KR102012837B1 - G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 all-trans-retinoic acid (ATRA)에 의한 인간 골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포의 분화 과정 중, OR 발현이 감소하는 것을 확인하였다. G9a는 OR 프로모터로 모여드는 반면, OR 프로모터 상 LSD1의 수준은 감소하는 것을 밝혀냈으며, 이를 통해 OR 유전자의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. OR10G2의 넉다운은 세포 증식을 억제하였는데, 이를 통해 OR의 발현이 백혈병 세포 유지를 조절하는 역할을 수행할 수 있다는 것을 밝혀냈다.

Description

G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법{Screening method of therapeutic agents for leukaemia by regulating expression of olfactory receptor by G9a and LSD1}
본 발명은 G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체(olfactory receptor; OR) 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
G9a는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(histone methyltransferase; HMTase)로서, Su(var)3-9 패밀리에 속하는 단백질이고, 전사 억제와 관련된 히스톤 H3K9 mono- 및 di-메틸화를 촉진시킨다. G9a 및 이의 상동적 HMTase G9a-유사 단백질(G9a-like protein; GLP)에 의한 전사 조절은 많은 세포 공정에 관련되어 있다. 예를 들면, G9a (또는 GLP)는 마우스에서의 초기 배아 발달 및 배아줄기세포 분화에 중요한 역할을 한다. G9a 넉아웃(knockout) 마우스는 H3K9 메틸화가 크게 감소되었고, 초기 발달에 있어 심각한 성장 결핍을 나타냈다. 또한, G9a는 인간 급성 골수성 백혈병 세포주인 HL-60 세포의 분화 과정에서 DNA 메틸화 유지를 위해 필수적인 기능을 수행하는 ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 (UHRF1)의 억제를 통하여 DNA 메틸화 수준을 감소시켰다. HL-60 세포에서 G9a는 H3Y41 인산화의 촉매인 Janus kinase 2 (JAK2)를 억제시키는데, 이는 JAK2-H3Y41P-HP1α 경로-매개 백혈병 발생을 억제하는 결과를 나타냈다. FAD-의존성 아민 옥시다제인 리신-특이적 디메틸라제 1 A (lysine-specific demethylase 1 A; LSD1)는 H3K4me2 및 H3K9me2의 디메틸화를 촉진하는 능력을 가진 독특한 단백질로서, 상황에 따라 전사 억제자 또는 활성자로서 각각 작용할 수 있다. LSD1은 H3K4me2를 디메틸화시키고, CoREST 복합체와 함께 전사를 억제시키는 것으로 최초 보고되었다. 하지만, LSD1은 안드로젠 또는 에스트로겐 수용체와 함께 H3K9me2의 디메틸화를 촉진시켜, 전사 활성자로도 작용하는 것으로 확인되었다.
후각 수용체(Olfactory receptor; OR)는 후각 상피의 후각 감각 뉴런(olfactory sensory neuron; OSN)에서 주로 발현되는 G 단백질 연결 수용체이다. OR은 냄새 유발 물질을 검출하고, 뇌로 OSN 축색을 안내하는 역할을 수행한다. 포유류는 대부분의 염색체 상에 유전자 클러스터로 조직된 ~1,000개의 OR 유전자들을 가지고 있으나, 인간은 OR을 코딩하는 것으로 추정하는 약 350개 정도의 유전자들을 가지고 있다. 포유류에서 OR은 가장 큰 유전자 슈퍼패밀리이지만, 각각의 후각 뉴런은 "하나의 수용체, 하나의 뉴런" 규칙에 따라, 오직 단일 OR allele 만을 발현한다. 최근 연구에 따르면, 포유류에서의 단일 OR 발현이 HMTase G9a 및 demethylase LSD1에 의해 매개된다고 보고하였다. 단일 OR 유전자가 선택되기 전, OR 유전자들은 G9a을 통해 H3K9me2로 표시되고, 이는 뉴런에서 OR 침묵(silencing)을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 분화가 진행될수록, 뉴런에서의 모든 OR 유전자들은 지속적 이질 염색체(constitutive heterochromatin)의 특징인 H3K9me3 및 H4K20me3을 나타내고, 완전히 침묵하게 된다. 발달 단계에서, LSD1은 단일 OR allele의 H3K9me2 디메틸화를 촉진시켜, 선택된 OR은 활성화되는 반면, 다른 모든 OR은 억제된다. OR 발현에 의해 작동되는 피드백은 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response; UPR)을 유도하고, LSD1의 음성 조절자인 아데닐일 사일라제 3(adenylyl cylase 3; Adcy3)의 발현을 유도한다. 이런 방식으로, G9a 및 LSD1은 오직 하나의 OR을 발현시키고 상기 발현을 유지하여, 단일 OSN을 조절할 수 있다.
