KR102019589B1 - 내이에서의 약물전달용 나노입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 내이에서의 약물전달용 나노입자에 관한 것으로, 포스포리피드 나노에멀젼을 기반으로 하는 내이 질환 치료 또는 예방용 약물을 유효성분으로 포함하는 내이-특이적 약물전달용 나노입자를 제공한다. 상기 나노입자는 내이 내 약물전달이 가능하며, 이를 통하여 내이 질환을 예방 및 치료하는데 큰 활용을 할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

내이에서의 약물전달용 나노입자{NANOPARTICLE FOR DRUG DELIVERY IN INNER EAR}
본 발명은 내이에서의 약물전달용 나노입자에 관한 것이다.
청각문제는 내이(inner ear)의 각종 장애, 질환 또는 외상으로 생길 수 있으며 오늘날 사회에서 증가하고 있는 문제점이다. 내이 질환은 흔히 난치성 질환으로 분류되는데, 큰 이유중의 하나가 내이로 약물 혹은 유전자의 전달이 혈관내이장벽(blood-labyrinthine barrier)으로 전신순환과 분리되어 있고 두개저 깊숙이 위치하여 약물이 닿지 않기 때문이다. 이러한 문제점을 극복하고자 내이로의 효율적인 약물전달을 위해 고막을 통해 중이강(middle ear cavity)에 약물을 위치시켜 약물이 중이강에서 내이로 달팽이관(cochlea)의 정원창(round window membrane)을 투과하여 약물을 전달하는 국소 전달(local delivery)이 연구중에 있다.
한편, 나노입자(nanoparticle)는 약물전달, 유전자 전달, 세포 내 영상, 광선치료와 같은 생체의학 분야에서 촉망되는 도구로서 사용되어 왔으며, 특히 금 나노소재는 합성과 작용의 용이성, 화학적 안정성, 생체 적합성, 및 조정 가능한 광학적 및 전기적 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있다. 이에 따라, 나노입자를 이용한 약물전달은 암치료를 위해 암세포주에서 주로 연구되어 왔고 최근 내이 질환에서도 시도가 되고 있지만 아직까지는 국소 전달의 경우 효과적으로 정원창을 투과하여 충분한 양의 약물을 내이로 전달하기 어려운 실정이다.
이러한 문제점을 극복하고자 폴리(2-하이드록시에틸 L-아스파트아미드) 및 옥타아르기닌을 기반으로 하는 나노입자를 합성하여, 약물을 내이로 동시-전달할 수 있는 약물전달체가 개발되었으나, 이는 여전히 안정성 및 효능 측면에서 불충분한 것으로 나타났다(Yoon, Ji Young, et al. "Intratympanic delivery of oligoarginine-conjugated nanoparticles as a gene (or drug) carrier to the inner ear." Biomaterials 73 (2015): 243-253; Kim, Dong-Kee, et al. "Development of a drug delivery system for the inner ear using poly (amino acid)-based nanoparticles." Drug delivery 22.3 (2015): 367-374).
이에 따라, 내이 질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있는 신규한 약물전달체에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 포스포리피드 나노에멀젼을 기반으로 한 내이 질환 치료 또는 예방용 약물을 유효성분으로 포함하는 내이-특이적 약물전달용 나노입자를 제공하는 것에 목적이 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
이하 상기 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 구체예에서 "내이 질환"이란, 각종 장해, 질환 또는 외상으로 생길 수 있는 질병을 의미하며, 내이로 약물 또는 유전자의 전달이 용이하지 않기에 난치성 질환으로 분류되는 질환 중 하나이다. 내이 질환은 이명, 발작성 체위성 현기증(BPPV)과 같은 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 이명, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로는 감각신경성 난청(sensorineural hearing loss)을 의미하며, 더욱 구체적으로는 내이의 달팽이관 내 유모세포(hair cell), 나선신경절 신경세포(spiral ganglion neuron, SGN), 코르티 기관 등의 손상으로 야기된 난청을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 "나노입자"란, 나노 단위의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 나노크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않는다. 의약품에 있어서, 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면 다음과 같은 장점들이 있다. 먼저, 투여 시에 입자의 크기가 큰 경우보다 더 많이 흡수될 수 있어, 결과적으로 치료제의 생물학적 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 경구투여만이 가능했던 약물을 흡입형으로 환자에게 투여할 수 있게 되는 것과 같이, 치료제 제형의 형태를 다양하게 할 수 있다. 또한, 치료제의 방출속도는 서방형 치료제의 제형에 있어서 매우 중요한 요소인 바, 치료제 입자의 크기를 나노입자로 하면, 그 크기가 상대적으로 균일해짐에 따라 치료제의 방출속도가 예측가능하기 때문에, 보다 효과적인 치료제를 제조할 수 있게 된다. 본 발명에서 사용되는 나노입자로는 수성매질에서 통상의 수중유적(O/W) 방법으로 제조된 포스포리피드 나노에멀젼 형태를 기반으로 하며, 표면에 중성, 음이온성, 양이온성 전하를 띄며, 양이온성 전하에는 추가로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 결합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "나일 레드"란, 내이 내 여러 조직으로의 나노입자의 약물전달 가능성을 보기 위하여 나노입자 내부에 봉입된 소수성 형광염료로 형광 지표(indicator) 및 소수성 약물 모델로서 사용된다. 나일 레드는 약물전달, 약물방출 및 세포흡수 시험에서 다양하게 사용된다.
