KR102010839B1

KR102010839B1 - Esterase-KG01 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof

Info

Publication number: KR102010839B1
Application number: KR1020160179530A
Authority: KR
Inventors: 이경태; 임다정; 고해수; 박미림; 권미라; 장명진
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2019-08-16
Also published as: KR20180075790A

Abstract

본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-KG01 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 에스터라제-KG01 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 유제품, 약제 등의 식품을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an esterase-KG01 gene derived from a black goat rumen microorganism and its use, and more particularly to a novel esterase-KG01 gene selected from a black goat rumen microorganism and a protein product thereof, It relates to additives, detergent compositions, and methods for producing foods such as dairy products and pharmaceuticals.

Description

Esterase-KG01 gene from rumen microorganism of black goat and uses approximately

식물 세포벽의 주요 구성 성분은 셀룰로오스(celluloase), 헤미-셀룰로오스(hemi-cellulose), 펙틴(pectin)이며, 이들은 초식동물의 반추위에서 복잡하고도 효과적인 과정을 통해 미생물에 의해 분해 및 흡수된다. The major components of plant cell walls are cellulose (celluloase), hemi-cellulose and pectin, which are degraded and taken up by microorganisms through complex and effective processes in the rumen of herbivores.

반추위의 미생물은 극도의 혐기성으로, 곰팡이, 프로토조아 및 박테리아를 포함하며, 섬유소의 분해는 주로 박테리아와 곰팡이가 담당하는 것으로 알려져 있다. Rumen microorganisms are extremely anaerobic and include fungi, protozoa and bacteria, and the breakdown of cellulose is known to be primarily responsible for bacteria and fungi.

하지만 이들 미생물은 대부분 배양이 어려워 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 현재까지 알려진 바로, 반추위 미생물 중에서 식물 세포벽을 소화하는데 주요하게 관여하는 박테리아로는 파이브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes), 루미노코커스 플라베파시엔스(Ruminococcus flavefaciens), 루미노코쿠살버스(Ruminococcusalbus), 부티리비브릭 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens), 유박테리움 셀룰로솔벤스(Eubacterium cellulosolvens), 프레보텔라(Prevotella), 및일부 클로스트리디움(Clostridium) 속에 속하는 박테리아가 밝혀져 있다. 현재까지 대부분의 반추동물의 섬유소분해효소 유전자를 발굴하기 위하여 소와 토끼, 캥거루의 소화기관의 총 미생물 DNA, 혹은 메타게놈(metagenome; 환경미생물의 총 DNA를 일컬음)에 대한 연구가 진행되었으며, 이를 통해 다수의 글루카나아제(glucanase), 및 셀룰로솜 복합체(cellulosome complex)들이 밝혀진 바 있다. However, most of these microorganisms are difficult to cultivate and are not well known. Among the rumen microorganisms known to date, the major bacteria responsible for digesting plant cell walls include Fibrobacter succinogenes , Ruminococcus flavefaciens, and Luminococcalbus. Ruminococcusalbus), has been shown that bacteria belonging to the genus -butyrolactone Libby P brick debris brush Bence (Butyrivibrio fibrisolvens), oil cake Te as Solarium cellulite brush Bence (Eubacterium cellulosolvens), pre-correction telra (Prevotella), and some of Clostridium (Clostridium). To date, most of ruminant fibrinase genes have been studied to investigate the total microbial DNA or metagenome of the digestive system of cattle, rabbits and kangaroos. A number of glucanases and cellulosome complexes have been identified.

그러나, 상기 대부분은 연질의 식물 섬유소원을 먹이로 진화한 경우이다. 산업적으로는 섬유소분해효소 중 보다 경질의 섬유소원에 대한 분해능력이 요구된다. However, most of these cases have evolved to feed soft plant fibrinogen. Industrially, the ability to decompose harder fibrinogen among fibrinase is required.