최근에, 고환, 혀, 심장, 혈액, 전립선, 뇌 및 정자 유래 조직을 포함하는 비-후각 조직에서 여러 OR이 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이소적으로 발현된 OR은 그들 자신의 생리학적 기능을 갖는다. 예를 들면, hOR17-4는 고환 및 정자에서 발현되고, 정자 주화성에 있어 중요한 역할을 한다. OR10J5는 심장에서 발현되고, 혈관신생에 관여한다. 또한, 과발현된 OR51E2 (PSGR, prostate-specific G-protein-coupled receptor)는 NF-κB의 활성화를 통해 전립선 조직에서 암 발생을 촉진시킨다. 하지만, 여전히 상기 조직들에서 OR의 생리학적 역할은 잘 밝혀지지 않아, 추가적인 연구가 필요한 실정이다.
한국등록특허 제10-1468773호(2014.11.27 등록)
본 발명의 목적은 백혈병세포에서 후각 수용체의 발현 수준 측정을 통한 백혈병 치료제 스크리닝 방법 및 후각 수용체 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 G9a HMTase를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 억제용 시약 조성물 또는 LSD1을 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 촉진용 시약 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) G9a HMTase를 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 억제 방법 또는 시험관 내에서(in vitro) LSD1을 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 촉진 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 (1) 백혈병세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 백혈병세포에서 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체(Olfactory receptor; OR)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 G9a HMTase를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 억제용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSD1을 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 촉진용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) G9a HMTase를 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) LSD1을 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 촉진 방법을 제공한다.
본 발명은 G9a 및 LSD1에 의한 후각 수용체 발현 조절을 이용한 백혈병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 all-trans-retinoic acid (ATRA)에 의한 인간 골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포의 분화 과정 중, OR 발현이 감소하는 것을 확인하였다. G9a는 OR 프로모터로 모여드는 반면, OR 프로모터 상 LSD1의 수준은 감소하는 것을 밝혀냈으며, 이를 통해 OR 유전자의 발현을 억제한다는 것을 확인하였다. OR10G2의 넉다운은 세포 증식을 억제하였는데, 이를 통해 OR의 발현이 백혈병 세포 유지를 조절하는 역할을 수행할 수 있다는 것을 밝혀냈다.
도 1은 OR의 발현이 ATRA-유도 HL-60 세포 분화 과정에서 억제된다는 결과를 나타낸다.
도 2는 OR1N1 및 OR10G2의 발현이 G9a 및 LSD1에 의해 조절된다는 결과를 나타낸다.
도 3은 인간과 쥐의 OR의 발현이 G9a 및 LSD1에 의해 조절된다는 결과를 나타낸다.
도 4는 G9a 및 LSD1이 OR4F6 및 OR7A17의 전사를 조절한다는 결과를 나타낸다.
도 5는 G9a 및 LSD1은 H3K9의 메틸화 또는 디메틸화를 통해 OR 발현을 조절한다는 결과를 나타낸다.
도 6은 HL-60 세포의 분화 과정 동안, G9a 및 LSD1은 H3K9의 메틸화 또는 디메틸화를 조절하여 OR4F6 및 OR7A17의 발현을 조절한다는 결과를 나타낸다.