본 발명의 일 구체예에서 "약물전달"이란, 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화하기 위하여 필요한 양의 약물을 치료부위에 선택적으로 전달함으로서 건강한 조직을 약물에 노출시키지 않음과 동시에 소량의 약물만으로도 우수한 치료효과를 낼 수 있도록 효율적으로 전달하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 약물전달은 정원창을 투과하여 난청의 주요 장애 부위인 유모세포, 코르티 기관 또는 나선신경절 세포에 약물을 전달하는 국소 전달을 목적으로 한다.
본 발명의 일 구체예에서 "투과"란, 나노입자가 정원창을 투과하여 내이로 효과적인 약물전달을 할 수 있는 능력을 의미하며, 고막을 통해 중이강에 약물을 위치시켜 약물이 중이강에서 내이로 달팽이관의 정원창을 투과하는 것을 의미한다. 본 발명의 나노입자는 내이세포로의 투과도를 높이기 위해 나노입자의 표면에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 결합시켜 투과성이 우수하므로, 내이 내 약물전달용 물질로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 "세포독성"이란, 세포의 기능을 억제하거나 저하시켜 세포의 파괴를 야기시키는 효과를 의미한다. 본 발명에서의 세포독성 시험에서 세포 생존율을 MTT 분석법을 이용하여 결정하였으며, 상기 실험을 통하여 결정된 최대 안전 용량(maximal safe dose)은 0.25mg/mL 내지 0.5mg/mL이다.
본 발명의 일 구체예에서 "세포흡수"란, 세포 내 흡수되는 나일 레드를 통하여 확인할 수 있으며 형광현미경 또는 공초점 현미경으로 형광 강도의 비교를 통하여 측정하였다.
본 발명의 일 구체예에서 "약물방출"이란, 지속적 방출 또는 제어된 방출로 구분될 수 있고, 지속적 방출은 소정의 기간에 걸쳐 약물 또는 치료제 또는 이들의 임의의 조합물의 계속적인 방출을 의미하며, 제어된 방출은 전달되는 약물 또는 치료제의 속도 및/또는 양의 조절을 의미한다. 제어된 방출은 연속적 또는 불연속적이고/거나 선형 또는 비선형일 수 있다. 이것은 하나 이상의 유형의 중합체 조성물, 약물 로딩, 부형제 또는 분해 개선제, 또는 다른 개질제의 포함, 단독으로, 조합하여 또는 연속으로 투여시켜 요망되는 효과를 제공하는 것을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명에서는 인공 외림프액 내 방출되는 나일 레드의 양을 UV 분광기로 측정하였다.
본 발명의 일 구체예에서 "제타 전위(zeta potential)"란 대전된 입자표면에 붙어 있는 불가동수분과 입자로부터 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 가동수분의 확산 이중층에서의 양전하 밀도차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 의미한다. 세포표면과 주변 배양액 사이의 전기적 전위차 또는 제타 전위로 나타내기도 한다.
