KR102016056B1

KR102016056B1 - 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법

Info

Publication number: KR102016056B1
Application number: KR1020180045435A
Authority: KR
Inventors: 박용철; 김태엽; 박해성
Original assignee: 국민대학교 산학협력단
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2019-08-29

Abstract

본 발명은 카모마일(Matricaria recutita)유래 비사보롤((-)-αbisabolol) 합성효소인 MrBBS((-)-α-bisabolol synthase)를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양하여 탄소원으로부터 비사보롤을 생산하는, 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법에 관한 것이다. 이에 의하여 비사보롤의 합성 효소의 유전자를 도입하고, 비사보롤의 전구체인 메발론산의 대사경로에 관여하는 효소의 유전자를 추가로 도입하여 기존의 메발론산의 대사를 강화하며, 아세틸-CoA 합성효소의 유전자를 추가로 도입하여 세포질 내 아세틸-CoA의 생합성을 증가시킬 수 있도록 형질전환 효모를 이용하여 비사보롤을 제조함으로써 환경오염의 문제를 최소화하면서도 제조 수율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING BISABOLOL USING TRANSFORMED YEAST}

본 발명은 비사보롤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 형질전환 효모를 이용하여 탄소원으로부터 비사보롤을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이소프레노이드(isoprenoid)는 탄소수 5개인 이소프렌을 기본 단위로 하는 화합물로서 현재 약 5만 가지 이상의 종류가 알려져 있다. 다양한 이소프레노이드에서 항산화 활성을 보유하고 있는 것이 보고된바 있으며 바이오 식품소재의 원료, 기능성 식품의 원료 및 헬스케어 산업소재로 널리 이용되고 있다. 이소프레노이드계열 물질 중, 비사보롤((-)-α-bisabolol)은 특히 피부를 치유하는 성분과 항자극, 항염증 및 항균 성분이 있다고 알려져 있어, 최근 화장품의 첨가물로 각광을 받고 있다. 현재 비사보롤의 생산은 수목채취 및 화학적 합성를 통해 이루어지고 있는데 공정에 따른 높은 비용 및 환경문제가 대두되고 있어 이를 극복하기 위해 친환경적이고 비용대비 효율이 우수한 기술의 개발이 필요한 실정이다.

현재 대장균(Escherichia coli)를 이용하여 비사보롤을 생산하는 연구가 이미 발표되어 있다. 효모의 일종인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 산과 알코올류에 내성이 높은 균주로 알려져 있어 각종 이소프레노이드 계열 물질 생산의 숙주 균주로 이용하고 있어 유전자 재조합에 따른 형질전환 효모를 이용하여 높은 수준의 비사보롤의 효율적인 생산을 기대할 수 있다.

한국등록특허공보 제10-0823533호

본 발명의 목적은 종래 문제점을 해결하기 위한 것으로, 비사보롤의 합성 효소의 유전자를 도입하고, 비사보롤의 전구체인 메발론산의 대사경로에 관여하는 효소의 유전자를 추가로 도입하여 기존의 메발론산의 대사를 강화하며, 아세틸-CoA 합성효소의 유전자를 추가로 도입하여 세포질 내 아세틸-CoA의 생합성을 증가시킬 수 있도록 형질전환한 효모를 이용하여 비사보롤을 제조함으로써 환경오염의 문제를 최소화하면서도 제조 수율을 향상시킬 수 있는 비사보롤의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면,

카모마일(Matricaria recutita)유래 비사보롤((-)-α-bisabolol) 합성효소인 MrBBS((-)-α-bisabolol synthase)를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양하여 탄소원으로부터 비사보롤을 생산하는 단계를 포함하는, 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법이 제공된다.

상기 효모는 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 및 아르술라(Arxula) 속으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

바람직하게는, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 및 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.

상기 탄소원은 포도당, 과당, 갈락토오스, 맥아당, 설탕 및 젖당으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 MrBBS를 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행될 수 있다.