도 7은 OR10G2의 하향 조절이 세포 증식을 감소시킨다는 결과를 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 all-trans-retinoic acid (ATRA)에 의한 인간 골수성 백혈병 세포주 HL-60 세포의 분화 과정 중, OR 발현이 감소하는 것을 확인하였다. G9a는 OR 프로모터로 모여드는 반면, OR 프로모터 상 LSD1의 수준은 감소하는 임을 밝혀냈으며, 이는 OR 유전자의 발현 억제로 인한 것임을 확인하였다. OR10G2의 넉다운은 세포 증식을 억제하였는데, 이는 OR의 발현이 백혈병 세포 유지를 조절하는 역할을 수행할 수 있다는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 백혈병세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 백혈병세포에서 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체(Olfactory receptor; OR)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 후각 수용체 발현 억제제는 OR1N1, OR4F6, OR7A17 또는 OR10G2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 후각 수용체 활성 억제제는 OR1N1, OR4F6, OR7A17 또는 OR10G2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
더욱 상세하게는, 상기 약학조성물은 G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제(histone methyltransferase; HMTase) 활성을 촉진하거나, 리신-특이적 디메틸라제 1 A (lysine-specific demethylase 1 A; LSD1) 활성을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 G9a HMTase를 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 억제용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LSD1을 유효성분으로 함유하는, 시험관(in vitro) 내 백혈병세포의 후각 수용체 발현 촉진용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) G9a HMTase를 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) LSD1을 백혈병세포에 처리하는 단계를 포함하는 시험관 내 후각 수용체 발현 촉진 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 후각 수용체는 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 본 명세서에 기재된 후각 수용체들의 GenBank acession no.는 도 1A에 기재되어 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 플라스미드 구축
루시퍼라제 분석을 위해, 게노믹 DNA를 준비하였고, OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2 프로모터 영역(각각, -1487 내지 0, -1500 내지 + 20, -1365 내지 0 및 -1022 내지 0)은 각각의 프라이머 쌍을 이용하여 인간 게노믹 DNA로부터 증폭되어 pGL4.12-basic vector (Promega)에 삽입하였다. pEGFP-G9a, pCMV-Flag-LSD1, pCMV-Suv39h1 및 pCMV10-Flag-KDM3B은 이전에 보고하였다(Nucleic Acids Res, 2015, 43, 3509-3523; Mol Cell Biol, 2012, 32, 3681-3694; BMB Reports, 2015, 48, 401-406). G9a에 대한 짧은 헤어핀 RNAs(Short hairpin RNAs; shRNAs)는 이전에 보고하였고(Nucleic Acids Res, 2015, 43, 3509-3523), LSD1 및 OR10G2에 대해서는 siRNA sequence designer software (Clontech)를 이용하여 제작하였다. shRNA 플라스미드 구축을 위한 이중-나선 올리고뉴클레오티드는 표 1에 기재된 프라이머를 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 pLKO.1 TRC vector (Addgene)의 AgeI/EcoRI 사이트 내로 삽입하였다. 본 발명에 사용된 프라이머는 표 1에 기재하였다.
Figure 112017090564400-pat00001
2. 세포 배양
HCT116, H1299 및 HL-60 세포는 RPMI 1640에서 배양하였고, G9a-/- MEF 및 HEK293 T 세포는 10% 열 불활성화된 FBS 및 0.05% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 분화를 위해, HL-60 세포는 60 mm plate에 ml 당 5 × 106 세포수로 접종되었고, 1uM ATRA 또는 DMSO (Sigma)로 처리하였다. 배양 48h 후, 세포들을 수확하였고, 각 실험을 위해 사용하였다. G9a 및 LSD1 억제를 위해, HL-60 세포는 60 mm plate에 5 × 106 세포수로 접종되었고, 각각 5 μM BIX01294 및 500 nM GSK-LSD1로 처리하였다. 각각 배양 48h 및 24 h 후, 세포들을 수확하였고, 각 실험을 위해 사용하였다.
3. 항체
β-Actin (sc-47778), LSD1 (sc-271720; Santa Cruz Biotechnology), G9a (07-551), H3K9me2 (07-441), H3K4me2 (07-030) 및 mouse IgG (12-371; Millipore)에 대해 특이적인 항체들은 구입하였다.
