KR102030430B1

KR102030430B1 - 전기적 조절을 통해 양쪽 이온성, 양이온성 및 음이온성 표면으로 가역적인 상호 변환이 가능한 표면

Info

Publication number: KR102030430B1
Application number: KR1020170154875A
Authority: KR
Inventors: 여운석; 최인성; 강현욱
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2019-10-10
Also published as: KR20190057663A

Abstract

본 발명은 본 발명은 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성(zwitterionic) 표면으로서, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물은 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 형성하며, 양(+) 전위 인가시에는 양이온성(cationic) 표면으로 전환되고, 음(-) 전위 인가시에는 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면에 대한 것으로서, 본 발명에 따른 표면은, 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)으로 구성됨으로써, 전위 처리에 의해 양이온성, 음이온성 및 양쪽 이온성 표면으로의 가역적인 상호 전환이 가능하므로, 단일 표면으로 복수의 기능(예를 들면, 박테리아의 선택적 부착, 사멸 및 탈착)을 구현할 수 있는 다기능 동적 표면 (multi-functional dynamic surface)으로서 생물 의학/조직 공학, 의료 장비 및 기본 세포 연구를 포함한 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

전기적 조절을 통해 양쪽 이온성, 양이온성 및 음이온성 표면으로 가역적인 상호 변환이 가능한 표면{SURFACE REVERSIBLY INTERCONVERTIBLE AMONG ZWITTERIONIC, ANIONIC AND CATIONIC SURFACES THROUGH ELECTRICAL MODULATION}

본 발명은 외부 자극에 의해 표면 특성이 변하는 동적 표면에 대한 것이다.

동적 표면(dynamic surface)은 온도, 유기 시약, 효소, pH 및 전위 등의 외부 자극에 의해 유도되는 표면 분자의 화학적 전환(chemical conversion) 또는 구조적 전환(conformational conversion)에 의해 표면 특성이 조절되는 표면을 일컫는다.

상기 화학적 전환은 주로 화학 반응이 관여해 정확하고 예측 가능한 표면 특성조절을 가능하게 하는 반면, 어떤 경우에는 생물 시스템에 대한 침습성(invasiveness) 및 표면 공유 결합 분자의 비가역적인 변화 때문에 생리 조건(physiological condition) 하에서의 사용 및 반복적인 표면 특성 조절에는 바람직하지 않다.

일례로, 양쪽 이온성(zwitterionic) 고분자를 이용해 한 가지 고분자 소재만으로도 표면에 흡착하는 박테리아 세포를 죽이고, 죽은 세포들은 표면에서 탈착될 수 있게끔 디자인된 기존의 표면의 경우, 가수분해를 통해서 항균성에서 non-biofouling으로 기능이 전환되는 이중 기능성(dual functionality)을 장점으로 가지지만, 가수분해로 non-biofouling 기능으로 전환이 되고 나면 다시 항균성 기능으로는 전환이 불가능해서 가수분해 전에 박테리아 세포들을 최대한 박멸할 수 있어야 하고, 항균성 및 non-biofouling 기능을 동시에 구현하는 일이 일회성으로 그치는 단점이 있어 두 기능간 반복적 사용이 요구되는 경우에는 활용성에 한계를 가진다.

한국 공개특허 제10-2016-0136958호 (공개일: 2016.11.30.) 미국 공개특허 제2015-0320913호 (공개일: 2015.11.12.)

M. Mrksich, MRS Bulletin 2005, 30, 180-184. P. M. Mendes, Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 2512-2529. T. Sun, G. Qing, Adv. Mater. 2011, 23, H57-H77.

본 발명은 외부 자극에 의한 표면 분자의 구조적 전환을 통해 전기적 특성이 가역적으로 상호 전환될 수 있는 동적 표면의 제공을 발명의 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위해, 본 발명은 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성(zwitterionic) 표면으로서, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물은 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 형성하며, 양(+) 전위 인가시에는 양이온성(cationic) 표면으로 전환되고, 음(-) 전위 인가시에는 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

또한, 상기 양전하를 띠는 말단기는 4차 암모늄 양이온, 피롤리디늄 양이온, 이미다졸리움 양이온, 트리아졸륨 양이온, 피리디늄 양이온, 피리다지늄 양이온, 피리미디늄 양이온, 피라지늄 양이온 또는 트리아지늄 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

또한, 상기 음전하를 띠는 말단기는 카르복실레이트, 알킬카르복실레이트, 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드, 카르보네이트, 클로라이드, 수소 카르보네이트, 설페이트, 수소 설페이트, 실리케이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, 헥사플루오로포스페이트 또는 테트라플루오로보레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

또한, 표면에 양(+) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제2 화합물의 음전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 양이온성(cationic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

또한, 표면에 음(-) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제1 화합물의 양전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

또한, 전위 인가에 따라 박테리아 접착성(bacteria-adherable)의 양쪽 이온성 표면, 박테리아 살균성(bactericidal)의 양이온성 표면 및 비오염성(non-fouling)의 음이온성 표면 상호 간의 가역적인 전환이 가능한 표면을 제안한다.