상기 MrBBS를 암호화하는 유전자는 효모용으로 코돈 최적화된 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 형질전환 효모는 메발론산 대사경로에 관여하는 ERG10(Acetoacetyl-Co-A thiolase)을 암호화하는 유전자 및 tHMG1(HMG-CoA reductase)을 암호화하는 유전자 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 도입할 수 있다.

상기 ERG10 단백질을 암호화하는 유전자 및 tHMG1 단백질을 암호화하는 유전자 의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행될 수 있다.

상기 형질전환 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 ACS1(acetyl-CoA synthase 1)를 암호화하는 유전자를 추가로 도입할 수 있다.

상기 ACS1(acetyl-CoA synthase 1)을 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행될 수 있다.

상기 배양은 YPD 배지 또는 YPDG 배지에서 수행될 수 있다.

상기 배양 전에 배지에 알칸(alkane)을 추가로 투입할 수 있다.

상기 알칸은 C9 내지 C12 알칸으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 배양은 회분식 배양 또는 유가식 배양에 의해 수행될 수 있다.

상기 배양은 유가식 배양에 의해 수행될 수 있다.

상기 유가식 배양은 pH 4.5 내지 6의 조건에서 수행될 수 있다.

상기 비사보롤의 제조방법은 발효부산물로 에탄올이 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 피부질환은 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 땀띠, 진무름, 및 건선으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 오일제, 왁스제, 유탁액제, 현탁액제, 겔제 및 에어로졸제로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 피부미백 또는 탄력개선용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 피부미백 또는 탄력개선용 화장료 조성물은 스킨, 유액, 에센스, 앰플, 로션, 미용액, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 건강 기능성 식품 조성물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법은 비사보롤의 합성 효소의 유전자를 도입하고, 비사보롤의 전구체인 메발론산의 대사경로에 관여하는 효소의 유전자를 추가로 도입하여 기존의 메발론산의 대사를 강화하며, 아세틸-CoA 합성효소의 유전자를 추가로 도입하여 세포질 내 아세틸-CoA의 생합성을 증가시킬 수 있도록 형질전환 효모를 이용하여 비사보롤을 제조함으로써 환경오염의 문제를 최소화하면서도 제조 수율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법에 대한 기술을 확보함으로써 업스트림(upstream)에서 다운스트림(downstream)까지 일련의 바이오 및 발효공정기술에 강점을 보유하여 향후 화장품, 식품 및 헬스케어 산업에 응용될 수 있으며, 유전공학, 단백질공학, 대사공학, 발효공학, 시스템생물공학 기술의 융합으로 부가가치 창출에 활용될 수 있다.

도 1은 재조합 효모 DtEMA 균주 내 비사보롤 생산 대사경로를 나타낸 것이다.
도 2는 비사보롤 생산 재조합 효모를 구축하는데 사용한 클로닝 벡터의 모식도이고, A)는 pRS423GPD_tHMG1, B)는 pRS423TEF_ERG10, C)는 pRS425GPD_MrBBS, D)는 pRS426HXT_ACS1 이다.
도 3은 야생형 효모 S. cerevisiae D452-2를 다양한 농도의 비사보롤을 첨가한 YP+20 g/L 포도당 배지에서 생장력 테스트를 실시한 결과이다.
도 4는 MrBBS의 유전자서열을 S. cerevisiae 의 코돈 용법(usage)에 맞추어 코돈 최적화를 실시한 서열번호 1의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 5a는 실시예 1에 따른 포도당 50 g/L, 100rpm 조건에서 DM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 실시예 1에 따른 포도당 100 g/L, 100rpm 조건에서 DM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 실시예 1에 따른 포도당 50 g/L, 200rpm 조건에서 DM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5d는 실시예 1에 따른 포도당 100 g/L, 200rpm 조건에서 DM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 실시예 2에 따른 DM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 실시예 2에 따른 DEM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 실시예 2에 따른 DtM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6d는 실시예 2에 따른 DtEM균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 실시예 2에 따른 DtEMA균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 6f는 실시예 2에 따른 DtEMAA균주의 회분식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 실시예 3에 따른 DtEMA균주의 유가식 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 실시예 3에 따른 DtEMAA균주의 유가식 배양 결과를 나타낸 것이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다.

