법으로, 상기 수 처리 공정에서 상기 상등수를 무산소 상태에서 배양하여 탈질화균에 의한 탈질화 반응을 수행하는 단계; 상기 슬러지 처리 공정에서 상기 슬러지를 혐기 상태에서 메탄발효하는 단계; 상기 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 메탄산화균을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 메탄산화균의 배양물을 상기 수 처리 공정의 탈질화 반응에 추가하는 단계를 포함하며, 상기 메탄산화균의 배양물의 추가는 상기 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소의 환원 반응을 억제하여 이산화질소가 축적된다.
본원에 따른 방법에서 메탄산화균 배양액의 추가는 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소의 환원 반응을 억제하여, 아산화질소의 축적을 초래한다. 이런 의미에서 본원은 아산화질소의 생산 또는 축적 방법이다.
본원의 하폐수처리란 현탁성, 콜로이드성, 용해성 물질을 포함하는 가정이나 공장에서 배출하는 하수를 인위적으로 물리화학적 또는 생물학적 방법으로 정화하는 것이다.
본원에 따른 방법은 생물학적 하폐수 처리공정에 사용된다. 생물학적 처리 방법은 박테리아, 균류, 조류, 원생동물과 같은 미생물을 이용하여 폐수내의 오염물질을 분해 또는 해독시키는 방법으로 탈질화에 의해 질소를 제거하고, 유기물질을 이산화탄소나 메탄가스 형태로 제거하는 것을 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 하폐수 처리공정은 도 1과 같이 유입된 하폐수를 침사지에서 상등수와 고형분(슬러지)으로 분리하고, 이를 각각 수 처리 공정 및 슬러지 처리 공정으로 나누어 처리한다. 수 처리 공정은 최초로 유입된 하수로부터 분리된 상등수의 처리 공정이며 예를 들면 최초 침전조 - 혐기조 - 무산소조 - 호기조 - 2차 침전조를 거쳐 처리된다. 상기 슬러지 처리 공정은 최초로 유입된 하수로부터 분리된 슬러지의 처리 공정으로 슬러지 농축조 - 슬러지 조절조 - 탈수조 - 소화조 또는 메탄생성(발효)조 - 메탄산화조를 거쳐 처리된다.
상기와 같은 수 처리 및 슬러지 처리 공정은 당업계에 공지된 것으로 당업자라면 적절한 조건을 선택할 수 있을 것이다.
예를 들면 상기 수처리 공정의 최초 침전조는 유입된 하수를 2시간 내외 체류하면서 비중이 무거운 부유물을 침전 시키고 상등액을 혐기조로 공급한다. 상기 혐기조 - 무산소조 - 호기조는 미생물을 이용하는 미생물처리 공정이다. 최초 침전조에서 상등액이 공급되는 혐기조는 인을 방출하는 곳으로 용존산소 또는 질산이온이나 황산이온과 같은 무기 결합산소가 존재하지 않는 상태이다. 상기 혐기조에서는 인(P)제거 미생물이 혐기성조건에서 인을 방출하고 후에 호기조에서 방출한 인의 3~5배의 인을 과잉 섭취하도록 인을 제거하기 위한 전처리 반응조이다. 상기 혐기조를 거친 유출수는 무산소조로 공급되는데, 상기 무산소조는 용존산소는 없으며 NO2 -, NO3 -와 같은 결합산소는 존재하는 상태이다. 상기 무산소조는 질소성분을 제거하기 위한 생물반응조로, 생물학적 탈질화 반응이 수행된다.
생물학적 탈질화 반응이란 산소가 없는 상태(용존 산소가 없는 무산소 상태)에서 탈질화 미생물 예를 들면 슈도모나스 속(Pseudomonas spp.) 예를 들면 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri)와 같은 호기성 종속영양체 들이 용존산소가 없을 때 호흡을 하기 위하여 최종 전자 수용체로 작용하는 질산성 질소를 환원시키는 반응이다. 이러한 특징을 나타내는 다양한 탈질환 미생물이 본원에 사용될 수 있으며 예를 들면 데클로로모나스 아로마티카(Dechloromonas aromatica strain RCB) 또는 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) 상기와 같은 균주는 시중에서 입수할 수 있는 것으로 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 파라코커스 데니트리피칸스는 ATCC17741로 입수가능한다.