흑염소는 나뭇가지 및 껍질, 그리고 초목과 같이 보다 조악한 섬유소원의 사료를 잘 소화하도록 진화하였다. 이는 흑염소의 반추위 미생물군이 다른 초식동물과 다르게 공생되어 진화되었다는 것을 의미한다. 난배양성 미생물군에 대한 유전자 탐색을 위하여 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid) 및 BAC(bacterial artificial chromosome) 유전자은행을 이용하여 신규 물질을 탐색하는 기술이 널리 사용되고 있다. 이러한 방법으로 현재까지 많은 섬유소분해효소 유전자가 밝혀진 바 있다.Black goats have evolved to better digest diets of coarser fibrinogens such as twigs, bark, and vegetation. This means that the rumen microbial community of black goats evolved symbioticly from other herbivores. In order to search for genes for a non-cultured microbial population, a technique for searching for new materials using phosmid, cosmid and bacterial artificial chromosome (BAC) gene banks is widely used. In this way, many fibrinase genes have been identified.

한국공개특허공보 제2011-0119961호Korean Laid-Open Patent Publication No. 2011-0119961 한국공개특허공보 제2007-0116881호Korean Laid-Open Patent Publication No. 2007-0116881

이와 같은 기술적 배경하에서 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Under such technical background, the present inventors have completed the present invention as a result of diligent effort.

결국, 본 발명의 목적은 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-KG01 유전자 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.After all, it is an object of the present invention to provide an esterase-KG01 gene derived from a black goat rumen microorganism and its use.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제 KG01 유전자가 제공될 수 있다.According to one aspect of the present invention, an esterase KG01 gene derived from a black goat rumen microorganism, which consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, may be provided.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-리파아제(esterase_lipase) 도메인 계열인 에스터라제 단백질이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, an esterase protein which is a family of esterase-lipase domains derived from a black goat rumen microorganism, which is encoded from the gene and consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, may be provided. .

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a recombinant vector comprising the gene may be provided.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a host cell transformed with the recombinant vector may be provided.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 에스터라제 단백질을 포함하는 지방 분해 증진용 사료첨가제가 제공될 수 있다.According to another aspect of the invention, there may be provided a feed additive for fat degradation enhancement comprising the esterase protein.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 에스터라제 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a detergent composition comprising the esterase protein may be provided.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 에스터라제 단백질을 포함하는 식품이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a food comprising the esterase protein may be provided.

본 발명은 신규한 흑염소 반추위 미생물 유래의 지방분해효소 제공하며, 이를 통해 보다 다양한 기질을 분해할 수 있다. 본 발명을 활용하여 사료 곡물 가격 상승에 대비한 저가의 사료 첨가제를 개발할 수 있고, 유제품 및 약제 등의 식품 공정에 이용할 수 있으며, 얼룩제거 및 이를 이용한 세제개발 등 다양한 방면에 적용할 수 있다. The present invention provides a lipase derived from a novel black goat rumen microorganism, through which it is possible to decompose more various substrates. By using the present invention can be developed a low-cost feed additive in preparation for rising feed grain prices, can be used in food processing, such as dairy products and pharmaceuticals, can be applied to various aspects, such as stain removal and the development of detergents using the same.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포스미드(Fosmid) 유전자 은행 구축을 위한 메타게놈 DNA 부분절단 조건 확립 및 삽입 DNA 절단 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Ad 분획과 Lq 분획에 대한 포스미드 유전자은행 평균 삽입 크기 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리부티린-아가(Tributyrin-Agar) 플레이트 상에 접종 후, 트리부티린 분해에 따라 투명환이 생긴 클론 선발 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터라제-KG01의 뉴클레오티드 검색(nucleotide blast) 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터라제-KG01 단백질 검색(protein blast)에 따른 주요 도메인 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터라제-KG01 단백질 검색(protein blast) 결과에 따른 주요 유사 단백질을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 에스터라제-KG01 단백질 검색(protein blast) 결과 중 최상위 상동 단백질과 다른 지방분해효소 단백질과의 유사성 검토(phylogenetic tree) 및 상동성과 추정값을 나타낸다.1 shows the results of establishing the metagenome DNA cleavage conditions and inserting DNA cleavage for constructing a Fosmid gene bank according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the results of confirming the average insertion size of the phosmid gene bank for the Ad fraction and Lq fraction according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the clone selection result of the clear ring after inoculation on the tributyrin-Agar plate according to an embodiment of the present invention, tributyrin degradation.
4 shows nucleotide blast results of esterase-KG01 according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 shows the main domain identification results according to the esterase-KG01 protein search (protein blast) according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows the main analogous protein according to the results of the esterase-KG01 protein search (protein blast) according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 shows a similarity (phylogenetic tree) and homology and estimated value between the highest homologous protein and other lipolytic proteins among the results of esterase-KG01 protein search according to an embodiment of the present invention.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 사용되는 용어, 슈퍼패밀리(superfamily)란, 아미노산 배열, 단백질 기능 및 단백질의 입체 구조 등이 서로 유사한 단백질 군을 의미한다.As used herein, the term "superfamily" refers to a group of proteins similar in amino acid sequence, protein function, and conformation of proteins.