본 발명의 일 구체예에서 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 또한, 본 발명에서 사용된 상기 치료란 용어는 나노입자의 투여로 내이 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서 "예방"이란, 상기 나노입자의 투여로 내이 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명은 내이 질환 치료 또는 예방용 약물을 유효성분으로 포함하는 포스포리피드 나노에멀젼으로서, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린, 소듐염(DPPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DPPE-PEG2000); 및 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(DPTAP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 내이-특이적(inner ear-specific) 약물전달용 나노입자(nanoparticle)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 아마씨유 또는 콩기름을 추가로 포함할 수 있다. 포스포리피드의 경우 리포좀이 만들어져 내부 공간의 대부분이 주로 친수성 수용액 환경이 되지만 내부 공간에 아마시유 또는 콩기름을 추가하는 경우에 내부가 소수성 기름층이 되어 덱사메타손 등의 소수성 약물을 봉입할 수 있는 공간을 충분히 확보할 수 있게 된다. 소수성 기름층을 생성하기 위해 아마씨유 또는 콩기름이 가장 바람직하지만, 해바라기씨유, 캐놀라유, 야자유, 옥수수유, 면실유, 평지자유, 홍화씨유, 귀리유, 올리브유, 팜유, 땅콩유, 살구씨유, 아몬드유, 아보카도유, 올리브유, 동백유, 미강유, 면실유, 땅콩유, 호두유, 유채유, 쌀겨유, 참깨유, 대두유, 피마자유, 코코아버터, 팜핵유 등을 포함할 수 있으며, 상술한 성분을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 다만 본 발명이 상기 나열된 종류로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 DPPC를 3 내지 10mg을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 4 내지 8mg이며, 가장 바람직하게는 6mg를 함유할 수 있다. 이를 함유하는 나노입자의 표면은 중성 전하를 나타낸다. 중성 전하를 갖는 나노입자는 점막을 통해 침투하여 세포 내로 효과적으로 흡수될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 DPPC 및 DPPS를 1:1 내지 1:4로 함유하며, 바람직하게는 1:2로 함유할 수 있다. 이를 함유하는 나노입자의 표면은 음이온성 전하를 나타내며, 내이 내 약물전달에 효과를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 DPPC 및 DPTAP를 1:1 내지 1:4로 함유하며, 바람직하게는 1:2로 함유할 수 있다. 이를 함유하는 나노입자의 표면은 양이온성 전하를 나타낸다. 양이온성 전하는 갖는 나노입자는 세포 내 우수한 흡수 효과를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 DPPE-PEG2000 및 DPTAP를 1:1 내지 1:4로 함유하며, 바람직하게는 1:2로 함유할 수 있다. 이를 함유하는 나노입자의 표면은 양이온성 전하를 나타내며, 표면에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 결합된 형태를 갖는다. 나노입자의 표면에 PEG를 결합시킴으로서 내이세포로의 투과성을 높일 수 있으며, 외림프액에서 보다 긴 약물의 순환을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 150 내지 250nm의 크기를 가지며, 바람직하게는, 약 250nm의 크기를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 정원창(round window membrane)을 투과하여 유모세포 또는 코르티 기관에 약물을 전달한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 내이 질환 치료 또는 예방용 약물은 덱사메타손, 스테로이드, 이뇨제, 혈관확장제, 베타히스티딘, 전정억제제, 덱스트란, 만니톨 또는 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택되지만, 내이 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 약물이라면 제한이 없다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 내이 질환은 이명, 발작성 체위성 현기증(BPPV)과 같은 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 이명, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 포스포리피드 나노에멀젼을 기반으로 한 내이 질환 치료 또는 예방용 약물을 유효성분으로 포함하는 내이-특이적 약물전달용 나노입자로서, 고막 내 경로를 통한 내이전달의 가능성이 있음이 확인하였으며, 안정성 및 효능 측면에서도 우수한 효과를 갖는다. 또한, 이를 통하여 내이 질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 고막내 약물전달의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 나노입자의 크기 및 제타 전위를 나타낸 것이다.
도 3은 나노입자의 세포독성을 시험한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 나노입자의 세포흡수 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 인공 내이 정원창 모델에서 유모세포로의 나노입자의 침투 속도를 나타낸 것이다.
도 6은 생체외 나노입자의 독성 및 침투를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 양이온성-PEG에 로딩된 덱사메타손의 방출 프로파일을 나타낸 것이다.
도 8은 CAT-PEG-Dex 및 덱사메타손의 분포 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 CAT-PEG-Dex에 의한 항생제-유도 난청 마우스의 회복 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 : 나노입자의 제조
재료
1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린, 소듐염(DPPS)을 Echelon Biosciences(Salt Lake City, UT)로부터 구입하였다. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DPPE-PEG2000) 및 1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(DPTAP)을 Avanti Polar lipids(Birmingham, AL)로부터 구입하였다. 아마씨유 및 나일 레드를 Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 덱사메타손(Dex)을 Cayman Chemical(Ann Arbor, Michigan, USA)로부터 구입하였다. 덱사메타손 플루오레세린(Dex-FITC)을 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였다. 디메틸 설폭사이드, 99.0%(메틸 설폭사이드, DMSO) 및 Triton X-100을 Samchun(Korea)로부터 구입하였다. 인산염완충식염수(PBS, pH 7.4)를 Gibco®로부터 구입하였다. 투석막(Pre-wetted RC tubing, MWCO:25KD)을 Spectrum labs(Rancho Dominguez, California, USA))로부터 구입하였다.
