KR102017676B1 - 익상편 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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이근욱
김혜인
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연세대학교 원주산학협력단
한림대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 저해제를 유효성분으로 포함하는 익상편 질환 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에서 mTORC2Akt/mTORC1 축 저해는 HPF에서 근섬유아세포 분화 및 ECM 합성을 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타내었고, 이러한 것은 기질(stromal) 섬유아세포로 재발성 익상편을 억제하기 위한 수술 후 어쥬번트 치료용 유망한 후보 약제로 사용될 수 있을 것이다.

Description

익상편 예방 및 치료용 조성물{A composition for preventing and treating pterygium}
본 발명은 익상편 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
익상편은 주로 안구의 내측 결막(흰자위)에서부터 각막(검은동자)쪽으로 섬유혈관 조직이 증식되어 침범하고 진행하는 질환을 말한다. 익상편이 진행되면 외관상 보기가 좋지 않을 뿐만 아니라, 심한 경우에는 동공까지 침범하여 시력장애를 유발할 수 있다.
익상편의 원인은 아직까지 확실하게 밝혀지지는 않았으나 유전적요인과 자외선, 바람, 먼지 등에 의한 자극이 익상편의 발생과 진행에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
종래 익상편에 의한 여러 증상의 호전을 위해 약물, 예를 들면 충혈제거제, 항염증 안약을 투여하였으나 이는 익상편 자체를 완전히 치료할 수 없다는 문제가 있다.
따라서, 익상편이 심하게 진행하여 동공근처까지 침범한 경우에는 시력보호를 위해 외과적 수술로 제거하는 방법이 시도되어 왔다. 외과적 수술은 국소마취후 20 ~ 30 분 정도의 시술에 의해 완료가 되나 통증과 이물감을 수반하며 1개월간 간헐적인 통원치료가 요구된다.
익상편의 수술 자체는 상술한 바와 같이 간단하지만 수술 후의 재발이 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. 제거수술이 매우 성공적이었다고 하더라도 평균 30%이상 최대 70%까지 재발될 정도로 그 재발률이 높은 것으로 알려져 있다.
익상편의 재발을 방지하기 위해 결막자가이식, 화학요법등의 방법들이 시도되어오고 있다. 결막자가이식은 익상편 조직을 절제한 부위에 환자의 건강한 결막을 절제하여 봉합하는 것으로 일종의 피부이식과 유사한 방법이고, 화학요법은 약물에 의존하여 재발을 방지하는 방법이다.
그러나, 이들 방법에 의한 익상편 재발률은 여전히 만족할 만한 수준은 아니다.
[선행 특허 문헌]
대한민국 특허 공개특허 10-2008-0104593
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 익상편 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 저해제를 유효성분으로 포함하는 익상편 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 저해제는 토린(torin)-2 또는 라파마이신인 것이 바람직하고, 상기 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 저해제는 토린(torin)-2인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 토린(torin)-2를 유효성분으로 포함하는 익상편 섬유아세포의 근섬유아세포 분화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 익상편 섬유아세포는 TGF-베타1에 의하여 활성화된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 토린(torin)-2를 유효성분으로 포함하는 익상편 섬유아세포 증식 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 익상편 섬유아세포는 에팝토시스가 일어나지 아니하고, 세포증식억제(cytostatic) 효과를 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 토린(torin)-2를 인 비트로에서 익상편 섬유아세포에 처리하여 상기 섬유아세포에서 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 1 및 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 2 활성을 모두 저해하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 토린(torin)-2를 유효성분으로 포함하는 익상편 섬유아세포의 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 1 및 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 2 활성 저해용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 단백질 카이네이즈 B(Akt) 저해제를 유효성분으로 포함하는 익상편 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 카이네이즈 B(Akt) 저해제는 MK2206인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 2 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 익상편 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 안과용 제형에 관한 것이다. 본원에서 사용된 "안과용 제형" 은 안구 투여, 즉 눈에 투여하기에 적합한 어떠한 약제학적 조성물이라도 나타낸다.바람직하게는, 안과용 제형은 눈에 대한 국소 투여에 적합하지만, 안과용 제형은 초자체내 주사(intravitreous injection) 또는 결막하 주사(subconjunctival injection) 등의 기타 투여 경로용 조성물로서 제형화될 수 있다. 예시적이고 비제한적인 예로서, 국소 투여에 적합한 안과용 제형은 액체, 예를 들면, 현탁제 또는 용제; 크림; 연고; 겔; 겔 형성 액체; 리포솜 또는 마이셀을 함유하는 현탁제; 분무 제형; 에멀젼; 눈의 맹낭(cul-desac)으로 삽입될 수 있는 부식성 또는 비부식성 담체의 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 안과용제형은 액상 현탁제이다.
본 발명의 양태에 따라, 안과용 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제의 예는 이들로 제한되지는 않지만, 계면활성제, 보존제, 점도 조절제, pH-활성 성분(예: pH 조절제, 완충제 등), 안정제 및 삼투 조절제(긴장성 조절제(tonicity adjusters))를 포함한다.