4. RNA 간섭
바이러스 입자들을 생산하기 위해서, HEK293T 세포들은 VSV-G, NL-BH를 코딩하는 플라스미드와, G9a, LSD1 및 OR10G2에 대한 shRNAs로 동시-형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 상기 바이러스를 포함하는 부분을 수집하였고, polybrene (8 μg/ml)를 첨가하여 HL-60 세포를 감염시켰다.
5. 역전사 PCR 및 qRT - PCR
Tri-RNA Reagent (FAVORGEN)를 사용하여, 전체 RNA를 각 세포로부터 분리시켰다. cDNA 합성 후, 상기 cDNA를 정량하였고, mRNA 발현 분석을 위해 사용하였다. 본 발명에 사용된 PCR 프라이머는 표 1에서 기재하였다. 적절한 길이의 단일 산물이 증폭되었는지 확인하기 위해서, 각 PCR 반응 후 해리 곡선(dissociation curves)을 작성하였다. 평균 임계 사이클(threshold cycle; Ct) 및 표준 오차 수치는 단계당 3번 반복 반응하여 얻어진 각각의 Ct 수치로부터 계산하였다. 표준화된 평균 Ct 수치(ΔCt)는 β-actin의 평균 Ct를 제외하고 계산하였다. ΔΔCt는 대조군 ΔCt 및 각 샘플에서 얻은 수치 사이의 차이를 계산하였다. 유전자 발현에 있어, 미처리 대조군 대비 n-배 차이는 2- ΔΔCt로서 계산하였다.
6. 루시퍼라제 분석
루시퍼라제 분석을 위해, HEK293T 세포를 48-웰 플레이트에 접종하였고, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine)을 이용하여, 표시된 발현 플라스미드와, pGL4.12-OR1N1, pGL4.12-OR4F6, pGL4.12-OR7A17 및 pGL4.12-OR10G2 리포터 플라스미드로 동시-형질감염시켰다. 48시간 후, 세포들을 수확하였고, 루시퍼라제 분석에 적용하였다(Promega). β-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성 수준은 루시퍼라제 리포터의 표준화를 위해 사용하였다. 데이터는 단일 분석으로부터 얻은 4번 반복 결과의 평균으로 표시하였다. 모든 결과들은 최소한 3번 이상 독립적인 실험을 수행하여 나타냈다.
7. ChIP 및 실시간 PCR 분석
세포를 수확한 후, 1% 포름알데히드로 가교 결합시켰다. 간단히 설명하면, 배지에 1% 포름알데히드를 첨가하여 상온에서 10분 동안 반응시킨 후, 125 mM 글리신을 첨가하여 상온에서 5분 동안 반응시켰다. HL-60 세포들을 원심분리하였고, 펠렛을 1X PBS로 한 번 씻어냈다. 세포 펠렛은 SDS lysis buffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 8.1])에 현탁시켰다. 그 후, 세포들은 초음파 처리하였으며, 표시된 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 면역침전물은 용출시켰고, 역가교 결합시켰다. 그 후, PCR 증폭을 위해 DNA 단편들을 분리시켰다. 상기 DNA 단편들을 정제하였고, 정량하기 위해 각각의 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분 동안 유지한 후, 95℃에서 10 s, 56℃에서 10 s 및 72℃에서 30 s로 45 사이클 (Bio-Rad). 평균 임계 사이클(threshold cycle; Ct) 및 표준 오차 수치는 단계당 2번 반복 반응하여 얻어진 각각의 Ct 수치로부터 계산하였다. 표준화된 평균 Ct 수치(ΔCt)는 항-CCND2 면역침전 샘플로부터 얻어진 평균 Ct를 제외하고 계산하였다.
8. MTT (3-(4,5- dimethylthiazol -2- yl )-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 분석
shNC 및 shOR10G2 HL-60 세포를 각 웰 및 ml 당 5 × 105 세포수로 48-웰 플레이트에 접종하였다. 24, 48 및 72 h 후, 세포에 최종 농도 0.5 mg/mL의 MTT를 첨가하였다. 첨가 후, 세포들을 37℃에서 4h 동안 반응시켰다. DMSO를 첨가하였고(200 μl), 575 nm 파장에서 흡광광도계를 이용하여 OD를 측정하였다.