또한, 상기 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)은, 보호기(protecting group)을 포함하는, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물의 전구체 화합물을 합성하는 단계; 상기 전구체 화합물을 표면과 결합시키는 단계; 및 상기 보호기를 제거해 제1 화합물, 제2 화합물, 및 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 공간을 형성시키는 단계에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 표면을 제안한다.

그리고, 본 발명은 발명의 다른 측면에서 상기 표면을 포함하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

또한, 상기 제1 화합물은 양전하를 띠는 말단기; 기판과 결합된 결합부; 및 상기 말단기와 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

또한, 상기 제2 화합물은 음전하를 띠는 말단기; 기판과 결합된 결합부; 및 상기 말단기 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

또한, 상기 결합부는 제1화합물 또는 제2 화합물과 표면 간의 배위 결합(coordination bond)에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

또한, 상기 연결부는 알칸 사슬(alkane chain)로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

또한, 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag) 또는 구리(Cu)로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 제안한다.

본 발명에 따른 표면은, 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)으로 구성됨으로써, 전위 처리에 의해 양이온성, 음이온성 및 양쪽 이온성 표면으로의 가역적인 상호 전환이 가능하다.

따라서, 본 발명에 따른 표면은 단일 표면으로 복수의 기능(예를 들면, 박테리아의 선택적 부착, 사멸 및 탈착)을 구현할 수 있는 다기능 동적 표면 (multi-functional dynamic surface)으로서 생물 의학/조직 공학, 의료 장비 및 기본 세포 연구를 포함한 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1(a)는 본 발명에 따른 동적 표면을 가지는 전기 활성(electro-active) 기판 상의 박테리아 세포 운명의 주문형 조절(on-demand modulation)의 모식도이고, 도 1(b)는 상기 동적 표면의 화학적 구조의 모식도이며, 도 1(c)는 본원 실시예에서 사용된 디설파이드(disulfide)와 알칸티올(alkanethiol)의 화학 구조식이다.
도 2는 보호된 카르복실레이트/4급 암모늄 디설파이드(PCB/QA disulfide) 및 QA 접합 퀴논(QA-conjugated quinone)의 합성 과정을 보여주는 모식도이다.
도 3(a) MALDI-TOF MS와 접촉각 측정을 이용한 단분자막의 특성 분석 결과이고, 도 3(b)는 전기 화학적 탈착 분석을 위한 SAM의 순환 전압 전류 그래프(cyclic voltammogram)이며, 도 3(c)는 사이 클릭 볼타메트리 및 분자 동역학 시뮬레이션에 의해 계산된 알칸티올레이트의 정량화 결과이다.
도 4는 원자 분자 역학 시뮬레이션 결과로서, (초기(왼쪽 패널) 및 평형 (오른쪽 패널) 구성(configuration)에서 (a) CB/QA를 포함하는 HDSAM 및 (b) PCB/QA를 포함하는 LDSAM의 대표 스냅 샷이다.
도 5는 전위에 따른 입체 구조의 변화 확인 결과로서, (a) 상이한 전위의 처리에 의한 세 가지 표면 상태와 표면 하전된 물질의 선택적 흡착의 모식도, (b) 1mM K₃Fe(CN)₆의 존재 하에 + 0.24V에서 CB/QA의 HDSAM(흑색선) 또는 LDSAM(적색선) 상에서 얻은 전기 화학적 임피던스 스펙트럼(왼쪽) 및 1mM QA 접합 퀴논(QA-conjugated quinone)의 존재 하에 - 0.30V에서 CB/QA의 HDSAM(흑색선) 또는 LDSAM(적색선) 상에서 얻은 전기 화학적 임피던스 스펙트럼(오른쪽), (c) CB로 개질된 녹색 형광 미세구(microsphere)와 아민으로 개질된 적색 형광 미세구의 혼합물을 (b)에서 기술한 것과 동일한 실험 조건 하에서 양쪽 이온성 LDSAM과 함께 배양한 결과에 따른 형광 이미지. (d) PBS (pH 7.4) 내의 b-카제인(pI 4.6-5.1)과 리소자임(pI 11.0)의 혼합물을 (b)에서 기술한 것과 동일한 실험 조건하에 양쪽 이온성 LDSAM과 함께 배양한 결과에 따른 MALDI-TOF MS 분석 결과 및 (e) CB로 개질된 금 나노입자(AuNP)와 QA로 개질된 금 나노입자의 혼합물도 (b)에서 기술한 것과 동일한 실험 조건하에 양쪽 이온성 LDSAM과 함께 배양한 결과에 따른 MALDI-TOF MS 분석 결과(상기와 유사한 결과를 나타냄)
도 6(a)는 전위 처리에 의한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서의 살아있는 대장균 세포(녹색)와 죽은 대장균 세포(적색)의 형광 현미경 이미지이고, 도 6(b) 및 도 6(c)는 상기 도 6(a)에서의 대장균의 항균 효율과 박테리아 밀도의 정량 분석 결과이며, 도 6(d)는 대조군으로서 (i) MUTA 단일층, (ii) MUA 단일층, (iii) 1시간 동안 +0.2 V로 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 및 (iv) 1시간 동안 -0.2 V로 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상의 대장균의 SEM 이미지이다(확대 SEM 이미지는 각각의 오른쪽 패널에 표시).
도 7은 HDSAM 상에서 박테리아(E. coli)의 세포 반응 실험 결과로서, (a) CB/QA를 포함하는 HDSAM (왼쪽 패널), QA를 포함하는 HDSAM (중간 패널) 및 CB를 포함하는 HDSAM (오른쪽 패널) 상에서 그람 음성 대장균의 살아있는 세포(녹색) 및 죽은 세포(적색)의 대표적인 형광 현미경 이미지 및 (b, c) 상기 (a)에서의 대장균의 항균 효율 및 세균 밀도 정량 분석 결과이다.
도 8은 LDSAM 및 HDSAM에서 세균 (B. subtilis)의 세포 반응 실험 결과로서, (a) 다양한 배양 시간에서 CB/QA를 포함하는 LDSAM의 그람 양성 B. subtilis의 생존 세포 (녹색) 및 죽은 세포 (적색) 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지, (b, c) 상기 (a)에서의 B. subtilis의 항균 효율 및 세균 밀도 정량 분석 결과, (d) 다양한 배양 시간에서 3가지 HDSAM의 그람 양성 생존 B. subtilis (녹색) 및 죽은 B. subtilis (적색) 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지 및 (e, f) 상기 (d)에서의 B. subtilis의 항균 효율 및 세균 밀도 정량 분석 결과이다.
도 9는 대장균에 대한 단일층의 항균 효과 실험 결과를 보여주는 사진으로서, 대장균은 1 시간 동안 전기 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM상에서 배양되었으며, 단일층 상의 대장균이 방출되어 한천 플레이트 상에 퍼졌고, 한천 플레이트 상의 집락(colony) 이미지는 37℃에서 24 시간(첫 번째 줄)과 48 시간 (두 번째 줄) 동안 배양 한 후에 얻었다. 대조군으로서, LB 배지를 한천 플레이트에 뿌렸다.
도 10(a)는 (i) -0.2 V에서 +0.2 V (ii) +0.2 V에서 -0.2 V, (iii) -0.2 V에서 개방회로(OC) 및 (iv) +0.2 V에서 OC까지의 전위를 주기적으로 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서의 살아있는 대장균 세포 (녹색) 및 죽은 대장균 세포(적색)의 형광 현미경 이미지이고, 도 10(b)는 상기 도 10(a)에 대한 항균 효율(실선)과 박테리아 밀도(점선)의 정량 분석 결과이다(오차 막대는 3가지 독립된 분석법으로부터 결정된 표준 편차임).
도 11은 NIH 3T3 세포의 세포 반응 및 NIH 3T3 세포와의 공배양에서의 선택적 항균 활성에 대한 실험 결과에 따른 형광이미지로서, (a) NIH 3T3 또는 (b) 대장균/NIH 3T3 공배양을 개방회로(OC) (왼쪽 패널), +0.2V (중간 패널) 및 -0.2V(오른쪽 패널)로 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서 처리한 결과에 따른 형광이미지이다.
도 12(a)는 개방회로(OC) (왼쪽 패널), +0.2V (중간 패널) 및 -0.2V (오른쪽 패널)의 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상의 미코플라스마를 나타내는 형광 이미지이고, 도 12(b) 및 도 12(c)는 상기 도 6(a)에서의 항균 효율과 박테리아 밀도의 정량 분석 결과이며, 도 12(d)는 OC (왼쪽 패널), +0.2V (중간 패널) 및 -0.2V (오른쪽 패널)의 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상의 미코플라스마/NIH 3T3 공배양을 나타내는 형광 이미지이다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.