나노입자의 제조
나노입자를 수성매질에서 통상의 수중유적(O/W) 에멀전 방법으로 제조하였다. 중성, 음이온성, 양이온성, 양이온성 PEG 나노에멀전에 대해 각각 DPPC 단독(6mg), DPPC(2mg)/DPPS(4mg), DPPC(2mg)/DPTAP(4mg) 및 DPPE-PEG2000(2mg)/DPTAP(4mg)를 사용하였다. 나일 레드(0.3mg) 또는 Dex(10mg)를 20ul DMSO에 용해시키고, 50mg의 아마씨유와 혼합하였다. 이어서, 아마씨유(나일 레드 또는 Dex 함유) 및 포스포리피드를 2% 글리세롤 물(지질 농도 2.4mg/ml)에서 초음파처리하여 분산시켰다. 로딩되지 않은 나일 레드 또는 Dex를 증류수를 사용하여 1시간 동안 투석(MWCO:25KD)하여 제거하였다. DMSO 및 Triton X-100에 의해 완전히 리포좀을 파괴한 후, 나노입자 내 나일 레드의 양을 나일 레드의 형광(510/605nm)을 기반으로 평가하였다.
DTA(Data Transfer Support) 소프트웨어를 사용하여 Zetasizer(zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, UK)로 PBS(pH 7.2)에서 나노입자의 유체역학적 반경과 제타 전위를 25℃에서 측정하였다. 나노입자의 형태를 확인하기 위해, 2%(w/v) 우라닐 아세테이트 용액으로 음성 염색을 수행한 후 TEM(투과 전자 현미경)으로 관찰하였다.
시간 경과에 따른 나노입자의 Dex 방출을 측정하기 위해 Dex-FITC를 사용하였다. Dex(Dex:Dex-FITC=49:1 중량비)-로딩된 나노입자를 실온에서 PBS(pH 7.2) 내 투석막에 넣었다. 이어서, 외부 용액 내 Dex-FITC의 형광(485/530nm)을 적정한 시점에 따라 측정하였다.
실시예 1: 후보 나노입자 운반체의 스크리닝
1. HEI -OC1의 시험 관내 세포 배양
CPP의 세포흡수 및 세포독성을 Dr. MK Park(서울대학교, 의과대학, 서울, 한국)에 의해 제공된 코르티 기관 세포주 HEI-OC1의 불멸화 마우스를 사용하여 평가하였다. HEK-OC1 세포를 10% 소태아혈청 및 50U/mL 재조합 마우스 인터페론-γ로 보충한 둘베코 변형 이글 배지에서 성장시키고 계대배양한 후, 33℃에서 10% CO2 습도환경에서 배양하였다.
2. 세포독성 시험
HEI-OC1 세포에 대한 4가지 후보 나노입자 운반체의 세포독성을 다음과 같이 조사하였다. HEI-OC1 세포를 96-웰 플레이트에 1x104개/웰의 밀도로 0.1mL 완전 성장 배지에 도포하고, 80% 성장치로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 24시간 동안 4가지 후보 나노입자 운반체로 처리하였다. 제조사의 프로토콜(EZ-Cytox, 대일 연구소, 서울, 한국)에 따라 상업적으로 이용가능한 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 사용하여 세포 생존율을 결정하였다. 배양 후, 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 450nm에서 샘플의 광학 밀도를 결정하였다.
3. 세포흡수 시험
HEI-OC1 세포를 Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System(Nunc, Roskilde, Denmark)에 도포하고, 세포독성 시험에서 결정된 최대 안전 용량에서 4시간 동안 나일 레드와 접합된 후보 나노입자 운반체로 처리하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 Vectashield Mounting Medium 및 DAPI(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 봉입하였다. 처리된 세포를 공초점 현미경 LSM5 Live Configuration Variotwo VRGB, Zeiss, Jena, 독일) 및 형광-활성 세포 분류기(FACS, BD FACS Canto™ II; Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)로 관찰하였다.
4. 인공 점막을 이용한 시험관 내이의 약물전달 스크리닝 모델
실행 가능하고 재구성된 3차원 인간 점막층인 RWM을 모방하기 위해 네오덤Neoderm®-OD(Tego science, Seoul, South Korea)을 구입하였다. 상피 세포는 인간 구강 점막 상피 세포로 이루어져 있으며, 스트로마는 콜라겐 매트릭스의 섬유 아세포로 구성되어 있다. 이의 두께는 약 100㎛로, 약 70㎛인 인간 RWM의 두께와 유사하다. Neoderm®-OD를 바닥에 HEI-OC1가 있는 6-월 플레이트로 이동시켰다. HEI-OC1 세포 배양을 위한 동일한 배양 배지를 Neoderm®-OD와의 접촉이 도 1과 같이 나타날 때까지 6-웰 플레이트에 채웠다.
Neoderm®-OD를 통해 네일 레드가 결합된 4가지 후보 나노입자 운반체를 각 나노입자 운반체의 나일 레드 1ug과 동일한 용량으로 40시간 동안 적용시킨 후, 바닥에 있는 HEI-OC1에서 나일 레드의 흡수를 공초점 현미경 검사 및 FACS로 관찰하였다.