일 구현예에서 질소화합물을 아산화질소로 환원시키기 위한 슈도모나스 스투트제리 의 배양 조건은 pH 7.0, 30도에서 배양되며 산소가 없는 상태로 전자공여체가 충분히 공급되어야한다. 탈질화 반응의 경로는 Nitrate → nitrite → nitric oxide → nitrous oxide → nitrogen 순이며 최종산물은 질소 기체이며 이는 대기 중으로 방출된다. 상기 탈질화 반응을 거친 무산소조의 방류수는 호기조(aeration)로 공급된다. 상기 호기조는 하수 내에 폭기 수단에 의해 공기를 불어넣고 호기성 상태로 유지되며 인(P)흡수를 유도하며 질산화 및 유기물의 산화가 이루어진다. 호기조에서 질산화 반응을 수행한 방류수는 최초 침전조로 반송된다.
예를 들면 상기 슬러지 처리 공정은 최초 유입된 하수로부터 분리된 슬러지의 처리 공정이며 농축조 - 슬러지 조절조 - 탈수조 - 소화조를 거쳐 처리된다. 상기 농축초는 최초 유입된 슬러리를 예를 들면 12시간 정도 체류하면서 중력침강에 의해 농축시켜 고형물(Total Solids)의 함량을 높인다. 상기 고형물은 슬러지 조절조(sludge regulation) 및 탈수조를 거치면서 다량의 협잡물 제거, pH 조절 등 화학적 처리 및 수분제거를 통해 슬러지 케이크(cake) 형태로 소화조에 공급된다. 상기 메탄생성조는 메탄생성 미생물의 반응기작을 통해 슬러지를 처리하는 반응조로서 외부와의 공기접촉을 차단하여 혐기성 분위기를 조성한다. 혐기성 소화는 유기물을 여러 미생물의 분해 작용에 의하여 메탄으로 전환하는 일련의 공정이다. 혐기성 소화조 슬러지에는 산발효균, 메탄발효균, 수소생성균 등 다양한 종류의 균이 포함되어 있다. 상기 소화조의 슬러지는 가열되고, 혼합되며, 산소가 공급되지 않는 환경에서 미생물에 의해 분해된다. 예를 들면 30일 동안 35℃에서 반응할 수 있다. 이때, 약 30% 또는 그 이상의 고형물이 가스로 변하는데 주로 메탄가스와 약간의 이산화탄소로 변환된다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 슬러지 처리공정의 메탄생성(발효)조에서 생성된 메탄을 공급하여 메탄산화균이 배양되고, 상기 메탄산화균의 배양액은 수 처리 공정의 탈질화 반응이 일어나는 무산소조에 주입된다.
구체적으로 본원에 따른 일 구현예에서 소화조(또는 메탄생성조)에서 생성된 메탄은 메탄산화조에 공급되어 메탄산화균(methanotroph)의 에너지원으로 사용된다. 이때 상기 메탄산화조에 메탄산화균을 접종할 수 있으며, 상기 메탄생성조에서 공급된 메탄은 상기 메탄산화균의 배양에 사용되어 메탄산화균 배양물이 수득된다. 본원에 따른 메탄산화균은 메탄을 탄소원이나 에너지원으로 사용하여 메탄올, 포름알데히드, 포름산 등을 거쳐 최종 이산화탄소 및 물로 분해하는 그람음성의 절대 호기성 세균이다. 최종 전자수용체로서 산소를 이용하는 물질대사 체계를 가지고 있으며, 메탄을 산화시킬 때 세포질 막에 위치하는 pMMO (particulate methane monooxygenase) 효소를 이용하는데, 메탄산화균은 pMMO의 발현과 충분한 활성을 위해 다량의 구리(Cu) 이온을 필요로 한다. 이에 따라 구리가 부족한 환경에서 충분한 양의 구리를 확보하기 위해서 메타노박틴(methanobactin)이라는 강력한 킬레이트제를 생산 및 배출한다. 배출된 메타노박틴은 구리와 결합된 상태로 메탄산화균에 흡수되어 메탄을 산화할 때 필요한 효소인 pMMO 합성 및 활성화에 이용된다. 메타노박틴에 흡착된 구리는 메탄산화균에 의해서만 흡수, 활용될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 메탄산화균 외의 미생물의 메타노박틴 활용 가능성은 매우 낮다.
따라서 본원에서는 메탄산화균이 메타노박틴를 배출하여 하수처리수 내의 구리를 결합 및 재흡수하여, 탈질화균으로부터 발생되는 아산화질소의 생산/축적에 사용될 수 있음을 발견하였다. 즉, 본원에서는 메탄산화균 유래의 메타노박틴을 사용하여 상기 수 처리 공정의 무산소조의 탈질화균 반응 기작 중 아산화질소 환원 효소로 구리를 필요로 하는 NosZ (Nitrous oxide reductase genes)의 활성를 저해하여, 아산화질소의 환원반응을 억제할 수 있음을 발견하였다.