본 발명에 따르는 안과용 제형에 사용될 수 있는 적합한 계면활성제는 이들로 제한되지는 않지만, 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 오일, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르,폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 지방산, 글리세릴 지방산 에스테르, α-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트(α-tocopheryl polyethylene glycol succinate, TPGS), 폴리에톡시 알킬아릴 에테르 중합체, 알킬아릴 폴리에테르 알콜의 중합체 등을 포함한다. 바람직하게는, 계면활성제는 트윈(Tween) 80, 트윈 20, 폴록사머(poloxamer) 188, 폴록사머 407 또는 티록사폴을 포함한다.
본 발명에 따르는 안과용 제형에 사용될 수 있는 적합한 점도 조절제는 이들로 제한되지는 않지만, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(hydroxypropyl methylcellulose, HPMC), 하이드록시프로필셀룰로스(hydroxypropylcellulose, HPC), 카복시메틸셀룰로스(carboxymethylcellulose, CMC), 메틸셀룰로스 (methylcellulose, MC), 하이드록시에틸셀룰로스(hydroxyethylcellulose, HEC), 셀룰로스 및 이들의 유도체,폴리카보필(Polycarbophil), 폴리옥시에틸렌 글리콜(polyoxyethylene glycol, PEG), 히알루론산(hyaluronic acid, HA), 아밀라제 및 이의 유도체, 아밀로펙틴 및 이의 유도체, 덱스트란 및 이의 유도체, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol, PVA), 및 아크릴 중합체, 예를 들면, 하이드록시메틸 메타크릴레이트(hydroxylmethyl methacrylate, HEMA), 카보머(Carbomer) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 폴리아크릴산 또는 폴리메타크릴산의 유도체를 포함한다.
본 발명에 따르는 안과용 제형에 사용될 수 있는, 적합한 pH 활성 성분, 예를 들면, 완충제 또는 pH 조절제는 이들로 제한되지 않지만, 산, 예를 들면, 붕산, 시트르산, 염산 및 이의 염; 알칼리 금속염, 예를 들면, 인산이나트륨, 인산일나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 수산화나트륨 및 인산칼륨을 포함한다.
본 발명의 양태에 따르면, 안과용 제형의 pH는 약 5.0 내지 8.0, 예를 들면, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 또는 8.0으로 변화할 수 있다. 바람직하게는, pH는 약 6.0 내지 7.5이다.
본 발명에 따르는 안과용 제형에 사용될 수 있는 보존제는, 이들로 제한되지는 벤즈알코늄 클로라이드, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 벤조도데시늄 브로마이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 티오메르살, 클로로부탄올,벤질 알콜, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알콜, 소르브산, 메틸 및 프로필 파라벤, 클로르헥시딘 디글루코네이트,EDTA, 폴리쿠아드(polyquad), 푸라이트(purite), 퍼보레이트계 보존제(perborate-based preservatives), 기타 수은 화합물, 아연 폴리올 착체 또는 이들의 화합물을 포함한다.
본 발명의 양태에 따라, 안과용 제형 중의 mTOR 억제제의 농도는 약 0.01 내지 약 10% w/v, 예를 들면, 0.01%, 0.03%, 0.05%, 0.1%, 0.3%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%의 범위이다.
본 발명의 양태에 따르는 피검체에 대한 안과용 제형의 투여량, 투여 빈도수, 투여 기간 등의 파라미터는 어떠한 특정 방식으로라도 제한되지 않는다. 이러한 파라미터들의 최적 값은 다양한 인자, 예를 들면, 치료되는 피검체, 치료되는 특정 안구 표면 질환, 질환의 중증도 등에 좌우될 수 있고, 당업자는 목적하는 치료적 또는 임상적 결과를 달성하기 위하여 이러한 파라미터에 대한 최적 값을 측정한다. 예를 들면, 안과용 제형은 1일 1회, 보다 바람직하게는 1일 1회 초과, 예를 들면, 2회, 3회, 4회 등으로 투여될 수 있다. 예시적인 비제한적 투약 양생법은 안과용 제형을 1 내지 2주의 기간 동안 1일 3회 점안제로서 투여함을 포함한다
이하, 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 본 발명자들은 인간 익상편 섬유아세포(human pterygium fibroblasts; 이하, 'HPFs'라 함)에서 mTOR(mammalian target of rapamycin)의 역할 및 HPFs의 근섬유아세포 형성에 대한 mTOR 복합체의 상대적인 기여를 조사하였다.