실시예2 : 내이 약물전달에 대한 나노입자 운반체의 적용
스크리닝 시험 결과에 따라, 하나의 나노입자 운반체를 선택하고, 생체외 시험에 나일 레드를 로딩하고, 생체내 시험에 덱사메타손을 로딩하였다. 생체외 시험에서, 효율 평가를 위해 기관형 배양에서 나일 레드 흡수 패턴을 관찰하였고, 안정성 평가를 위해 유모세포의 섬모의 손상 및 코르티 기관의 미세구조를 관찰하였다.
생체내 시험에서, 현재 임상에서 사용되는 덱사메타손 또는 덱사메타손 소듐 포스페이트가 로딩된 나노입자 운반체를 정상 동물 또는 내이신경독성 동물의 중이강 내로 투여하였다. 이후에, 약물이 두 가지 정상 동물군 사이에서 내이 조직 내에 존재하는 기간과 내이에 흡수되는 양을 비교하고, 내이신경독성 동물군 사이에서 청력이 얼마나 보호되는지, 달팽이관의 손상이 어느 정도 감소되는지 비교하였다.
1. 생체외 시험
일차 달팽이관의 체외이식을 출생 후 3일(P3)된 C57/BL6 마우스로부터 준비하였다. 절개한 코르티 기관을 5% FBS, 5% 말 혈청 및 10ng/mL 엠피실린을 함유한 고-글루코스 DMEM으로 37℃ 및 5% CO2에서 가습된 배양기에서 배양하였다. 나일 레드가 로딩된 나노입자 운반체를 24시간 동안 최대 안정 용량 및 이의 절반 용량으로 처리하였다. 처리 후, 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고, 아세톤으로 투과화하고, Alexa Fluor 488 Phalloidin(Molecular Probes, Eugene, OR)과 결합하는 항체를 적용한 후, DAPI(Vector Laboratories)로 Vecta shield Mounting Medium에 고정시켰다. 저배율 이미지를 위한 형광 현미경(Eclipse TE300 Microscope; Nikon,Tokyo, Japan 및 고배율 이미지를 위한 고초점 현미경을 통해 나노에멀전의 흡수를 조사하였다. 표본을 DAPI 및 FITC-표지 팔로이딘으로 염색하여 유모세포 섬모 및 조직 구조의 손상을 평가하였다.
2. 생체내 약물분포
2.1 동물 수술
1개월된 수컷 C57/BL6 마우스를 실험에 사용하였다. 수술 전, 마우스를 30mg/kg 졸레틸(Virbac,Carros, France) 및 10mg/kg Rompun(Bayer, Leverkusen, Germany)의 혼합물로 마취시켰다. 마우스를 열 조절된 보온 패드에 반듯이 눕혀 놓고, 중간선 절개를 수행하고, 왼쪽 융기(Bulla)를 노출시켰다. 융기에 미세 겸자를 사용하여 구멍을 내었다. 이어서, 최대 안정 용량(나노파티클 농도 0.5mg/ml, Dex 농도 0.14mg/ml)으로 나노입자에 로딩한 덱사메타손(Sigma-Aldrich, St. luis, MO) 또는 5mg/ml로 로딩한 덱사메타손 소듐 포스페이트(Sigma-Aldrich, St. luis, MO)를 중이강이 완전히 채워질 때까지 중이강 내로 투여하였다. 더 많은 임상 증상을 반영하기 위해, 장기간 동안 중이에 약물을 보관할 수 있는 젤 거품을 사용하지 않았다. 구멍을 골 왁스(B. Braun, Melsungen, Germany)로 막고, 상처를 봉합하였다. 수술 후, 리마딜(1.0mg/kg; Pfizer, UK, Surrey, UK)을 주사하여 통증을 완화시켰다. 베이트릴(10mg/kg, Orion, Hamburg, Germany)를 중이 감염에 대한 예방약으로서 복강내 주입하여 1일 1회 주입하였다.
2.2 약물분포 평가
수술 후 1시간, 24시간 및 72시간에 동물을 희생시키고 달팽이관을 수확하엿다. 분리한 달팽이관을 수돗물로 1분간 헹구어 외부 표면에 잔류하는 자유 입자를 제거하고 4% 파라포름알데히드(Merck, Darmstadt, Germany) 용액에 24시간 동안 보관하였다. 하룻밤 동안 고정시키고, 5% EDTA(0.3M, pH 6.5)로 탈석회화시키고 파라핀에 함침(embedded)시켰다. 5μm 와우축 절편을 수득하였다. 와우축 절편을 Vectastain Elite ABC HRP Kit 및 Vector NovaRED Peroxidase Substrate(Vector Labs, CA)의 제조업체의 절차에 따라 적용하였다. 항-덱사메타손 항체(Abcam, UK)를 사용하여 달팽이관에서 덱사메타손 또는 덱사메타손 소듐 포스페이트를 표적으로 하였다.