그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 용어 "벡터"란 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

도 1은 본 발명의 형질전환 효모 중 하나인 MrBBS, ERG10, tHMG1, ACS1를 암호화하는 유전자를 도입한 형질전환 효모 균주(DtEMA) 내 비사보롤 생산 대사경로를 나타낸 것이다. 이하, 도 1을 참고하여 본 발명의 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.

본 발명의 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법은 카모마일(Matricaria recutita)유래 비사보롤((-)-α-bisabolol) 합성효소인 MrBBS를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양하여 탄소원으로부터 비사보롤을 생산하는 것을 특징으로 한다.

상기 효모는 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula) 등의 속의 효모일 수 있다.

바람직하게는, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans) 등일 수 있다.

더욱 바람직하게는, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 일 수 있다.

상기 탄소원은 포도당, 과당, 갈락토오스, 맥아당, 젖당 등인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 포도당을 사용할 수 있다.

상기 형질전환 효모는 메발론산 대사경로에 관여하는 ERG10(Acetoacetyl-Co-A thiolase)을 암호화하는 유전자 및 tHMG1(HMG-CoA reductase)을 암호화하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 도입하는 것이 바람직하다. 상기 ERG10와 tHMG1는 효모에 존재하는 것이나 이를 암호화하는 유전자를 추가로 도입하여 과발현시킴으로써 비사보롤의 전구체인 메발론산의 대사경로를 강화하고 최종적으로 비사보롤의 생산효율을 향상시킬 수 있다. ERG10와 tHMG1는 메발론산 대사경로에서 피드백 저해(feedback inhibition)를 억제하여 대사경로를 강화하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 형질전환 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 ACS1(acetyl-CoA synthase 1)를 암호화하는 유전자를 추가로 도입하는 것이 바람직하다. ACS1를 암호화하는 유전자를 추가로 도입하여 과발현 시킴으로써 세포질 내 아세틸-CoA의 합성량을 높여 최종적으로 비사보롤의 생산성을 증대시킬 수 있다.

상기 MrBBS, ERG10, tHMG1, ACS1를 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, YAC 등의 벡터에 의해 수행될 수 있으나, 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않으며 진핵 생물에 적용될 수 있는 다양한 벡터가 사용될 수 있다.

참고로, 효모에피솜유사플라스미드(YEp, Yeast episomal plasmid)는　S. cerevisiae에서 분리한 플라스미드를 적절히 가공하여 만든 것이다. S. cerecisiae는 진핵세포지만 플라스미드를 갖는 것을 특징으로 한다. 대략 6kb 정도의 크기로, 효모 내에서 독자적으로 존재하며 플라스미드와 동일한 패턴을 보이지만, 복제 수가 매우 높다.　 또한, 효모편입형플라스미드(YIp, Yeast integrative plasmid)는 Yep 보다 훨씬 큰 벡터로, 처음에는 원형의 플라스미드 형이지만 효모의 유전체 안에 삽입되어 발현되는 벡터이다. 또한, 인공효모염색체(YAC, Yeast atificial chromosomes)는 효모 내에서 하나의 완전한 유전체로 기능할 수 있는 거대한 벡터이다.

상기 배양은 YPD 배지 또는 YPDG 배지에서 수행될 수 있으나 본 발명의 범위가 여기에 한정되지 않는다.

상기 알칸은 C9 알칸 내지 C12 알칸으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 배양은 회분식 배양 또는 유기식 배양에 따라 수행될 수 있으나, 유가식 배양으로 수행하는 것이 비사보롤 생산율을 더욱 높일 수 있다.

