KR102036711B1 - Manufacture method for stem cell-nano complex - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기존의 줄기세포 부작용 및 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제효과도 매우 우수한 줄기세포 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 및 금(Au) 나노입자 기반의 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 제공한다. The present invention is a stem cell-nano anticancer agent loaded with carbon nanotube (CNT) and gold (Au) nanoparticle-based anticancer agents on the stem cell surface, which overcomes the existing stem cell side effects and target limitations of the nano anticancer agent and also has an excellent anticancer effect. It provides a method for producing a composite.

Description

줄기세포-나노 복합체의 제조방법{Manufacture method for stem cell-nano complex}       Manufacturing method for stem cell-nano complex

본 발명은 나노 항암제 복합체의 제조방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포-나노항암제 복합체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a nano-cancer drug complex, and more particularly, to a method for producing a stem cell-nano-cancer drug complex.

현재, 암을 치료하기 위한 방법으로는 수술을 통한 치료, 방사선 치료 그리고 항암제 투여를 통한 치료 등이 있으나 이는 부작용이 수반되거나, 암의 진행 정도에 따라 시술이 제한적으로 적용되고 특히, 항암제는 거듭된 연구결과 양적인 측면에서는 그 종류가 늘었지만, 질적인 측면에서는 큰 변화가 없었다. 그 이유는 항암제 대부분이 분열이 왕성한 세포의 세포주기를 멈추게 하고 사멸케 하는 메커니즘으로 작동하기 때문이고, 이로 인해 암세포 이외에도 정상적으로 분열하는 세포를 공격해서 항암제의 대표적 부작용인 탈모, 식욕부진 및 백혈구 감소로 인한 면역력 저하 등을 유발하기 때문이다. 이러한 항암제의 부작용을 최소화하기 위해 표적항암제의 개발이 활발히 일어나고 있으며, 현재까지 18종 이상의 표적항암제가 개발되어 임상에 적용되고 있고, 200여종 이상이 임상실험 중이다. 하지만 이러한 표적항암제는 같은 종류의 암이라도 특정 표적인자가 나타난 환자에게 효과가 있다는 한계가 있으며, 표적치료제는 장기간에 걸쳐서 투여해야하기 때문에 내성을 유발하는 문제가 있어 이를 보완하기 위해 표적치료제를 기존의 강력한 항암제와 병합하는 칵테일 요법과 여러 표적인자를 동시에 공격함으로써, 단 시간에 암을 제거하는 단일항암제를 사용하는 방법 등이 있는데, 이것 또한 심각한 부작용을 유발할 위험성을 내포하고 있다. 따라서 부작용이 적으면서도 효율적으로 암을 치료할 수 있는 표적치료제로 금나노 물질(Gold Nanoparticle), 생분해성 폴리머류(Biodegradable polymers) 및 탄소 나노튜브(carbon nanotubes)를 이용한 항암제의 연구가 활발히 진행중이다. 특히 나노입자들은 기계적, 시각적, 화학적 특성으로 인하여, 이미징(imaging), 암 치료 등을 포함한 다양한 생물의학 분야에서 적용이 가능하다. 항암제 전달체(drug carrier)로서 탄소 나노튜브는 세포내 이입(endocytosis)을 통하여 생체 분자를 세포 내로 효과적으로 전달하는 방법에 관한 연구가 주로 진행되어 왔으며, 탄소 나노튜브의 표면을 PEG(polyethylene glycol)로 처리하여, 항암제를 적재(loading)하는 방법이 연구되고 있다. 또한, 금 입자를 나노 크기로 제어하면 원재료에서 볼 수 없는 새로운 물리ㅇ화학적 성질이 나타내는데 이것은 결정의 크기가 작아지면 전체 원자에 대한 표면 원자의 비가 크게 증가하며 이러한 결과는 물질의 열역학적 성질에 큰 변화를 일으킨다. 일반적으로 고체 물질의 표면 원자들은 내부 원자들에 비해 자유 에너지에 큰 기여를 하는데 표면원자의 증가는 나노 결정의 녹는점 내림이나 상전이 같은 열역학적 성질을 변화시키고 전자기적, 광학적, 기계적, 열적 특성을 나타내기 때문에 트랜지스터, 발광소자, 센서, 태양전지 등 다양한 나노소자의 기초 물질이 되고 이를 이용하여 항암제 치료 효율이 향상된 항암제 제조에 사용되고 있다. 예컨대 금 나노 입자에 관능기를 만들고 독소루비신이나 파클리탁셀과 같은 항암제를 금 나노 입자 표면에 적재한 금 나노 입자 기반의 항암제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. Currently, there are methods for treating cancer, such as treatment through surgery, radiation therapy and chemotherapy, but this may be accompanied by side effects or the treatment is limited depending on the progression of the cancer. As a result, the number increased in terms of quantity, but there was no significant change in quality. The reason for this is that most anticancer drugs act as a mechanism to stop and kill the cell cycles of proliferating cells, which in turn attacks the normally dividing cells in addition to cancer cells, leading to hair loss, loss of appetite, and white blood cells. This is because it causes a decrease in immunity. In order to minimize the side effects of these anticancer drugs, the development of target anticancer drugs is actively taking place. To date, more than 18 target anticancer drugs have been developed and applied to clinical trials, and more than 200 are currently in clinical trials. However, these target anticancer drugs have a limitation in that they can be effective in patients with specific targets even when the same type of cancer is used. Targeted drugs have to be administered over a long period of time, causing resistance. Cocktail therapy that combines powerful anticancer drugs with multiple targets at the same time, using a single anticancer drug to remove cancer in a short time, including the risk of causing serious side effects. Therefore, researches on anticancer drugs using gold nanoparticles, biodegradable polymers and carbon nanotubes as target therapeutics that can effectively treat cancers with fewer side effects are being actively conducted. In particular, nanoparticles are applicable to various biomedical fields including imaging, cancer treatment, etc. due to their mechanical, visual, and chemical properties. Carbon nanotubes as a drug carrier (drug carrier) has been mainly studied how to effectively deliver biological molecules into cells through endocytosis, the surface of the carbon nanotubes treated with polyethylene glycol (PEG) Thus, a method of loading an anticancer agent has been studied. In addition, nanoscale control of gold particles reveals new physicochemical properties that are not found in raw materials, which means that the smaller the size of the crystal, the greater the ratio of surface atoms to total atoms, which results in a large change in the thermodynamic properties of the material. Causes In general, the surface atoms of a solid material make a significant contribution to free energy compared to internal atoms. The increase in surface atoms alters thermodynamic properties such as melting of nanocrystals and phase transitions, and exhibits electromagnetic, optical, mechanical, and thermal properties. Since it is a base material of various nano devices such as transistors, light emitting devices, sensors, solar cells, and the like, it is used to manufacture anticancer drugs with improved anticancer drug treatment efficiency. For example, studies on gold nanoparticle-based anticancer agents that have functional groups on gold nanoparticles and loaded anticancer agents such as doxorubicin or paclitaxel on the surface of gold nanoparticles are being actively conducted.

보다 효율적인 항암제치료를 위해 개발되어 온 기존의 나노 항암제들의 경우 제형에 사용되어 온 생분해성 폴리머가 산성 pH 및 혈액조건에서 항암제가 나노 물질로부터 쉽게 해리되어 표적 부위로의 항암제 전달에 한계가 있어 왔고 실리카, 자성입자, 탄소계 나노입자 등의 비분해성 나노입자는 독성 극복 항암제 용량에서 효능에 대한 검증이 안 되어 세망내피계(reticular endothelial system; RES) 기관에 축적되는 등의 단점을 가지고 있는 등, 종래의 나노 항암제들은 아직 해결해야 할 난제를 가지고 있다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1711127호는 암 표적화된 항암제 결합 산화철 나노입자 복합체, 그 제조방법, 및 그의 용도에 대해 개시하고 있다. In the case of conventional nanocancer drugs that have been developed for more effective anticancer drugs, the biodegradable polymers used in the formulation have been easily dissociated from the nanomaterials at acidic pH and blood conditions, and there is a limit to the anticancer drug delivery to the target site. Non-degradable nanoparticles, such as magnetic particles and carbon-based nanoparticles, have not been proven to be effective in overcoming toxic anticancer doses, and have disadvantages such as accumulation in reticular endothelial system (RES) organs. Nano-cancers still have challenges to solve. In this regard, Korean Patent No. 1711127 discloses a cancer-targeted anticancer agent-bonded iron oxide nanoparticle complex, a method for preparing the same, and a use thereof.

그러나 상기 선행기술의 경우, 낮은 암 표적능으로 인해 항암제의 효과가 감소되는 문제점이 있다. However, in the case of the prior art, there is a problem that the effect of the anticancer agent is reduced due to the low cancer targeting ability.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 종래의 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제의 효능을 극대화한 새로운 형태의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The present invention is to solve a number of problems including the above problems, to provide a method for producing a new type of stem cell-nano anticancer complexes that overcome the target limitations of conventional nano-cancer drugs and maximize the efficacy of anti-cancer drugs. The purpose. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.