본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 한다.

본 발명은 외부 자극에 의한 표면 분자의 구조적 전환(conformational conversion)을 통해 전기적 특성이 가역적으로 상호 전환될 수 있는 동적 표면으로서, 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성(zwitterionic) 표면으로서, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물은 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 형성하며, 양(+) 전위 인가시에는 양이온성(cationic) 표면으로 전환되고, 음(-) 전위 인가시에는 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 표면은, 양전하를 띠는 제1 화합물 분자 및 음전하를 띠는 제2 화합물 분자로 이루어지는 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 포함하고, 상기 LDSAM은 통상의 SAM에 비해 충분한 분자 간 공간을 가진다.

따라서, 전위가 인가되지 않은 상태에서 표면은 양쪽 이온성(zwitterionic)의 표면 특성을 가지지만, 표면에 전위를 인가할 경우 인가하는 전위와 부호가 반대인 말단기를 가지는 분자의 말단기 부분이 표면 측으로 굽어지고, 그에 따라 표면은 인가하는 전위와 부호가 동일한 전기적 특성을 가지는 표면으로 전환된다.

예를 들어, 표면에 양(+) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제2 화합물의 음전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 양이온성(cationic) 표면으로 전환된다.

또한, 표면에 음(-) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제1 화합물의 양전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 음이온성(anionic) 표면으로 전환된다.

상기와 같이, 본 발명에 따른 표면의 전기적 특성은, 화학적 전환(chemical conversion)이 아닌 전기적 조절(electrical modulation)에 의한 구조적 전환(conformational conversion)을 통해 전환됨으로써, 양이온성, 음이온성 및 양쪽 이온성 표면으로의 가역적인 상호 전환이 가능하다.