유가식 배양으로 수행되는 경우 pH 4.5 내지 6의 조건에서 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pH 5.0 내지 5.3의 조건에서 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 피부미백 및 탄력개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 비사보롤을 포함하는 피부미백 및 탄력개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 피부질환은 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 땀띠, 진무름, 건선 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기의 화장료 조성물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있으며, 이러한 배합 성분으로서는 물, 유분, 계면활성제, 보습제, 점증제, 방향제, 보존제, 중화제, 에몰리언트제, 피부보호제 및 피부컨디셔닝제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상 사용되는 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있으며, 그 예로 스킨, 유액, 에센스, 앰플, 로션, 미용액, 바디로션, 바디젤, 바디에센스, 바디세정제, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징 겔, 팩, 마사지크림, 마사지겔, 영양크림, 수면크림 및 수분크림으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 비사보롤을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 신체 부위에 따라 그 제형이 특별히 한정되지 않으며, 당업계의 공지기술을 참조하여 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 액제, 연고제, 크림제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 오일제, 왁스제, 유탁액제, 현탁액제, 겔제 또는 에어로졸제 등 형태로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 통상적인 첨가제, 예를 들어 보존제, 의약 침투를 보조하는 용매, 연고 및 크림의 경우 연화제 등을 포함할 수 있으며, 에탄올 또는 올레일 알코올과 같은 통상적 담체를 함유할 수 있다

또한, 본 발명은 상기 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법을 포함하는 피부질환 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 비사보롤을 포함하는 피부질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 피부질환은 여드름, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 땀띠, 진무름, 및 건선 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 빵류 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 본 발명의 식품조성물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 식품조성물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 건강기능식품이란, 본 발명의 비사보롤을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 본 발명의 식품 조성물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 들어 구체적으로 설명하도록 한다.

[실시예]

제조예 1: 유전자 재조합 플라스미드 제조

아래의 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 클로닝에 필요한 DNA 절편을 증폭하였다.

프라이머	시퀀스(5’ to 3’)
ALD6 forward primer	CGCGGATCCATGACTAAGCTACACTTTGACACT
ALD6 reverse primer	CCGCTCGAGTTACAACTTAATTCTGACAG
ACS1 forward primer	CCGGAATTCATGTCGCCCTCTGCCGTACA
ACS1 reverse primer	CCGCTCGAGTTACAACTTGACCGAATCAA
tHMG1 forward primer	GGACTAGTAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGAAAACT
tHMG1 reverse primer	CCGCTCGAGTTAGGATTTAATGCAGGTGACG
ERG10 forward primer	CGGGATCCATGTCTCAGAACGTTTACATTGTAT
ERG10 reverse primer	CCGCTCGAGTCATATCTTTTCAATGACAATAGAG
MrBBS forward primer	ATTGTCTCATGAGCGGATAC
MrBBS reverse primer	GCGTTATCCCCTGATTCTGT
Forward_gRNA primer	CTGGTAGTTGCACAGAAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Reverse_gRNA primer	TCTTTCTGTGCAACTACCAGCGATCATTTATCTTTCACTGCGGA
SacI primer	CGAGCTCTCTTTGAAAAGATAATGTAT
KpnI primer	GGGGTACCAGACATAAAAAACAAAAAAA
dDNA forward primer	AAAAGAGAAGAAAAAAGAGAAGAAATGAATTCTATTATGATAGCGAATGCAATTAACCCTCACTAAAGGGA
dDNA reverse primer	TGCTGGTTGCCTTATTAATTTATATGGAAGACGAGATAATTCATTAATTAGTAATACGACTCACTATAGGGC
Confirmation forward primer	AATGAATTCTATTATGATAGCGAATGC
Confirmation reverse primer	CACAGGATTTACGAAGACC

이후, pRS423GPD, pRS425GPD, pRS426GPD 플라스미드를 기반으로 ERG10, tHMG1, MrBBS 유전자가 도입된 플라스미드를 아래의 표 2과 같이 구축하였으며, 비사보롤 생산 재조합 효모를 구축하는데 사용한 클로닝 벡터의 모식도를 도 2에 나타내었다.