따라서 상기와 같은 특징을 나타내는 다양한 종의 메탄산화균이 본원에 따른 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서 메탄산화균은 메틸로사이너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain SB2), 또는 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain LW5)이다. 본원에 따른 방법에서는 메탄산화균을 슬러지 처리 공정에서 생성된 메탄을 이용하여 배양할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 메탄산화균은 소화조에서 생성된 메탄을 에너지원으로 사용한다. 배양된 메탄산화균의 배양물은 메타노박틴을 포함하며, 메타노박틴을 포함하는 한, 메탄산화균을 포함하거나 또는 포함하지 않는 배양액을 포함하는 배양물일 수 있다.
본원에 따른 방법에서 메탄산화균의 배양물을 상기 수처리 공정의 탈질화균을 포함하는 무산소조에 주입하면, 배양물의 유입에 따라 이에 포함된 메타노박틴이 무산소조의 탈질화 반응 중 아산화질소의 환원 반응을 억제하여 아산화질소를 축적할 수 있다.
일 구현예에서 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소가 생성된 후 환원되지 않고 유지되게 하기 위해서는 메탄산화균, 특히 메틸로사이너스 트리코스포리움 균주가 충분히 배양되어야 한다. 이는 예를 들면 pH 7.0, 30도에서 충분히 교반이 되며, 약 20:80 (메탄:공기)의 부피 비율로, 공기의 고갈이 없는 상태가 유지되어 메틸로사이너스 트리코스포리움이 충분히 배양될 수 있게 하여야한다. 일 구현예에서 메탄산화균의 배양시 OD600 0.3~0.4 정도 이상이면 아산화질소가 생성된 후 환원되지 않고 유지되기 위한 충분한 조건이다.
메탄산화균의 배양물에 포함된 메타노박틴은 무산소조 내의 결합성 질소의 농도, 탈질화균 수에 따라 조절되어 사용할 수 있으며 바람직하게 한 구현예에서 본원의 하수처리에서는 구리 0.2μM 이하의 하수 처리수에서, 메타노박틴 1.0μM 이상의 농도로 포함된다. 0.1μM 이하의 농도에서는 아산화질소의 환원 억제반응이 충분히 일어날 수 없다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 탈질화균 및 메탄산화균의 공배양에 따른 아산화질소 생성
메탄산화균과 탈질화균의 공배양(co-culture)에서 질산염(NO3 -) 환원반응과 N2O 환원반응의 억제효과를 알아보기 위해 메타노박틴을 생성하는 메탄산화균 메틸로사이너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium strain OB3b ATCC 35070)와 탈질화균 Pseudomonas stutzeri (The ISME journal, 1., Yoon, S., Nissen, S., Park, D., Sanford, R. A., & L
Figure 112018081416946-pat00001
ffler, F. E. (2016). Nitrous oxide reduction kinetics distinguish bacteria harboring clade I versus clade II NosZ. Applied and environmental microbiology, AEM-00409)를 다음과 같은 조건으로 공배양하였다.
메탄산화균 배양: 메탄산화균과 탈질화균이 모두 잘 배양될 수 있는 배지인, NMS (nitrate mineral salts) 배지 100mL를 250mL 세럼병에 넣고 봉한 후 pH 7.0 인산완충액 5mM 주입하고 위 공간(headspace)에 20:80 (메탄:공기)의 비율이 되도록 메탄을 주입한 뒤, 메틸로사이너스 트리코스포리움을 접종하여 30도, 140rpm 조건에서 배양하였다.
[표 1] NMS 배지 성분
Figure 112018081416946-pat00002
탈질화 균 배양: 탈질화균 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri )도 같은 NMS 배지에 pH 7.0 인산완충액 5mM, 아세트산나트륨 10mM (전자공여체), CuCl2 0.2μM를 넣어준 후, 위의 공간을 99.999% 질소가스(N2)로 15분간 플러싱하여 산소를 제거하였다. 이후 슈도모나스 스투트제리 pre-culture를 접종하여 25도, 140rpm으로 조건에서 배양하였다.
메탄산화균(M. trichosporium)이 OD600 0.3~0.4 정도까지 배양하고, 메탄 소모가 정지하면(산소 고갈), 메탄산화균 배양액에 탈질화균을 0.5mL를 접종하여 공배양의 형태로 배양한 후, 탈질 반응과 N2O 양의 변화를 관찰하였다. 탈질화균 첨가시 전자공여체인 아세트산나트륨과 N2O 환원효소에 이용되는 CuCl2를 0.2μM를 함께 첨가하였다.