따라서, 본 발명에 따른 표면은 인가되는 전위에 따라 박테리아 접착성(bacteria-adherable)의 음이온성 표면, 박테리아 살균성(bactericidal)의 양이온성 표면 및 비오염성(non-fouling)의 양쪽 이온성 표면 상호 간의 가역적인 전환이 가능한 표면으로 활용될 수 있다.

상기 제1 화합물에 포함된 양전하를 띠는 말단기는 4차 암모늄 양이온, 피롤리디늄 양이온, 이미다졸리움 양이온, 트리아졸륨 양이온, 피리디늄 양이온, 피리다지늄 양이온, 피리미디늄 양이온, 피라지늄 양이온 또는 트리아지늄 양이온을 포함할 수 있다.

참고로, 상기 4차 암모늄 양이온이 포함된 양이온성 고분자는 박테리아 세포들을 죽일 수 있는 항균제로서 사용할 수 있음이 알려져 있다.

또한, 상기 제2 화합물에 포함된 음전하를 띠는 말단기는 카르복실레이트, 알킬카르복실레이트, 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드, 카르보네이트, 클로라이드, 수소 카르보네이트, 설페이트, 수소 설페이트, 실리케이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, 헥사플루오로포스페이트 또는 테트라플루오로보레이트를 포함할 수 있다.

한편, 전위 인가시 제1 화합물 분자 또는 제2 화합물 분자의 굽은 형태(bent form) 및 직선 형태(straight form) 사이에서의 구조적 변환을 수용하기에 충분한 공간을 제공하는 역할을 하는 상기 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)은, 보호기(protecting group)을 포함하는, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물의 전구체 화합물을 합성하는 단계; 상기 전구체 화합물을 표면과 결합시키는 단계; 및 상기 보호기를 제거해 제1 화합물, 제2 화합물, 및 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 공간을 형성시키는 단계에 의해 형성될 수 있다.

전술한 본 발명에 따른 표면은 전기 전도성 기판(electrically conductive substrate) 상에 형성되어 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판을 이룰 수 있다.

이때, 상기 전기 전도성 기판은 금속 또는 투명 전도성 산화물(transparent conducting oxide, TCO)로 이루어질 수 있다.

상기 금속으로는 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag) 또는 구리(Cu), 팔라듐(Pd), 아연(Zn), 철(Fe), 인듐(In) 등을 예로 들 수 있으며, 특히, 금(Au)은 우수한 전기 전도도 뿐만 아니라 사용의 편의성, 다양한 생물학적/화학적 기능기 도입을 위한 합성의 용이성 및 다양한 유형의 생물 시스템과의 생체 적합성을 가져 본 발명에 따른 표면이 형성되는 기판을 이루는 소재로서 보다 바람직하다.

또한, 상기 투명 전도성 산화물로는 인듐 주석 산화물(indium tin oxide, ITO), ZnO(Zinc Oxide), SnO₂(Tin Dioxide), GZO (Ga-doped ZnO), AZO (Al-doped ZnO) 등을 사용할 수 있다.

한편, 상기 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물은 상기 표면측의 양전하를 띠는 말단기, 기판과 결합된 결합부, 및 상기 말단기와 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함할 수 있고, 상기 제2 화합물은 음전하를 띠는 말단기, 기판과 결합된 결합부, 및 상기 말단기 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함할 수 있다.

예를 들어, 상기 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)이 알칸티올(alkane thiol)을 이용해 금(Au), 백금(Pt), 은(Ag) 또는 구리(Cu)로 이루어진 금속 기재 상에 형성될 경우, 상기 결합부는 제1화합물 또는 제2 화합물과 표면 간의 배위 결합(coordination bond)에 의해 형성될 수 있으며, 상기 연결부는 알칸 사슬(alkane chain)로 이루어질 수 있다.

상기에서 설명한 본 발명에 따른 표면은, 양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)으로 구성됨으로써, 전위 처리에 의해 양이온성, 음이온성 및 양쪽 이온성 표면으로의 가역적인 상호 전환이 가능하다.

이하, 실시예를 통해 본 발명에 대해 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예>

본 실시예에서는 전위(electrical potential)를 이용한 저밀도 자기조립 단일층(low density self-assembled monolayer, LDSAM)의 입체 구조(conformation) 조절을 위해, 전기적으로 상호 변환 가능한 3개의 표면(양쪽 이온성(zwitterionic), 음이온성(anionic), 양이온성(cationic) 표면)을 생성할 수 있도록, 음전하를 띤 카르복실레이트(carboxylate, CB) 헤드 그룹과 양전하를 띤 4급 암모늄(quaternary ammonium QA) 헤드 그룹을 모두 갖춘 전례 없는 다기능 LDSAM 시스템을 제조했다.

상기 시스템은 구별되는 별개의 특성을 가진 3개의 대전된 표면을 하나의 단위로 결합할 수 있다는 대단히 큰 장점을 가진다. 특히, 후술하는 바와 같이 박테리아와 생물 의학 및 조직 공학의 최근 테마(미생물 군집(microbial colonization), 생물막 형성(biofilm formation) 및 미생물 감염(microbial infection) 방지)에 대해 다양한 효과를 가진다.

