KR101468773B1

KR101468773B1 - 히스톤 Ｈ3Ｋ9 메틸트랜스퍼라아제 Ｇ9ａ를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101468773B1
Application number: KR1020120110200A
Authority: KR
Inventors: 서상범; 김지영; 손혜주
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-04
Filing date: 2012-10-04
Publication date: 2014-12-09
Also published as: KR20140046530A

Abstract

본 발명은 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a는 JAK2의 전사를 억제하며, 골수파괴치료가 아닌 비타민 유도체인 ATRA (all-trans retinoic acid, 트레티노인) 를 사용한 분화유도요법에서 전골수성백혈병 세포주인 HL-60의 ATRA-유발 세포분화를 촉진시키는 바, JAK2 활성 및 돌연변이와 관련된 질병, 구체적으로 골수증식 장애의 치료 또는 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

히스톤 Ｈ3Ｋ9 메틸트랜스퍼라아제 Ｇ9ａ를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical Composition Comprising Histone H3K9 Methyltransferase G9a for Preventing and Treating Myeloproliferative Disorders}

본 발명은 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

골수증식 장애 (MPD)는 비교적 정상적인 분화를 수반하는 1종 이상의 조혈 계통의 과생성을 특징으로 하는 클론 악성종양으로, 세포과다 골수 (BM)를 야기한다. MPD는 BM 및 혈액을 좌우하는 단일의 다능성 선조 또는 줄기 세포에서 생겨난다고 여겨진다. MPD 환자에서 유래되어 배양한 조혈 선조는 변경된 성장 특성 및 성장 인자 독립성(independence)을 나타낸다. 일련의 최근 보고들이 JAK2의 슈도키나제(pseudokinase) 도메인에서의 단일 아미노산 치환 V617F를 진성 적혈구증가증 (PV), 본태성 혈소판증가증 (ET) 및 만성 특발성 골수섬유증 (CIMF)에 있어서의 유력한 분자 병변으로서 확인해낼 때까지는 특정 MPD의 분자적 기초가 명확하지 않았다. 상기 돌연변이는 PV 환자의 75％ 내지 97％, 및 ET 및 CIMF 환자의 약 40％ 내지 50％에서 발견되었다 또한, V617F 돌연변이는 골수이형성 증후군 (MDS) 환자에서도 확인되었다.

JAK2는 비 수용체 티로신 인산화효소(non-receptor tyrosine kinase)로 세포질에서의 신호전달 경로를 유도함으로써 다양한 세포 내 프로세스를 조절한다. Dawson 등은 지금까지 알려지지 않았던 JAK2의 핵 내부에서 기능을 밝혔다. JAK2에 의한 히스톤 단백질 H3의 티로신 인산화는 염색질에 대한 HP1 알파의 결합을 차단하며, 그 결과에 따라 유전자 발현을 변화시킨다. 이러한 연구 결과는 JAK2 억제제가 JAK2 조절에 문제가 있는 골수성 백혈병의 치료제로 개발될 가능성을 가진다는 점에서 특별한 관심의 대상이 될 것으로 보여진다(Dawson et al ., JAK2 phosphorylates histone H3Y41 and excludes HP1α from chromatin, Nature 461, 819-822).

골수성 백혈병의 치료로, 1990년대 들어 치료의 큰 변화를 보인 것으로는 골수파괴치료가 아닌 비타민 유도체인 all-trans retinoic acid (ATRA)를 사용한 분화유도요법의 등장이다. 이러한 방법으로 골수저하 없이 약 90%에서 완전관해가 얻어질 수 있다. 그러나 이후 연구를 통해 ATRA 단독요법은 곧 내성을 초래하므로 3상 연구를 통하여 ATRA 및 관해유도 화학요법이 표준요법으로 인정되고 있으며 관해율은 80-90%로 매우 높다. 특히 비교적 가벼운 공고요법만으로도 80%이상에서 완치가 되므로 관해 후 대개 anthracycline 계통의 단독 공고요법을 받는 것이 원칙이며 극히 일부의 고위험군에서만 골수이식의 역할이 주장되고 있는 상황이다. 이와 같은 치료를 올바르게 선택한 경우 전체 환자의 400% 이상이 완치될 수 있다. 그러나 많은 환자들이 완치되지 못하고 급성백혈병으로 돌아가시는 것도 엄연한 현실인 바, 치료 성적을 향상시키기 위한 많은 연구들이 수행되고 있다.

따라서 본 발명은, JAK2 억제 기작을 통해 JAK2의 과발현 및 돌연변이과 관련된 골수증식 장애를 효과적으로 치료하기 위한 수단으로, 특히, 분화유도요법에서 ATRA과 함께 사용될 수 있는 우수한 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 골수증식 장애 치료제의 스크리닝 방법 및 골수증식 장애 진단 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 골수증식 장애를 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 골수증식 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 골수증식 장애를 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서의 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a의 발현 프로파일과 비교하여 골수증식 장애 여부를 판정하는 단계를 포함하는 골수증식 장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a는 JAK2의 전사를 억제하며, 골수파괴치료가 아닌 비타민 유도체인 ATRA (all-trans retinoic acid, 트레티노인) 를 사용한 분화유도요법에서 전골수성백혈병 세포주인 HL-60의 ATRA-유발 세포분화를 촉진시키는 바, JAK2 활성 및 돌연변이와 관련된 질병, 구체적으로 골수증식 장애의 치료 또는 예방에 세포 치료제 또는 단백질 치료제의 형태로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 JAK2가 H3K9-Me2의 타겟 유전자임을 확인시켜주는 실시예 1 및 실시예 2의 실험 결과에 해당한다.
도 2는 JAK2가 G9a의 SET 도메인에 의해 저해됨을 확인시켜주는 실시예 3의 실험 결과이다.
도 3은 G9a가 JAK2의 전사를 억제하는 역할을 수행한다는 점을 확인시켜주는 실시예 4의 실험 결과이다.
도 4는 G9a 매개 JAK2 저해에 YY1이 연관됨을 보여주는 실시예 5의 실험 결과이다.
도 5는 G9a 및 YY1이 JAK2 프로모터에 작용하여 JAK2전사를 억제함을 보여주는 실시예 6의 실험 결과이다.
도 6은 G9a의 H3Y41 인산화 저해능 및 ATRA 유도 세포 분화 촉진능을 보여주는 실시예 7 및 실시예 8의 의 실험 결과이다.