플라스미드	특징	구분
pRS423GPD	외래 유전자를 플라스미드 형태고 과발현하기 위한 벡터로 GPD promoter를 포함	공벡터
pRS423GPD_tHMG1	S. cerevisiae 유래의 tHMG1 유전자를 함유한 pRS423TEF	재조합 벡터
pRS423TEF	외래 유전자를 플라스미드 형태고 과발현하기 위한 벡터로 TEF promoter를 포함	공벡터
pRS423TEF_ERG10	S. cerevisiae 유래의 ERG10 유전자를 함유한 pRS423TEF	재조합 벡터
pRS425GPD	외래 유전자를 플라스미드 형태로 과발현하기 위한 벡터로 GPD promoter를 포함	공벡터
pRS425GPD_MrBBS	MrBBS 염기서열을 함유한 pRS425GPD	재조합 벡터
pRS426HXT	외래 유전자를 유전체에 삽입시키기 위한 벡터로 HXT promoter를 포함	공벡터
pRS426HXT_ACS1	S. cerevisiae 유래의 ACS1 유전자를 함유한 pRS423TEF	재조합 벡터
pRS426GPD	외래 유전자를 유전체에 삽입시키기 위한 벡터로 GPD promoter를 포함	공벡터
pRS426GPD_ALD6	S. cerevisiae 유래의 ALD6 유전자를 함유한 pRS423TEF	재조합 벡터
pRS426GPD_ALD6_ACS1	S. cerevisiae 유래의 ACS1, ALD6 유전자를 함유한 pRS423TEF	재조합 벡터
pRS414TEF-Cas9	Cas9 endonuclease 효소를 발현하는 벡터	재조합 벡터
p42H_gRNA_CS6	효모 내 guide RNA를 발현하는 벡터	재조합 벡터
pBHA_MrBBS	효모용으로 코돈최적화된 MrBBS 유전자가 삽입되어 있는 벡터	재조합 벡터

제조예 2: 형질전환 효모 균주 제조

제조예 1에 따라 구축된 재조합 플라스미드를 도입한 형질전환 효모 균주를 아래의 표 3과 같이 제조하였다.

재조합 균주	특징
D	야생형 효모 S. cerevisiae D452-2 (모균주)
Dt	D + tHMG1 발현카세트를 유전체 내로 도입한 균주
DM	D + pRS425GPD_MrBBS
DEM	D + pRS423TEF_ERG10 + pRS425GPD_MrBBS
DtM	Dt + pRS425GPD_MrBBS
DtEM	DtM + pRS423TEF_ERG10
DtEMA	DtEM + pRS426HXT_ACS1
DtEMAA	DtEM + pRS426GPD_ALD6_ACS1

Bisabolol 농도별 함유 배지에서 S. cerevisiae 의 생존력 시험

S. cerevisiae 균주가 최종생산물질인 비사보롤에 어느 정도의 내성이 있는지를 판단하기 위해 24시간 배양한 S. cerevisiae D452-2 균주배양액을 3차 증류수에 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 배 비율로 각각 희석한 후 이를 비사보롤이 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1 g/L 로 포함된 YPD 고체배지에 스팟 접종 후 30℃에서 48시간 정치배양 하고 시간 경과에 따른 배지의 상태를 도 3에 나타내었다.

이에 따르면, 육안으로 정치배양한 배지들의 세포 사멸 정도를 파악한 결과, 비사보롤 1 g/L가 첨가된 배지에서 배양한 균주의 성장력이 비사보롤을 첨가하지 않은 YPD에서 배양한 결과와 다르지 않음을 확인할 수 알 수 있었다 이와 같은 결과에 따르면, 효모는 1 g/L의 비사보롤이 첨가된 배지에서도 생장의 위협받지 않음을 알 수 있었고 이는 S. cerevisiae D452-2 균주가 비사보롤 생산의 숙주 균주로 적합한 것으로 사료된다.

실시예 1: 비사보롤 합성 유전자 도입된 효모를 이용한 비사보롤의 제조

캐모마일(Matricaria recutita) 유래의 비사보롤 생산 유전자인 MrBBS를 발현하는 벡터를 효모 내로 형질전환하였다. 제조예 2에서 제조된 재조합 균주(DM)를 다양한 조건 하에서 회분식 배양을 통해 배양 후 비사보롤의 생산을 확인하였다.