또한, 본 실시예에 따른 동적 표면은 인시츄(in-situ) 전기적 조절을 통해 박테리아 접착성(bacteria-adherable), 살균성(bactericidal), 및 비오염성(non-fouling) 상태의 3가지 상호 변환 가능한 상태를 통합한 것이다.

양쪽 이온성 LDSAM 내의 티올레이트의 입체 구조(conformation)는 표면이 양이온 또는 음이온 전하를 나타내도록 전기적으로 조절되어 표면이 생리 조건(physiological condition)에서 박테리아에 달리 반응해 박테리아의 운명을 결정한다(도 1(a)).

음(-)의 전위 처리를 하면 양이온 포함 알칸티올레이트가 금(Au) 전극으로 이끌려가서 살아있는 박테리아의 부착을 매개하는 음이온성 표면을 형성한다. 양(+)의 전위 처리로 인해 생성된 양이온성 표면은 세포막 누출(membrane leakage)을 유도하여 부착된 박테리아를 효과적으로 사멸시킨다. 개방 회로(OC)에서 형성되는 양쪽 이온성 표면은 죽은 박테리아를 표면으로부터 방출하고 동시에 배지 내에서의 박테리아의 부착을 방지한다.

도 1(b)는 보호된 카르복실레이트/4급 암모늄 디설파이드(protected carboxylate/quaternary ammonium (PCB/QA) disulfide)로부터 제조된 LDSAM의 화학 구조와 전위 처리에 의한 입체 구조 변화를 보여준다.

도 1(c)는 본 실시예에서 사용된 PCB/QA 디설파이드 및 대조군 디설파이드의 구조를 보여준다.

상기 PCB/QA 디설파이드는, CB 포함 알칸티올레이트 및 QA 포함 알칼티올레이트의 전구체로서의 역할 뿐만 아니라, 이에 포함된 큰 부피를 가지는 (트리플루오로메틸)벤질 보호기가 제거되면 알칸티올레이트 사이에 공간을 만들어 LDSAM을 형성하는 역할을 한다.

LDSAM을 생성하기 위해 우리는 황(S)-금(Au) 배위 결합을 통해 금 위에 SAM을 형성하는 알칸티올(alkanethiol)의 말단에 부피가 큰 보호기(bulky protecting group)를 사용했다. 이후 부피가 큰 보호기가 제거되면 알칸티올레이트 사이에 공간이 생긴다. 본 실시예에서는 (트리플루오로메틸)벤질 ((trifluoromethyl)benzy) 보호기를 사용해서, 부피가 큰 보호기를 가진 CB 및 QA로 구성된 헤테로디설파이드(heterodisulfide) 분자(PCB/QA)를 설계했다(도 2 참조).

본 실시예에서 CB/QA를 포함하는 LDSAM의 제조하기 위한 구체적인 공정을 아래와 같다.

먼저, 금(Au) 칩을 피라니아 용액(황산 : 과산화수소(30 %) = 7 : 3)로 세척한 후, PCB/QA 용액(에탄올 중 0.5 mM)에 12 시간 동안 담그고 에탄올로 헹구고 질소 스트림 하에서 건조시켰다. 이어서, 백필링(backfilling) 분자로서 1 mM MET의 존재 하에 0.5 M KOH 용액을 사용하여 (트리플루오로메틸)벤질 ((trifluoromethyl)benzyl) 보호기를 6 시간 동안 제거하였다. 생성된 CB/QA를 포함하는 LDSAM을 물 및 에탄올로 세척하고 질소 스트림 하에서 건조시켰다. SAM 형성 및 탈보호 반응은 MALDI-TOF MS 분석에 의해 확인되었다.

그리고, 대조군으로서 CB/QA, CB 또는 QA를 포함하는 3 종류의 고밀도 자기조립 단분자막(HDSAM)을 아래와 같이 제조했다.

부피가 큰 보호기(bulky protecting group) 없이 12 시간 동안 CB 및 QA 기능기로 구성된 CB/QA 디설파이드 용액(에탄올 중 0.5 mM)에 금 칩을 담궈 생성된 단일층을 에탄올로 헹구고, 1 mM MET로 6 시간 동안 백필링하고, 물 및 에탄올로 세척하고, 질소 스트림 하에서 건조시켰다. CB 또는 QA를 포함하는 HDSAM의 경우, 칩을 80:20 비율의 MUA 및 MET의 혼합 용액(에탄올 중 1mM) 또는 80:20 비율의 MUTA 및 MET의 혼합 용액(에탄올 중 1mM)에 12 시간 동안 침지시켰다 생성된 CB 또는 QA를 포함하는 HDSAM을 물 및 에탄올로 세척하고, 질소 스트림 하에서 건조시켰다.

단일층의 형성과 이후의 보호기 제거는 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간형 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)과 접촉각 측정을 통해 확인되었으며, 순환 전압 전류(cyclic voltammetry)와 분자 동역학 시뮬레이션(molecular dynamics simulation)을 이용한 정량 분석을 통해 CB/QA를 포함하는 SAM(CB/QA-presenting SAM)가 저밀도의 티올레이트를 포함하는 것을 확인했다(도 3(b), 도 3(c) 및 도 4).