본 발명은 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 발명자들은 전골수성백혈병 세포주인 HL-60의 ATRA-유발 세포분화 과정에서, JAK2 의 발현이 히스톤 H3K9 메틸화에 의해 억제되고, 상기 기작에 히스톤 H3K9 트랜스퍼라아제 G9a가 관여함을 새롭게 확인하였다. 이에 따라, 상기 히스톤 H3K9 트랜스퍼라아제 G9a의 JAK2의 억제 기작이 YY1 의존적인 전사 억제 기작임을 확인하였고, 이러한 억제활성을 통해 상기 히스톤 H3K9 트랜스퍼라아제 G9a가 JAK2의 돌연변이 및 과발현에 의해 유발되는 질병의 치료에 적용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 골수증식 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물, 골수증식 장애 치료제의 제조를 위한 상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질의 용도, 상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 골수증식 장애의 치료 방법을 제공한다.

이하의 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 히스톤 H3K9 메틸트렌스퍼라아제 G9a 단백질은 JAK2의 전사 및 발현을 억제하여 JAK2-H3Y41-HP1α 신호전달 경로를 저해할 수 있다. 이에 따라 JAK2의 돌연변이 및 과발현에 의해 유발되는 질병에 적용될 수 있으며, 상기 JAK2의 돌연변이 및 과발현에 의해 유발되는 질병은 골수증식 장애가 이에 해당하며, 보다 구체적으로는 진성 적혈구증가증 (PV), 본태성 혈소판증가증 (ET), 골수 이형성을 수반하는 골수섬유증 (MMM), 특발성 골수섬유증 (CIMF), 미분류 골수증식 장애 (uMPD), 골수성 백혈병(ML), 호산구과다 증후군 (HES) 및 전신성 비만세포증 (SM)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질을 이용하여 골수증식 장애의 치료에 활용하는 경우로는, 면역세포 예를들어, 대식세포, 수지상세포 등에 전장 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 유전자를 벡터/바이러스를 이용하여 형질감염 시켜 이들 세포에 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질을 발현시켜서 사용하는 방법이 있을 수 있다. 이때, 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 를 발현하는 면역세포를 사용하는 경우는 세포치료제의 형태가 될 것이고, 융합재조합 단백질은 단백질 치료제의 형태가 될 것이다.

상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질은, 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 VSIG4를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질일 수 있으며, 진핵 생물 유래의 천연형의 아미노산 서열 뿐만 아니라 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 이때, 상기 서열 변이체는 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미하고, 본 발명과 같이 천식의 예방 또는 치료에 유효한 활성을 유지하는 한, 단백질의 최종 구조물에서 어떤 절단, 결실, 삽입, 치환 등의 조합도 가능하다. 보다 구체적으로, 인간 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a (genbank ID: NP_006700.3)일 수 있다.

삭제

또한, 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질은 천연 기원의 공급원으로부터 분리하는 방법, 화학적으로 합성하는 방법 또는 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질을 코딩하는 재조합 발현벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법으로 얻을 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a-인코딩 유전자는 발현벡터 내에 포함되어 개체에 전달될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 가장 바람직하게는 pEGFP 벡터를 의미한다. 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio . Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio . Chem ., 263:14621-14624, 1988).

본 발명에서 사용된 “치료”이라는 용어는 질환, 상태 또는 이상에 대처할 목적으로 환자를 처치하고 돌보는 것을 의미한다. 치료는 활성약물을 투여하여 증상 또는 합병증 발생을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 약화시키거나, 질환, 상태 또는 이상을 없애는 것을 포함한다.

본 발명에서 사용된 “예방”이라는 용어는 약제가 골수증식 장애 상태 발생 이전에 투여되어 천식의 발생을 예방하는 것을 의미한다. 천식을 겪고 있거나 증상을 나타낸 환자에게 투여된다면, 그러한 약제는 천식의 진행을 예방하는 효과가 있을 것으로 기대된다.

본 발명에서 사용된 “약제학적으로 허용 가능한 담체”는 사용한 용량 및 농도에서 세포 또는 포유동물에게 무독한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 흔히 수용성 pH 완충액일 수 있으며, 담체의 예로는 인산, 구연산 및 다른 유기산; 아스코르빈산을 포함한 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 이하) 폴리펩타이드; 혈장 알부민, 젤라틴 또는 면역글로블린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 단당류, 다당류 및 다른 탄화수소; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올류; 소듐과 같은 염 형성 반대이온; 및/또는 TWEEN20, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 소듐 타우로디하이드로퓨시데이트(STDHF) 및 PLURONICS과 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 허용되는 약전을 기초로 투여경로에 따라 제형화될 수 있다(Fingi 등, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1, 1975; Lemington's Pharmaceutical Sciences, 18 ed., Mack Publishing Co, Easton, PA, 1990). 따라서, 제형은 정제, 환약, 분말, 향낭, 엘릭실제, 현탁제, 유화제, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 포장 분말 등의 형태가 가능하다. 본 발명에 따른 약학조성물은 환자에게 투여된 후에 활성 성분의 즉효성, 지속성 및 서방성을 달성할 수 있도록 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법들을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다. 즉, 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있고, 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.