NO3 - 및 NO2 - 는 IC (Ion chromatography, Metrohm 883 BASIC IC Plus ion chromatograph (Metrohm, Riverview, FL, US), Metrosep A Supp 4-250/4.0 음이온 컬럼)를 제조자의 방법대로 이용하여 측정하였으며, N2O 가스는 GC (gHP 6890 Series gas chromatograph, HP-PLOT/Q 컬럼, electron capture detector, Agilent, USA)를 제조자의 방법대로 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2a를 참조하면 탈질화균이 메탄산화균과 공배양된 경우, 초기 질산염(449.46±2.8 μmol)의 약 96% 정도가 최종적으로 아산화질소로 환원된 것으로 나타났다. 이에 대한 비교예로 메타노박틴을 생성하는 유전체(mbnA gene)를 제거한 M. trichosporium의 mbnA - mutant를 이용하여 탈질화균 슈도모나스 스투트제리과 공배양 실험을 수행한 결과, 도 2b와 같이 소량(0.53±0.31 μmol)의 아산화질소가 생성되었으나 모두 질소로 환원되는 것으로 나타났다. 이는 메탄산화균에서 생성된 메타노박틴이 아산화질소의 환원에 중요한 것을 나타낸다.
실시예 2 정제된 메타노박틴의 농도에 따른 N 2 O 환원 반응에 미치는 영향 분석
메타노박틴이 탈질화 반응에 있어서 N2O 환원 반응에 미치는 영향을 알아보기 위해 탈질화균(Pseudomonas stutzeri) 배양 하면서(배양 조건은 실시예 1에 기재된 방법과 동일) 정제된 메타노박틴(Iowa State University Alan A.DiSpirito 교수 Bandow, N. L., Gallagher, W. H., Behling, L., Choi, D. W., Semrau, J. D., Hartsel, S. C., ... & DiSpirito, A. A. (2011). Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. In Methods in enzymology (Vol. 495, pp. 259-269). Academic Press.)의 농도를 0.1μM 내지 1.0μM의 범위에서 도 3에 기재된 바와 같이 첨가하였고, 1.0μM에서는 구리를 0.2μM 농도로 첨가한 후 탈질화 반응을 수행하였다. 구체적으로 NMS 배지에 pH 7.0 인산완충액 5mM, 아세트산나트륨 10mM (전자공여체), CuCl2 0.2μM를 넣어준 후, 위의 공간을 99.999% 질소가스(N2)로 15분간 플러싱하여 산소를 제거하였다. 이후 P. stutzeri pre-culture를 접종하여 25도, 140rpm으로 조건에서 배양하였다.
그 결과 도 3을 참조하면 0.1μM 내지 0.5μM 까지 메타노박틴의 농도가 증가함에 따라 N2O가 발생하였다가 모두 질소 가스(N2)로 모두 환원되었고, 1μM의 메타노박틴이 주입된 경우 초기 질산염의 85.4%가 N2O로 발생되어 일정하게 유지되는 현상을 확인하였다. 메타노박틴을 구리와 결합한 후 첨가해주었을 경우, 메타노박틴이 구리와 결합을 한 상태이기 때문에 추가적으로 구리를 이용할 수 없기 ?문에 구리를 필요로 하는 아산화질소 환원효소(NosZ)의 작용을 억제하지 않았고, 결국 N2O의 환원을 저해시키지 않았다.
이러한 결과는 메탄산화균이 생성하는 메타노박틴이 배양액 중의 구리와 결합하여, 구리의 농도를 낮추어, 구리를 필요로 하는 아산화질소 환원효소(NosZ)의 작용을 억제하여 결국 N2O의 환원을 저해시키며, 일정 농도 이상이 되면 N2O가 생성된 후 유지될 수 있음을 나타내고, 질산염으로부터 아산화질소의 생산/축적이 가능한 것을 나타낸다.
실시예 3. 메탄과 반응성 질소(NO 3 - , NH 4 + 등)가 동시에 검출되는 환경시료 중의 탈질화 반응 분석
메탄산화균 배양액에 메탄과 반응성 질소(reactive nitrogen) NO3 -, NH4 + 등이 동시에 검출되는 환경시료인 논 토양을 배양한 토양 탈질화균을 배양해주었다.