또한, 양쪽 이온성의 CB/QA를 포함하는 LDSAM이 인가된 전위에 반응하여 티올레이트의 구조 변화에 의해 표면 상태를 전환하는 능력은, 양 또는 음으로 하전된 표면을 갖는 두 물질의 혼합물을 사용하여, 임피던스 측정, 형광 분석 및 질량 분석에 의해 살펴보았다(도 5).

상기한 분석을 통한 결과는 CB/QA를 포함하는 LDSAM이 부피가 큰 보호기의 가수 분해 제거(hydrolytic removal)를 통해 성공적으로 형성되고, 인가된 전위에 따른 형태 변화가 유도되었음을 명확히 보여준다. 또한, 표면은 그 크기에 관계없이 단백질 및 나노/마이크로 입자와 같은 다양한 물질에 대한 표면 전하에 따라 선택적 흡착 및 비오염 특성을 나타냈다.

다음으로, CB/QA를 포함하는 LDSAM에서 박테리아 세포의 운명(fates)을 전위 처리를 통해 조절했다. CB/QA disulfide, (11-mercaptoundecyl)-N,N,N-trimethylammonium (MUTA) 및 11-mercaptoundecanoic acid (MUA)을 각각 사용하여 CB/QA를 포함하는 고밀도 자기조립 단일층(high density self-assembled monolayer, HDSAM) 및 CB를 포함하는 HDSAM, QA를 포함하는 HDSAM을 대조군으로 준비하였으며, 그 구조는 도 1(c)에 도시했다.

각 SAM은 그람 음성 박테리아 Escherichia coli (대장균, PBS 중 5 ㅧ 10⁸ cells/ mL, pH 7.4)로 처리하고 10 내지 60 분의 다양한 시간 동안 배양한 후 간단히 세척하고, SAM 상의 박테리아를 live/dead assay을 위해 형광 프로브 SYTO9(살아있는 세포에 대해 녹색) 및 propidium iodide(죽은 세포에 대해 적색)로 염색했다. CB/QA를 포함하는 LDSAM 및 CB/QA를 포함하는 HDSAM에서는 소수의 대장균만 관찰되어 양쪽 이온성 표면의 불활성(inertness)이 입증되었다(도 6(a) 및 도 7(a)의 왼쪽 패널). +0.2 V의 전위로 처리된 QA를 포함하는 LDSAM와 MUTA로부터 제조된 QA를 포함하는 HDSAM은 효율적인 살균성(bactericidal property)을 나타냈지만(도 6(a) 및 도 7(a)의 중간 패널), -0.2 V의 전위로 처리된 CB를 포함하는 LDSAM 및 MUA로부터 제조한 CB를 포함하는 HDSAM 상에는 수많은 살아있는 박테리아가 관찰되어 박테리아 부착성(bacteria-adherable property)을 나타냈다(도 6(a) 및 도 7(a)의 오른쪽 패널).

양적 분석 결과, QA를 포함하는 SAM 상에 흡수된 대장균에 대한 항균력은 배양시간에 따라 증가하여 1 시간 후에는 99.5 % 이상의 살균 효율을 나타내었으며(도 6(b) 및 도 7(b)), 세균 세포 밀도는 QA를 포함하는 SAM 및 CB를 포함하는 SAM 모두에서 점차 증가하였다(도 6(c) 및 도 7(c)). 그람 양성균인 Bacillus subtilis (B. subtilis)에 대한 LDSAM과 대조군 HDSAM의 항균 활성 및 세균 밀도에 대해서도 평가하였다(도 8). 또한, 한천(agar) 플레이트에서 박테리아 성장을 관찰하여 전기적 조절 후 양쪽 이온성, 양이온성 및 음이온성 상태의 LDSAM의 항박테리아 효과를 입증했다(도 9). 양이온성 표면이 세포벽의 손상을 쉽게 유도하는지를 살펴보기 위해 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 세균의 형태학적 차이를 시각화했다(도 6(d)). 대장균은 대조군으로서 MUTA 및 MUA로부터 제조된 단일층 및 1 시간 동안 + 0.2V 및 -0.2V로 전위 처리한 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서 각각 배양되었다. MUTA 단일층의 양이온성 표면 (도 6(d) (i)) 및 +0.2V로 처리된 QA를 포함하는 LDSAM (도 6(d) (iii))과 접촉한 박테리아 세포는 세포 내 성분(intracellular component)의 누출로 인해 세포의 완전성을 상실했다. 그러나, MUA 단일층의 음이온성 표면 (도 6(d) (ii)) 및 -0.2V로 처리된 CB를 포함하는 LDSAM (도 6(d) (iv))에 부착된 대장균은 세포벽의 파괴 없이 세포 가장자리가 명확하게 보이며 손상되지 않은 형태를 나타냈다. 전반적으로, 이러한 일련의 실험과 결과는 도 1에 나타낸 양쪽 이온성, 양이온성, 및 음이온성 상태에 대한 박테리아의 다른 반응에 의해 입증되는 것처럼, 전기적 제어 및 이에 의한 티올레이트의 구조적 변화를 통해 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서 온 디맨드(on-demand) `방식으로 박테리아 세포의 운명을 조절할 수 있음을 보여준다.