일 실시예로, 일반적인 지침에 따라 지시된 효과를 얻기 위해 사용될 활성성분의 일일 경구투여량은 체중 1 kg 당 대략 0.001∼1,000 mg, 바람직하게는 대략 0.01∼100 mg일 수 있다. 정맥내 투여시 일일 투여량은 일정한 속도로 주입시 체중 1kg 당 0.001 내지 100.0 ng일 수 있다. 이렇게 일정한 정맥내 주입은 바람직하게는 체중 1kg 당 0.01∼50 ng, 보다 바람직하게는 0.1∼10.0 ng으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단회 일일 투여량으로 투여되거나, 또는 총 일일 투여량을 하루 2회, 3회 또는 4회의 분량으로 나누어 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 원하는 몇일, 몇주, 몇 개월의 시간 동안 약물을 서서히 방출할 수 있는 데포(depot) 제형으로 투여될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사 등에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 골수증식 장애를 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; 및 히스톤 H3K9 메틸트렌스퍼라아제 G9a의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 골수증식 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 골수증식 장애를 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 샘플에서 히스톤 H3K9 메틸트렌스퍼라아제 G9a의 발현 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 발현 프로파일을 정상대조군에서의 히스톤 H3K9 메틸트렌스퍼라아제 G9a의 발현 프로파일과 비교하여 골수증식 장애 여부를 판정하는 단계를 포함하는 골수증식 장애 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 플라스미드

루시퍼라아제 분석을 위해, 유전체 DNA가 준비되었고, JAK2 프로모터 구역(-1980 에서 -981)이 pGL4.12 [luc2CP] 벡터(Promega, Madison, WI, USA)로 삽입되었다. JAK2 프로모터 서열은 특정 프라이머로 증폭되었다. 이하의 PCR 프라이머가 사용되었다: 정방향 프라이머로 EcoRV site-linked primer, 5′-GATATCGGGCCCCTCACAAAATATCACATT-3′, 역방향 프라이머로 Hind III site-linked primer, 5′-AAGCTTCCGACACACTCCTTGCCCTACTGG-3′.

YY1 발현을 위해, YY1 전체 cDNA를 KUGI 로부터 구입하였다. YY1 cDNA의 부분 구역(아미노산 1-160, 150-300 및 290-414)는 pGEX-4T1 박테리아 발현벡터(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 에 삽입되어 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST) 융합 단백질을 형성하였다. YY1 전체 cDNA는 pGEX-4T1 박테리아 발현 벡터 및 pEGFP-C1 진핵세포 발현벡터에 삽입되었다. pcDNA3-Flag-hG9a (1001 a.a), pEGFP-hG9a (1210 a.a), pEGFP-hG9a-ΔSET, pCMV-HA-Ezh2, pCMV-Suv39h1, pCMV-myc-Smyd2, pCMX HDAC1, 및 pcDNA3.1-HDAC2가 각각의 실험에 사용되었다. G9a 에 대한 shRNA(RHS4533-NM-006709) 는 Open Biosystems (Lafayette, CO, USA)로부터 구입하였다. YY1 에 대한 siRNA (sc-36863, sc-44330) 는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

2. 항체

G9a 항체 (07-551, Millipore, Bedford, MA, USA), JAK2 항체 (sc-278, Santa Cruz Biotechnology), YY1 항체 (sc-7341X, Santa Cruz Biotechnology), Suv39h1 항체 (sc-025366, Santa Cruz Biotechnology), GFP 항체 (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology), H3K9-111 me2 항체 (07-441, Millipore), H3K4-me2 항체 (07-030, Millipore), acetyl-H3 항체 (06-599, Millipore), acetyl-H4 항체 (06-598, Millipore), HDAC1 항체 (05-614, Millipore), HDAC2 항체 (ab12169, Abcam, Cambridge, MA, USA), SMRT 항체 (sc-20778X, Santa Cruz Biotechnology), Ezh2 항체 (3147S, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), Smyd2 항체 (sc-130879, Santa Cruz Biotechnology), histone H3 항체 (sc-8654, Santa Cruz Biotechnology), H3Y41P 항체 (ab26310, Abcam), IgG 항체 (sc-2028, Santa Cruz Biotechnology), 및 β-actin 항체 (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology)가 웨스턴 블랏, 면역침강 및 ChIP 분석에 사용되었다. 항-인간 CD14-APC (17-0149, eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 항-CD11B-PE (FCMAB178P, Millipore)가 유세포분석(FACS, fluorescence-activated cell sorting)에 사용되었다.

3. 화학 물질

트레티노인(All-trans retinoic acid, ATRA), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 헤민(hemin), 트리코스타틴 A (TSA) 및 니코틴아마이드 (NIA) 은 Sigma (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. BIX01294 는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)로부터 구입하였다.

4. 세포 배양 및 일시적 형질감염( transient transfection )

K562 및 HL-60 세포는 RPMI-1640 에서 배양되었고, HEK293T 세포는 10% 열-불활성화된 우태혈청 및 0.05% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 37℃, 5% CO₂ 대기조건으로 배양되었다. K562 및 HEK293T 세포는 각각 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 폴리에틸렌이민 (Sigma)을 사용하여 형질감염되었다.