먼저, 캐모마일(Matricaria recutita) 유래의 MrBBS 유전자의 코돈을 효모이용률이 높은 서열로 변경하는 코돈 최적화 과정을 선행하였다. 코돈최적화된 MrBBS 유전자는 pBHA 벡터에 삽입된 형태로 업체에서 제공받았으며 제조예 1에서와 같이 MrBBS 유전자가 함유된 효모용 발현벡터인 pRS425GPD_MrBBS 벡터를 구축하였다. 코돈 최적화된 MrBBS 유전자의 염기서열은 도 4에 나타낸 서열번호 1과 같다.

구축된 균주를 사용하여 포도당을 기질로 하는 회분식 배양을 실시하였다. 실험조건은 각각 50 g/L과 100 g/L 포도당을 탄소원으로 공급한 100 ㎖ YP 배지(1 %(w/v) Yeast extract, 2 %(w/v) Peptone)에 5 ㎖ N-도데칸(N-dodecane)을 투입한 후 30℃에서 100rpm, 200rpm 두 가지 조건으로 나누어 28시간 동안 배양한 결과를 도 5a 내지 도 5d에 나타내었다. 이에 따르면, MrBBS 유전자를 도입한 재조합 효모의 경우 비사보롤의 생산이 이루어진 것을 알 수 있었으며 포도당의 농도와 rpm 조건은 비사보롤 생산에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 포도당을 전부 소모한 이후에는 비사보롤의 생산이 일어나지 않는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 메발론산 대사경로 강화유전자 및 비사보롤 합성유전자가 도입된 효모를 이용한 비사보롤의 제조( 회분식 배양)

ERG10, tHMG1 유전자는 각각 메발론산 대사경로를 시작하는 Acetoacetyl-CoA 티올라아제(thiolase)와 메발론산 대사경로의 율속 인자인 HMG-CoA 환원효소(reductase)를 암호화하는 유전자로 세포 내 과발현시 메발론산 대사경로의 전체적인 활성을 증가시키며 비사보롤의 전구체인 메발론산의 세포 내 합성을 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 상기 두 유전자와 더불어 체 내 아세틸-CoA 합성에 주요한 효소로 알려진 ACS1 유전자를 효모 내로 각각 도입한 균주와 추가적으로 비사보롤 생산 유전자인 MrBBS 유전자를 효모균주에 도입한 균주를 구축하고 회분식 배양을 통해 최종 산물인 비사보롤의 생산을 확인하였다.

보다 높은 비사보롤의 생산을 위해 tHMG1을 CRISPR/Cas9을 통해 효모(S. cerevisiae D452-2)의 유전체로 도입하여 Dt균주(S. cerevisiae D452-2에 tHMG1 유전자 도입)를 구축하였다. 제조예 2에서와 같이 Dt균주를 기반으로 pRS423TEF_ERG10 벡터를 도입한 DtEM 균주, DtEM에 pRS426HXT_ACS1벡터를 삽입한 DtEMA 균주, DtEM에 pRS426GPD_ALD6_ACS1벡터를 삽입한 DtEMAA 균주, DM 균주를 50 g/L 포도당을 탄소원으로 공급한 100 mL YP 배지 (1 %(w/v) Yeast extract, 2 %(w/v) Peptone) 에 5 ㎖ N-dodecane이 들어간 배지에 30℃, 200rpm 조건으로 28시간 배양하여 그 결과를 아래의 표 4 및 도 6a 내지 도 6f에 나타내었다.

균주	Bisabolol (mg/L)
D(Control)	0
DM	95.2 (± 7.61)
DEM	91.9 (± 2.24)
DtM	172.5 (± 42.2)
DtEM	270.7 (± 29.6)
DtEMA	296.6 (± 23.0)
DtEMAA	146.0 (± 19.1)

이에 따르면, 배양결과 DtEM, DtEMA, DtEMAA 균주 모두 DM 균주에 비해 높은 비사보롤 생산성을 보였다. DtEM과 DtEMA 균주의 비사보롤 최종생산량은 약 300 mg/L로 비슷하게 나타났으며, DtEMAA 균주의 비사보롤 생산성은 위 두 균주에 비해 낮은 것으로 보아 ALD6 유전자의 발현이 비사보롤 생산에 유의미하게 작용하지는 못하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 유가식 배양법에 따른 비사보롤 제조

실시예 2의 회분식 배양에서 비사보롤 생산의 우수성을 보인 DtEM 균주와 DtEMA 균주를 2.5리터 규모의 생물배양기에서 유가식 배양을 통하여 배양하여 생산성을 알아보았다.