본 발명에서는 HPFs의 전섬유화(Profibrotic) 활성화는 TGF-β1에 의하여 유도되고, aSMA 및 fibronectin를 포함하는 섬유화 마커의 발현을 Western blotting, qRT-PCR 및 면역형광 분석으로 측정하였고, HPFs를 rapamycin 및 torin2와 같은 mTOR 저해제, 또는 Akt 저해제 MK2206로 처리하고, αSMA 및 fibronectin의 유도에 대한 mTOR 저해의 효과를 조사하였다. 세포 주기 및 에팝토시스를 flow cytometry로 분석하고, 이동(migration) 어세이를 scratch-wound 어세이를 채택하여 수행하였다.
mTORRC1 및 2 partner인 siRNAs 타겟팅 Raptor 및 Rictor를 HPFs의 섬유화 활성화에 대한 각 mTOR 복합체의 영향을 결정하는데 사용하였다. 활성화된 HPFs의 수축 표현형(Contractile phenotype) Collagen gel contraction 어세이에 의하여 평가하였다.
이러한 실험을 통하여 본 발명은
mTOR 복합체의 활성은 정상 결막(conjunctiva)에 비하여 HPFs에서 더 높았다. mTOR 활성 부위 저해제 torin2는 mTORC1 및 mTORC2 모두를 HPFs에서 억제하는데 충분하였고, TGF-β1에 의하여 유도된 αSMA 및 fibronectin의 발현을 현저하게 저해하였다., 반면, allosteric mTOR 저해제 rapamycin mTORC1 활성을 부분적으로 저해하였고, 섬유화 마커들의 유도에 대한 효과를 야기한다. mTOR 저해는 에팝토시스 촉발없이 HPFs의 증식 및 이동을 약화시켰다. 또한, αSMA 및 fibronectin의 유도는 siRNA-매개된 Rictor의 넉다운에 의하여 실질적으로 방해된 반면에 siRNA 타겟팅 Raptor에 의하여 상대적으로 적당하게 영향을 받았다.
Collagen gel contraction 어세이는 torin2가 TGF-β1-유도된 HPFs의 수축 능력을 rapamycin에 비하여 더 효과적으로 억제하는 것을 보여주었다. 생화학적 및 기능적 분석에 기반하면, mTOR 저해의 항섬유화 효과는 Akt 저해가 torin2 또는 siRNA 타겟팅 Rictor의 HPFs의 활성화에 대한 효과를 모방하기 때문에, mTORC2-Akt 신호전달 축과 관련이 있는 것 같다.
이러한 본 발명을 통하여, mTOR HPFs의 신호전달은 전섬유화(Profibrotic) 활성화를 촉진하고, mTORC2-Akt-축은 TGF-β1-유도된 근섬유아세포 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 결과는 익상편 및 다른 섬유화성 질환을 치료하기 위한 신호전달 컴포컨트를 타겟팅하는 신규한 치료 전략의 개발을 위한 새로운 지평을 열었다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
인간 익상편에서 mTOR 신호전달의 과활성화(Hyperactivation)
mTOR 신호전달이 인간 익상편에 관여하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 mTOR 활성을 HPFs와 결막밑 섬유아세포 사이에서 비교하였다.
mTORC1의 활성화는 4E-BP1, 및 S6K1를 조절하여 단백질 합성을 촉진하고, 그것의 활성화는 ribosomoal S6 단백질의 인산화를 야기한다(도 1A). 도 1B에 나타낸 것과 같이, S6K1, S6 및 4E-BP1의 인산화는 결막밑 섬유아세포와 비교하여 HPFs에서 크게 증가하였다. mTORC2는 NDRG1를 타겟하는 SGK1 및 Akt의 소수성 모티프, PKC isoforms를 인산화한다(도 1A). mTORC2 활성은 HPFs에서 증가된 인산화의 Akt 및 NDRG1에 의하여 나타낸 것과 같이 대조군 섬유아세포에 비하여 더 높았다(도 1B). 이 결과들은 익상편 및 결막 조직을 사용한 면역조직화학 분석에 의하여 확인하였다. 따라서, 본 데이터들은 mTORC1 및 mTORC2 활성이 인간 정상 결막조직에 비해 익상편에서 증가되어 있다는 것을 의미한다.
ATP-competitive TOR 저해제 Torin2는 익상편 섬유아세포의 TGF - α1 -induced 근섬유아세포 분화를 억제함
다음 본 발명자들은 익상편의 섬유화 활성에 대한 mTOR 신호전달을 억제하는 효과를 mTOR 저해제 Torin-2 및 Rapamycin을 사용하여 테스트하였다. 본 발명자들이 HPFs를 TGF-β1로 활성화할 때, 본 발명자들은 근섬유아세포 분화의 지표인 alpha-평활근 액틴(α-SMA) 및 EDA-FN(fibronectin containing extra domain A ) 및 fibronectin (FN)과 같은 ECM 단백질의 발현 유도를 관찰하였다(도 2).
ATP 경쟁적 mTOR 저해제인 Torin-2는 TGF-β1에 의해 활성화된 HPFs에서 α-SMA, FN 및 EDA-FN의 발현 유도를 억제하는데 충분하였다(도 2A). 중간엽 섬유아세포에 대한 마커인 vimentin의 발현은 mTOR 저해에 의하여 영향이 없었다.