본 발명의 일 관점에 따르면, 나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계; 카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계: EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 항체의 기능성 단편 또는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및 상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법이 제공된다. According to one aspect of the invention, the carboxylation step of introducing a carboxyl group (-COOH) on the surface of the nanoparticles; EDC linker binding step of binding an EDC {1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} linker to a carboxylated nanoparticle: to an anticancer compound having an amine group and a stem cell surface antigen Anticancer compound and antibody binding step of covalently binding an antibody or a functional fragment or antibody mimetics of the antibody to specifically bind; And it provides a method for producing a stem cell-nano anticancer complex comprising a stem cell binding step of combining the anti-cancer compound and the antibody-bound nanoparticles and stem cells.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 항암제의 효능을 극대화하고 종래 나노 항암제의 표적능이 향상된 새로운 형태의 줄기세포-나노항암제 복합체의 제조방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. According to one embodiment of the present invention made as described above, it is possible to maximize the efficacy of the anticancer agent and to implement a method for producing a new type of stem cell-nanoanticancer complex with improved target ability of the conventional nanoanticancer agent. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 중간엽 줄기세포(MSC)의 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 기반 및 금(Au) 나노 기반 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조를 개략적으로 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-탄소 나노튜브 기반 나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)(A)와 줄기세포-금 나노입자 기반 나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-Au-DOX)(B)를 제조 후 공초점 형광현미경을 이용하여 줄기세포 표면에 독소루비신 결합 mwCNT 및 Au가 제대로 부착되어 있음을 확인한 그림과 현미경 사진이다.
도 3은 줄기세포 표지 단백질 CD90에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도를 분석한 그래프이다.
도 4는 줄기세포 표지 단백질 CD90 또는 CD73에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도 변화를 분석한 그래프이다.
도 5는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 시간에 따른 항암제 결합지속 정도를 분석한 그래프이다.
도 6은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 줄기세포의 세포 생존률 변화를 분석한 그래프이다.
도 7은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) 결합 후의 시간별 줄기세포의 생존률 변화를 분석한 그래프이다.
도 8은 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 내 칼슘 농도 변화를 분석한 그래프이다.
도 9는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 MSC 세포 데미지(damage)를 표지단백질(E-cadherin) 발현변화를 통해 확인한 공초점 현미경 사진이다.
도 10은 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 제조 후 세포 표면과 결합된 나노항암제를 확인한 공초점 현미경 사진과 결합 후 암세포 표적 능력 변화를 분석하여 줄기세포-나노항암제 복합체의 기능성을 분석한 그래프이다.
도 11은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노항암제 복합체의 독소루비신 항암제의 농도를 분석한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 독소루비신 항암제의 적재 정도를 분석한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체의 비소세포 폐암세포주(A549 및 H1975)로의 표적 능력을 분석한 그래프이다.
도 14는 MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군 및 MSC conjugation CNT-DOX 실험군의 줄기세포간의 자체 독성을 비교분석한 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 장시간에서의 시간별 폐암세포(H1975) 사멸능력을 비교분석한 유세포 분석 데이터이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 장시간에서의 시간별 폐암세포(H1975) 사멸능력을 분석한 그래프이다.
도 17은 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군의 줄기세포 자체의 사멸능을 분석한 그래프이다.
도 18은 MSC 배지 처리군, MSC 처리군, MSC intracellular CNT-DOX uploading 실험군, MSC conjugation CNT-DOX 실험군 및 대조군에 240 시간 동안 폐암세포주에 처리한 후 암세포 표지 단백질(CD 31, 34)을 이용하여 줄기세포의 암세포로의 역분화를 분석한 그래프이다.
도 19는 줄기세포 내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군의 세포 내 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 20은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군을 폐암세포주(H1975)에 처리한 후 각각 세포간의 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 21은 줄기세포내로 나노 항암제를 적재하거나 줄기세포 막 단백질과 결합시킨 줄기세포-나노 항암제 복합체 및 MSC 대조군을 폐암세포주(H1975)에 처리한 후 각각 세포간의 칼슘 신호전달 변화를 분석한 그래프이다.
도 22는 누드마우스에 luciferase-RFP 형광을 발광하는 종양세포 주입 후 폐종양 모델을 성립과 확인 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 23은 폐종양 모델 마우스에 종양세포 주입 후 형광 이미징 장비(IVIS in vivo imaging system)와 폐조직 염색을 통하여 확인한 사진이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여로 형광 발광 폐종양의 생성 여부를 형광이미지 장비로 관찰한 사진이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여 후 관찰된 형광 발광의 세기를 분석한 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여로 폐종양의 생성이 억제되었음을 H&E 조직화학염색법으로 관찰한 사진이다.
도 27은 특정 암에 선택적으로 표적하는 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD90-Au-DOX)의 적용과정을 개략적으로 나타내는 그림이다.1 schematically illustrates the preparation of a stem cell-nano anticancer complex loaded with carbon nanotube (CNT) -based and gold (Au) nano-based anticancer agents on the surface of mesenchymal stem cells (MSCs) according to an embodiment of the present invention. It is an illustration.
Figure 2 is a stem cell-carbon nanotube-based nano-cancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) (A) and stem cell-gold nanoparticle-based nano-cancer complex prepared in accordance with an embodiment of the present invention (hMSC-CD90 -Au-DOX) (B) was prepared using confocal fluorescence microscopy to confirm that doxorubicin-coupled mwCNT and Au are properly attached to the stem cell surface and micrographs.
Figure 3 is a graph analyzing the degree of anticancer drug loading per cell of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) bound using an antibody that binds to the stem cell marker protein CD90.
Figure 4 analyzes the changes in the anticancer drug load of cells of the stem cell-nanoanticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) bound using an antibody binding to the stem cell marker protein CD90 or CD73 One graph.
Figure 5 is a graph of the anticancer agent persistence of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) over time.
Figure 6 is a graph analyzing the change in cell viability of stem cells of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX).
Figure 7 is a graph analyzing the change in survival rate of stem cells over time after the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) binding.
Figure 8 is a graph analyzing the intracellular calcium concentration change of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX).
9 is a confocal micrograph of MSC cell damage of stem cell-nano anticancer complexes (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) through changes in the expression of marker protein (E-cadherin). to be.
Figure 10 is a stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) of the present invention after the combination of confocal micrographs confirming the anti-cancer drug bound to the cell surface after the combination of cancer cells target capacity analysis by analyzing the stem cell- It is a graph analyzing the functionality of the nano-cancer drug complex.
11 is a graph analyzing the concentration of doxorubicin anticancer agent of the stem cell-nanoanticancer complex in which the nanoanticancer agent is loaded into the stem cells or combined with the stem cell membrane protein.
12 is a graph analyzing the loading degree of doxorubicin anticancer agent of the stem cell-nanoanticancer complex of the present invention.
Figure 13 is a graph analyzing the target capacity of the stem cell-nano anticancer complex of the present invention to non-small cell lung cancer cell lines (A549 and H1975).
Figure 14 is a graph comparing the self-toxicity between the stem cells of the MSC intracellular CNT-DOX uploading experimental group and MSC conjugation CNT-DOX experimental group.
Figure 15 compares the time-dependent lung cancer cells (H1975) killing capacity of the MSC medium treatment group, MSC treatment group, MSC intracellular CNT-DOX uploading experimental group, MSC conjugation CNT-DOX experimental group and control group for a long time according to an embodiment of the present invention Analyzed flow cytometry data.
Figure 16 analyzes the ability to kill the lung cancer cells (H1975) for a long time in the MSC medium treatment group, MSC treatment group, MSC intracellular CNT-DOX uploading experimental group, MSC conjugation CNT-DOX experimental group and the control group according to an embodiment of the present invention. One graph.
Figure 17 is a graph analyzing the killing capacity of stem cells in the MSC medium treatment group, MSC treatment group, MSC intracellular CNT-DOX uploading experimental group, MSC conjugation CNT-DOX experimental group and the control group.
Figure 18 was treated with lung cancer cell lines in MSC media treatment group, MSC treatment group, MSC intracellular CNT-DOX uploading experimental group, MSC conjugation CNT-DOX experimental group and control group for 240 hours using cancer cell marker proteins (CD 31, 34) It is a graph analyzing the reverse differentiation of stem cells into cancer cells.
19 is a graph analyzing intracellular calcium signaling changes of the stem cell-nano anticancer complex and the MSC control group in which the nano-cancer agent is loaded into the stem cells or combined with the stem cell membrane protein.
FIG. 20 is a graph illustrating changes in calcium signaling between cells after treatment with a lung cancer cell line (H1975), in which a stem cell-nano anticancer complex and an MSC control group in which a nano anticancer agent is loaded into a stem cell or combined with a stem cell membrane protein.
Figure 21 is a graph analyzing the changes in calcium signaling between cells after the treatment of the cancer cell line (H1975) with a stem cell-nano anticancer complex and an MSC control group loaded with nano anticancer agents or stem cell membrane proteins into stem cells.
FIG. 22 is a schematic diagram illustrating a procedure for establishing and confirming a lung tumor model after injecting tumor cells emitting luciferase-RFP fluorescence into nude mice. FIG.
FIG. 23 is a photograph confirmed by fluorescence imaging equipment (IVIS in vivo imaging system) and lung tissue staining after tumor cell injection into a lung tumor model mouse.
24 is a photograph observing whether the generation of fluorescence lung tumor by the administration of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) prepared according to an embodiment of the present invention with fluorescence imaging equipment.
25 is a graph analyzing the intensity of fluorescence observed after administration of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) prepared according to one embodiment of the present invention.
Figure 26 is a photograph observed by H & E histochemical staining that the production of lung tumors was inhibited by administration of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) prepared according to an embodiment of the present invention.
FIG. 27 is a diagram schematically illustrating a process of applying a stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD90-Au-DOX) selectively targeted to a specific cancer.

용어의 정의:Definition of Terms:

본 문서에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)"는 성체 줄기세포 중 성체 중간엽 줄기세포(Adult mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미하며 골수나 제대혈, 지방세포에서 유래되며 다분화능을 가진 것이 특징이다. As used herein, the term "mesenchymal stem cells (MSCs)" refers to adult mesenchymal stem cells (MSCs) among adult stem cells and is derived from bone marrow, cord blood, or adipose cells. It is characterized by having differentiation ability.

본 문서에서 사용되는 용어 "탄소 나노튜브(carbon nanotube, CNT)"는 지구상에 다량으로 존재하는 탄소로 이루어진 탄소동소체로서 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질이며, 튜브의 직경이 나노미터(nm=10 억분의 1 미터) 수준으로 극히 작은 영역의 물질을 의미한다. As used herein, the term "carbon nanotube" (CNT) is a carbon allotrope made up of a large amount of carbon present on the earth, a material in which one carbon is combined with another carbon atom in a hexagonal honeycomb pattern to form a tube. It means the material of the extremely small area with the diameter of the tube in the order of nanometer (nm = 1 billionth of a meter).

상기 탄소 나노튜브는 우수한 기계적 특성, 전기적 선택성, 뛰어난 전계방출 특성, 고효율의 수소저장매체 특성 등을 지니며 현존하는 물질 중 결함이 거의 없는 완벽한 신소재로 알려져 있고, 고도의 합성기술에 의해 제조되며, 합성방법으로는 전기방전법, 열분해법, 레이저 증착법, 플라즈마 화학 기상 증착법, 열화학기상증착법, 전기분해방법, Flame 합성방법 등이 있다. The carbon nanotubes are known to be perfect new materials having excellent mechanical properties, electrical selectivity, excellent field emission characteristics, high-efficiency hydrogen storage medium properties, and few defects among existing materials, and are manufactured by highly synthetic technology. Synthesis methods include electric discharge, pyrolysis, laser deposition, plasma chemical vapor deposition, thermochemical vapor deposition, electrolysis, flame synthesis, and the like.

본 문서에서 사용되는 용어 "금 나노 입자(AuNP)"는 금의 입자 크기가 nanometer scale에 있는 것으로 1-9m 정도의 입자로 완전한 구 모양이 아니라 불규칙한 모양으로 되어있으며 각각의 모양과 크기에 따라 states가 다르고 색깔이 다르다. 상기 states에 따라 어떤 영역에 해당하는 파장을 어느 정도 반사하고 흡수하는 지에 따라 색깔이 결정된다. 이를 통해 energy gap을 추측할 수 있고 크기가 클수록 짧은 파장의 색을 내는데 항암제를 부착시켜 입자를 약 운반제로 이용하거나, 특정 항체를 부착시켜 세포 표면에서 항원을 검출하는데 이용될 수 있다. 또한, 류마티스 관절염의 치료제로도 사용될 수 있으며, 의료부분 뿐만 아니라 다양한 분야에 사용될 수 있는 차세대 신 물질이다.As used herein, "Gold nanoparticles (AuNP)" is the particle size of the gold particles as well as a perfect sphere of about 1 -9 m to be in the nanometer scale is irregular in shape, and in accordance with the respective shapes and sizes, Different states and different colors. Depending on the states, the color is determined by how much of the region reflects and absorbs the wavelength. Through this, the energy gap can be inferred, and the larger the size, the shorter the wavelength of the color can be attached to the anticancer agent to use the particles as a drug carrier, or by attaching a specific antibody can be used to detect the antigen on the cell surface. In addition, it can be used as a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, and is a next generation new substance that can be used in various fields as well as the medical part.

본 문서에서 사용되는 용어 "나노 항암제 복합체"는 항암제의 방출, 흡수를 제어 하거나, 체내의 특정부위에 항암제를 표적화(targeting)하여 전달하기 위한 것으로, 항암제의 부작용을 줄이면서 효능을 극대화 시켜 필요한 양의 항암제를 표적부위에 일정시간 동안 효과적으로 머무를 수 있도록 조절하기 위한 것으로 나노기술을 이용한 항암제 전달 시스템을 의미한다.As used herein, the term "nano-cancer complex" is intended to control the release and absorption of an anticancer agent, or to target and deliver an anticancer agent to a specific part of the body, and to maximize the efficacy while reducing the side effects of the anticancer agent. It is to control the anticancer agent in the target site to effectively stay for a certain time. It means an anticancer drug delivery system using nanotechnology.

본 문서에서 사용되는 용어 "항암제가 적재된 탄소나노튜브(CNT) 또는 급(Au) 나노입자"는 의미는 탄소 나노튜브 또는 금 나노입자에 카르복실기(-COOH)와 같은 관능기(functional group)를 도입하고 독소루비신이나 파클리탁셀과 같은 항암제 또는 트라츠맙(Trastuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 및 인플릭시맙(Infliximab) 등과 같은 항암제치료용 항체를 금 나노 입자 표면에 부착시킨 항암제 나노입자를 의미한다. 탄소나노튜브의 관능기 도입은 산 처리에 의해 수행될 수 있고, 금 입자 자체에는 관능기가 없으므로 정전기적으로 안정화시키기 위해서 카르복실기로 치환된 PEG 또는 PLGA와 같은 폴리에스테르 계열 생적합성 중합체를 코팅시킨 후 아민기(-NH2)를 가진 독소루비신과 같은 항암제 또는 항체를 결합하여 제조할 수 있다. As used herein, the term "carbon nanotube (CNT) or class (Au) nanoparticles loaded with anticancer agent" means the introduction of a functional group such as a carboxyl group (-COOH) to carbon nanotubes or gold nanoparticles. And anticancer nanoparticles having an anticancer agent such as doxorubicin or paclitaxel or an anticancer agent such as trastuzumab, adalimumab, and infliximab attached to a gold nanoparticle surface. The functional group introduction of carbon nanotubes can be performed by acid treatment, and since the gold particles themselves have no functional groups, they are coated with a polyester-based biocompatible polymer such as PEG or PLGA substituted with a carboxyl group to stabilize electrostatically. It can be prepared by combining an anticancer agent or an antibody such as doxorubicin with (-NH 2 ).

본 문서에서 사용되는 용어 "항체의 기능성 단편"은 항체의 항원 결합부위의 기능이 보존되어 항원 결합능을 보유한 항체의 단편을 의미한다. 이러한 항체의 기능성 단편에는 항체를 파파인이나 펩신과 같은 단백질 분해효소로 절단하여 생성된 Fab, Fab' 및 F(ab')2와 같은 단백질 분해효소 절단편 및 Fv, scFv, diabody, triabody, 및 sdAb과 같이 유전자 재조합에 의해 생성된 재조합 항체단편도 포함된다.As used herein, the term "functional fragment of an antibody" refers to a fragment of an antibody that retains the ability of antigen binding to retain the function of the antigen binding site of the antibody. Functional fragments of these antibodies include protease fragments such as Fab, Fab 'and F (ab') 2 and Fv, scFv, diabody, triabody, and sdAb, which are produced by cleaving the antibody with proteases such as papain or pepsin. Also included are recombinant antibody fragments produced by genetic recombination.

본 문서에서 사용되는 용어 "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigen-binding)으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편으로 VH-CH1 및 VL-CL,의 두 펩타이드의 이량체로, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystalisable)라 지칭한다.As used herein, the term "Fab" refers to a fragment generated by cleaving an antibody molecule with papain, a protease, as an antigen-binding antibody fragment, which is the amount of two peptides, VH-CH1 and VL-CL. In other words, other fragments produced by papain are referred to as fragment crystalisable (FC).

본 문서에서 사용되는 용어 "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원 결합 부위를 포함하는 단편으로 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.As used herein, the term “F (ab ′) 2 ” refers to a fragment containing an antigen binding site among fragments generated by cleaving an antibody with pepsin, a protease, and forms a tetramer in which two Fabs are linked by disulfide bonds. Indicates. Another fragment produced by pepsin is called pFc '.

본 문서에서 사용되는 용어 "Fab'"는 상기 Fab와 유사한 구소를 갖는 항체단편으로서 상기 F(ab')2를 환원시켜 생성되며, Fab에 비해 중쇄 부분의 길이가 약간 더 길다.The term "Fab '", as used herein, is an antibody fragment having a structure similar to that of Fab, resulting from the reduction of F (ab') 2, with the length of the heavy chain portion slightly longer than that of Fab.