5. RNA 분리 및 실시간 PCR 분석

총 RNA는 RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Ohtsu, Japan) 를 사용하여 형질감염되거나 30 μM 헤민 처리된 K562 세포 및 1 μM ATRA 또는 DMSO 처리된 HL-60 세포로부터 분리되었다. RNA (2.5 μg)는 올리고(dT) 프라이머 (Fermentas, Burlington, ON, Canada) 및 M-MLV 역전사효소 (Enzynomics, Daejeon, South Korea)를 사용하여 역전사되었다. 정량화된 cDNA는 JAK2, G9a, Suv39h1 및 YY1 mRNA 발현 분석에 사용되었다. 이하의 PCR 프라이머가 사용되었다: JAK2 (정방향: 5′-TGCACTGGCAGCAACAGAGCC-3′ 및 역방향: 5′-TTCAAGCACGGCTGGAGGTGC-3′), G9a (정방향: 5′-CCGGCGCAAGGCCAAGAAGA-3′ 및 역방향: 5′-CGGTGGGCCACACGGAAGTC-3′), Suv39h1 (정방향: 5′-ACGAGTGCAACTCCCGCTGC-3′ 및 역방향: 5′-GGCAGCCGCTCGTCAAGGTT-3′), YY1 (정방향: 5′-GGATCCCTGGTCACCGTGGCGGCGGCCG-3′ 및 역방향: 5′-CTCGAGATGAGGGCAAGCTATTGTTCTT-3′). 각각의 PCR 후 적합한 길이의 단일 생성물이 증폭되었는지 여부의 확인을 위해 분리 곡선이 형성되었다. 평균 감지 시작 주기(Ct) 및 스텐다드 에러는 개개의 스테이지당 세번 측정된 Ct 값으로부터 계산되었다. 표준화된 평균 Ct 는 β-actin 의 평균 Ct를 감하여 ΔCt로 추산되었다. ΔΔCt 값은 대조군 ΔCt 및 각각의 샘플에서 얻어진 값의 차이로 계산되었다. 미처리된 대조군과 연관된 유전자 발현에 있어서 n-fold 변화는 2-ΔΔCt 로 계산되었다.

6. 웨스턴 블랏 분석

총 단백질은 RIPA 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% SDC, 1% NP40, 0.5×protease inhibitor cocktail, 1 mM EDTA)를 사용하여 용해된 세포로부터 획득되었고, 소듐 도데실 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분획되고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동되었다. 상기 막은 4℃에서 항체와 함께 하룻밤 동안 반응되었고, 블랏은 HRP-conjugated goat anti-rabbit, anti-mouse, 또는 donkey anti-goat 항체 (Santa Cruz Biotechnology)와 배양 후 enhanced chemiluminescence (ECL) system (Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 검출되었다.

7. 히스톤 추출

형질감염된 K565 세포는 RSB 용액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0.5% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) 에 30분간 4℃에서 용해되었다. 용해된 세포는 원심분리되었으며, 상청액을 버리고 펠렛을 RSB 용액에 재부유하였다. 그 후 용액은 10초간 5회 초음파 처리되었다. 그 후 다시 원심분리 후 상청액을 버리고, 잔여 펠렛을 RSB 용액으로 각각 10분간 4℃에서 6회 세척하였다. 펠렛은 최종적으로 HSB 버퍼 (20 mM HEPS, 0.65 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.34 M sucrose, 1 mM β-mercaptoethanol, 및 0.5 mM PMSF) 에 재부유되었다.

8. 루시퍼라아제 분석

루시퍼라아제 분석이 JAK2 프로모터 리포터를 사용하여 수행되었다. K562 세포는 pGL4.12-JAK2 프로모터 및 지정된 DNA로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 를 사용하여 형질감염되거나, 또는 30 μM 헤민으로 처리 시간을 달리하며 처리되었다.

형질감염 후, 세포는 수득되었고, 루시퍼라아제 활성이 luciferase assay system (Promega)을 사용하여 분석되었다. 분석값은 3번 반복된 측정값의 평균으로 나타내었다.

9. 면역침강법

상호작용 분석을 위해, K562 및 형질감염된 HEK293T 세포가 1시간동안 4℃에서 용해 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.5× protease inhibitor cocktail, 및 1 mM PMSF) 에 용해되었다. 용해물은 4℃에서 항-G9a항체, 항-YY1 항체로 하룻밤동안 면역침강되었고, 단백질 A/G 아가로스 비드(GenDEPOT, Barker TX, USA)를 4℃에서 2시간동안 교반하며 가하였다. 결합 단백질은 항-GFP, 항-YY1 및 항-G9a 항체로 웨스턴 블랏을 통해 분석되었다.

10. GST 풀다운 분석

GST-YY1 WT (아미노산 1-414), GST-YY1 AD (아미노산 1-160), GST-YY1 RD (아미노산 150-300), 및 GST-YY1 DBD (아미노산 290-414) 및 GST 정제 단백질이 4℃에서 하룻밤 동안 G9a-과발현된 HEK293T 세포 단백질 용해물과 함께 배양되었다. 침전된 단백질은 8% SDS-PAGE를 사용하여 분리되었고, 항-G9a 항체를 사용한 웨스턴 블랏으로 분석되었다.