3. 내이신경독성 마우스 모델에서의 내이로의 덱사메타손 전달
1개월된 수컷 C57/BL6 마우스를 4개의 군으로 나누어 실험을 수행하였다. 대조군은 수술이나 치료를 수행하지 않았고, 다른 3개의 군에는 내이독성 유도 2시간 전에 상기 기재한 바와 같이 중이강 내로 약물을 투여하였고, 3개의 군 각각에 모의수술(sham operation)을 위해 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 포스페이트 또는 식염수를 로딩한 나노입자를 투여하였다.
내이신경독성을 마우스에 카나마이신(500mg/kg; Sigma-Aldrich, St. luis, MO)을 피하 주입하고 30분 후 푸로세미드(120mg/kg; Sigma-Aldrich, St. luis, MO)를 복강내 주입하여 유도시켰다. 내이신경독성 유도 40시간 후, 일부 마우스를 RT-PCT을 위해 희생시키고, 1주일 후 나머지 마우스에 ABR을 실시하였다.
3.1 ABR
청성뇌간반응(ABR; Auditory brainstem responses)을 System III Evoked Potential Workstation(Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA)으로 내이신경독성 유발 7일 후에 수득하였다. 즉, 마우스를 30mg/kg 졸레틸(Virbac,Carros, France) 및 10mg/kg 럼푼(Bayer, Leverkusen, Germany)의 혼합물로 마취시키고, 방음 음향 챔버 내부의 가열 패드 위에 두었다. ABR 시험에서, 5 내지 10dB SPL 단계에서 90 내지 20dB SPL의 MF1 자기 스피커(TDT)로 클릭 및 톤 버스트 자극(click and tone burst stimuli)(4, 8, 16 및 32kHz)을 제시하였다. 클릭 자극은 0.1ms로, 톤 버스트 자극은 5ms로 지속하였다(정체기 없이 상승 및 감소에 대해 각각 2.5ms). 임계 반응을 유발된 반응의 최대 진폭(대기시간, 2.5-7.5ms)이 자극 발생 이전의 평균 배경 활동(15-20ms) 보다 2개의 표준편차 이상인 음압 레벨로 정의하였다. 마우스 군 사이의 임계값 차이를 통계적으로 결정하였다. ABR 측정 후, 슬라이드에 봉입시키기 위해 마우스를 희생시켰다.
3.2 RT- PCR
전체 RNA를 easy-BLUE 전체 RNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, WA)를 사용하여 달팽이관으로부터 추출하였다. 역전사효소 프리믹스(Elpis Biotech, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하고 유전자-특이적 프라이머 쌍을 가진 Power SYBRTM Green polymerase chain reaction (PCR) Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA)에서 증폭시켰다; IL1b 정방향, 5'- GCC CAT CCT CTG TGA CTC AT-3', IL1b 역방향, 5'-AGG CCA CAG GTA TTT TGT CG-3', IL6 정방향, 5'-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3', IL6 역방향, 5'-CCG GAG AGG AGA CTT CAC AG-3, TNFa 정방향, 5'-ACG GCA TGG ATC TCA AAG AC-3', TNFa 역방향, 5'- GTG GGT GAG GAG CAC GTA GT-3', IFNr 정방향, 5'-GCT ACA CAC TGC ATC TTG GCT TT-3', IFNr 역방향, 5'- AAT GAC TGT GCC GTG GCA GTA A-3'. 정량적 실시간 PCR을 ABI 7500 FAST 기기(Applied Biosystems)에서 수행하였다. mRNA의 발현 레벨을 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)의 발현으로 정규화하였다. 데이터 분석을 위해 Microsoft에서 제공하는 알고리즘을 포함하는 엑셀 스프레드 시트를 사용한 ΔΔCt 방법을 사용하였다. 이어서, 변화값을 계사하고 식염수 적용 군으로부터 값의 로그-정규화 비율로 나타내었다.
3.3 코르티 기관( OC ) 슬라이드 제작
ABR 측정 후, 마우스를 희생시켜 달팽이관을 추출하고, 상기 언급된 방법으로 추출된 달팽이관을 고정시키고 탈석회화시켰다. 각진 날카로운 마이크로 메스를 사용하여 뼈와 막미로(membranous labyrinth)와 덮개막(tectorial membrane)을 조심스럽게 제거하여 코르티 기관(OC)을 노출시켰다. OC는 달팽이관의 정점과 중간 회전을 포함하는 하나의 부분과 달팽이관의 기초 회전을 포함하는 다른 하나의 부분인 두 개의 부분으로 나누어져 있으며, 이를 PBS로 채워진 플레이트(Nunclon Microwell Plates, Sigma Aldrich)에 놓고 4℃에서 보관하였다. 시료를 0.5% Triton X-100(Sigma Aldrich)로 15분간 실온에서 쉐이커로 투과화시킨 후, PBS 중 1:1000 팔로이딘(R Alexa Fluor 488 phalloidin, Invitrogen)으로 1시간 동안 배양하엿다. PBS로 3회 세척한 후, 시료를 슬라이드로 옮기고 DAPI(Vector Laboratories)를 함유하는 Vectashield Mounting Medium에 고정시켰다.