본 문서에서 사용되는 용어 "scFv"는 단일쇄 가변영역 단편(single chain fragment variable)로서 항체의 Fab 중 가변영역(VH 및 VL)을 링커를 이용하여 단일쇄로 제조한 재조합 항체 단편을 의미한다.As used herein, the term "scFv" refers to a recombinant chain fragment prepared by using a linker in a variable chain (VH and VL) in the Fab of the antibody as a single chain fragment variable.

본 문서에서 사용되는 용어 "sdAb(single doamain antibody)"는 나노바디(nanobody)라고 지칭되며, 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다.The term "sdAb (single doamain antibody)" as used herein is referred to as a nanobody and is an antibody fragment consisting of a single variable region fragment of an antibody. Although sdAbs mainly derived from heavy chains are used, single variable region fragments derived from light chains have also been reported to have specific binding to antigens.

본문서에서 사용되는 용어 "VHH"는 낙타류에서 발견된 중쇄의 이량체로만 구성된 IgG의 중쇄의 가변영역 단편으로서 항원에 대한 특이적 결합을 하는 항체 단편 중 가장 작은 크기(~15 kD)을 가지고 있으며, Ablynix사에 의해 Nanobody??라는 상표명으로 개발된 바 있다.As used herein, the term "V H H" is a variable region fragment of the heavy chain of IgG consisting only of dimers of heavy chains found in camels, the smallest (~ 15 kD) of antibody fragments that specifically bind to the antigen. and has, Nanobody by four Ablynix ?? It was developed under the trade name.

본 문서에서 사용되는 용어 "Fv(fragment variable)"는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영영(VH 및 VL)만으로 구성된 이량체성 항체 단편으로 크기가 상기 sdAb와 Fab의 중간 정도(약 ~ 25 kD)로서 항체를 특별한 조건에서 단백질 가수분해시켜 생성하거나 VH 및 VL을 암호화하는 유전자를 하나의 발현벡터에 삽입하여 발현시킴으로써 제조한다.As used herein, the term "Fv (fragment variable)" is a dimeric antibody fragment consisting of only the variable and heavy chains of the antibody (VH and VL), the size of the sdAb and Fab (about 25 kD) Antibodies are produced by proteolytic hydrolysis under specific conditions or by inserting genes encoding VH and VL into one expression vector.

본 문서에서 사용되는 용어 "다이아바디(diabody)"는 scFv의 VH 및 VL 사이의 링커 길이를 짧게하여(5 a.a) 두 개의 scFv가 서로 이량체를 형성하도록 제조된 이가성(divalent)의 이중특이성(bispesific)을 갖는 재조합 항체 단편으로 통상의 scFv 보다 항원 특이성이 더 높은 것으로 알려져 있다.As used herein, the term "diabody" refers to a divalent bispecific that is made to shorten the linker length between VH and VL of the scFv (5 aa) so that the two scFvs form dimers with each other. Recombinant antibody fragments with bispesific are known to have higher antigen specificity than conventional scFv.

본 문서에서 사용되는 용어 "트라이아바디(triabody)"는 세 개의 scFv가 서로 삼량체(trimer)를 형성하도록 제조된 삼가성(trivalent)의 재조합 항체 단편을 의미한다.As used herein, the term "triabody" refers to a trivalent recombinant antibody fragment prepared so that three scFvs form trimers with each other.

본 문서에서 사용되는 용어 "항체 유사체(antibody mimetics)"는 항체와 유사하게 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일쇄 기반의 단백질로서, 기본이 되는 스캐폴드 단백질의 항원인식부위에 대한 무작위 돌연변이 도입 후 패닝(panning)을 통해 선별된다. 이러한 항체 유사체에는 아피린(affilins; Ebersbach, H. et al. J. Mol. Biol., 372: 172-185, 2007), 아피머(affimers; Johnson, A. et al. Anal. Chem., 84(15): 6553-6560, 2012), 아피틴(affitins; Krehenbrink, M. et al., J. Mol. Biol., 383: 1058-1068, 2008), 안티칼린(anticalins; Skerra, A. et al., FEBS J., 275: 2677-2683, 2008), 아비머(avimers; Silverman, J. et al. Nat. Biotechnol., 23: 1556-1561, 2005), DARPin(Stumpp, M.T. et al., Drug Discov. Today 13(15-16): 695-701, 2008), 피노머(Fynomers, Grabulovski, D. et al., J. Biol. Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 모노바디(monobodies; Koide, A. et al., Methods Mol. Biol., 352: 95-109, 2007), VLR(variable lymphocyte receptor; Boehm, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), 리피바디(repebodies, Lee, S.-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(9): 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.As used herein, the term "antibody mimetics" is a single chain-based protein capable of specifically binding to an antigen, similar to an antibody, introducing random mutations into the antigen recognition site of the underlying scaffold protein. It is then screened through panning. Such antibody analogues include apirin (affilins; Ebersbach, H. et al . J. Mol. Biol ., 372: 172-185, 2007), affimers; Johnson, A. et al . Anal. Chem . 84 (15): 6553-6560, 2012), apitin (affitins; Krehenbrink, M. et al ., J. Mol. Biol. , 383: 1058-1068, 2008), anticalins (Skerra, A. et. al ., FEBS J. , 275: 2677-2683, 2008), avimers; Silverman, J. et al . Nat. Biotechnol ., 23: 1556-1561, 2005), DARPin (Stumpp, MT et al. Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701, 2008), finomers (Fynomers, Grabulovski, D. et al., J. Biol. Chem. 282 (5): 3196-3204, 2007), Monobodies (Koide, A. et al ., Methods Mol. Biol ., 352: 95-109, 2007), VLR (variable lymphocyte receptor; Boehm, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 30: 203-220, 2012), repebodies, Lee, S.-C. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109 (9): 3299-3304, 2012).

발명의 상세한 설명:Detailed description of the invention:

본 발명의 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 관점에 따르면, 나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계; 카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계: EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편 또는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및 상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법이 제공된다.According to one aspect of the invention, according to one aspect of the invention, a carboxylation step of introducing a carboxyl group (-COOH) on the surface of the nanoparticles; EDC linker binding step of binding an EDC {1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} linker to a carboxylated nanoparticle: to an anticancer compound having an amine group and a stem cell surface antigen An anticancer compound and an antibody binding step of covalently binding an antibody that binds specifically, a functional fragment or antibody mimetics of the antibody; And it provides a method for producing a stem cell-nano anticancer complex comprising a stem cell binding step of combining the anti-cancer compound and the antibody-bound nanoparticles and stem cells.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 나노입자는 탄소 나노튜브일 수 있고 상기 탄소 나노튜브는 다중벽 탄소 나노튜브일 수 있으며 상기 다중벽 탄소 나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 가질 수 있다. In the method for producing a stem cell-nano anticancer complex, the nanoparticles may be carbon nanotubes, the carbon nanotubes may be multi-walled carbon nanotubes, and the multi-walled carbon nanotubes may have a diameter of 5 to 50 nm. Can have.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 카르복실화 단계는 상기 탄소 나노튜브를 산(acid)처리하는 산처리 공정에 의해 수행될 수 있고 산처리된 탄소 나노튜브를 초음파(ultrasonic wave) 처리하는 초음파 처리 공정을 추가로 포함할 수 있다. In the method for preparing the stem cell-nano anticancer complex, the carboxylation step may be performed by an acid treatment process of acid treating the carbon nanotubes, and ultrasonically treated the acid-treated carbon nanotubes. The method may further include an ultrasonic treatment process.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 나노입자는 금 나노입자일 수 있고 상기 카르복실화 단계는 상기 금 나노입자에 카르복실기를 포함하는 중합체(polymer)를 코팅하는 폴리머 코팅공정에 의해 수행될 수 있으며 상기 카르복실기를 포함하는 중합체는 카르복실화 PEG(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)} 또는 PGA{poly(glycolic acid)}일 수 있다. In the method for producing a stem cell-nano anticancer complex, the nanoparticles may be gold nanoparticles, and the carboxylation step may be performed by a polymer coating process of coating a polymer including a carboxyl group on the gold nanoparticles. The polymer including the carboxyl group may be carboxylated PEG (polyethylene glycol), hyaluronic acid (hyaluronic acid), PHA (polyhydroxyalkanoates), PLGA {poly (lactic-co-glycolic acid)}, PLA {poly (lactic acid)} or PGA {poly (glycolic acid)}.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 CD90, CD73 또는 CD105일 수 있고 상기 나노입자 및 항암 화합물의 중량비가 1:1 내지 1:3일 수 있다. In the method for preparing the stem cell-nano anticancer complex, the antibody specifically binding to the stem cell surface antigen may be CD90, CD73 or CD105 and the weight ratio of the nanoparticles and the anticancer compound is 1: 1 to 1: 3. Can be.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 항암 화합물은 독소루비신, 파클리탁셀, ABT737, 5-플루오로우라실, BCNU, CCNU, 6-메르캅토퓨린, 나이트로젠 머스타드, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메소트렉세이트, 시타라빈 싸이오테파, 부설판 또는 프로카바진일 수 있고 상기 줄기세포는 지방 줄기세포, 제대혈 줄기세포, 역분화 줄기세포, 또는 중간엽 줄기세포(MSC)일 수 있다. In the method for producing the stem cell-nano anticancer complex, the anticancer compound is doxorubicin, paclitaxel, ABT737, 5-fluorouracil, BCNU, CCNU, 6-mercaptopurine, nitrogen mustard, cyclophosphamide, vincristine , Vinblastine, cisplatin, mesotrexate, cytarabine thiothepa, busulfan, or procarbazine, wherein the stem cells are adipose stem cells, cord blood stem cells, dedifferentiated stem cells, or mesenchymal stem cells (MSC) Can be.

상기 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법에 있어서, 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, VHH(variable domain of camelid heavy chain), sdAb, diabody 또는 triabody일 수 있고 상기 항체 유사체는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, VLR(variable lymphocyte receptor), VHH(variable domain of camelid antibody heavy chain) 또는 repebody일 수 있다. In the method for preparing the stem cell-nano anticancer complex, the functional fragment of the antibody is Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, Fv, V H H (variable domain of camelid heavy chain), sdAb, diabody Or may be a triabody and the antibody analogue may be Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, variable lymphocyte receptor (VLR), variable domain of camelid antibody heavy chain (VHH) or repebody.

기존의 나노 항암제들의 경우 제형에 사용되어 온 생분해성 폴리머가 산성 pH 및 혈액조건에서 항암제가 나노 물질로부터 쉽게 해리되어 표적 부위로의 항암제 전달에 한계가 있어 왔고, 종래 실리카, 자성입자, 탄소계 나노입자 등의 비분해성 나노입자는 독성 극복 항암제 용량에서 효능에 대한 검증이 안되고 세망내피계(reticular endothelial system; RES) 기관에 축적되는 등의 해결해야 할 난제를 가지고 있다. 이러한 종래 항암제의 효능을 극대화하고자 탄소 나노튜브 기반의 항암제에 대한 연구가 계속되고 있는데 탄소 나노튜브(carbon nanotubes, CNT)는 탄소를 기본으로 형성된 물질들로 구성되어, Graphite, Carbon tube, Fullerene, Graphene, Diamond 등으로 기계적, 시각적, 화학적 특성으로 인해 이미징(imaging), 암 치료 등을 포함한 다양한 생물의학 분야에서 적용되고 있다(Bae, S., et al., Nat. Nanotechnol. 5, 574, 2010). 최근, 탄소 나노튜브는 무게, 농도 대비 표면적이 가장 넓은 특성, 바이오물질과의 결합이 용이한 특징등으로 바이오 분야에서 항암제 전달체, 의료영상 Agent, DNA 결합체, Biosensor, biochip 등으로 활용 연구 개발되고 있다(Yang, W., et al., Nanotechnol., 18, 412-421, 2007). In the case of conventional nano-cancer drugs, the biodegradable polymers used in the formulation have been easily dissociated from the nano-materials at an acidic pH and blood conditions, so that there is a limit to the delivery of the anti-cancer agent to the target site, and conventional silica, magnetic particles, and carbon-based nano Non-degradable nanoparticles, such as particles, have difficulties to be resolved, such as lack of efficacy in anti-toxic anticancer doses and accumulation in reticular endothelial system (RES) organs. In order to maximize the efficacy of these conventional anticancer drugs, studies on carbon nanotube-based anticancer drugs continue. Carbon nanotubes (carbon nanotubes, CNTs) are composed of carbon-based materials, such as graphite, carbon tube, fullerene, and graphene. , Diamond, etc. have been applied in various biomedical fields including imaging, cancer treatment, etc. due to their mechanical, visual, and chemical properties (Bae, S., et al., Nat. Nanotechnol. 5, 574, 2010). . Recently, carbon nanotubes have been widely used in anti-cancer drug carriers, medical imaging agents, DNA conjugates, biosensors, biochips, etc. in the bio field because of their weight, concentration, surface area, and easy bonding with biomaterials. (Yang, W., et al., Nanotechnol. , 18, 412-421, 2007).