9. FACS 분석
세포사멸에 있어 OR10G2의 영향을 측정하기 위해서, shOR10G2 HL-60 세포를 씻어냈다. 유세포 분석 직전, 세포들을 RNase A (20 mg/ml)로 처리하였고, Annexin V-FITC (Biobud)로 2시간 동안, 프로피디움 이오다이드(SIGMA)로 30분 동안 염색하였다. 그 후, BD FACSAriaTM II (BD bioscience)를 사용하여 HL-60 세포에 대한 FACS 분석을 수행하였고, FCS Express 6 Plus (De Novo Software)를 사용하여 데이터 분석하였다.
10. 통계 분석
결과는 3번 이상의 독립적인 실험 결과에 대하여 평균 ± S.D로서 나타냈다. 마이크로소프트 엑셀의 기능을 사용하여 통계적 유의성(P < 0.05)을 계산하였다. 그룹 간 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 통해 평가하였고, 그 후 Student's t-tests 또는 Bonferroni test를 적절하게 사용하였다.
< 실시예 1> ATRA -매개 HL -60 세포 분화 과정에서 하향 조절되는 OR
최근, 비-후각 조직에서의 OR에 대한 기능이 연구되고 있는데, 초파리에서 혈액 전구 세포의 유지에 OR의 활성화가 중요하다고 보고되었다(Cell, 2013, 155, 1141-1153). 이에, 본 발명자들은 백혈병의 조혈기작에 있어, OR 프로모터의 차등적 H3K9me2 수준이 OR의 조절 역할과 관련될 수도 있다고 추측하였다. 본 발명자들은 HL-60 세포의 ATRA에 의한 분화 전후의 ChIP-chip data를 분석하였고(Mol Cell Biol, 2012, 13, 2917-2933), 여러 OR의 H3K9me2 수준이 ATRA 처리에 따라 증가한다는 것을 확인하였다(도 1A). H3K9me2 수준 변화에 의해 확인된 ChIP-chip data 세트에서의 상위 10개 OR의 HL-60 세포 분화 과정 동안 발현의 변화를 측정하였다. 우선, 본 발명자들은 RT-PCR을 사용하여, HL-60 세포에서 상기 OR이 발현되는 것을 확인하였다(도 1B). 다음으로, HL-60 세포를 ATRA로 48 h 동안 처리하였고, OR의 mRNA 발현 수준은 qRT-PCR로 분석하였다. HL-60 세포의 ATRA-매개 분화 과정 동안 OR 발현은 하향-조절되었다(도 1C). 본 발명자들은 분석된 다른 OR 유전자들에 비해 전사 수준이 상당히 감소한 것으로 나타난, OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2에 초점을 맞추었다. 본 발명자들은 ChIP-chip data로 얻은 상기 OR 프로모터의 H3K9 메틸화 수준을 확인하기 위하여, ChIP-qPCR를 수행하였다. ChIP-chip 결과와 같이, OR 프로모터의 H3K9me2 수준은 ATRA 처리 48 h 후 증가하였다(도 1D). 이에, 본 발명자들은 HL-60 세포에서의 ATRA-매개 분화 과정 동안, 프로모터의 H3K9me2 수준을 증가시켜 OR의 발현이 억제된다고 결론내렸다.