통계학적 분석
모든 데이터를 3회 실시한 측정값의 평균±표준오차로 나타내었다. 다양한 군에 대해 일원분산분석(ANOVA)을 수행하여 군 사이의 차이를 확인하였다. 모든 분석에서, P<0.05는 통계적 유의성을 나타낸다.
실험결과
나노입자의 제조 및 특성 규명
상기 제조예에 기재한 바와 같이, 나노입자는 자가-조립에 기반한 통상적인 O/W 에멀전 방법으로 제조하였다. 나노입자의 코어는 아마씨유로 채워졌고 쉘은 포스포리피드로 이루어져 있다. 나일 레드와 덱사메타손을 나노입자의 코어에 로딩하였다. 제조된된 나노입자의 크기는 약 200nm이고 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 수성 조건에서 구형을 갖는 것으로 나타났다(도 2). 중성, 음이온성, 양이온성 및 양이온성-PEG 나노입자에 대한 제타 전위 값은 각각 -4.32, +25.8, -26.0 및 -0.28이다. 이들 값은 유사한 크기를 유지하면서 포스포리피드의 조성에 따라 표면 전하가 적절하게 조절되었음을 보여준다.
후보 나노입자 운반체의 스크리닝 결과
실시예 1에 기재한 바와 같이, 세포 생존율 및 세포흡수를 확인하였다. 후보 나노입자 처리 후, MTT 분석으로 세포 생존율을 측정하였다. 각각의 나노입자 운반체의 안전 용량은 처리하지 않은 대조군 세포에 비해 음이온성의 경우 0.5mg/ml, 양이온성의 경우 0.25mg/ml, CAT-PEG의 경우 0.5mg/ml이었다. 또한, 중성 나노입자 운반체의 세포독성은 2.5 mg/ml의 시험 용량에서 검출되지 않았다(도 3).
일반적인 배양 조건에서 배양된 HEI-OC1 세포에서 나일 레드가 로딩된 나노입자의 세포흡수를 시험하였다. 세포를 각 나노입자 0.5mg/ml로 4시간 동안 처리한 후, FACS로 분석하고 공초점 현미경으로 확인하였다. 양이온성 나노입자는 FACS 및 공초점 현미경 모두에서 HEI-OC1의 가장 강한 나일 레드 흡수를 보였으며, 그 다음으로는 Cat-PEG, 중성 및 음이온성 나노입자 운반체로 나타났다(도 4).
이어서, 시험관내 내이 RWM 모델을 사용하여 인공 점막과 배양 배지를 통해 나노입자 운반체를 통해 전달된 HEI-OC1 세포에서의 나일 레드 형광의 강도를 관찰하였다. Cat-PAEG 나노입자는 FACS 및 공초점 현미경 검사에서 가장 강한 형광을 나타내었고, 그 다음으로는 중성, 양이온성 및 음이온성 나노입자로 나타났다(도 5). 중성 나노입자는 Cat-PEG와 비슷한 효율을 보였는데, 이에 따라, Cat-PEG 나노입자를 선택하여 약물전달 확인 및 내이독성 마우스 모델에서의 치료학적 결과를 확인하였다.
내이에서 Cat-PEG 나노입자를 이용한 생체외 및 생체내 약물전달
실시예 2에 나타낸 바와 같이, 생체외 및 생체내 약물전달을 확인하였으며, 이때 Cat-PEG 나노입자를 사용하였다. 스크리닝 검사 결과, 배양된 코르티 기관에 Cat-PEG를 안정 용량으로 처리하였다. 0.25 및 0.5mg/ml의 CAT-PEG로 처리한지 24시간 후에, 형광 및 공초점 현미경 검사에서 유모세포 섬모 및 코르티 기관의 구조 손상이 관찰되지 않았으며, 나일 레드는 농도에 비례하여 0.25mg/ml 보다 0.5mg/ml 군에서 보다 많이 흡수되었다. 두 군 모두 기관형 배양의 내측, 즉 나선신경절 및 나선판에서 나일 레드의 높은 흡수를 보였다(도 6).