α-SMA (ACTA2), FN (FN1), EDA-FN, 및 type 1 collagen (COL1A1)을 코딩하는 mRNAs의 레벨은 Torin-2 처리에 의하여 현저하게 감소하였고, 이것은 mTOR 신호전달 경로에 의하여 섬유화 마커의 전사 조절을 시사한다(도 2B).
반면에, allosteric mTOR 저해제 rapamycin은 근섬유아세포 마커들 및 ECM 단백질의 유도에 대한 미미한 효과를 나타내었다(도 2A & B). Torin-2가 Rapamycin에 비하여 TGF-β1-유도된 α-SMA 및 FN의 발현을 더 강하게 저해한다는 면역형광 염색에서도 확인하였다(도 2C & D). 이 결과들은 mTOR 신호전달이 α-SMA 및 ECM 단백질의 유도를 HPFs에서 촉진하고, mTOR 복합체의 익상편 섬유아세포의 근섬유아세포 분화에서 상대적인 기여를 시사한다.
Torin -2는 근섬유성 세포로 기활성화된 HPFs의 α- SMA와 fibronectin 단백질을 감소시킴
HPFs 세포를 추출한 조직과 계대배양 상태에 따라 근섬유성 세포로 기활성화된 HPF에 대한 mTOR 저해의 효과를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 높은 수준의 α-SMA 및 FN 단백질 발현을 나타내는 배치의 HPF 세포에 Torin-2 및 Rapamycin으로 처리하였다. α-SMA 및 FN 단백질의 기준 레벨은 Torin-2에 의하여 용량의존적으로 감소하였다.
mTOR 저해제들은 익상편 섬유아세포의 증식을 억제하지만 세포 사멸을 유도하지 않음
Torin-2와 같은 mTOR 저해제들은 HPFs의 근섬유성 활성화를 억제할 수 있다. 그러나, 약화된 섬유성 단백질의 유도는 mTOR 저해의 세포사멸 또는 세포증식억제(cytostatic) 효과를 야기할 수 있다. 발명자들이 HPFs의 생존률을 평가할 때, 본 발명자들은 Torin-2 처리로 유의하게 감소된 생존 세포를 관찰하였고, Rapamycin은 Torin-2에 비해 상대적으로 낮은 생존률 감소 효능을 나타내었다(도 3A).
Annexin-V 염색 기법을 이용하여 Torin-2 및 Rapamycin의 처리가 테스트된 농도에서 HPFs의 에팝토시스의 유도하지 않음을 입증하였다(도3B). mTOR 저해의 증식률에 대한 효과를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 HPFs를 EdU, thymidine 유사체인 EdU를 처리하고 유세포분석법을 사용하여 EdU의 지노믹 DNA로의 삽입을 측정하였다. 도3C 및 D에서 알 수 있는 바와 같이, 비록 rapamycin이 Torin-2에 비하여 상대적으로 약한 효능이지만 mTOR 저해제들은 EdU 업테이크의 능력을 크게 약화시켰다. 따라서, 데이터는 인간 익상편 섬유아세포에 대한 세포사멸 효과가 아니라 세포증식억제(cytostatic) 효과를 나타낸다.
mTOR 저해는 익상편 세포의 근섬유성 활성화에 의하여 매개된 콜라겐 젤 수축 및 세포 이동을 저해함
많은 섬유화성 질환들은 중증 또는 반복적인 상처 힐링 과정과 관련된다. HPF 세포로 전형적인 scratch-wound 어세이를 사용하여, 본 발명자들은 TGF-β1이 갭의 중앙으로 성장 및 세포 이동에 의하여 상처 갭의 힐링을 촉진하는 것을 관찰하였다 (도 4).
그러나, mTOR 신호전달의 HPFs를 Torin-2 또는 Rapamcyin으로 처리에 의한 저해는 상처 부위의 힐링 속도를 현저하게 늦추었다(도 4). mTOR 저해제로 처리된 HPF의 손상된 상처 힐링은 mTOR 신호전달이 증식 및 익상편 섬유아세포의 이동을 촉진한다는 것을 암시한다.
근섬유아세포의 기능적 특성에 대한 관찰을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 콜레겐 젤 수축 어세이를 수행하고, 근섬유아세포 수축성(contractility)의 모델 시스템인 3차원 콜라겐 격자의 수축 정도를 조사하였다.
도 5에서 알 수 있는 바와 같이, HPF-충진된 콜라겐 젤의 TGF-β1 처리는 콜라겐 디스크의 젤 부위를 점차적으로 감소시켰다. 본 발명자들이 mTOR 저해제들의 HPFs의 수축성 표현형에 대한 효과를 비교할 때, 본 발명자들은 Torin-2가 콜라겐 디스크가 TGF-β1-유도된 수축을 효율적으로 억제하는 것을 관찰하였다(도 5).