또한, 금(Au)은 지각을 구성하고 있는 물질 중 대략 1% 미만을 차지하고 있어 인류가 사용하고 있는 금속 중에 가장 최초로 사용된 금속 중의 하나로서 잘 알려져 있고 오랫동안 금화용, 장식용, 치과ㅇ의료용으로 사용되고 있을 뿐만 아니라 최근에는 전자, 인공위성, 핵발전소 산업 등에서 미세전선, 도금, 전기접점 등 특수용도로서 다양한 합금형태로 사용되고 있으며, 다양한 방법을 통해 나노 입자로 제조된다. 금 나노 입자를 제조하는 방법은 화학적 합성방법, 기계적 제조방법, 전기적 제조방법이 있다. 기계적인 힘을 이용하여 분쇄하는 기계적 제조방법은 공정상 불순물의 혼입으로 고순도의 입자를 합성하기 어렵고 나노 크기의 균일한 입자의 형성이 불가능하다. 실제적인 방법으로서 레이저 어블레이션(laser ablation)법, 오븐빔(oven beam)법, 고에너지 볼 밀링(high energy ball milling)법 등이 사용되고 있는데 레이저 어블레이션 법은 진공에서 원재료에 레이저빔을 인가하여 발생되는 원자 또는 분자의 증기를 응축하여 나노입자를 제조하며 비교적 고가이고 열효율이 낮은 레이저를 이용하므로 생산량에 비해 생산비가 너무 큰 문제점이 있었고, 또한 진공 하에서 끊는 점이 낮은 물질을 녹여 발생되는 증기를 응축시켜 나노입자를 제조하는 오븐빔 법과 기계적으로 갈아내어 나노입자를 만드는 고에너지 볼 밀링법은 고도의 기술이 요구되고 제조과정이 매우 어려우며, 고가의 제조설비가 요구되는 문제점이 있다. 또 전기분해에 의한 전기적 제조방법의 경우 제조시간이 길고, 농도가 낮아 효율이 낮다는 단점이 있다. 화학적 합성법에는 크게 기상법과 액상법(colloid법)이 있는데, 플라즈마나 기체 증발법을 사용하는 기상법의 경우 고가의 장비가 요구되며 과정이 복잡하여 효율이 떨어지는 단점 때문에 저비용과 간단한 제조 공정으로 균일한 입자의 합성이 가능한 액상법이 주로 사용되고 있다. 상기 액상법에 의한 금 나노 입자의 제조방법은 액상에서 화합물을 해리 시킨 후 환원제나 계면활성제를 사용하여 히드로졸(hydrosol) 형태의 금 나노입자를 제조하는 방법이 있다. 최근에는 염화금산(HAuCl4)염 상태의 무기화합물을 환원제를 이용하여 콜로이드 상태로 합성하는 액상환원법을 통해 금 나노 입자를 제조하고 이에 항암제를 적재하여 암세포로의 표적능력이 향상된 항암제 복합체에 대한 연구 개발이 활발히 진행되고 있다. In addition, gold (Au) accounts for less than 1% of the constituents of the earth's crust, making it well known as one of the first metals used by mankind, and has long been used for gold coins, decorative, and dental care. In addition, in recent years, in the electronic, satellite, nuclear power industry, such as the use of a variety of alloys, such as micro-wires, plating, electrical contacts, and is used in a variety of alloy forms, it is made of nanoparticles through various methods. Methods of preparing gold nanoparticles include chemical synthesis, mechanical production, and electrical production. In the mechanical manufacturing method of grinding using mechanical force, it is difficult to synthesize particles of high purity due to incorporation of impurities in the process, and it is impossible to form uniform particles of nano size. As a practical method, a laser ablation method, an oven beam method, and a high energy ball milling method are used. The laser ablation method applies a laser beam to a raw material under vacuum. Nanoparticles are produced by condensing vapors of atoms or molecules generated and using lasers that are relatively expensive and have low thermal efficiency.Therefore, the production cost is too high compared to the production amount. Also, condensation of vapors generated by melting materials with low break points under vacuum Oven beam method for making nanoparticles and high-energy ball milling method for making nanoparticles by mechanically grinding nanoparticles requires a high level of technology, a very difficult manufacturing process, and expensive manufacturing equipment. In addition, the electrical manufacturing method by the electrolysis has a disadvantage that the production time is long, the concentration is low, the efficiency is low. There are two methods of chemical synthesis: gas phase method and liquid phase method (colloidal method). The gas phase method using plasma or gas evaporation method requires expensive equipment, and the process is complicated and the efficiency is low. The liquid phase method which can synthesize | combine is mainly used. The method for preparing gold nanoparticles by the liquid phase method may include dissolving a compound in a liquid phase and then preparing gold nanoparticles in a hydrosol form using a reducing agent or a surfactant. Recently, research on the chloroauric acid (HAuCl 4) the salt conditions of producing the gold nanoparticles from the liquid phase reduction method for synthesizing the inorganic compound in the colloidal state with a reducing agent, and to this load cancer targeted ability of a cancer cell enhanced anticancer complex Development is underway.

본 발명자들은 종래 나노 항암제의 표적 한계성을 극복하고 항암제의 효능을 극대화하고자 예의노력한 결과, 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC)의 표면에 탄소 나노튜브(CNT) 및 금(Au) 나노입자에 항암제효과가 검증된 항암제가 적재된 줄기세포의 암표적(homing) 및 세포 사멸기능(apoptosis)을 갖는 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법을 개발하였다(도 1).The present inventors have made efforts to overcome the target limitations of the conventional nano-cancer drugs and maximize the efficacy of the anti-cancer drugs. As a result, the carbon nanotubes (CNT) and gold (Au) on the surface of the mesenchymal stem cells (MSCs) having excellent targeting ability to cancer cells ) A method for preparing a stem cell-nano anticancer complex having cancer targeting and apoptosis of stem cells loaded with an anticancer agent having proven anticancer effect on nanoparticles (FIG. 1).

이하, 실시예를 통해 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전히 알려주기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the invention will be described in detail by way of examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but can be implemented in various different forms, the following examples are intended to complete the disclosure of the present invention, to those skilled in the art the scope of the invention It is provided to fully inform you.

실시예 1: 탄소 나노튜브의 제조(mwCNT) Example 1 Preparation of Carbon Nanotubes (mwCNT)

본 발명의 일 실시예에 따라 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC) 표면에 나노 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조에 사용될 탄소 나노튜브를 제조하였다. According to an embodiment of the present invention was prepared a carbon nanotube to be used in the production of a stem cell-nano anticancer complex loaded with a nano anticancer agent on the surface of mesenchymal stem cells (MSC) very good target cancer cells.

구체적으로, 탄소 나노튜브는 반더발스인력(van der Waals attraction)에 의하여 쉽게 응집되는 특성이 있고, 분산시키기 어려운 문제가 있어 탄소 나노튜브의 말단 및 결함부위(defect sites)의 탄소 원자를 산화시키기 위하여 산(acid)을 이용하였다. 산 용매를 이용하여 산소를 함유하는 작용기를 탄소 나노튜브의 표면에 산화시킴으로써, 카복실기(carboxylic group)와 같은 작용기를 도입할 수 있다. 상기와 같이 카복실기가 표면에 도입되어, 표면 기능화(surface functionalization)된 탄소 나노튜브를 하기와 같이 제조하였다. 상기 다중벽 탄소 나노튜브의 표면에 카복실기를 도입하는 방법은 (a) 강산 용매에 탄소 나노튜브를 혼입하여, 산소를 함유하는 작용기를 탄소 나노튜브의 표면에 화학적으로 산화시켜 도입하는 단계, 및 (b) 상기 산 용매 중에서 초음파 처리하는 단계를 통하여 수행되었다. 다중벽 탄소 나노튜브(multi-wall canbon nanotube, MWCNT)는 직경이 10-30 nm 범위인 SES research 제품(lot NT-0140, catalog # 900-1260, Inc USA) 20 mg을 H2SO4(98%) 9 ㎖과 HNO3(65%) 3 ㎖을 3:1의 부피비율로 혼합한 후, 30분 동안 초음파처리(sonicate)하였다. 이때, 초음파 처리는 20~25 KHz 주파수 범위에서 80분 내지 120분 동안 처리하였다. 주파수 범위는 20~22 KHz일 수 있으며, 이때에는 90분 내지 110분 동안 초음파 처리할 수 있다. 이러한 과정에 의하여 응집된 나노튜브 구조가 절단되고 길이가 짧은 다발의 구조로 되었으며, 초음파 처리 시 발생하는 충격파(shockwave)는 부유 상태의 고체 입자를 더욱 분산된 상태로 만들었다. 그 후, 상기 용액에 50℃에서 24시간동안 열을 가하면서, 마그네틱 바(magnetic bar)를 이용하여 300 rpm의 속도로 교반하였다. 상기의 산 용매와 반응하는 단계와 초음파 처리 단계를 1회 반복하였다. 상기 단계를 통하여 화학적으로 기능화된 MWCNT(MWCNT-COOH)는 10 μm 직경의 필터 멤브레인(membrane)(Millipore, lot: ROBA95509)을 이용하여 여과시킨 후, 상기 필터 멤브레인을 16~20시간 동안 60℃에서 진공상태로 건조시켰다. 그 후, 상기 화학적으로 기능화된 MWCNT-COOH를 스테인레스 철 재질의 의료용 스크레이브(scrape)를 이용하여 상기 필터 멤브레인에서 긁어냈다. 상기 실험 단계를 통하여 나노튜브의 표면의 결함 위치(defect site)에 카복실 잔기(-COOH)가 생성되었다. 탄소 나노튜브의 결함부위를 카복실화시키는 변형은 물 또는 유기용매 내에서 탄소 나노튜브의 용해성을 증가시킨다.Specifically, the carbon nanotubes are easily aggregated by van der Waals attraction and difficult to disperse, so that the carbon nanotubes oxidize carbon atoms at the ends and defect sites of the carbon nanotubes. Acid was used. By oxidizing a functional group containing oxygen on the surface of the carbon nanotube using an acid solvent, a functional group such as a carboxylic group can be introduced. As described above, the carboxyl group was introduced to the surface to prepare surface functionalized carbon nanotubes as follows. Method for introducing a carboxyl group on the surface of the multi-walled carbon nanotubes (a) incorporating carbon nanotubes in a strong acid solvent, chemically oxidizing functional groups containing oxygen on the surface of the carbon nanotubes, and ( b) by ultrasonication in the acid solvent. Multi-wall canbon nanotubes (MWCNTs) contain 20 mg of SES research products (lot NT-0140, catalog # 900-1260, Inc USA) with a diameter of 10-30 nm in H 2 SO 4 (98 %) 9 ml and 3 ml HNO 3 (65%) were mixed in a volume ratio of 3: 1, and then sonicated for 30 minutes. At this time, the ultrasonic treatment was performed for 80 to 120 minutes in the 20-25 KHz frequency range. The frequency range may be 20-22 KHz, in which case it may be sonicated for 90 minutes to 110 minutes. By this process, the aggregated nanotube structure was cut into a short bundle structure, and the shockwave generated during the ultrasonic treatment made the suspended solid particles more dispersed. Thereafter, the solution was heated at 50 ° C. for 24 hours while stirring at a speed of 300 rpm using a magnetic bar. The reaction with the acid solvent and the sonication step were repeated once. The chemically functionalized MWCNT (MWCNT-COOH) through the step was filtered using a filter membrane (Millipore, lot: ROBA95509) of 10 μm diameter, the filter membrane at 60 ℃ for 16-20 hours Dry in vacuo. The chemically functionalized MWCNT-COOH was then scraped off the filter membrane using a medical scrap of stainless steel. Through the experimental step, a carboxyl residue (-COOH) was generated at a defect site of the surface of the nanotube. Variations that carboxylate the defects of carbon nanotubes increase the solubility of the carbon nanotubes in water or organic solvents.

실시예 2: 금 나노입자의 제조(AuNP) Example 2: Preparation of Gold Nanoparticles (AuNP)

본 발명의 일 실시예에 따라 암세포로의 표적능력이 매우 우수한 중간엽 줄기세포(MSC) 표면에 나노 항암제가 적재된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조에 사용될 금(Au) 나노입자를 제조하였다. According to one embodiment of the present invention, gold (Au) nanoparticles were prepared to be used for preparing a stem cell-nano anticancer complex in which a nano anticancer agent was loaded on a surface of a mesenchymal stem cell (MSC) having excellent targeting ability to cancer cells.