논 토양을 배양한 토양 탈질화균 배양 방법/조건은 다음과 같다. 토양 3g(wet weight)을 NMS 배지 (pH 7.0, 5 mM phosphate buffer)에 NO3 - 1mM (질산염), 아세트산나트륨 5 mM (전자공여체), CuCl2 0.2μM를 넣어준 후, 99.999% N2로 15분간 플러싱하여 토양 탈질화균을 농화배양하였다. NMS 배지에서 질산염, 아질산염, 아산화질소가 모두 0으로 환원반응이 끝난 것이 확인되면, 메탄산화균 배양체에 0.5 mL의 토양 pre-culture를 접종하여 25도, 140rpm으로 조건에서 배양하였다. 실험에서 사용된 토양은 제주도 곶자왈(33°46'13.4"N 125°09'14.5"E)의 상부(0-15cm)지점에서 채취되었다. 대조군으로, 메탄산화균 배양액 대신 NMS 배지에 토양 탈질화균을 접종하여 아산화질소 발생량을 측정하였다. 토양 성상은 표 2와 같다.
[표 2] 논 토양의 이화학성 정보
Figure 112018081416946-pat00003
그 결과 도 4a와 같이 초기 첨가한 질산염 1 mM 이 모두 아산화질소(113.54±4.85μmol)로 환원된 후, 아산화질소가 줄어들지 않고 일정하게 유지되는 현상을 관찰할 수 있었다. 녹색 라인과 붉은 라인 모두 아산화질소이며, 메탄산화균의 유무의 차이로, 녹색은 메탄산화균 배양 후, 탈질화균을 배양한 샘플이고, 붉은 라인은 메탄산화균을 배양하지 않고 탈질화균을 배양한 샘플의 결과이다. 모든 반응이 종료된 후, 이 샘플을 메탄산화균 배양액에 다시 접종하여 아산화질소의 발생량(메탄산화균 배양액에 메타노박틴이 포함되어있어 아산화질소에서 질소로의 환원을 억제하기 때문에 아산화질소가 생성되었다)을 측정한 결과 도 4b와 같이 아산화질소가 발생된 후 환원되지 않고 일정하게 유지되는 모습을 보였다.
이에 대한 비교실험으로 메탄산화균이 존재하지 않는 배지에 토양 탈질화균을 접종하여 아산화질소 발생량을 측정하였을 때, 최대 5.39μmol의 아산화질소가 발생된 후 모두 환원되어 제거되었다. 이는 메탄과 반응성 질소 NO3 -, NH4 + 등이 동시에 검출되는 환경에서도 메탄산화균이 메타노박틴을 생성함에 따라 아산화질소의 환원 반응을 저해하여 아산화질소를 생산해낼 수 있음을 나타내는 것이다. 본 발명의 하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법은 메탄산화균과 탈질균의 상호작용을 이용하여 하수 내 질소화합물 제거 및 에너지원인 아산화질소로 전환을 동시에 수행하여 대기로 방출되는 아산화질소를 저감함과 동시에 연료로 사용할 수 있는 효과가 있는 것으로 판단된다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (7)

  1. 하폐수에서 분리된 상등수 및 슬러지를 각각 처리하는 수 처리 공정 및 슬러지 처리 공정을 포함하는 하폐수처리 공정에서 아산화질소의 축적 방법으로,
    상기 수 처리 공정에서 상기 상등수를 무산소 상태에서 배양하여 탈질화균에 의한 탈질화 반응을 수행하는 단계;
    상기 슬러지 처리 공정에서 상기 슬러지를 혐기 상태에서 메탄발효하는 단계;
    상기 메탄발효에서 생성된 메탄을 이용하여 메탄산화균을 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 메탄산화균의 배양물을 상기 수 처리 공정의 탈질화 반응에 추가하는 단계를 포함하며,
    상기 메탄산화균은 메틸로사이너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain SB2), 또는 메틸로시스티스 sp.(Methylocystis sp. strain LW5)이고,
    상기 탈질화균은 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas spp.), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 데클로로모나스 아로마티카(Dechloromonas aromatica strain RCB) 또는 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans) 이고,
    상기 배양물은 메탄산화균 유래의 메타노박틴(methanobactin)을 포함하며, 상기 메타노박틴은 상기 탈질화균의 NosZ (Nitrous oxide reductase genes) 효소를 억제하여 상기 탈질화 반응에서 생성된 아산화질소의 환원 반응을 억제하는 것인,하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양물은 배양액, 또는 배양균 및 배양액을 포함하는 것인, 하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 메타노박틴은 0.1μM 내지 1.0μM 농도로 포함되는, 하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 탈질화균을 배양하는 단계에서, 상기 메탄발효에서 생성된 메탄은 메탄:공기의 부피비가 20:80이 되도록 공급되는 것인, 하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 메탄산화균을 배양하는 단계에서, 상기 배양은 pH7.0, 30℃의 조건에서 수행되는 것인, 하수처리공정에서 아산화질소의 축적 방법.
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