섬유화성 마커들과 ECM 단백질들의 유도에 대한 생화학적 데이터와 종합하면, 이들 결과들은 익상편 섬유아세포의 섬유화성 기능 및 근섬유화성 분화에서 mTOR 신호전달 구성요소의 중요한 역할을 제시하였다.
mTORC2 - Akt 신호전달은 TGF - β1에 의한 익상편 섬유아세포의 근섬유성 세포로의 활성화를 매개함
mTOR allosteric 저해제 Rapamycin은 Akt 및 NDRG1의 인산화와 같은 mTORC2 활성을 감소시킬 수 없었다(도 6A). 또한 Rapamycin은 HPF에서 S6K1와 S6 단백질의 인산화를 강력하게 억제하지만 다른 mTORC1 기질 단백질 4E-BP1 인산화를 저해하는데 실패하였다(도 6A). 반면에, ATP-competitive mTOR catalytic 저해제 Torin-2는 S6K1 및 4E-BP1의 억제된 인산화 및 Akt 단백질의 S473 인산화의 저해 각각에서 나타낸 것과 같이, HPF에서 mTORC1 및 mTORC2 활성 모두를 효과적으로 억제하였다(도 6A).
다음으로 본 발명자들은 mTOR 저해제들이 HPF 세포에서 TGF-β 수용체들에 의하여 매개되는 전형적인 신호전달에 영향을 주는지를 테스트하였다. Torin-2 및 rapamycin 모두는 TGF-β 수용체 신호전달의 기질 Smad2/3 단백질들의 TGF-β1에 의해 유도된 인산화를 저해하지 않았다(도 6B).
이 결과는 HPFs의 섬유화성 활성에 대한 관찰된 억제 효과는 전형적인 TGF-β 신호전달에 대한 Torin-2의 저해 활성으로부터 유래한 것 같지 않다는 것을 시사한다. 게다가, 본 데이터는 익상편 섬유아세포의 섬유화성 활성화에 대한 mTOR 신호전달 구성요소의 상대적인 기여를 시사한다.
mTOR 저해제들을 효능을 비교분석한 결과로는, 본 발명자들은 HPFs의 근섬유성 분화에 관여하는 mTOR 복합체 mTORC1 및 mTORC2 각각의 기능을 규명할 수 없었다. 익상편 섬유아세포에서 각 mTOR 복합체의 관여를 더 조사하기 위하여, 본 발명자들은 shRNAs 및 siRNA 이중나선을 사용한 RNA 간섭 방법을 적용하였다. Raptor 및 Rictor의 단백질 양은 HPFs에 Raptor 및 Rictor를 코딩하는 mRNA 타겟팅 siRNA로 트랜스팩션하거나 shRNA로 트랜스덕션할 때 각각 효과적으로 감소하였다. 비록 그 타겟 mRNA의 완전한 결손은 아니지만, 단백질의 감소는 HPF 세포에서 TGF-β1에 의해 유도되는 α-SMA 및 FN 발현을 현저하게 저해하였다(도7A & B). 반면, HPFs로부터 Raptor 결손은 α-SMA 및 FN 단백질 발현 유도를 약화시켰지만, Rictor를 결손하는 것에 비해 낮은 효능을 나타내었다(도 7A &B). 이 데이터는 mTORC2 신호전달이 익상편 섬유아세포의 섬유화성 프로그램에 관련된다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 Akt 저해제 MK2206를 사용한 익상편 섬유아세포의 근섬유성 분화에서 Akt의 필요를 조사하였다. Akt 저해제는 Akt 단백질 S473의 인산화에 대한 강력한 저해 효과를 용량의존적으로 나타내었고, 이것은 HPF 세포에서 TGF-β1에 의한 α-SMA 및 FN의 발현 유도 감소와 관련되었다(도 7C & D). 전체적으로, 본 데이터는 익상편 세포의 TGF-β1에 의해 유도된 근섬유성 활성화를 조절하는 mTORC2-Akt 신호전달의 중요성을 강조한다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 mTORC2Akt/mTORC1 축 저해는 HPF에서 근섬유아세포 분화 및 ECM 합성을 감소시키는데 효과적이라는 것을 나타내었고, 이러한 것은 기질(stromal) 섬유아세포로 재발성 익상편을 억제하기 위한 수술 후 어쥬번트 치료용 유망한 후보 약제로서 그것의 사용의 기초를 제공할 수 있다.
도 1은 인간 익상편에서 증가된 mTORC1 및 mTORC2 활성을 나타낸 그림.
(A) mTOR 신호 전달 경로의 도식적인 설명.
(B) 인간 익상편 및 결막밑 세포들을 실시예와 같이 배양하고 기재된 항체로 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. α-tubulin 및 비인산화된 단백질의 면역블럭팅을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2는 mTOR 저해는 익상편 섬유아세포에서 ECM 단백질 및 근섬유성 마커들의 TGF-β1-유도된 발현을 억제한다는 것을 나타낸 그림.
HPFs를 Torin-2 및 Rapamycin으로 기재된 농도에서 전처리하고, TGF-β1의 존재 또는 부존재하에서 배양하였다. 48 시간 후, 세포들을 Western blotting (A), 및 실시간 역전사PCR (B)로 분석하였다.