< 실시예 2> HL -60 세포에서 OR의 발현을 조절하는 G9a 및 LSD1
종양 억제자, miRNAs 및 전사 인자의 후생적 조절은 백혈병 세포의 분화와 관련되어 있다. OR의 후생적 조절을 더 조사하기 위해서, 본 발명자들은 H3K9me2를 조절하는 것으로 잘 알려진 여러 후생적 변형인자들을 과발현시켰다. H3K9me2는 G9a 및 Suv39h1에 의해 추가되고, KDM3B에 의해 제거된다. 또한, 본 발명자들은 LSD1도 시험하였는데, 이는 H3K4me2 및 H3K9me2를 제거함으로써, 각각 전사 활성자 및 억제자로 기능한다. G9a는 HCT116 및 H1299 세포에서 OR1N1 및 OR10G2의 발현을 억제하였는데, Suv39h1은 아무런 영향이 없었다(도 2A). 또한, LSD1은 HCT116 및 H1299 세포에서 OR1N1 및 OR10G2 발현을 활성화시켰는데, 이는 LSD1이 OR 발현에 있어 H3K9me2 demethylase로 기능할 수 있다는 것을 나타낸다(도 2A). 하지만, KDM3B는 OR 발현을 조절하지 않았다. 또한, G9a 및 LSD1는 HEK293T 세포에서도 OR4F6 및 OR7A17의 발현을 조절하였다(도 3A). 상기 결과는 G9a 및 LSD1이 후각 신경 뿐 아니라 HCT116, H1299 및 HEK293T를 포함하는 다른 세포주에서도 OR 발현을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, HL-60 세포에서의 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2 발현 수준은 G9a 및 LSD1의 shRNA 넉다운에 의해 각각 증가 및 감소되었다(도 3B 및 도 3C). 또한, G9a 특이적 억제제인 BIX01294를 처리하면, OR의 발현이 증가되었다(도 2B 및 도 3D). 반면, LSD1 특이적 억제제인 GSK-LSD1을 처리하면, OR의 발현이 억제되었다(도 2C 및 도 3E). 종합하면, 상기 결과는 HL-60 세포에서 G9a는 OR의 발현을 억제시키고, LSD1는 OR의 발현을 활성화시킨다는 것을 나타낸다. 또한, MEF G9a 넉아웃 세포는 정상 세포에 비해 OR1N1 및 OR10G2의 마우스 상동체인 Olfr351 및 Olfr1510의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 3F). 이러한 결과는 G9a 및 LSD1이 여러 세포주에서 OR의 발현에 있어 중요한 조절자 역할을 수행한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 G9a 및 LSD1의 조절 기능이 OR의 프로모터 활성에 영향을 미치는지 루시퍼라제 리포터 분석을 이용하여 확인하였다. 예상대로, G9a는 OR1N1 및 OR10G2 프로모터 활성을 억제할 수 있었으나, LSD1는 이를 활성화시켰다(도 2D). 또한, 이전 결과와 일관되게, BIX01294-매개 G9a 억제는 OR 프로모터 활성을 활성화시켰으며, GSK-LSD1 처리는 OR 프로모터 활성을 억제시켰다(도 2E 및 도 2F). 본 발명자들은 OR4F6 및 OR7A17 에서도 동일한 결과를 얻었다(도 4). 이러한 결과는 G9a 및 LSD1이 OR의 프로모터 부위에 영향을 미쳐, 전사 조절자로서 기능한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 3> H3K9me2의 수준을 통해 매개되는 G9a 및 LSD1에 의한 OR 발현 변화
ATRA-매개 HL-60 세포의 분화 과정 동안, 본 발명자들은 각 OR의 프로모터 상 H3K9me2 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 1D). 본 발명자들은 G9a 또는 LSD1이 각각 H3K9의 메틸화 또는 디메틸화를 통해 OR 발현을 조절하는지 ChIP-qPCR으로 확인하였다. ATRA 처리 48 h 후, OR 프로모터로의 G9a 접근은 증가하였으나, OR 프로모터에서의 LSD1 양은 감소하였다(도 5A 및 도 6A). 또한, H3K9me2 수준은 OR 프로모터에서 증가하였다. 하지만, HL-60 세포 분화 과정 동안, OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2 프로모터에서의 H3K4me2 수준은 감소되었는데, 이는 낮은 OR mRNA 발현 수준과 일치하였다. HL-60 세포 분화에 있어, G9a 및 LSD1의 역할을 더 확인하기 위해서, 본 발명자들은 HL-60 세포에 BIX01294 및 GSK-LSD1를 각각 처리하였다. BIX01294를 처리하면, OR 프로모터 부위로의 G9a 접근이 억제되었으며, H3K9me2 수준을 감소시키는 결과를 나타냈다(도 5B 및 도 6B). 반대로, GSK-LSD1을 처리하면, OR 프로모터로의 LSD1 접근이 감소되었으며, H3K9me2의 디메틸화를 억제시켰다(도 5C 및 도 6C). 예측과 달리, GSK-LSD1 처리는 H3K4me2 수준도 증가시켰는데, 이는 LSD1이 OR 프로모터 부위에서 H3K4me2와 H3K9me2를 모두 디메틸화시킬 수 있는 가능성을 의미한다. 종합하면, 상기 결과는 ATRA-매개 HL-60 세포의 분화 과정 동안, G9a 및 LSD1이 H3K9 메틸화 수준을 조절한다는 것을 나타낸다.