플라스크 배양에서 비사보롤의 생산이 가장 높게 측정된 DtEM 균주와 DtEMA 두 가지 균주를 유가식 배양법을 통해 배양하여 비사보롤 및 발효부산물 생산을 확인해 보았다. 유가식 배양은 2.5리터 규모의 생물배양기에서 진행되었으며 배양조건은 pH 5.0 ~ 5.3, 1L의 YP 배지 (1 %(w/v) Yeast extract, 2 %(w/v) Peptone)에 20 g/L 초기포도당 농도, 1 vvm, 30℃, 200 rpm 으로 진행하였다. 초기 포도당을 모두 소모한 시점에서 추가로 500 g/L의 포도당 용액을 넣어주었으며, 500g/L의 포도당 용액을 배지 내 포도당의 완전한 소모가 확인될 때마다 덤핑하는 방법으로 추가 포도당을 공급하였다. 발효 시작 후 12시간 경과한 때부터 비사보롤의 생산이 시작되었는데 이때의 최초 건조균체량(DCW₀) 은 DtEM 균주의 경우 7-9, DtEMA 균주의 경우 14-18을 유지하며 49시간 동안 발효를 진행하여 DtEM 균주에서의 결과를 아래의 표 5 및 도 7a에 나타내었으며, DtEMA 균주에서의 결과를 아래의 표 6 및 도 7b에 나타내었다.

최종산물	생산량
DCW	8.04 g/L
Acetate	0.323 g/L
Ethanol	83.534 g/L
(-)-α-Bisabolol	0.664 g/L

최종산물	생산량
DCW	14.4 g/L
Acetate	0 g/L
Ethanol	83.796 g/L
(-)-α-Bisabolol	1.28 g/L

이에 따르면, DtEM 균주를 생물배양기에서 배양한 결과 플라스크에서의 회분식 배양에 비해 약 2.4 배 높은 비사보롤 최종 농도를 나타내었다. 비사보롤의 생산과 더불어 에탄올도 높은 농도로 생산되는 것을 확인할 수 있었다. 49시간의 발효 끝에 DtEM 균주는 83.534 g/L의 에탄올과 0.664 g/L 의 비사보롤을 생산하였다. DtEM 균주를 배양한 방법과 동일한 배양방법을 통해 ACS1 유전자가 추가로 발현된 DtEMA 균주를 발효한 결과 DtEMA 균주는 최종 83.796 g/L의 에탄올과 1.28 g/L 비사보롤을 생산하였으며 아세트산은 생산되지 않는 것으로 나타났다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