(A) 4 또는 5회 독립적인 실험의 대표적인 면역블럿 및 각 샘플에서 α-tubulin의 것과 표준화된 α-SMA의 상대적인 강도의 평균 (±SEM)를 나타내었다: *, P 값은 0.05보다 적음.
(B) mRNA의 농도를 Actb의 것과 표준화하고 기재된 mRNAs의 상대적인 레벨의 평균(± SD 또는 SEM)을 나타내었다.
α-SMA (C) 및 FN (D)의 발현을 HPFs를 A & B에서와 같이 배양한 후 2일 후 면역염색 및 형광 현미경으로 조사하였다. 세 독립적인 실험이 대표를 나타내었다. 핵을 핵 DNA를 DAPI로 표지하여 관찰하였다.
도 3은 mTOR 저해제들이 익상편 섬유아세포의 증식률을 감소시키지만 에팝토시스를 야기하지 않는다는 것을 나타낸 그림.
(A) HPFs를 Torin-2, Rapamycin 또는 비히클로 48시간 동안 처리하고 세포 생존률을 EZ-Cytox 시약을 사용하여 조사하였다. 데이터를 삼중실험을 수행한 두 독립적인 실험의 O.D. (450nm) 값들의 평균(± SEM)로 나타내었다.
(B) 에팝토틱 세포들을 Annexin-V으로 원형질막의 외막 리플렛 상의 포스파티딜세린을 염색하여 검출하였다. Annexin-V+ 세포의 빈도수로 대표적인 히스토그램으로 나타내었다. 일부 세포들을 양성 대조군으로 mitomycin C로 처리하였다.
(C & D) 세포들을 (A)에서와 같이 배양하고, 실시예와 같이 EdU 업테이크를 어세이하였다. EdU+ 세포의 빈도수로 대표적인 히스토그램을 나타내었다. 세 독립적인 실험으로부터 얻어진 실험 결과를 (D)에서 EdU+ 세포의 평균(± SEM) 퍼센테이지로 요약하였다: *, P 값은 0.05보다 작고; **, P 값은 0.01보다 작다.
도 4는 익상편 섬유아세포의 이동에 대한 mTOR 저해 효과를 나타낸 그림.
HPFs를 컨푸루언스하게 성장시킨 후 역상차 현미경을 사용하여 캡쳐된 이미지로 scratch wound 어세이를 수행하였다.
(A) 기재된 시간 동안 상처 부위의 중앙으로 이동하는 세포의 대표적인 이미지를 나타낸다.
(B) 상처 힐링의 속도를 ImageJ 소프트웨어를 사용한 상처 갭 부위를 정량화(평균 ± SEM)하여 측정하였다. 세 독립적인 실험으로부터 얻어진 상대적인 평균 (± SEM) 스크래치 부위를 나타내었다.
도 5는 mTOR의 익상편 섬유아세포의 수축성 표현형에 대한 저해 효과를 나타낸 그림.
HPFs를 포함하는 콜라겐 젤을 준비하고 TGF-β1 포함 또는 불포함 배지에 위치하였다. 촬영을 기재된 시간에 수행하였고, HPF-매개된 젤 수축을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 콜라겐 디스크의 젤 부위를 정량화하여 측정하였다. 세 독립적인 실험으로부터 얻어진 젤 수축의 상대적인 평균 (± SEM)을 나타내었다. *, P 값은 0.05보다 작고; **, P 값은 0.01보다 작다.
도 6은 mTOR 저해는 익상편 섬유아세포에서 Smad 단백질의 TGF-β1-유도된 인산화에 영향이 없다는 것을 나타낸 그림,
HPFs를 Torin과 Rapamycin으로 30분간 전처리한 후 추가 1시간 동안 TGF-β1로 활성화하였다.
(A) 웨스턴 블럿팅을 mTORC1 및 mTORC2 활성을 측정하기 위하여 도 1에서와 같이 수행하였다.
(B) Smad2/3 단백질들의 인산화를 P-Smad3/4 및 비인산화된 Smad2/3에 대한 항체로 검출하였다. 데이터는 세 독립적인 실험의 대표이다.
도 7은 mTORC2-Akt 신호전달 축의 파괴는 익상편 섬유아세포의 근섬유성 활성화를 강하게 저해한다는 것을 나타낸 그림.
(A) HPFs를 대조군 pGIPZ 벡터와 함께 Raptor 또는 Rictor를 타겟팅하는 shRNAs를 발현하는 렌티바이러스 입자로 감염하였다. puromycin 선택 후, 트랜스덕션된 세포들을 TGF--β1로 48시간 동안 활성화하고 도 2A에서와 같이 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다.