11. 크로마틴 면역침강 ( ChIP ) 분석

HL-60 세포가 1μΜ ATRA 또는 DMSO로 처리되었고, 72시간 후 수거되었다. K562 세포는 지정된 DNA 또는 100 nM si-CTL RNA 및 100 nM si-YY1 RNA로 형질감염되었다. 1% 포름알데히드를 배지에 상온에서 10분간 가하고 125mM 글리신을 5분간 가하여 세포를 교차결합시키고 SDS 용해 버퍼에서 용해시켰다. 샘플은 초음파처리 후 지정된 항체로 면역침강되었다. 면역 침강물은 녹여서 분리되었고, 교차결합을 분리하였으며, DNA 단편은 PCR 정제 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)로 정제되었다. JAK2의 프록시멀 프로모터(proximal promoter) 영역인 -1230 에서 -1031 서열에 대응하는 200-bp 단편 및 JAK2의 디스털 프로모터(distal promoter) 영역인 -3946 에서 -3632 서열에 대응한 315-bp 단편이 PCR로 증폭되었다. 사용된 PCR 프라미머 서열은 다음과 같다: JAK2 프록시멀 프로모터 영역 (정방향: 5′-ACTGGTTCATTCTCATCCTTCAG-3′ 및 역방향: 5′-CGGGGGCTCGAAGCCCTGAA-3′). JAK2 디스털 프로모터 영역 (정방향: 5′-GCCTCAGTGTGTCCCAATTT-3′ 및 역방향: 5′-TCTGTCCTGCTATCCCTGCT-3′). LMO2 프록시멀 프로모터 영역 (정방향: 5′-CCAGACAAACTCAAATAACGTACACA-3′ 및 역방향: 5′-AGTGGGTACCATTGTCCCTGTT-3′). LMO2 디스털 프로모터 영역 (정방향: 5′-CAGGCTTCTCCCGTGTAACTG-3′ 및 역방향: 5′-AGGACCTCACACGTTGAAGACA-3′).

각각의 PCR 후 적합한 길이의 단일 생성물이 증폭되었는지 여부의 확인을 위해 분리 곡선이 형성되었다. 평균 감지 시작 주기(Ct) 및 스텐다드 에러는 개개의 스테이지당 두번 측정된 Ct 값으로부터 계산되었다. 표준화된 평균 Ct 는 input 의 평균 Ct를 감하여 ΔCt로 추산되었다.

12. 유세포분석

HL-60 세포가 G9a 또는 sh-G9a RNA로 형질감염되었다. 24시간 후, 형질감염된 HL-60 세포에 1 μM ATRA를 72시간 동안 처리하였다. CD11B 및 CD14 발현을 FACS 분석으로 검출하였고, Wright-Giemsa 염색이 세포 형상을 확인하기 위해 수행되었다. 세포는 CD14-APC (eBiosience) 및 CD11B-PE (Millipore) 항체로 염색되었고, FACS Aria I (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정되었다. 결과는 FACScan Cell Quest 소프트웨어 (BD Biosciences)로 분석되었다.

< 실시예 1> ATRA 에 의한 백혈병 세포주 분화시 H3K9 - Me2 의 JAK2 유전자 타겟 위치 검토

H3K9-Me2이 백혈병 세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 전골수성 백혈병 세포주인 HL-60를 대상으로 Chip-chip 분석을 수행하였다. TSS 타겟 영역 중, JAK2가 H3K9-Me2의 잠재적 타겟임을 확인하였다. JAK2는 인간 크로모좀 9(9p24)에 위치하며, H3K9-Me2 타겟 위치는 JAK2의 프로모터로 나타났다(도 1a 참조)

< 실시예 2> H3K9 - Me2 타겟 유전자 JAK2 프로모터의 확인

HL-60 세포가 ATRA로 처리되었고, 후성적 상태 및 크로마틴 리모델링 인자의 JAK2 프로모터에의 접근이 분석되었다. 첫번째로, 본 발명의 발명자들은 JAK 발현이 HL-60 세포주의 ATRA-매개 분화 중 음성 조절됨을 확인하였다(도 1b 및 도 1c 참조). JAK2 프로모터에서 H3K9-me2 수준은 ATRA 처리에 의해 증가한 반면(도 1d의 A), 세포 분화에 따라 H3K9-me2 수준은 감소하였다(도 1d의 B). 이에 따라 예상한 바와 같이, H3 및 H4 히스톤 아세틸화는 ATRA가 처리된 세포에서의 JAK2 프로모터에서 현저히 감소하였다(도 1d의 C 및 D 참조). H3K9-me2과 같은 히스톤 변형은 다양한 크로마틴 리모델링 보조인자를 접근시키고, 이를 통해 목적하는 유전자의 전사를 조절한다. 본 발명의 발명자들은 JAK2 프로모터와 연관된 보조인자를 조사하였다. H3K9-me2는 전사 억제 마커이며, 보조-억제자인 HDAC1 및 SMRT의 JAK2 프로모터로의 접근을 촉진함이 ATRA 처리 후 ChIP 분석 및 실시간 PCR결과에서 확인되었다(도 1d의 E 및 F 참조). 상기 보조-억제자 복합체의 결합 증가 및 히스톤 변형의 억제는 JAK2 프로모터를 억제하며, 나아가 JAK2가 ATRA에 의한 HL-60 세포 분화에서 매우 억제되어 있음이 확인되었다. JAK2 디스털 프로모터 영역에서는 히스톤 변형 또는 보조-억제인자 접근 변화가 관찰되지 않았다(도 1d의 A-F 참조).

상기 결과를 통해, ATRA 처리로 인한 백혈병 세포 분화 중, JAK2 프로모터는 H3K9 메틸화되고, 다양한 보조-억제인자 복합체로 인해 전사가 억제됨을 알 수 있었다.