구체적으로, 금 나노입자의 합성은 염화금산(HAuCl4)염 상태의 무기화합물을 환원제를 이용하여 콜로이드 상태로 합성하였다(Turkevich method를 이용). Sigma Aldrich 제품(catalog # S4614)의 300 ㎖의 시트르산나트륨 2.2 mM을 100℃ 까지 가열한 뒤 25 mM의 Sigma Aldrich 제품(catalog # 520918)의 염화금산염을 2 ㎖ 첨가 후 300 RPM에서 금 나노입자를 환원시켰다. 상기 환원 반응중인 용액은 투명한 색에서 회색 그리고 붉은색을 거치며, 15분 이내로 반응이 진행되고 합성된 금 나노입자는 상온에서 30분 이상 식혀주며 안정화 시켰다. 위의 반응은 모두 3차 증류수를 용매로 하여 이뤄졌다. 상기 합성된 금 나노입자는 구연산염 이온(citrate ion)에 의해 평형 상태를 이루고 있으나, 염(salt)이나 동결건조에 의해 평형상태를 잃고 입자 사이의 반데르발스인력(van der Waals attraction)에 의하여 쉽게 응집되는 특성이 있다. 이러한 결점을 보완하기 위해, 폴리머(α-Mercapto-ω-carboxy-PEG) 1 mg/mL를 이용해 2 mg/mL의 금 나노입자와 24시간 반응시켜 표면에 자가조립단층(self assembled monolayer)을 형성하여 입체적(steric) 안정성을 높여줌과 동시에 폴리머의 Carboxylate 음전하에 의한 정전기적(electrostatic) 안전성도 향상되었다. 상기 제조된 폴리머 코팅이 이뤄진 카르복실화 금 나노입자(AuNP-COOH)는 원심분리기를 이용하여 16000 g의 속도에서 용매로부터 분리시키고 3차 증류수를 이용하여 재부유한 후 현탁하여 사용하였다. Specifically, the synthesis of gold nanoparticles was synthesized in the colloidal state of the inorganic compound in the gold chloride (HAuCl 4 ) salt state using a reducing agent (using the Turkevich method). 2.2 ml of 300 ml of sodium citrate from Sigma Aldrich (catalog # S4614) was heated to 100 ° C, and then 2 ml of 25 mM Sigma Aldrich (catalog # 520918) chloride was added to reduce gold nanoparticles at 300 RPM. I was. The solution during the reduction reaction is gray and red in a transparent color, the reaction proceeds within 15 minutes, and the synthesized gold nanoparticles are cooled at room temperature for 30 minutes or more and stabilized. All of the above reactions were carried out using tertiary distilled water as a solvent. The synthesized gold nanoparticles are in equilibrium by citrate ions, but lose their equilibrium by salt or lyophilization, and are easily brought about by van der Waals attraction between particles. There is a characteristic of flocculation. To compensate for this drawback, 1 mg / mL of polymer (α-Mercapto-ω-carboxy-PEG) is reacted with 2 mg / mL of gold nanoparticles for 24 hours to form a self assembled monolayer on the surface. As a result, the steric stability was increased, and the electrostatic stability due to the carboxylate negative charge of the polymer was also improved. The prepared polymer-coated carboxylated gold nanoparticles (AuNP-COOH) were separated from the solvent at a rate of 16000 g using a centrifugal separator and resuspended using tertiary distilled water and then suspended.

실시예 3: EDC 링커의 연결 Example 3: Connection of EDC Linker

본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 1에서 제조한 탄소 나노튜브와 실시예 2에서 제조한 금 나노입자에 단백질 결합의 안정성을 위하여 EDC 링커를 결합하였다. According to an embodiment of the present invention, the carbon nanotubes prepared in Example 1 and the gold nanoparticles prepared in Example 2 were combined with an EDC linker for stability of protein binding.

구체적으로, 탄소 나노튜브(MWCNT-COOH) 및 금 나노입자(AuNP-COOH)에 EDC 링커를 결합시키는 반응은 약 산성을 띠는 MES 버퍼(2-morpholinoethanesulfonic acid)내에서 수행하였고 MES 버퍼(low moisture content≥99%, sigma-aldrich CAT: M3671)는 용액의 pH를 조절하기 위하여 사용하였다. 우선, 10 mg의 AuNP-COOH 및 3.2 mg의 MWCNT-COOH를 각각 1.6 ㎖의 MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 넣은 후, 팁 소니케이터(tip sonicator)(company: Misonix sonicators, Product: sonicator 4000)를 이용하여 3초 on/3초 off의 주기로 5분 동안 분산시켰다. 그 후, MES 버퍼(50 mM, pH 5.5)에 1.6 ㎖ NHS(400 mM)(N-hydroxysuccinimide, Cas: 06066-82-6)를 혼합한 용액을 상기 초음파 분쇄된 용액에 첨가한 후, 30분 동안 Rocker를 사용하여 혼합하였다. 그 후, EDC 10 ㎖ 용액(20 mM)(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N- ethylcarbodiimide hydrochloride; Sigma, Lot No.: 040M17411V)을 상기 초음파 처리 용액에 첨가하고 30분 동안 Rocker로 혼합시켜, EDC 링커가 연결된 탄소 나노튜브(EDC-MWCNT-COOH) 및 금 나노입자(EDC-AuNP-COOH)를 각각 제조하였다. Specifically, the reaction of binding the EDC linker to the carbon nanotubes (MWCNT-COOH) and the gold nanoparticles (AuNP-COOH) was carried out in a weakly acidic 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) and low moisture content ≧ 99%, sigma-aldrich CAT: M3671) was used to adjust the pH of the solution. First, 10 mg AuNP-COOH and 3.2 mg MWCNT-COOH, respectively, were placed in 1.6 ml MES buffer (50 mM, pH 5.5), followed by a tip sonicator (company: Misonix sonicators, Product: sonicator) 4000) for 5 minutes with a cycle of 3 seconds on / 3 seconds off. Thereafter, a solution of 1.6 ml NHS (400 mM) (N-hydroxysuccinimide, Cas: 06066-82-6) mixed with MES buffer (50 mM, pH 5.5) was added to the ultrasonically ground solution, followed by 30 minutes. While mixing using Rocker. Then 10 mL EDC solution (20 mM) (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N-ethylcarbodiimide hydrochloride (Sigma, Lot No .: 040M17411V)) was added to the sonication solution and mixed with Rocker for 30 minutes to give EDC Linker-linked carbon nanotubes (EDC-MWCNT-COOH) and gold nanoparticles (EDC-AuNP-COOH) were prepared, respectively.

상기 혼합액은 4 센트리콘 YM-50 필터 튜브(Amicon ultra-15, 50K device-50000 NMWL, TM millpore, USA)에 넣고 2,000 rpm의 속도로 원심분리한 후, MES 버퍼(50 mM)로 3회 또는 그 이상 세척하였으며, 이때 1회에 20분 동안 원심분리를 수행하였다. 그리고 상기 MWCNT-COOH 5 mg을 PBS(phosphate buffered saline) 5 ㎖에서 팁 소니케이터를 이용하여 3초 on/3초 off의 조건으로 5분 동안 초음파 분쇄를 더 수행하였으며, 이 상태를 하기 항암제를 적재한 탄소 나노튜브 기반의 항암제에 대한 대조군으로 이용하였다.The mixed solution was placed in 4 Centricon YM-50 filter tubes (Amicon ultra-15, 50K device-50000 NMWL, TM millpore, USA) and centrifuged at 2,000 rpm, followed by 3 times with MES buffer (50 mM) or It was washed further, where centrifugation was performed for 20 minutes at a time. And 5 mg of the MWCNT-COOH 5 ml PBS (phosphate buffered saline) 5 ml using a tip sonicator under conditions of 3 seconds on / 3 seconds off was further performed for 5 minutes, this state is the anticancer agent It was used as a control for the loaded carbon nanotube-based anticancer agent.

실시예 4: 탄소 나노튜브 기반의 항암제의 제조 Example 4 Preparation of Carbon Nanotube-Based Anticancer Agent

4-1: 공유결합에 의해 항암제가 적재된 mwCNT 제조 4-1: Preparation of mwCNT loaded with anticancer agent by covalent bond

본 발명의 일 실시예에 따른 탄소 나노튜브 기반의 항암제는 종래의 공유결합을 이용한 항암제에 비하여 항암제의 결합율이 증가되었다. 종래의 기술에 비하여 항암제의 결합율을 증가시키기 위하여, EDC 링커 결합과 항암제 결합시의 pH를 조절하였다. EDC 링커가 가장 잘 붙는 조건인 pH 4-6 범위 가운데, pH 5.5를 선택하여 EDC 링커의 최대 결합을 유도하였고, 항암제를 결합시킬 때에는 pH 6으로 상향시켜 항암제 적재 최대화 조건인 pH 7-8을 충족하진 못하여도 EDC의 가수분해(hydrolysis)를 억제할 수 있는 pH 범위로 조절하였다. 상기 2 번에 걸친 pH(pH 5.5 및 6)의 변화는 EDC 링커 결합을 안정적으로 유지하는 동시에 항암제의 적재를 최대화함으로서 강력한 공유결합을 유도하였다.Carbon nanotube-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention has an increased binding rate of the anticancer agent compared to the conventional anticancer agent using a covalent bond. In order to increase the binding rate of the anticancer agent compared to the prior art, the pH at the EDC linker binding and anticancer agent binding was adjusted. PH 5.5 was chosen to induce maximum binding of the EDC linker in the range of pH 4-6, which is the condition that EDC linker attaches best. Even though it was adjusted to a pH range that can inhibit the hydrolysis of EDC. The two changes in pH (pH 5.5 and 6) induced strong covalent bonds by maximizing the loading of the anticancer agent while maintaining stable EDC linker binding.

그 후, 상기 제조한 EDC-mwCNT 용액을 암세포 핵분열 억제 항암제인 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat#D1515)을 결합시켰다. 이때, EDC-mwCNT와 항암제는 1:1의 농도 비율로 혼합시키고, 플랫폼 교반기(platform shaker)에서 14~18시간 동안 4℃에서 교반시킨 후, 항암제가 적재된 EDC-mwCNT 용액은 센트리콘 YM-50 필터 튜브를 이용하여 2,000 rpm에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신을 제거하였다. 그 후, 독소루비신이 적재된 mwCNT(mwCNT-DOX)는 PBS 5 ㎖에 녹여서, 하기 실험에 사용하였다.Thereafter, the prepared EDC-mwCNT solution was bound to doxorubicin (Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat # D1515) which is a cancer cell fission inhibiting anticancer agent. At this time, the EDC-mwCNT and the anticancer agent were mixed at a concentration ratio of 1: 1, and stirred at 4 ° C. for 14-18 hours in a platform shaker, and the EDC-mwCNT solution loaded with the anticancer agent was senticon YM- Centrifugation was performed at 2,000 rpm using a 50 filter tube and residual doxorubicin that failed to bind was removed by removing the supernatant. Then, mwCNT (mwCNT-DOX) loaded with doxorubicin was dissolved in 5 ml of PBS and used in the following experiment.

4-2: 공유결합에 의해 항암제가 적재된 AuNP 제조4-2: Preparation of AuNP with Anticancer Agent by Covalent Bond

본 발명의 일 실시예에 따른 금 나노입자 기반의 항암제는, EDC/NHS 교차결합 화학물질을 이용하여 결합을 진행하였다. pH의 안정화에 용이한 MES buffer를 용매로 하여 금 나노입자와 항암제의 안정적인 결합반응을 유도하였으며 EDC의 가수분해 효율을 줄일 수 있는 pH 6에서 반응을 진행시켜 금 나노입자 표면위에 NHS-ester 유도체를 형성한다.Gold nanoparticle-based anticancer agent according to an embodiment of the present invention, the binding using the EDC / NHS cross-linking chemicals. Using MES buffer as a solvent to stabilize pH, it induced stable binding reaction between gold nanoparticles and anticancer agent, and reacted at pH 6 to reduce the hydrolysis efficiency of EDC. Form.

구체적으로, 상기 제조한 AuNP-NHS ester 용액을 암세포 핵분열 억제 항암제인 독소루비신(Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat#D1515)과 결합시켰다. 이때, 4 nM 농도의 AuNP-NHS ester와 0.17 mM 농도의 항암제를 혼합하여 자석교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 20~24시간 동안 4℃에서 교반시킨 후, 항암제가 적재된 AuNP-NHS ester 용액은 원심분리기를 이용하여 10000 g에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신을 제거하였다. 그 후, 독소루비신이 적재된 AuNP(AuNP-DOX)는 PBS 1 ㎖에 녹여서, 하기 실험에 사용하였다.Specifically, the AuNP-NHS ester solution prepared above was combined with doxorubicin (Doxorubicin, DOX, Sigma-aldrich, Cat # D1515), a cancer cell fission inhibiting anticancer agent. At this time, the AuNP-NHS ester of 4 nM concentration and the anticancer agent of 0.17 mM concentration were mixed and stirred at 4 ° C. for 20 to 24 hours using a magnetic stirrer, and the AuNP-NHS ester solution loaded with the anticancer agent was Centrifugation was performed at 10000 g using a centrifuge and residual doxorubicin that failed to bind was removed by removing the supernatant. Then, AuNP (AuNP-DOX) loaded with doxorubicin was dissolved in 1 ml of PBS and used for the following experiment.

실시예 5: MSC-나노 항암제 결합 Example 5: MSC-Nano Anticancer Binding

본 발명의 일 실시예에 따라 주변 정상세포에는 비표적 및 무독성을 나타내지만 비소폐암 및 소폐암주에서는 추적능력 및 사멸능력이 확인된 MSC의 표면에 표지 단백질인 CD90를 특이적으로 인식하는 항체를 20 μg/ml의 농도로 상기 실시예 3에서 제조한 EDC-mwCNT 및 AuNP-NHS ester 용액과 30분 반응시킨 후, 독소루비신을 결합시켜 플랫폼 교반기(platform shaker)에서 14~18시간 동안 4℃에서 교반시켰다. 이어서, 항암제가 적재된 EDC-mwCNT 및 AuNP-NHS ester 용액은 센트리콘 YM-50 필터 튜브를 이용하여 4,000 rpm에서 원심분리를 수행하였으며, 상층액을 제거함으로써 결합하지 못한 잔여 독소루비신 및 항체를 제거하였다. 상기 실시예 3에서 제조된 CD90 항체-독소루비신-mwCNT 복합체(CD90-mwCNT-DOX) 및 CD90 항체-독소루비신-AuNP 복합체(CD90-AuNP-DOX)를 1 μg/ml 농도로 줄기세포에 반응시킨 후, 결합되지 않은 CD90-mwCNT-DOX 및 CD90-AuNP-DOX를 제거하고, 형광 마이크로 플레이트 리더기(VICTOR X3, PerkinElmer)를 이용하여, 결합된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD90-AuNP-DOX)의 DOX 형광 파장을 측정하였다. hMSC-CD90-mwCNT-DOX의 경우 1X105 줄기세포당 72 ng/ml의 독소루비신 나노 항암제가 탑재된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)를 제조하였고, 공초점 형광현미경을 이용하여 줄기세포 표면에 독소루비신 결합 mwCNT 및 AuNP가 제대로 부착되어 있음을 확인하였다(도 2). According to an embodiment of the present invention, the antibody that specifically recognizes CD90, a labeling protein, is shown on the surface of MSCs that show non-target and non-toxicity to surrounding normal cells but have traceability and killing ability in non-pulmonary and small lung cancer lines. After reacting with the EDC-mwCNT and AuNP-NHS ester solution prepared in Example 3 at a concentration of 20 μg / ml for 30 minutes, doxorubicin was combined and stirred at 4 ° C. for 14-18 hours in a platform shaker. I was. Subsequently, the anticancer loaded EDC-mwCNT and AuNP-NHS ester solutions were centrifuged at 4,000 rpm using a Centricon YM-50 filter tube to remove the remaining doxorubicin and antibodies that failed to bind by removing the supernatant. . After the CD90 antibody-doxorubicin-mwCNT complex (CD90-mwCNT-DOX) and CD90 antibody-doxorubicin-AuNP complex (CD90-AuNP-DOX) prepared in Example 3 were reacted with stem cells at a concentration of 1 μg / ml, Remove unbound CD90-mwCNT-DOX and CD90-AuNP-DOX and use a fluorescent microplate reader (VICTOR X3, PerkinElmer) to bind the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC) The DOX fluorescence wavelength of -CD90-AuNP-DOX) was measured. For hMSC-CD90-mwCNT-DOX, a stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) equipped with 72 ng / ml of doxorubicin nano anticancer agent per 1 × 10 5 stem cell was prepared, using a confocal fluorescence microscope. It was confirmed that doxorubicin binding mwCNT and AuNP is properly attached to the stem cell surface (Fig. 2).