다음으로, 연속적인 전기적 처리 시에 CB/QA를 포함하는 LDSAM의 표면 이온 상태의 가역적인 변화를 평가하여 박테리아를 죽이고, 죽은 박테리아를 표면에서 방출하는 재사용 가능한 이중(dual) 기능이 가능한지를 살펴보았다. 이를 위해, 대장균을 포함하는 CB/QA를 포함하는 LDSAM을 -0.2V의 전위로 처리한 다음, + 0.2V의 전위로 처리하였다. 이어서, PBS로 부드럽게 세척한 다음 live/dead assay를 위해 형광 프로브로 염색하였다. 형광 이미지는 높은 세포 밀도에서 효율적인 항균 효과를 나타냈으며 세포가 처음에는 -0.2 V에서 CB를 포함하는 단일층에 부착되었을 때 살아 있었다가 + 0.2 V로 처리하여 노출된 QA기에 의해 사멸되었다(도 10(a) (i)). 그러나, +0.2V에서 -0.2V의 전위 처리는 살아있는 세포와 죽은 세포 모두 높은 세포 밀도로 부착시켰다(도 10(a) (ii)). 이러한 관찰 결과는 CB를 포함하는 단일층이 세포 접착을 유도하고 세포 생존을 보장하며, QA를 포함하는 단일층은 세포 부착 후에 박테리아를 사멸한다는 것을 보여주는 결과와 잘 일치한다. CB/QA를 포함하는 LDSAM이 -0.2V에서 개방회로(OC) (도 10(a) (iii)) 또는 +0.2V에서 개방회로(OC) (도 10(a) (iv))로 처리되었을 때, 각각의 경우에서 단지 몇몇의 살아있는 세포 또는 죽은 세포만이 흡착되었으며, 이는 개방회로(OC)에서의 양쪽 이온성 표면의 오염 방지 효과(non-fouling effect)를 보여준다. 주기적으로 전위를 처리하는 CB/QA를 포함하는 LDSAM 상에서의 살아있는 세포와 죽은 세포의 정량 분석(실선) 및 세포 밀도(점선)는 도 10(b)에 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 표면이 박테리아를 효율적으로 죽일 수 있을 뿐만 아니라, 활성(activity)의 감소 없이 동일 배치에서 전위 조절을 통해 흡수된 죽은 박테리아를 방출할 수 있다는 것을 입증한다는 점에서 매우 중요하다.

본 발명에 따른 표면의 실제 응용으로서, 포유류 세포 배양(mammalian cell culture)에서 미코플라스마(mycoplasma) 박멸을 위해 표면을 활용했다.

가장 작고 단순한 자가 복제 박테리아 미생물인 미코플라스마는 5 - 35 %, 위치에 따라서는 65 - 80 %의 높은 오염도(contamination rate)로 잘 알려진 세포 배양의 주요 오염원이다. 미코플라스마 감염은 세포 기능 및 대사의 변화와 같은 배양 세포에 대한 다양한 세포 변성 영향(cytopathic effects)을 일으켜 정확한 생물학적 분석을 제한한다다. 또한, 장기간의 미코플라스마 감염은 감염된 세포의 유전적 이상(genetic abnormality)을 유발하며 결장암, 위암, 폐암, 전립선암 및 신장암과 같은 미코플라스마와 관련된 여러 종류의 암이 알려져 있다.

미코플라스마에는 펩티도글리칸 기반(peptidoglycan-based)의 세포벽이 없어서 이론적으로 상용 항생제에 반응하지 않으므로 특수 화학 분자로 치료하거나 누드 마우스에서 생체 내에서 세포를 통과 시키거나, 감염된 세포와 대식세포(macrophages)의 공배양, 기니아 피그 또는 토끼 혈청으로 반복적으로 처리하는 등 감염된 세포 배양에서 미코플라스마를 제거하는 다양한 방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 방법 중 일부는 포유류 세포에 해롭고 복잡한 장비와 프로토콜을 필요로 한다.

본 실시예에서는 본 발명에 따른 표면을 이용해 포유류 세포에 대한 생체 적합성과 포유 동물 세포의 생존 능력을 저해하지 않으면서 박테리아에 대한 선택적인 살상 효과를 가짐을 확인했다(도 11). 그리고, 가장 일반적인 세포 배양 오염물의 5 가지 중 하나인 Acholeplasma laidlawii를 사용하여 본 발명에 따른 표면의 미코플라스마 사멸 능력을 평가했다.

도 12(a)에 도시한 바와 같이, CB/QA를 포함하는 LDSAM은 전기적 조절에 의해 조절되는 미코플라스마 세균 부착성, 살균성 및 비오염성을 보여줬다. LDSAM에 대한 항균 효율 및 부착 세포 밀도의 정량적 비교는 QA를 포함하는 LDSAM에서 99.8 % 이상의 미코플라스마가 죽고 QA/CB를 포함하는 LDSAM에서는 시간이 지남에 따라 세포 밀도가 점차 증가해, E. coli 및 B. subtilis에 대한 경우와 유사한 경향을 보였다(도 12(b) 및 도 12(c)).