< 실시예 3> JAK2 발현을 조절하는 G9a 의 확인

ATRA 처리로 인한 백혈병 세포 분화 중 JAK2가 음성적으로 조절된다는 사실을 통해, 상기 기작에 후성적 조절자가 관여하는지 여부를 확인하였다.

JAK2가 H3K9-me2 타겟 유전자로 ChIP-chip 프로파일링을 통해 스크리닝되었고, H3K9 HMTase 에 집중하여 이들 중 유전자 전사 억제에 연관된 효소를 선별하였다. 실시간 RT-PCR로 테스트된 HMTases 중 G9a가 JAK2 발현을 현저히 저해하는 것을 확인하였다(도 2a 참조). G9a에 의한 JAK2 발현의 억제는 웨스턴 블랏으로 분석되었고, 이는 G9a가 JAK2 전사 조절에 관여함을 시사하였다(도 2b 참조). G9a에 의한 JAK2 발현의 음성적 조절은 두 종류의 sh-G9a RNA를 통해 추가로 확인되었다(도 2c 및 도 2d 참조). 서로 다른 G9a의 이소폼이 보고된 바 있고, 항체에 의해 두 G9a 밴드가 검출된 바 있으며, 상기 두 밴드는 본 실시예에 사용된 두 종류의 sh-G9a RNA에 의해 효과적으로 억제되었다(도 2d 참조). HL-60 세포에 ATRA 처리 전 및 후에 G9a 발현을 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏으로 분석한 결과, G9a 발현은 ATRA 처리 후 증가하는 것으로 확인되었다(도 2e 및 도 2f 참조). 상기 언급한 바와 같이, ATRA 처리는 다른 H3K9 HMTase Suv39h1의 발현 수준에 영향을 주지 않았다. G9a 발현이 백혈병 세포 분화시 증가하는 것이 세포 특이적인지 확인하기 위해, 다른 백혈병 진핵 세포주이고, 헤민(hemin)에 의해 분화되는 K562를 대상으로 실험을 수행하였다. ATRA 처리된 HL-60 세포주에 대한 결과와 유사하게, G9a 발현은 헤민 처리 24시간 후부터 증가하였으며, 36시간까지 유지되었다(도 2g 및 도 2h 참조). JAK2 발현 수준은 G9a와 정반대로 나타났다. G9a 발현이 증가하면, JAK2 발현은 감소하였으며, 이는 K562 세포주에서 JAK2 전사가 G9a 에 의해 조절됨을 시사한다(도 2g 및 도 2h 참조). G9a-매개 JAK2 억제에 있어서 HMTase 활성의 중요성이 SET 도메인-삭제된 G9a 돌연변이 G9a-ΔSET 평가로 확인되었는데, 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏 분석에서 JAK2 발현 변화가 관측되지 않음을 알 수 있었다(도 2i 및 도 2j 참조).

상기 결과는 ATRA-매개 HL-60 분화 중 증가된 H3K9 HMTase G9a가 SET 도메인 의존적 조건에서 특이적으로 JAK2 발현을 억제함을 시사한다.

< 실시예 4> JAK2 전사를 억제하는 G9a 의 확인

G9a 가 세포 분화 중 JAK2 발현을 억제하는 결과를 바탕으로, 온전한 세포에서 G9a의 일시적 형질감염을 통해 G9a가 직접적으로 JAK2 전사를 억제하는지 여부를 검토하였다.

본 발명의 발명자들은 G9a-매개 JAK2 전사 조절을 평가하기 위해 JAK2-luc 리포터 시스템을 사용하여 리포터 분석을 수행하였다. JAK2 프로모터 부위는 다양한 전사 인자 결합부위를 보유하며, -1980 부터 -981 부위를 pGL4.12 [luc2CP] 벡터에 도입하고 루시퍼라아제 분석을 수행하였다. 실시간 PCR 및 웨스턴 블랏 결과와 일치하게, K562 세포주에서 JAK2 전사는 G9a 과발현에 의해 억제되었다(도 3a 참조). SET 도메인-삭제된 G9a 돌연변이를 사용하여, G9a에 의한 JAK2의 전사 억제가 HMTase 활성에 의존적임을 확인하였다. 두 종류의 sh-G9a RNA에 의한 G9a 넉다운 결과, G9a 매개 JAK2 전사 억제 효과를 상실함을 알 수 있었다(도 3a 참조). 상기 결과는 G9a가 직접적으로 JAK2 프로모터에 작용하는 기작을 통해 음성적으로 JAK 전사를 조절함을 시사한다. 헤민 처리에 의한 K562 세포주의 분화는 JAK 전사가 억제됨을 보여준다(도 3B 참조). JAK2 전사 억제에 대한 G9a의 역할을 확인하기 위해, G9a 특이적 저해제인 BIX 01294의 효과를 검토하였다. G9a-매개 JAK2 전사 억제는 BIX 01294 농도를 증가시킴에 따라 회복됨을 알 수 있었는바(도 3C 참조), G9a 가 JAK2의 전사를 억제하는 역할을 수행함을 알 수 있었다.

상기 결과는 백혈병 세포 분화시 G9a가 JAK2의 전사를 억제하며, 상기 억제는 HMTase 활성 의존적임을 시사한다.