실시예 6: 줄기세포에 나노항암제 결합의 최적화 확인Example 6: Confirmation of optimization of nanoanticancer binding to stem cells

본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포 표지 단백질 CD90 또는 CD73 에 결합하는 항체를 이용하여 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX)의 세포 당 항암제 적재 정도와 CD 항체에 따른 세포 당 항암제 적재 변화, hMSC-CD90-mwCNT-DOX의 시간에 따른 항암제 지속 정도, 시간별 나노 항암제 결합 후의 줄기세포의 세포 생존률 변화를 확인하였다. Anticancer agent per cell of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX, hMSC-CD73-mwCNT-DOX) bound using an antibody binding to the stem cell marker protein CD90 or CD73 according to one embodiment of the present invention The changes of anticancer drug load per cell according to the degree of loading and CD antibody, the anticancer drug persistence with time of hMSC-CD90-mwCNT-DOX, and the change of cell survival rate of stem cells after nano anticancer drug binding over time were confirmed.

구체적으로 MSC의 표지단백질과 나노 항암제의 농도에 따른 독소루비신 적재정도를 확인하기 위해 MSC에 CD90-mwCNT-DOX를 농도별(1, 2 μg/ml)로 2시간 처리하고 1X PBS로 3번 씻어낸 후 결합한 나노 독소루비신 항암제의 양을 형광 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 측정하였다(도 3). 또한, MSC에 각 CD 항체와 결합한 줄기세포-나노 항암제 복합체(CD90-mwCNT-DOX, CD73-mwCNT-DOX, CD90-CD73-mwCNT-DOX)를 1 μg/ml의 농도로 2시간 처리하고 1X PBS로 씻어낸 후 MSC에 결합한 나노 독소루비신 항암제의 형광 파장을 형광 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 결합 CD 항체에 따른 세포당 결합된 독소루비신 항암제 양의 변화를 측정하였다(도 4). 또한 MSC에 결합한 나노 항암제가 얼마나 잘 유지되고 있는지 MSC에 mwCNT-CD90-DOX를 결합시킨 후, 24, 48, 72, 144 시간 후 나노-독소루비신 항암제 유지 정도를 유세포분석기(FACS, flow cytometry)를 이용하여 분석하였다. MSC 5×103 cells을 96 well 플레이트에 파종(seeding)하고 18시간 배양 후에 mwCNT-CD90-DOX를 농도별(1, 2, 5 및 10 μg/ml) 및 시간별 (24, 48, 72 및 144 시간) 처리 후 1 mg/㎖ 농도의 MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)을 각 웰당 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 2시간 더 배양하였다. 이어서, DMSO 용액을 웰당 100 ㎕씩 첨가한 후, 마이크로플레이트 판독기(UVM340, ASYS)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 MSC의 생존률을 확인하였다. Specifically, in order to determine the degree of doxorubicin loading according to the concentration of the marker protein and the nano-cancer drug of MSC, CD90-mwCNT-DOX was treated with MSC for 2 hours by concentration (1, 2 μg / ml) and washed 3 times with 1X PBS. Afterwards, the amount of bound nano doxorubicin anticancer agent was measured using a fluorescent microplate reader (FIG. 3). In addition, MSC-treated stem cell-nano anticancer complexes (CD90-mwCNT-DOX, CD73-mwCNT-DOX, CD90-CD73-mwCNT-DOX) bound to each CD antibody were treated for 2 hours at a concentration of 1 μg / ml and 1X PBS. After washing with fluorescence wavelength of the nano doxorubicin anticancer agent bound to MSC using a fluorescent microplate reader was measured the change in the amount of doxorubicin anticancer agent bound per cell according to the binding CD antibody (Fig. 4). In addition, after binding mwCNT-CD90-DOX to MSC, how much nano-cancer drug bound to MSC is maintained, and after 24, 48, 72, 144 hours, nano-doxorubicin anti-cancer maintenance was measured using flow cytometry (FACS). And analyzed. MSC 5 × 10 3 cells were seeded in 96 well plates and 18 hours of incubation followed by mwCNT-CD90-DOX concentration (1, 2, 5 and 10 μg / ml) and hourly (24, 48, 72 and 144). Hours) MTT reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-) at a concentration of 1 mg / ml after treatment yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) was added to 100 µl of each well, and further incubated at 37 ° C for 2 hours. Subsequently, 100 μl of DMSO solution was added per well, and then the absorbance was measured at 570 nm using a microplate reader (UVM340, ASYS) to confirm the survival rate of MSC.

그 결과, CD90-CD73 항체 두 가지를 같이 결합하게 되면 CD73, CD90 항체 각각을 이용했을 때 보다 나노 항암제의 결합이 훨씬 높아짐을 확인하였고, hMSC-CD90-mwCNT-DOX 결합 후 96시간까지 나노 항암제가 높게 유지되는 것으로 나타났다(도 5). 또한 mwCNT-CD90-DOX를 10 μg/ml까지 결합시켜도 MSC 자체의 독성은 없었으며, 144 시간까지 MSC 생존률이 60% 이상을 유지하고 있음을 확인하였다(도 6).As a result, when the two CD90-CD73 antibodies were combined together, it was confirmed that the binding of the nanoanticancer agent was much higher than when using the CD73 and CD90 antibodies, respectively. The nanoanticancer agent was added up to 96 hours after hMSC-CD90-mwCNT-DOX binding. It appeared to remain high (FIG. 5). In addition, binding of mwCNT-CD90-DOX to 10 μg / ml was not toxic to MSC itself, and it was confirmed that MSC survival was maintained at 60% or more by 144 hours (FIG. 6).

실험예 1: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 표지 단백질에 따른 MSC 독성 검증 Experimental Example 1 Verification of MSC Toxicity According to Labeling Proteins of Stem Cell-Nano-cancer Complex

본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조시 줄기세포에 결합될 수 있는 표지 단백질 항체는 CD90, CD73 및 CD105 등이 있다. 표지 단백질에 다르게 결합할 수 있도록 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)를 단기간(72 시간) 및 장기간(240 시간) 폐암 세포(H1975)에 처리한 후 줄기세포-나노 항암제 복합체의 사멸을 분석하였다.According to one embodiment of the present invention, the labeling protein antibodies that can be bound to stem cells in the preparation of the stem cell-nano anticancer complex include CD90, CD73, and CD105. Stem cell-nano anticancer complexes (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) prepared to bind to labeled proteins differently for short-term (72 hours) and long-term (240 hours) lung cancer cells (H1975) After treatment, the killing of the stem cell-nano anticancer complex was analyzed.

구체적으로, 폐암 세포주(H1975)를 100π 배양 플레이트에 웰당 4×105 세포의 비율로 파종한 후, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 표지 단백질에 다르게 결합할 수 있도록 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 4×105 세포의 비율로 단기간(72 시간) 및 장기간(240 시간) 폐암 세포(H1975)에 처리한 후 줄기세포 특이적 마커(CD90, CD73)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 MSC의 사멸과 다른 표지 단백질의 변화를 FACS를 이용하여 분석하였다. Specifically, the lung cancer cell line (H1975) is seeded in a 100π culture plate at a rate of 4 × 10 5 cells per well, and then in DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). Incubated. Stem cells prepared to be combined different from the labeled protein - a short period of nano-cancer drug conjugate (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) at a rate of 4 × 10 5 cells (72 hours) and long term ( 240 hours) after treatment with lung cancer cells (H1975), after the stem cell specific markers (CD90, CD73) and fluorescent cell death markers (Annexin V) staining, MSC death and other marker proteins were analyzed using FACS.

그 결과, MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군과 비교하여 MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군이 MSC 자체 독성을 보이지 않았으며, MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군은 장기간 처리시 ROS 증가에 따른 독성으로 인해 줄기세포 자체적으로 사멸되는 것을 확인하였으므로 MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군인 줄기세포 나노-항암제 복합체가 실험에 더 적합한 것으로 나타났다(도 7).As a result, the MSC-CD90-mwCNT-DOX test group showed no MSC self-toxicity as compared to the MSC-CD73-mwCNT-DOX test group, and the MSC-CD73-mwCNT-DOX test group showed toxicity due to ROS increase during long-term treatment. Stem cells themselves were confirmed to die, so the stem cell nano-anticancer complex of the MSC-CD90-mwCNT-DOX experimental group appeared to be more suitable for the experiment (FIG. 7).

실험예 2: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 표지 단백질에 따른 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화 분석Experimental Example 2 Analysis of Changes in Calcium Signaling in MSC Cells According to Labeling Proteins of Stem Cell-Nano-Cell Complexes

본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 폐암 세포(H1975)와 반응시킨 후 줄기세포-나노 항암제 복합체의 MSC 세포내 칼슘 신호전달을 분석하였다.Stem cell-nanoanticancer complexes prepared according to an embodiment of the present invention (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) were reacted with lung cancer cells (H1975) and then the stem cell-nano anticancer complexes MSC intracellular calcium signaling was analyzed.

구체적으로 폐암 세포(H1975)와 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들을 4×105 세포의 비율로 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 4 μM of Fura-2가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수에 첨가 후 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시켰다. 그 후, 형광 현미경을 이용하여 여기/방출 340/510 nm 형광 파장에서 표지 단백질 항체에 따른 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들의 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다. Specifically, the lung cancer cells (H1975) and the stem cell-nano anticancer complexes (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) were co-cultured on the coverslip for 48 hours at a ratio of 4 × 10 5 cells. 0.05% Pluronic F-127 containing 4 μM of Fura-2 was added to physiological saline and reacted together at dark room temperature for 15 minutes. Subsequently, MSC cells of the stem cell-nano anticancer complexes (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) according to the labeled protein antibody at the excitation / release 340/510 nm fluorescence wavelength using a fluorescence microscope Changes in calcium signaling were identified and analyzed using MetaFluor system.

그 결과, MSC-CD90-mwCNT-DOX 실험군에 비하여 MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군에서 MSC 칼슘 신호전달 변화가 가장 높게 나타났고(도 8) MSC-CD73-mwCNT-DOX 실험군에서 MSC 세포 손상(damage)이 가장 많이 발생하는 것으로 나타났다(도 9).As a result, MSC-CD73-mwCNT-DOX experimental group showed the highest change in MSC calcium signaling compared to MSC-CD90-mwCNT-DOX experimental group (FIG. 8), and MSC cell damage in MSC-CD73-mwCNT-DOX experimental group. ) Was found to occur most frequently (FIG. 9).

실험예 3: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 표적 능력 및 기능성 분석 Experimental Example 3: Analysis of cancer cell target ability and function of stem cell-nano anticancer complex

본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)제조 후의 암세포 표적 능력 변화 분석을 통하여 줄기세포-나노 항암제 복합체 기능성을 확인하였다. Stem cell-nano anticancer complex functionalities were confirmed through analysis of cancer cell target ability change after preparation of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) prepared according to one embodiment of the present invention.