< 실시예 4> 세포 증식을 억제하고, HL -60 세포 분화를 유도하는 OR10G2 넉다운
ATRA-매개 HL-60 세포 분화 과정 동안 OR의 발현이 감소하므로, OR은 백혈병 세포 증식 또는 분화에 중요한 역할을 할 수도 있다. HL-60 세포에서 OR의 기능을 분석하기 위해서, OR10G2를 표적으로 하는 shRNAs를 제작하였고, OR10G2가 안정적으로 넉다운된 HL-60 세포를 구축하였다(도 7A). 우선, 본 발명자들은 HL-60 세포 분화 마커인 CD11b의 발현을 분석하였다. OR10G2 넉다운은 CD11b의 발현 수준에 아무런 영향을 미치지 않았다(도 4B). 다음으로, 본 발명자들은 OR10G2 넉다운에 의해 세포 증식에 변화가 일어나는지 확인하기 위해서, 세포수 계수 및 MTT 분석을 수행하였다(도 7C 및 도 7D). OR10G2가 안정적으로 넉다운된 HL-60 세포의 성장은 대조군 HL-60 세포보다 상당히 낮아졌다. 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS)을 이용하여, 본 발명자들은 대조군 세포에 비해, shOR10G2-1 및 shOR10G2-2 세포들에서 살아있는 세포의 비율이 감소하고(93.74%에서 각각 77.25% 및 90.52%로 감소), 사멸된 세포의 비율이 증가한다는 것을 확인하였다(4.49%에서 각각 19.50% 및 6.72%로 증가)(도 7E). 상기 결과는 HL-60 세포에서 OR10G2가 세포 증식에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. OR10G2 넉다운에 의한 분자 기작을 더 분석하기 위해서, 본 발명자들은 OR10G2가 안정적으로 넉다운된 HL-60 세포에서 세포 증식-관련 유전자들인 ATF3, ATF5, C-Jun, HES5, PCK2 및 WWP1와, 대조군으로 항-증식 유전자인 Gadd45a의 발현 수준을 확인하였다. 예상대로, OR10G2가 안정적으로 넉다운된 HL-60 세포에서 상기 유전자들은 상당히 하향조절되었으나, Gadd45a의 mRNA 수준은 변하지 않았다(도 7F). 상기 결과는 OR이 HL-60 세포 분화는 직접적으로 조절하지 않지만, HL-60 세포의 증식에 있어서는 OR이 조절자 역할을 수행한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이러한 결과는 G9a 및 LSD1에 의한 OR 전사 조절이 HL-60 세포의 증식에 중요한 역할을 수행하며, 이러한 조절에 결함이 생기면 백혈병 발생을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

Claims (12)

  1. (1) 백혈병세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 백혈병세포에서 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체(Olfactory receptor; OR)의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 백혈병 치료제 스크리닝 방법.
  2. 삭제
  3. OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체 발현 억제제로서, OR1N1, OR4F6, OR7A17 또는 OR10G2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 후각 수용체 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. OR1N1, OR4F6, OR7A17 및 OR10G2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 후각 수용체 활성 억제제로서, OR1N1, OR4F6, OR7A17 또는 OR10G2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 후각 수용체 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 약학조성물은 G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제(histone methyltransferase; HMTase) 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 약학조성물은 리신-특이적 디메틸라제 1 A (lysine-specific demethylase 1 A; LSD1) 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 백혈병 예방 또는 치료용 약학조성물.
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