< 실시예 5> G9a 의 JAK2 저해 기작에 관여된 YY1 의 확인

본 발명의 발명자들은 JAK2 프로모터 서열을 분석하여 전사인자 결합부위를 조사하였다. 다양한 전사인자가 결합하는 다양한 결합부위 중에서, 본 발명의 발명자들은 YY1 결합부위가 JAK2 프로모터 영역의 -1230 부터 -1031 사이에 위치하는 것을 확인하였고, 이는 YY1 이 JAK2 전사에 연관되어 있음을 시사한다. YY1은 배발생, 세포증식, 분화, 사멸 및 종양형성에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. G9a 및 YY1간의 상호작용 조사를 위해 co-IP 분석을 수행하였다. 첫번째로, 본 발명의 발명자들은 G9a 및 YY1을 공동 형질감염시켰으며, 면역침각분석(IP)을 상기 두물질에 대한 항체로 수행하였다. 면역침강분석 결과, YY1이 G9a 와 강하게 결합함을 알 수 있었다(도 4a 참조). 또한, 상기 두 단백질간의 endogenous interaction 분석 결과, G9a 및 YY1은 in vivo에서도 상호 결합함을 알 수 있었다(도 4b 참조). 상기 결과는 G9a 가 JAK2 전사를 YY1과의 상호작용을 통해 억제함을 시사한다.

YY1은 N-말단 활성 도메인(AD), C-말단 DNA 결합 도메인(DBD) 및 중간의 억제 도메인(RD)으로 구성되어 있다. 본 발명의 발명자들은 각 도메인을 포함하는 세 종류의 YY1 결실 돌연변이를 제작하고, GST-풀다운 분석을 수행하여 어떤 도메인이 상호결합에 작용하는지 확인하였다. 풀다운 분석 결과, YY1의 RD 및 DBD 도메인이 G9a와 각각 상호작용하나, 전체 YY1의 상호작용에 비해 그 강도가 약함을 알 수 있었다(도 4c 참조).

본 발명의 발명자들은 또한 G9a에 의한 JAK2의 음성적 조절에 YY1이 시너지 효과를 발휘하는지 여부를 조사하였다. 실시간 PCR 결과, YY1은 G9a-매개 JAK2 저해에 추가적인 효과를 가져오지 못함을 알 수 있었다. YY1 단독 또는 YY1 및 G9a의 발현은 JAK2 발현 감소에 추가적인 효과를 보이지 못했다(도 4d 참조). 웨스턴 블랏 실험 결과 또한, JAK2 발현은 G9a 단독 처리된 경우와 G9a 및 YY1 공동 형질감염된 경우에서 억제 정도에 차이가 없음을 보여준다(도 4e 참조).

G9a-매개 JAK2 전사 억제에 미치는 G9a 및 YY1의 상호작용 효과를 조사하기 위해, G9a 및 YY1을 대상으로 한 JAK2-luc 리포터 분석을 수행하였다. 상기 결과와 일치하게, G9a 또는 YY1 단독은 JAK2 전사를 억제하였다. 또한 G9a 공동 형질감염 및 YY1 양의 증가는 JAK2 전사를 추가로 억제하지는 않는 것으로 나타난 바, 이는 YY1 기능이 JAK2 프로모터에의 G9a 인도이며, 직접적인 전사 억제 효과는 없음을 시사한다(도 4f 참조).

G9a 매개 JAK2 전사 억제가 보조 억제자인 HDAC와 연관되어 있는지 확인하기 위해, HDAC 및 HDAC 저해제 TSA를 사용하여 JAK2 리포터 분석을 수행하였다. TSA의 처리는 G9a 의한 JAK2 전사 억제를 회복시켰고, 이는 HDAC가 G9a-유도 JAK2 전사 억제에 연관되어 있음을 시사한다(도 4g 참조). HDAC2 및 G9a의 공동 형질감염은 각각 G9a-매개 JAK2 발현을 억제하는 효과를 보였다(도 4g 참조). NIA의 추가는 G9a-매개 JAK2 전사 억제에 영향을 주지 못하는 것으로 나타났고, 이는 다른 히스톤 디아세틸라아제인 시르투인(sirtuin)은 상기 기작과 무관함을 시사한다(도 4g 참조).

G9a-매개 전사억제에 있어서 YY1의 역할이 추가로 si-YY1 RNA 존재 하에서 JAK-luc 리포터 분석으로 검토되었다. 두 종류의 si-YY1 RNA 로 인한 YY1 넉다운 결과, G9a로 인해 유도된 JAK2 전사 억제는 모두 회복되었다(도 4h 참조). 상기 결과는 G9a 에 의한 JAK 전사의 음성적 조절은 YY1 존재에 의존적임을 시사한다. JAK2의 음성적 조절은 YY1에 의존적이며, 이는 YY1 넉다운 조건에서 증가하는 JAK2 발현을 통해 확인할 수 있다(도 4i 참조). 상기 결과를 종합하면, G9a는 YY1과 in vivo에서 상호작용하고, YY1 의존적으로 JAK2 전사 억제를 매개함을 알 수 있었다.

< 실시예 6> G9a 및 YY1 의 JAK2 저해 기작 검토

G9a에 의한 JAK2 전사 조절 기작을 보다 자세히 확인하기 위해, ChIP 분석 및 실시간 PCR을 수행하였다. 먼저, ATRA 존재 하에서 G9a의 JAK2 프로모터에의 접근이 12배 가량 증가하는 것으로 확인되었으며, 이는 ChIP-chip 분석의 초기 결과와 일치한다(도 5a 참조). ATRA 존재 하에서 YY1 접근 또한 ~2.5배 증가하였다. 디스털 JAK2 프로모터 영역에서 G9a 및 YY1 수준의 변화는 관찰되지 않았다. 그 후 G9a를 과발현시킨 후, JAK2 프로모터의 프록시멀 프로모터 영역에 위치하는 H3K9-me2 가 증가함을 확인하였고, 디스털 영역에는 그렇지 않음을 확인하였다(도 5b 참조). 다음으로, YY1이 G9a 의 JAK2 프로모터에의 접근에 작용하는지 여부를 확인하였다. 도 5c 및 도 5d는 G9a가 JAK2 프로모터에 다량 접근하며, 두 종류의 si-YY1 RNA에 의해 유도된 YY1 넉다운에 의해 G9a의 JAK2 프로모터로의 접근은 대폭 감소됨을 보여준다.