(B) 세포들을 대조군 siRNA와 함께 Raptor 또는 Rictor를 타겟팅하는 siRNAs(small interfering RNA duplexes)로 트랜스팩션하고 TGF-β1로 자극한 후 48시간 후에 면역블럿을 수행하였다(A & B). 두 독립적인 실험의 대표적인 것을 나타내었다. (C) HPFs를 Akt 저해제 MK2206으로 30분 동안 기재된 농도에서 전처리하고 TGF-β1의 존재 하에서 배양하였다. 48 시간 후, 세포들을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 각 샘플에서 α-tubulin의 것과 표준화된 α-SMA 의 상대적인 강도의 평균(± SEM)을 나타내었다: *, P 값은 0.05보다 작다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실험 대상
익상편 및 정상 결막 조직을 익상편 제거 수술을 받은 환자로부터 얻었다. 본 연구 프로토콜은 본 위원회의 Institutional Review Board의 승인을 받았고(YWMR-15-0-053), Helsinki Declaration의 원리에 따라 수행하였다. 본 연구에서 참가자들의 서면의 동의서를 각 환자로부터 받았다.
실시예 1;HPFs의 분리 및 1차 배양
제거된 익상편 샘플을 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Welgene, Gyeongsan, Korea)를 포함하는 1.5 mL 튜브에 저장하고, 즉시 실험실로 운반하였다. 익상편 조직 샘플을 10% 우태아 혈청(FBS) 및 1% antibiotic/antimycotic (Gibco Life technologies)가 보충된 DMEM/F12 medium (Welgene)의 플레이트에 위치시켰다. 조직 배양을 세포가 외식편으로부터 이동하는 동안 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 이동된 세포를 0.25% trypsin (Gibco Life technologies)을 사용하여 해리시키고 5% FBS를 가지는 DMEM에서 배양하였다. 3-5 세포 계대를 모든 실험에 사용하였다. 근섬유아세포 분화를 유도하기 위하여, HPFs를 6-웰 크러스터에 시딩하고 5% FBS 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포들을 mTOR 저해제로 30분간 전처리하고 TGF-베타(2.5 ng/ml, PeproTech, Seoul, Korea)의 존재 또는 부존재 하에서 2일간 배양하였다.
실시예 2:웨스턴 블럿 분석
세포를 Pro-prepTM 단백질 추출 키트(Intron Biotechnology, Korea)를 사용하여 냉장에서 파쇄하고, 단백질 농도를 BCA protein 어세이 키트(Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)로 결정하였다. 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 요약하면, 20 mg의 단백질 파쇄액을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고, PVDF 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 그 막을 1 시간 동안 5% 탈지분유 및 0.05% Tween-20를 포함하는 PBS에서 블럭하고, 1차 항체로 3 시간 동안 배양하였다. 1차 항체는 알파 평활근 액틴(α-SMA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 및 fibronectin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 항체를 제외하고는 모두 Cell signaling Tech (Beverly, MA) 로부터 구입하였다. 항체-반응성 단백질은 적당한 HRP-부착된 2차 항체 및 enhanced chemiluminescence reagent (Amersham Biosciences, Cleveland, OH)로 검출하였다.
실시예 3:정량적인 실시간 PCR (Polymerase Chain Reaction )
HPFs를 상기와 같이 TGF-α1의 존재 또는 부존재하에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 전체 RNA를 was extracted using an RNA 추출 키트(Qiagen, Germany)로 추출하고, 제조업자의 지시에 따라서 LaboPassTM cDNA 합성 키트(Cosmo Genetech, Seoul, Korea)로 cDNA로 역전사하였다. 정량적인 실시간 PCR 반응을 CFX96 Real-Time PCR Detection system (Bio-Rad)을 사용하여 SYBR green PCR 믹스(Applied Biosystems Life Technologies, Foster City, CA)로 수행하였다. 모든 mRNA 정량화는 Actb로 표준화하였다.
실시예 4:면역형광 염색
HPFs를 24-웰 플레이트 내 커버슬립에 위치시키고 상기와 같이 TGF-α1의 존재 또는 부존재 하에서 배양하였다. 48시간 후, 세포를 4% paraformaldehyde로 고정하고, 투과하고, 2% FBS 및 0.1% Tween-20을 포함하는 PBS로 블럭하였다. 그 슬라이드를 2시간 동안 α-SMA 및 fibronectin에 대한 1차 항체로 배양하고, Alexa Fluor 488-부착된 2차 항체(Thermo Fisher Scientific Rockford, IL)로 1시간 동안 배양하였다. 그 커버슬립을 블럭킹 버퍼로 행구고 ProLong Gold Antifade Mountant containing DAPI (ThermoFisher)를 포함하는 ProLong Gold Antifade Mountant로 슬라이드 글라스 상에 마운트하였다. 형광을 LSM 710 laser 스캐닝 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 스캔하였다.
실시예 5:siRNA를 사용한 넉다운 어세이
siRNAs 타겟팅 마우스 Raptor 및 Rictor는 Ambion로부터 구입하였다. HPFs를 6-웰 클러스터 상에 위치시키고, 50 nM siRNA 두프렉스 또는 대조군 siRNA로 Lipofectamine-2000를 사용하여 트랜스펙션하였다. 2 일 후, 세포를 2.5 nM TGF-β로 2일간 활성화하고, 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. 일부 세포들을 Raptor 및 Rictor 에 대한 shRNAs를 발현하는 렌티바이로스 (Thermo Fisher Scientific)로 트랜스덕션하였다. 요약하면, lentiviral 입자를 293-T 패키징 세포의 배양으로부터 모아서 psPAX2, pMD2G, 및 shRNA 플라즈미드 또는 pGIPZ 대조군 벡터로 코트랜스펙션하였다. HPFs를 lentiviral 입자로 10 g/ml polybrene의 존재하에서 감염시키고, 12기간 동안 37℃에서 CO2 배양기에서 배양하였다. 트랜스덕션된 세포를 1 mg/ml puromycin을 첨가시켜 선택하고, 생존 세포를 배양하였다.