미코플라스마에 대한 탁월한 항박테리아 효과를 바탕으로 포유류 세포 배양(mammalian cell culture)에서 미코플라스마 오염 물질을 선택적으로 박멸하기 위해 본 발명에 따른 표면을 활용했다. 그 결과, 미코플라스마 및 포유류 세포에 대한 오염 방지 효과(non-fouling effect)는 CB/QA를 포함하는 LDSAM에서 관찰되었고(도 12(d)의 왼쪽 패널), 수많은 세포가 CB가 노출된 LDSAM에 부착되었다(도 12(d)의 오른쪽 패널). 특히, QA가 노출된 LDSAM은 미코플라스마에 대해 현저한 항박테리아 효과를 보인 반면, 포유류 세포는 손상되지 않았다(도 12(d)의 중간 패널). 이러한 결과는 세포벽이 없기 때문에 상용 항생제에 영향을 받지 않는 미코플라스마 세포가 포유류 세포에 대한 세포 독성 없이 포유류 세포 배양에서 선택적으로 제거 될 수 있음을 나타낸다.

결론적으로, 부피가 큰 보호기(bulky protecting group)를 이용해 제조되는, 음이온성의 CB 포함 알칸티올레이트 및 양이온성 QA 포함 알칸티올레이트를 포함하는 양쪽 이온성 LDSAM에서, 알칸티올레이트의 입체 구조(conformation)는 전위 인가에 의해 양이온성, 음이온성 및 양쪽 이온성 표면 상태로 가역적으로 전환 가능하고, 상기 3가지의 상호 전환 가능한 상태는 박테리아 접착성(bacteria-adherable), 박테리아 살균성(bactericidal) 및 비오염성(non-fouling)을 각각 나타내었으며, 그에 따라, 생리적 조건(physiological condition) 하에서 박테리아 세포 운명을 온 디맨드(on-demand) 및 인시츄(in situ)로 결정할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 동적 표면은 미코플라스마 오염 물질의 선택적 박멸을 위해 포유류 세포의 오염된 배양물에서 선택적 항균 활성을 입증했다.

본 발명에 따른 표면은 다기능 동적 표면 (multi-functional dynamic surface)으로서 생물 의학/조직 공학, 의료 장비 및 기본 세포 연구를 포함한 다양한 연구 응용 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

양전하를 띠는 말단기(terminal group)을 가지는 제1 화합물 및 음전하를 띠는 말단기를 가지는 제2 화합물을 포함하는 양쪽 이온성(zwitterionic) 표면으로서,
상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물은 하기 단계에 의해 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 형성하며,
양(+) 전위 인가시에는 양이온성(cationic) 표면으로 전환되고, 음(-) 전위 인가시에는 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면:
보호기(protecting group)을 포함하는, 상기 제1 화합물 및 상기 제2 화합물의 전구체 화합물을 합성하는 단계;
상기 전구체 화합물을 표면과 결합시키는 단계; 및
상기 보호기를 제거해 제1 화합물, 제2 화합물, 및 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 공간을 형성시키는 단계.
제1항에 있어서,
상기 양전하를 띠는 말단기는 4차 암모늄 양이온, 피롤리디늄 양이온, 이미다졸리움 양이온, 트리아졸륨 양이온, 피리디늄 양이온, 피리다지늄 양이온, 피리미디늄 양이온, 피라지늄 양이온 또는 트리아지늄 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 표면.
제1항에 있어서,
상기 음전하를 띠는 말단기는 카르복실레이트, 알킬카르복실레이트, 비스(트리플루오로메틸설포닐)이미드, 카르보네이트, 클로라이드, 수소 카르보네이트, 설페이트, 수소 설페이트, 실리케이트, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, 헥사플루오로포스페이트 또는 테트라플루오로보레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면.
제1항에 있어서,
표면에 양(+) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제2 화합물의 음전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 양이온성(cationic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면.
제1항에 있어서,
표면에 음(-) 전위를 인가할 경우, 저밀도 자기조립 단분자막(LDSAM)을 이루는 분자들 사이의 공간을 통해 제1 화합물의 양전하를 띠는 말단기가 전기적 인력에 의해 표면 측으로 이끌려와 음이온성(anionic) 표면으로 전환되는 것을 특징으로 하는 표면.
제1항에 있어서,
전위 인가에 따라 박테리아 접착성(bacteria-adherable)의 음이온성 표면, 박테리아 살균성(bactericidal)의 양이온성 표면 및 비오염성(non-fouling)의 양쪽 이온성 표면 상호 간의 가역적인 전환이 가능한 표면.
삭제
제1항에 기재된 표면을 포함하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.
제8항에 있어서,
상기 제1 화합물은 양전하를 띠는 말단기; 상기 기판과 결합된 결합부; 및 상기 말단기와 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.
제8항에 있어서,
상기 제2 화합물은 음전하를 띠는 말단기; 표면과 결합된 결합부; 및 상기 말단기 상기 결합부를 연결하는 연결부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 결합부는 제1화합물 또는 제2 화합물과 표면 간의 배위 결합(coordination bond)에 의해 형성된 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.
제9항 또는 제10항에 있어서,
상기 연결부는 알칸 사슬로 이루어진 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.
제8항에 있어서,
금(Au), 백금(Pt), 은(Ag) 또는 구리(Cu)로 이루어진 기판인 것을 특징으로 하는 항균성 및 방오성을 가지는 다기능성 기판.