이어서, 치료를 위해 Dex를 Cat-PEG 나노입자에 로딩하였다. 로딩 효율은 약 93.1±7.6%이고, 입자 크기는 약 143.53±21.18nm이며, 이는 약물 로딩 전과 유사했다. 로딩된 Dex는 PBS(pH 7.4)에서 Cat-PEG 나노입자로부터 서서히 방출되었다(도 7). 로딩된 Dex의 약 절반이 72시간 후에 방출되었고, 약물의 90%는 10일 후에 방출되었다. Cat-PEG-Dex 또는 덱사메타손 소듐 포스페이트(Dex-SP)를 중이강에 투여한 후, 항-덱사메타손 항체에 대한 면역조직화학을 시행하여 Dex 또는 Dex-SP의 분포를 확인하였다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 두 군 모두 투여 후 1시간 내지 24시간까지 내이 조직에서 Dex 또는 Dex-SP의 강한 흡수를 보였으며, 특히 와우축, 나선신경절 및 나선판을 포함하는 달팽이관의 내측에서 OC 및 측벽보다 가장 강한 흡수를 보였다. Cat-PEG-DEX 처리 군은 Dex-SP 군에 비해 Dex의 흡수가 약간 증가되었으나, 그 수준은 유사한 것으로 나타났다. 투여 72시간 후, 두 군의 달팽이관 내 나선신경절 및 내부 유모세포에서 Dex 또는 Dex-SP 섭취가 여전히 약하게 나타났다(도 8).
내이신경독성 마우스 모델에서 Cat-PEG- Dex 또는 Dex - SP의 치료학적 결과
실시예 2에 나타낸 바와 같이, 내이신경독성 마우스 모델에서의 치료학적 결과를 확인하였다. 3개 군의 ABR 역치를 7일째에 측정하였고, 크러스칼-왈리스 검증에서 4kHz(p=0.001), 8kHz(p=0.002), 16kHz(p=0.002), 32kHz(p<0.001) 및 클릭(p=0.001)에서 세 군 사이의 유의한 차이점을 보였다(도 9). Holm-Bonferroni 방법에 의한 사후검증에서 Deaf-Cat-PEG-Dex 군은 Deaf-Dex-SP 군에 비해 4kHz(p=0.008), 8kHz(p=0.008), 16kHz(p=0.008), 32kHz(P=0.005), 및 클릭(p=0.008)에서 유의하게 좋은 청력을 보였으며, 또한, Deaf-saline 군에 비해 4kHz(p=0.012), 8kHz(p=0.012), 16kHz(p=0.012), 32kHz(p=0.010), 및 CK(p=0.012)에서 좋은 청력을 보였다. 그러나, Deaf-Saline 군과 Deaf-Dex-SP 군 사이에는 모든 주파수에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
항생제-유도 염증 반응을 정량적 PCR로 나타내었다. 전염증성 사이토카인, IFN 감마, IL-6, IL-12 및 IL-1 베타의 발현은 항생제에 의해 상향조절되었다. 역방향 반응은 Dex-SP에 의해 나타났으며 CAT-PEG-Dex에 의해 보다 더 많이 나타났다. 카나마이신 및 푸로세마이드에 대한 Cat-PEG-Dex 또는 Dex-SP의 보호 효과를 알아보기 위해, 팔로이딘으로 염색된 각 군의 홀마운트(whole mount)시킨 코르티의 기관을 공초점 현미경으로 관찰하고, 장소-주파수 맵(place-frequency map)에 따라 4개의 특정 영역을 관찰하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, Deaf-Saline 군의 4개 주파수 영역 모두에서 부동섬모와 HC의 심각한 소실이 관찰되었으며, Deaf-Cat-PEG-Dex 군은 16kHz 부위에서 약간의 손상을 보였으나 대조군과 마찬가지로 잘 보존되었다. Deaf-Dex-SP 군은 Deaf-saline 군과 Deaf-Cat-PEG-Dex 군 사이에서 중간 결과를 보였다.

Claims (13)

  1. 내이 질환 치료 또는 예방용 약물을 유효성분으로 포함하는 포스포리피드 나노입자로서,
    상기 나노입자는
    1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DPPE-PEG2000); 및
    1,2-디팔미토일-3-트리메틸암모늄-프로판(DPTAP)을 포함하고,
    상기 DPPE-PEG2000 및 DPTAP의 비율은 1:1 내지 1:4(중량비)인,
    내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자에 아마씨유 또는 콩기름을 추가로 포함하는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 표면에 양이온성 전하를 갖는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 150 내지 250nm의 크기를 가지는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 0.25mg/mL 내지 0.5mg/mL의 최대 안전 용량(maximal safe dose)을 가지는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 정원창(round window membrane)을 투과하여 유모세포 또는 코르티 기관에 약물을 전달하는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 내이 질환 치료 치료 또는 예방용 약물은 덱사메타손, 스테로이드, 이뇨제, 혈관확장제, 베타히스티딘, 전정억제제, 덱스트란, 만니톨 또는 헤파린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 내이 질환은 이명, 현기증, 난청, 감각신경성 난청, 만성 이통, 외림프 누공, 이차 내림프수종, 미로염 및 전정 신경염, 청신경종, 내이독성, 자가면역성 내이 질병(AIED) 및 메니에르병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인, 내이-특이적 약물전달용 나노입자.
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