실시예 6:생존률 어세이
HPFs를 상기와 같이 mTORC 저해제로 전처리된 웰당 5천 세포의 밀도로 96웰 배양 플레이트에 시딩한 후 TGF-β의 존재 하에서 배양하였다. 48시간 후, 세포를 10 uL EZ-Cytox (DoGEN, Seoul, Korea)으로 제조업자의 지시에 따라 4시간 동안 배양하였다. 세포 생존률을 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 측정하였다. 실험은 각 농도에서 3차 반복 수행하였다.
실시예 7:유동 세포분석법(Flow Cytometry )
에팝토시스 및 증식을 유동 세포분석법에 의하여 측정하였다. HPFs를 mTOR 저해제의 존재 하에서 48시간 동안 배양하였고, PE-부착된 Annenxin-V (BD Biosciences San Jose, CA)로 140 mM NaCl 및 2.5 mM CaCl2 을 포함하는 10 mM HEPES (pH 7.4)에서 상온에서 20 분간 염색하였다. 데이터를 BD FACSCalibur 또는 FACSCanto-II를 사용하여 얻었고, FlowJO 소프트웨어(TreeStar)로 분석하였다. 세포 주기 속도를 측정하기 위하여, HPFs를 배양한 후 변형된 thymidine 아나로그 EdU로 Click-iT EdU Flow Cytometry Kit (Life Technologies)를 사용하여 표지하였다. 12시간 후, 세포를 고정화하고, 투과하고 Alexa Fluor 647-부착된 anti-EdU로 염색하였다. EdU+ 증식 세포의 인시던스를 유동 세포분석법으로 분석하였다.
실시예 8:세포 이동 어세이 (Cell Migration Assay)
HPFs의 이동을 scratch-wound 어세이를 사용하여 평가하였다. HPFs를 3 x 105 cells/웰을 6-웰 배양 플레이트(SPL, Korea)에 시딩하고 무혈청 배지에서 유지하였다. 배양 24 시간 후, scratch wound를 위해서 P200 피펫 팁을 사용하여 세포에 직선을 만든 후, 그 플레이트를 무혈청 배지로 헹구어서 부유된 세포들을 제거하였다. 동일한 세포 부위를 카메라(Canon, Tokyo, Japan)가 구비된 광원 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 40배로 스크래칭 0, 24, 및 48 시간 후 관찰하였다.
실시예 9:컨트랙팅 젤 어세이 (Contracting gel assay)
섬유아세포-충진된 콜라겐 젤을 준비하였다. 요약하면, 24-웰 플레이트를 0.2% BSA로 1시간 동안 미리코팅하였다. Rapamycin, torin 또는 dimethyl sulfoxide (DMSO, 대조군)-처리된 섬유아세포를 DMEM (106/mL)에 재부유하고 중화된 콜라겐 용액(2.3 mL의 세포를 type I 콜라겐, 및 36 uL의 0.1 mol/L NaOH 및 69 uL의 10 X PBS의 혼합물에 첨가하여 제조)에 첨가하여 최종 농도 1.5 x 105 cells/mL 및 1 mg/mL 콜라겐을 만들었다. 그 젤 용액을 4 웰 플레이트(600 uL/웰)에 첨가하고 중합화를 위하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. TGF-β1 (5.0 ng/mL) 처리 96시간 후, 그 젤을 촬용하고, 수축의 정도를 Image J 소프트웨어를 사용하여 표면적을 측정하여 정량화하였다.
본 발명의 데이터는 평균 ± 표준편차(S.D.)로 표현하였다. Mann Whitney 테스트 및 Kruskal Wallis 테스트를 대조군 및 처리군 사이에 유의적인 차이를 조사하는데 사용하였다. P value less than 0.05 보다 적은 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

Claims (12)

  1. 토린(torin)-2를 유효성분으로 포함하는 익상편 질환 치료 및 예방용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
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  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 토린(torin)-2를 인 비트로에서 익상편 섬유아세포에 처리하여 상기 섬유아세포에서 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 1 및 포유류 라파마이신 표적 단백질(mTOR;mammalian target of rapamycin) 복합체(Complex) 2 활성을 모두 저해하는 방법.
  9. 토린(torin)-2를 인 비트로에서 익상편 섬유아세포에 처리하여 상기 익상편 섬유아세포는 에팝토시스가 일어나지 아니하고, 세포증식억제(cytostatic) 효과를 나타나게 하는 방법.

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