상기 결과는 G9a 가 JAK2 를 YY1 전사인자의 JAK2 프로모터에 결합시키는 기작을 통해 억제함을 보여준다. JAK2 프로모터에서의 H3K9-me2 수준이 YY1 결실에 의해 감소된다는 사실 또한 G9a-매개 JAK2 전사 억제 기작이 YY1 의존적임을 시사한다(도 5c 및 도 5d 참조). 상기 결과는 ATRA에 의한 HL-60 세포 분화시 G9a가 YY1과 상호작용하고 이를 프로모터로 인도하는 기작을 통해 JAK2 발현을 억제함을 시사한다.

< 실시예 7> G9a 의 lmo2 프로모터 H3Y41 인산화 저해능 검토

JAK2가 히스톤 H3Y41을 인산화하며, HP1α를 백혈병 유발 유전자 lmo2의 프로모터에서 유리시키는 역할을 수행함이 알려져 있다. G9a가 음성적으로 JAK2 전사를 조절한다는 실험 결과를 바탕으로, G9a가 H3Y41 인산화와 직접적으로 연관이 있는지 여부를 조사하였다.

Suv39h1과 비교시, G9a 과발현은 H3Y41 인산화를 감소시켰고(도 6a 참조), 이러한 H3Y41 인산화의 조절은 두 종류의 sh-G9 RNA를 사용한 실험 결과에서도 뒷받침된다(도 6b 참조). 또한, H3Y41 인산화의 저해는 G9a의 HMTase 활성에 의존적으로 나타났다(도 6c 참조). 또한 JAK2 타겟 유전자 lmo2에서 H3Y41 인산화 변화를 검토하였다. G9a가 과별현되었을 때, lmo2 프로모터에서 H3Y41 인산화 수준은 현저하게 감소되었다(도 6d 참조). 두 종류의 sh-G9a RNA 에 의해 G9a가 넉다운된 조건에서는 H3Y41 인산화 수준이 증가하였다(도 6d 참조). 이에 따라 G9a 는 JAK2의 전사 및 발현을 저해하며, 이에 따라 lmo2 프로모터의 H3Y41 인산화 또한 저해됨을 알 수 있었다.

종합하면, 상기 결과는 G9a 에 의한 JAK2의 저해는 직접적으로 백혈병 유발 유전자 lmo2의 프로모터에서 H3Y41 인산화에 영향을 미치며, 이는 G9a 가 백혈병 발생시의 JAK2-H3Y41-HP1α 전사 신호전달에 연관되어 있음을 시사한다.

< 실시예 8> G9a 의 세포 분화 저해능 검토

ATRA-의존적 백혈병 세포 분화에 미치는 G9a의 역할을 확인하기 위해서, FACS 분석을 통해 CD11b 분화 마커의 발현 수준을 조사하였다.

실험 결과, G9a 단독 감염된 세포에서 대조군에 비해 CD11b 발현이 증가(21.7%)함을 알 수 있었다. 또한 G9a 감염되고 ATRA가 처리된 세포는 현저히 세포 분화 마커가 증가됨을 보였다(74.7%) (도 6e 참조). sh-RNA에 의한 G9a의 넉다운은 ATRA-매개 세포 분화를 감소시켰다.

상기 결과는 G9a 가 JAK2 전사를 억제하며, HL-60의 ATRA-매개 과립구 분화를 유발함을 시사한다. HL-60 세포 분화에 미치는 G9a의 영향은 Giemsa staining을 통한 세포 형태 검사를 통해서도 확인되었다. ATRA, sh-G9a+ATRA, 및 G9a+ATRA 처리 조건에서 분화된 세포는 화살표로 표시되었다(도 6e, 오른쪽 패널 참조). G9a가 ATRA 유도 HL-60 세포 분화에서 작용하는 전체 기작을 도 6f 에 나타내었다. 종합하면, 상기 결과는 G9a가 YY1 과 상호작용하여 JAK2프로모터를 메틸화시키며, 이를 통해 JAK2 전사가 억제되어 HL-60 세포 분화에 중요한 역할을 수행함을 시사한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질을 포함하며, 상기 히스톤 H3K9 메틸트랜스퍼라아제 G9a 단백질이 JAK2의 전사 및 발현을 억제하여 JAK2-H3Y41-HP1 신호전달 경로를 저해하며, 비타민 유도체인 올-트랜스 레티노산(All-trans retinoic acid, ATRA)를 사용한 분화유도요법에서 ATRA과 함께 사용되는 것을 특징으로 하는, 골수증식 장애 예방 또는 치료용 ATRA 분화유도요법 보조제.
제4항에 있어서,
상기 골수증식 장애는 진성 적혈구증가증 (PV), 본태성 혈소판증가증 (ET), 골수 이형성을 수반하는 골수섬유증 (MMM), 특발성 골수섬유증 (CIMF), 미분류 골수증식 장애 (uMPD), 골수성 백혈병(ML), 호산구과다 증후군 (HES) 및 전신성 비만세포증 (SM)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 골수증식 장애 예방 또는 치료용 ATRA 분화유도요법 보조제.
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