<110> KOOKMIN UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> METHOD FOR PRODUCING BISABOLOL USING TRANSFORMED YEAST <130> HPC-7928 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1719 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthased MrBBS <400> 1 atgtcaactt tatcagtttc tactccttcc ttctcttcat ctccattgtc ttcggttaat 60 aaaaacagca cgaaacaaca cgttactcgc aatagtgtaa tcttccatga tagtatctgg 120 ggggatcaat ttttggaata taaggaaaag tttaatgtag ctactgagaa acagctaatc 180 gaagagttga aagaagaagt gagaaacgaa ttgatgatca gagcttgtaa tgaagcatcc 240 aggtatataa aacttatcca attgattgat gtagttgaaa ggcttggttt ggcctaccat 300 tttgaaaagg aaatcgagga atccttgcaa catatctatg ttacatatgg ccataaatgg 360 accaactata acaacattga aagtctttcg ctgtggttta gactgttgcg acaaaatggc 420 ttcaacgtat catcggatat attcgagaac catattgatg aaaagggaaa tttccaggaa 480 agcttatgta atgaccctca agggatgctt gctttatacg aagcagcata tatgagggtt 540 gaaggtgaga taatactaga caaggcctta gaattcacca aattgcacct gggtatcata 600 tccaatgatc cttcttgtga ctcttctcta agaacagaaa taaagcaagc tctaaagcag 660 ccgcttcgta gaaggttgcc aaggctagag gcggtgcgat acatcgcaat ctatcaacaa 720 aaagcttctc actccgaggt cttgttaaag cttgcgaagt tagactttaa cgtgttacaa 780 gaaatgcata aagacgagct tagccaaatt tgcaaatggt ggaaggattt ggacattaga 840 aacaagttac cctatgtgcg cgacagattg attgaaggct acttttggat cttgggaatc 900 tatttcgaac cccaacattc tcgtacaaga atgttcttaa tgaaaacatg tatgtggctc 960 attgttttag atgacacgtt tgataattat ggtacttatg aggaacttga aatatttaca 1020 caggctgtcg aaagatggtc cataacctgc ttggatgaac taccagagta catgaagcta 1080 atttatcatg agcagttccg tgttcaccaa gaaatggagg aatcactaga gaaagaagga 1140 aaagcttatc aaatacatta tattaaagag atggccaaag agggtacaag gagccttctg 1200 ttagaagcca aatggttgaa agagggatac atgccaactt tggatgagta cctgtctaat 1260 tcactagtta cttgtggata tgcactcatg acagccagat cttatgttgc ccgggatgac 1320 ggtatagtca cggaggatgc ctttaaatgg gtggcaactc atccacctat tgtcaaagct 1380 gcatgtaaaa ttctgagatt aatggatgat attgctaccc acaaggagga acaggagaga 1440 ggtcacattg cttcaagtat tgaatgctac agaaaggaaa ctggtgcatc agaggaggaa 1500 gcttgcatgg atttcttaaa acaagtcgag gatggttgga aggttataaa tcaggaaagt 1560 ctgatgccta cagacgtacc atttcccctc cttattccag caattaacct tgcgcgtgtg 1620 agtgataccc tatacaagga taatgacggc tacaatcatg ctgataaaga agtcattggt 1680 tacatcaaat cgttatttgt tcacccgatg attgtctaa 1719

Claims

카모마일(Matricaria recutita)유래 비사보롤((-)-α-bisabolol) 합성효소인 MrBBS((-)-α-bisabolol synthase)를 암호화하는 유전자가 도입된 형질전환 효모를 배양하여 탄소원으로부터 비사보롤을 생산하는 단계를 포함하고,
상기 MrBBS를 암호화하는 유전자는 효모용으로 코돈 최적화된 서열번호 1로 표시되고,
상기 형질전환 효모는 메발론산 대사경로에 관여하는 ERG10(Acetoacetyl-Co-A thiolase)을 암호화하는 유전자 및 tHMG1(HMG-CoA reductase)을 암호화하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 효모는 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 및 아르술라(Arxula) 속으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 및 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 탄소원은 포도당, 과당, 갈락토오스, 맥아당, 설탕 및 젖당으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 MrBBS를 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 ERG10 단백질을 암호화하는 유전자 및 tHMG1 단백질을 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 형질전환 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 ACS1(acetyl-CoA synthase 1)를 암호화하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 ACS1(acetyl-CoA synthase 1)을 암호화하는 유전자의 도입은 pBHA, pRS, YEp, YIp, 및 YAC로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 벡터에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 YPD 배지 또는 YPDG 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 배양 전에 배지에 알칸(alkane)을 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 알칸은 C9 내지 C12 알칸으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 배양은 회분식 배양 또는 유가식 배양에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 배양은 유가식 배양에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제15항에 있어서,
상기 유가식 배양은 pH 4.5 내지 6의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 비사보롤의 제조방법은 발효부산물로 에탄올이 제조되는 것을 특징으로 하는 형질전환 효모를 이용한 비사보롤의 제조방법.
제1항의 제조방법을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법
제1항의 제조방법을 포함하는 피부미백 또는 탄력개선용 화장료 조성물의 제조방법.
제1항의 제조방법을 포함하는 피부질환 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품 조성물의 제조방법.