구체적으로, 실험세포주는 NHFB(human fibroblast, 정상세포주), A549(비소세포 폐암주), MDA-MB-231(유방암 세포주) 및 U87MG(신경교모세포종)을 사용하였다. 상기 선별을 위한 이동분석은 8 μm 다공을 가지는 폴리카보네이트 막을 이용하여 24-웰의 트란스웰에서 수행 하였다. 상기 MSC는 5 × 104 cells/ml 200 μl 매질(α-최소 필수 매질 + 0.5% 우태혈청)의 밀도에서 트란스웰 부속의 상부 챔버에 위치하게 하였다. 하부 챔버는 NHFB(human fibroblast, 정상세포주), A549(비소세포 폐암주), MDA-MB-231(유방암 세포주) 및 U87MG(신경교모세포종)을 배양중인 매질 500 μl를 함유하였다. 37℃에서 5% CO2하에서 5 시간 동안 배양한 후, 막의 상부 표면의 후 비-이동 세포를 제거하고 인산완충식염수로 세척하였다. 그 후, 상기 막은 100% 메탄올에서 1분 동안 고정하고 세포핵 염색 시약인 1% DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)로 30분 동안 염색하였다. 상기 이동 세포수는 x 200 배율의 현미경하에서 웰 당 열개의 무작위 부분을 카운트함으로써 결정하였고 비교를 위하여 CD90, CD73 항체를 함께 줄기세포에 결합시킨 줄기세포-나노항암제 복합체(MSC-CD90-CD73-CNT-DOX)와 나노항암제를 흡수(uptake)시킨 줄기세포도 분석하였다. Specifically, the experimental cell lines were NHFB (human fibroblast, normal cell line), A549 (non-small cell lung cancer line), MDA-MB-231 (breast cancer cell line) and U87MG (glioblastoma). Migration analysis for the screening was performed in a 24-well transwell using a polycarbonate membrane having 8 μm porosity. The MSCs were placed in the upper chamber of the transwell appendage at a density of 5 × 10 4 cells / ml 200 μl medium ( α -minimum essential medium + 0.5% fetal calf serum). The lower chamber contained 500 μl of medium incubating NHFB (human fibroblast, normal cell line), A549 (non-small cell lung carcinoma), MDA-MB-231 (breast cancer cell line) and U87MG (nerve glioblastoma). After incubation for 5 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 , the non-migrating cells of the upper surface of the membrane were removed and washed with phosphate buffered saline. The membrane was then fixed in 100% methanol for 1 minute and stained with 1% DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride), a nuclear staining reagent, for 30 minutes. The number of mobile cells was determined by counting ten random portions per well under a microscope at x 200 magnification and for comparison, the stem cell-nanoanticancer complex (MSC-CD90-CD73-CNT) in which CD90 and CD73 antibodies were bound to stem cells together. Stem cells uptake of DOX) and nanocancer drugs were also analyzed.

그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX) 제조 후에도 순수한 MSC와 비교하여 암 표적능력은 거의 유사한 것으로 나타났다(도 10).As a result, even after preparation of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX), cancer targeting ability was found to be almost similar to that of pure MSC (FIG. 10).

실험예 4: 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 줄기세포-나노 항암제 복합체의 나노 항암제 탑재 효율 및 폐암 표적 기능성 비교Experimental Example 4: Comparison of nano chemotherapy efficiency and lung cancer target functionalities between nano chemotherapy loading group and stem cell-nano anticancer complex in stem cells

본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체의 독소루비신 항암제 적재 효율과 폐암세포 표적 능력 변화를 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교를 통하여 분석하였다. Doxorubicin anticancer loading efficiency and lung cancer cell targeting capacity change of the stem cell-nanoanticancer complex prepared according to an embodiment of the present invention were analyzed by comparing with the nanoanticancer loading test group in stem cells.

구체적으로, 폐암 세포(H1975)와 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)를 4×105 세포의 비율로 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 Fura-2 4 μM가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수에 첨가하여 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시켰다. 그 후, 형광 현미경을 이용하여 여기(excitation)/방출(emission) 340/510 nm 형광 파장에서 표지 단백질 항체에 따른 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX 및 MSC-CD73-mwCNT-DOX)들의 MSC 세포내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다. Specifically, lung cancer cells (H1975) and stem cell-nano anticancer complexes (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-DOX) were co-cultured on the coverslip for 48 hours at a rate of 4 × 10 5 cells. Next, 0.05% Pluronic F-127 containing 4 μM of Fura-2 was added to physiological saline and reacted together at a dark room temperature for 15 minutes. Subsequently, the stem cell-nano anticancer complex (MSC-CD90-mwCNT-DOX and MSC-CD73-mwCNT-) according to the labeling protein antibody at excitation / emission 340/510 nm fluorescence wavelength using a fluorescence microscope The changes in intracellular calcium signaling in MSC cells of DOX) were analyzed and analyzed using MetaFluor system.

그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)가 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교했을 때, 독소루비신 항암제 탑재 효율(도 11 및 12) 및 폐암 표적능력이 더 우수하게 나타남을 확인하였다(도 13).As a result, the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) showed superior doxorubicin anticancer drug loading efficiency (Figs. 11 and 12) and lung cancer targeting ability as compared with the nano-cancer drug loading test group in the stem cells. It was confirmed (Fig. 13).

실험예 5: 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조 후 MSC의 세포사멸(apoptosis) 검증Experimental Example 5: Verification of apoptosis of MSC after preparation of stem cell-nano anticancer complex

본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체 제조 후 MSC 줄기세포 자체 독성을 나노항암제를 적재시킨 줄기세포군과 비교하여 분석하였다. According to one embodiment of the present invention, after the production of the optimized stem cell-nano anticancer complex, MSC stem cell self-toxicity was analyzed by comparing with the stem cell group loaded with the nanoanticancer agent.

구체적으로, MSC 5×105 cells에 나노항암제를 1 μg/ml의 농도로 2 시간 동안 흡수시키거나 결합(conjugation)시킨 후, 배지를 교체해 준 후 폐암세포와 24 시간 까지 배양하면서 줄기세포 자체의 사멸 정도를 줄기세포 특이적 마커(CD90)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 FACS를 이용하여 분석하였다. Specifically, the MSC 5 × 10 5 cells were absorbed or conjugated with a nano-cancer agent at a concentration of 1 μg / ml for 2 hours, and then cultured with lung cancer cells for 24 hours after replacing the medium. The degree of death was analyzed using FACS after staining the stem cell specific marker (CD90) and fluorescent cell death marker (Annexin V).

그 결과 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체 실험군에서 MSC 독성이 더 낮게 나타남을 확인하였다(도 14).As a result, it was confirmed that MSC toxicity was lower in the stem cell-nano anticancer complex experimental group compared to the nano-cancer drug loading experimental group in the stem cells (FIG. 14).

실험예 6: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 증폭된 암세포 사멸능력 검증Experimental Example 6: Verification of amplified cancer cell killing ability of stem cell-nano anticancer complex

본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 암세포에 주입하여 사멸능력을 비교분석하였다. In accordance with an embodiment of the present invention, the stem cell-nano anticancer complex optimized in functionality was injected into cancer cells and analyzed for killing ability.

구체적으로, 본 발명의 줄기세포-나노 항암제 복합체가 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 암세포 사멸이 증폭이 되는지 비교하기 위해 폐암 세포주(H1975)를 100π 배양 플레이트에 웰당 5×105 세포의 비율로 파종한 후, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 이때, 배양기는 CO2 5% 조건에서 37℃의 온도로 습기가 있는 상태로 유지하였다. 기능이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체, 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군을 5×105 cells로 처리한 후 240시간까지 관찰하였다. 폐암세포(CD54)및 줄기세포 특이적 마커(CD90)와 형광 세포 사멸 마커(Annexin V) 염색 후 유세포분석기(FACS, flow cytometry)를 이용하여 분석하였다. Specifically, the lung cancer cell line (H1975) in a 100π culture plate to compare whether the stem cell-nano anticancer complex of the present invention amplify cancer cell death compared to the free MSC (BM-MSC) and the nano-cancer drug loading experimental group in stem cells After seeding at a rate of 5 × 10 5 cells per well, the cells were cultured in DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). At this time, the incubator was kept in a humid state at a temperature of 37 ℃ under 5% CO 2 condition. Function optimized stem cell-nano anticancer complex, free MSC (BM-MSC) and nano-cancer drug loading test group in stem cells were observed up to 240 hours after treatment with 5 × 10 5 cells. Lung cancer cells (CD54) and stem cell specific markers (CD90) and fluorescent cell death markers (Annexin V) were stained and analyzed using flow cytometry (FACS).

그 결과, 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체가 장시간(240 시간)시간까지 높은 폐암세포 사멸능력을 나타내었으며(도 15 및 16) 72시간 이후 240 시간까지 사멸이 크게 늘어나는 것을 관찰하였다(도 17). As a result, the stem cell-nano anticancer complex showed high lung cancer cell killing ability up to a long time (240 hours) compared to the free MSC (BM-MSC) and the nano-cancer drug loading test group in stem cells (FIGS. 15 and 16). It was observed that death increased greatly up to 240 hours after the time (FIG. 17).

실험예 7: 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군 및 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 간의 칼슘 신호전달 분석 Experimental Example 7 Analysis of Calcium Signaling Between Stem Cells Loading Nanocancer Drugs and Cancer Cells of Stem Cell-Nanocancer Complexes

본 발명의 일 실시예에 따라 기능성이 최적화된 줄기세포-나노 항암제 복합체를 암세포에 처리한 후 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 폐암 세포(H1975)의 세포내 칼슘 신호전달 변화를 비교분석하였다. According to an embodiment of the present invention, after treating the stem cell-nano anticancer complex optimized in functionality to cancer cells, the intracellular calcium signaling changes of lung cancer cells (H1975) were compared and analyzed in comparison with the nano-cancer drug loading test group in the stem cells. .

구체적으로, 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군에 폐암 세포(H1975, 4×105)를 처리하고 48 시간동안 커버슬립 위에서 공배양 시킨 다음 4 μM of Fura-2가 함유된 0.05% Pluronic F-127을 생리식염수 속에서 어두운 실온에서 15분간 함께 반응시키고 형광 현미경을 이용하여 여기/방출 340/510 nm 형광 파장에서 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)와 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군을 처리한 후의 폐암세포 내 칼슘 신호전달 변화를 확인하였으며, MetaFluor 시스템을 이용하여 변화를 분석하였다. Specifically, lung cancer cells (H1975, 4 × 10 5 ) were treated to the stem cell-nano anticancer complex (MSC-CD90-mwCNT-DOX) and the nano-cancer drug loading test group in the stem cells, and co-cultured on the coverslip for 48 hours. 0.05% Pluronic F-127 containing 4 μM of Fura-2 was reacted together in physiological saline for 15 min at dark room temperature and the stem cell-nano anticancer complex at excitation / emission 340/510 nm fluorescence wavelength using a fluorescence microscope. MSC-CD90-mwCNT-DOX) and changes in calcium signaling in lung cancer cells after treatment with the stem cell nano-cancer drug loading test group were analyzed and analyzed using MetaFluor system.

그 결과, 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군과 비교하여 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)를 처리한 후 폐암세포의 세포내 칼슘 신호전달 변화가 가장 높은 것으로 나타났고 이는 폐암세포 사멸에 가장 높은 영향을 나타냄을 알 수 있었다(도 19 내지 21). As a result, the intracellular calcium signaling change of lung cancer cells was the highest after treatment with stem cell-nano anticancer complex (MSC-CD90-mwCNT-DOX) compared to the nano-cancer drug loading test group in stem cells. It can be seen that the highest effect on the death (Figs. 19 to 21).

실험예 8: MSC의 역분화 가능성 검증 Experimental Example 8: Verification of the possibility of reverse differentiation of MSC

본 발명의 일 실시예에 따라 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포 사멸 후 잔존한 MSC가 암으로의 역분화(tumorigenesis) 가능성을 검증하였다. 구체적으로, 4×105 세포의 비율로 유리 MSC(BM-MSC) 및 줄기세포 내 나노 항암제 적재 실험군 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)를 장기간(240 시간) 4×105 폐암 세포(H1975)과 공배양한 후 암세포 특이적 마커(CD31, 34) 염색 후 FACS를 이용하여 발현정도를 분석하여 MSC의 역분화 가능성을 조사하였다. According to one embodiment of the present invention, the MSC remaining after cancer cell death of the stem cell-nano anticancer complex was examined for the possibility of tumor differentiation (tumorigenesis) into cancer. Specifically, 4 × 10 5 cells were treated with free MSC (BM-MSC) and nano-cancer drug loading experiments in stem cells and stem cell-nano anticancer complexes (MSC-CD90-mwCNT-DOX) for a long time (240 hours). 10 5 After co-culture with lung cancer cells (H1975) and staining of cancer cell specific markers (CD31, 34), the expression level was analyzed using FACS to investigate the possibility of reverse differentiation of MSC.

그 결과, 장기간 처리되어 암세포 사멸 후에도 잔존한 줄기세포-나노 항암제 복합체(MSC-CD90-mwCNT-DOX)는 암으로 역분화 하지는 않는 것을 확인하였다(도 18).As a result, it was confirmed that the stem cell-nano anticancer complex (MSC-CD90-mwCNT-DOX) remaining after long-term treatment and cancer cell death did not reversely differentiate into cancer (FIG. 18).

실험예 9: 종양 동물모델의 제조 및 확인 Experimental Example 9: Preparation and Confirmation of Tumor Animal Model

본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포의 사멸효능을 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 통한 발광분석법으로 확인하기 위하여 안정적으로 형광/발광되는 A549 비소폐암세포주(A549-Luc-RFP)를 제작하여 종양 마우스 모델을 확립하였다. In accordance with an embodiment of the present invention A549 non-pulmonary cancer cell line stably fluorescent / luminescent in order to confirm the killing effect of the cancer cells of the stem cell-nano anticancer complex in the animal model in vivo by luciferase activity (luciferase activity) A549-Luc-RFP) was constructed to establish a tumor mouse model.

구체적으로, 형광/발광세포의 제작을 위해 2×103개의 A549 폐암세포 당 2×104 IU의 렌티바이러스를 도입한 후 24시간 동안 형질도입을 진행하였고 배양 후 2-3일 뒤 공초점 형광현미경을 통해 형광발현을 체크한 다음 퓨로마이신(puromycin) 항생제가 포함된 배지에서 약 2-3주간 키워서 최종적으로 안정적 세포주를 선별하였다. 상기 형광/발광 세포주는 안정적으로 루시퍼레이즈를 발현하기 때문에 기질인 루시페린을 쥐에 정맥주사를 통하여 주입하게 되면 루시퍼레이즈 활성에 따른 생물발광을 IVIS 이미징 장비를 통하여 암세포의 크기변화를 빠르게 측정할 수 있다. 이어서, 암컷(n=20) BALB/c 누드 마우스(20 g, 가천대학교 이길여암당뇨연구원 실험동물실)는 온도가 조절되며, 명주기(6:00-18:00), 자유식이 조건에서 사육하였다. 한편, 종양 동물모델을 제조하기 위하여, 비소세포 폐암주(A549) 암세포 및 루시퍼레이즈-RFP 형광을 발현하는 비소세포 폐암주 (A549-luciferase-RFP)를 IV(정맥 투여)로 BALB/c 마우스(2Ｘ106 cells)에 주입하여 폐종양을 생성하였고 1, 2, 3주후 동물 형광 이미징 장비(IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, Perkinelmer)를 이용하여 폐암생성 여부를 확인하였으며, 6주후 상기 마우스를 희생시켜 상기 폐조직을 채취하여 파라핀 조직 슬라이드 제작 후, 면역화학염색(immunohistochemistry) 통하여 폐암 생성 여부를 확인하였다(도 22). Specifically, 2 × 10 4 IU lentivirus was introduced per 2 × 10 3 A549 lung cancer cells for the production of fluorescent / luminescent cells, followed by transduction for 24 hours, and confocal fluorescence 2-3 days after culture. Fluorescence was checked through a microscope, and then grown in a medium containing puromycin antibiotic for about 2-3 weeks to finally select a stable cell line. Since the fluorescent / luminescent cell line stably expresses luciferase, when the substrate, luciferin, is injected intravenously into mice, bioluminescence according to luciferase activity can be rapidly measured through cancer cell size change through IVIS imaging equipment. . Subsequently, female (n = 20) BALB / c nude mice (20 g, Gachon University Igil Female Diabetes Research Institute Laboratory Animal Lab) were temperature-controlled, and were bred under the light cycle (6: 00-18: 00) and free diet conditions. It was. On the other hand, in order to prepare a tumor animal model, non-small cell lung cancer (A549) cancer cells and luciferase-RFP fluorescence expressing non-small cell lung cancer (A549-luciferase-RFP) IV (intravenous) BALB / c mice ( 2 x 10 6 cells) were used to generate lung tumors. After 1, 2 and 3 weeks, lung fluorescence was confirmed using an animal fluorescence imaging device (IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, Perkinelmer). Lung tissue was collected and paraffin tissue slides were prepared, and then confirmed whether lung cancer was generated through immunochemical staining (immunohistochemistry) (FIG. 22).

그 결과, 상기 종양 동물모델에 폐암 세포주 투여 2주 이후 폐종양이 생성되었음을 확인하였다(도 23).As a result, it was confirmed that lung tumors were generated two weeks after the administration of the lung cancer cell line to the tumor animal model (FIG. 23).

실험예 10: 줄기세포-나노 항암제 복합체의 폐종양 억제효능 분석 Experimental Example 10 Analysis of Lung Tumor Suppression Effect of Stem Cell-Nano-cancer Complex

본 발명의 일 실시예에 따라 in vivo 동물모델에서 줄기세포-나노 항암제 복합체의 항종양 효능을 분석하였다. According to an embodiment of the present invention, the antitumor efficacy of the stem cell-nano anticancer complex was analyzed in an in vivo animal model.

구체적으로, in vivo 형광 이미징을 줄기세포-나노 항암제 복합체의 암세포의 사멸효능을 형광/발광되는 A549-luciferase-RFP 종양 마우스 모델에서 IVIS 동물 형광 이미지 시스템을 이용하여 확인하였다. 먼저, 누드마우스에 luciferase-RFP 형광을 발광하는 폐암세포(H1975, A549) 주입하고 2주후 독소루비신 항암제(5 mg/kg), free MSC(2Ｘ106 cells) 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(2Ｘ106 cells, 0.06 mg/kg)를 5일 간격으로 2회 정맥주사 하였고 측정 1시간 전 루시페린 150 mg/kg IV 주사하여 루시퍼레이즈를 활성화 시킨 후, 형광 이미징 장비를 이용하여 시간별로 폐암세포(H1975) 형광의 변화를 분석하였다.Specifically, in vivo fluorescence imaging was confirmed using an IVIS animal fluorescence imaging system in an A549-luciferase-RFP tumor mouse model that fluoresces / luminesces the cancer cell death of the stem cell-nano anticancer complex. First, 2 weeks after injection of lung cancer cells (H1975, A549) emitting luciferase-RFP fluorescence into nude mice, doxorubicin anticancer agent (5 mg / kg), free MSC (2Ｘ10 6 cells) and stem cell-nano anticancer complex (2Ｘ10 6 cells) , 0.06 mg / kg) was injected intravenously twice at 5 day intervals, and luciferase was activated by injection of 150 mg / kg IV of luciferin 1 hour before measurement, and then fluorescence of lung cancer cells (H1975) was fluoresced every hour using fluorescence imaging equipment. The change was analyzed.

또한, 조직면역화학은 폐종양 누드마우스에 종양세포 주입하고 4주후 독소루비신 항암제(저농도: 0.02 mg/kg, 고농도: 5 mg/kg), 카본 나노항암제(저농도: 0.02 mg/kg), 자유 MSC(1Ｘ106 cells) 및 줄기세포-나노 항암제 복합체(저농도: 1Ｘ106 cells, 0.02 mg/kg; 고농도: 3Ｘ106 cells, 0.06 mg/kg)를 5일 간격으로 4회 정맥주사 후 상기 마우스를 희생시켜 폐조직을 재취하여 파라핀 조직 슬라이드 제작 후, 면역화학조직분석을 수행하여 줄기세포-나노 항암제 복합체의 효과를 확인하였다In addition, tissue immunochemistry showed that doxorubicin anticancer agent (low concentration: 0.02 mg / kg, high concentration: 5 mg / kg), carbon nanoanticancer (low concentration: 0.02 mg / kg), free MSC (4 weeks after tumor cell injection into lung tumor nude mice). 1 × 10 6 cells) and a stem cell-nano anticancer complex (low concentration: 1 × 10 6 cells, 0.02 mg / kg; high concentration: 3 × 10 6 cells, 0.06 mg / kg) four times intravenously every 5 days, and then the mice were sacrificed to sacrifice The tissues were recollected and paraffin tissue slides were prepared, followed by immunochemical analysis to confirm the effect of the stem cell-nano anticancer complex.

그 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여가 luciferase-RFP 형광을 발광하는 폐종양의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났고(도 24, 도 25), 조직면역화학을 수행한 결과, 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)의 투여가 폐종양의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 26).As a result, it was shown that administration of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) effectively inhibited the production of lung tumors that emit luciferase-RFP fluorescence (FIG. 24, FIG. 25). As a result, it was shown that administration of the stem cell-nano anticancer complex (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) effectively inhibited the generation of lung tumors (FIG. 26).

결론적으로, 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 줄기세포-나노 항암제 복합체(hMSC-CD90-mwCNT-DOX)는 암세포로의 이동능력이 우수한 MSC의 표면에 더 낮은 농도에서 항암제효과를 나타내는 나노 항암제를 적재함으로써 항암제 효능을 극대화하고 독성 등 부작용을 최소화할 수 있는 항암제로 사용될 수 있으며, 암 종류별 특이적 줄기세포를 선별하여 다양한 암에 항암제 효능을 극대화한 줄기세포-나노 항암제로 적용될 수 있다(도 27). In conclusion, the stem cell-nano anticancer complex prepared according to an embodiment of the present invention (hMSC-CD90-mwCNT-DOX) is a nano anticancer agent showing an anticancer effect at a lower concentration on the surface of MSC, which has excellent ability to migrate to cancer cells. It can be used as an anticancer agent to maximize the efficacy of anticancer drugs and minimize side effects such as toxicity, and can be applied as a stem cell-nano anticancer agent that maximizes the efficacy of anticancer agents to various cancers by selecting specific stem cells for each cancer type (FIG. 27).

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다. Although the present invention has been described with reference to the above-described examples and experimental examples, these are merely exemplary, and various modifications and equivalent other examples and experimental examples are possible to those skilled in the art. I will understand. Therefore, the true technical protection scope of the present invention will be defined by the technical spirit of the appended claims.

Claims (15)

나노입자 표면에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 카르복실화 단계;
카르복실화된 나노입자에 EDC{1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} 링커를 결합시키는 EDC 링커 결합단계:
EDC 링커가 결합된 나노입자에 아민기를 갖는 항암 화합물 및 CD90, CD73 및 CD105으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중간엽 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체; Fab, F(ab')2, Fab', scFv, Fv, VHH(variable domain of camelid heavy chain), sdAb, diabody 및 triabody로 구성되는 군으로부터 선택되는 상기 항체의 기능성 단편; 또는 Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, VLR(variable lymphocyte receptor) 및 repebody로 구성되는 군으로부터 선택되는 상기 중간엽 줄기세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 항체 유사체(antibody mimetics)를 공유결합시키는 항암 화합물 및 항체 결합단계; 및
상기 항암 화합물 및 항체가 결합된 나노입자와 상기 중간엽 줄기세포를 결합시키는 줄기세포 결합단계를 포함하는 중간엽 줄기세포-나노 항암제 복합체의 제조방법.A carboxylation step of introducing a carboxyl group (-COOH) on the surface of the nanoparticles;
EDC linker binding step of binding an EDC {1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide} linker to a carboxylated nanoparticle:
Antibodies specifically binding to mesenchymal stem cell surface antigens selected from the group consisting of CD90, CD73 and CD105 and an anticancer compound having an amine group on the nanoparticles to which the EDC linker is bound; Functional fragments of said antibody selected from the group consisting of Fab, F (ab ') 2 , Fab', scFv, Fv, variable domain of camelid heavy chain (V H H), sdAb, diabody and triabody; Or antibody mimetics that specifically bind to said mesenchymal stem cell surface antigens selected from the group consisting of Affibody, Affilin, Affitin, Anticalin, Avimer, DARPin, Fynomer, monobody, variable lymphocyte receptor (VLR) and repebody Anti-cancer compound and antibody binding step of covalently binding); And
Method for producing a mesenchymal stem cell-nano anticancer complex comprising a stem cell binding step of combining the anti-cancer compound and the antibody-bound nanoparticles and the mesenchymal stem cells. 제1항에 있어서,
상기 나노입자는 탄소 나노튜브인, 제조방법.The method of claim 1,
The nanoparticles are carbon nanotubes. 제2항에 있어서,
상기 탄소 나노튜브는 다중벽 탄소 나노튜브인, 제조방법.The method of claim 2,
The carbon nanotubes are multi-walled carbon nanotubes. 제3항에 있어서,
상기 다중벽 탄소 나노튜브는 5 내지 50 nm의 직경을 갖는, 제조방법.The method of claim 3,
The multi-walled carbon nanotubes have a diameter of 5 to 50 nm. 제2항에 있어서,
상기 카르복실화 단계는 상기 탄소 나노튜브를 산(acid)처리하는 산처리 공정에 의해 수행되는, 제조방법.The method of claim 2,
The carboxylation step is performed by an acid treatment step of acid treating the carbon nanotubes. 제5항에 있어서,
산처리된 탄소 나노튜브를 초음파(ultrasonic wave) 처리하는 초음파 처리 공정을 추가로 포함하는, 제조방법.The method of claim 5,
Further comprising a sonication process of ultrasonically treating the acid treated carbon nanotubes (ultrasonic wave). 제1항에 있어서,
상기 나노입자는 금 나노입자인, 제조방법. The method of claim 1,
The nanoparticles are gold nanoparticles, manufacturing method. 제7항에 있어서,
상기 카르복실화 단계는 상기 금 나노입자에 카르복실화 PEG(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid), PHA(polyhydroxyalkanoates), PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)} 및 PGA{poly(glycolic acid)}로 구성되는 군으로부터 선택되는 카르복실기를 포함하는 중합체(polymer)를 코팅하는 폴리머 코팅공정에 의해 수행되는, 제조방법.The method of claim 7, wherein
The carboxylation step is a carboxylated PEG (polyethylene glycol), hyaluronic acid (hyaluronic acid), PHA (polyhydroxyalkanoates), PLGA {poly (lactic-co-glycolic acid)}, PLA {poly (lactic) acid)} and PGA {poly (glycolic acid)}, which is carried out by a polymer coating process for coating a polymer comprising a carboxyl group selected from the group consisting of. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 나노입자 및 항암 화합물의 중량비가 1:1 내지 1:3인, 제조방법.The method of claim 1,
The weight ratio of the nanoparticles and the anticancer compound is 1: 1 to 1: 3. 제1항에 있어서,
상기 항암 화합물은 독소루비신, 파클리탁셀, ABT737, 5-플루오로우라실, BCNU(carmustine), CCNU(lomustine), 6-메르캅토퓨린, 나이트로젠 머스타드, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메소트렉세이트, 시타라빈 싸이오테파, 부설판 또는 프로카바진인, 제조방법. The method of claim 1,
The anticancer compounds include doxorubicin, paclitaxel, ABT737, 5-fluorouracil, BCNU (carmustine), CCNU (lomustine), 6-mercaptopurine, nitrogen mustard, cyclophosphamide, vincristine, vinblastine, cisplatin, Mesotrexate, cytarabine thiotepa, busulfan or procarbazine. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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