본 발명은 흑염소 반추위 미생물의 섬유소분해 능력에 초점을 두고, 흑염소 반추위 미생물 메타게놈에 대하여 포스미드(fosmid) 유전자은행을 구축하고, 이로부터 통상의 단백질 분해 활성을 검증하는데 활용되는 트리부티린(tributyrin)을 기질로 하여 분해 활성을 갖는 포스미드(fosmid) 클론을 선발하고, 그 클론의 플라스미드 DNA를 해독함으로써 유전정보를 확보하였다. 활성을 갖는 포스미드 클론의 플라스미드 DNA는 Qiagen Midi Prep Kit을 사용하여 추출하였으며, 추출된 DNA는 평균 400bp 길이로 100배수의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing) 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 전환하고, Newbler de novo assembler를 사용하여 조합하여 염기서열 정보를 확보하였다. 확보된 활성 포스미드(fosmid) 플라스미드 DNA 서열정보는 Metagenemark 프로그램을 사용하여 유전자를 찾아내고, 밝혀진 유전자들에 대하여 NCBI blastp 검색을 통해 주요 도메인과 유사 유전자를 검색하여 지방분해효소 관련 유전자를 발굴하였다. The present invention focuses on the fibrinolytic ability of the black goat ruminant microorganism, and establishes a fosmid gene bank for the black goat rumen microorganism metagenome, and from this, tributyrin (tributyrin) is utilized to verify normal proteolytic activity. Using a) as a substrate, a fosmid clone having a degrading activity was selected, and genetic information was obtained by decoding the plasmid DNA of the clone. The plasmid DNA of the phosphid clone having activity was extracted using the Qiagen Midi Prep Kit, and the extracted DNA produced 100 times of shotgun sequencing data with an average length of 400 bp. The produced data was converted to fasta format and combined using a Newbler de novo assembler to obtain sequencing information. The obtained active phosphmid plasmid DNA sequence information was searched for genes using the Metagenemark program, and the genes were identified by searching the major domains and similar genes through NCBI blastp search.

본 발명은 현재까지 공개된 에스터라제 유전자 서열과 매우 상이한 신규의 에스터라제 유전자인 것으로 확인되었다.The present invention has been found to be a novel esterase gene that is very different from the esterase gene sequences disclosed to date.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 에스터라제-KG01 유전자가 제공될 수 있다.According to an aspect of the present invention, an esterase-KG01 gene derived from a black goat rumen microorganism, which consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, may be provided.

본 발명에 따른 에스터라제-KG01 유전자는 에스터라제 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.The esterase-KG01 gene according to the present invention may be DNA or RNA encoding an esterase protein. DNA includes cDNA, genomic DNA or artificial synthetic DNA. DNA can be single stranded or double stranded. DNA may be a coding strand or a non-coding strand.

바람직하게는, 본 발명에 따른 에스터라제-KG01 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로부터 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.Preferably, the esterase-KG01 gene according to the present invention may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. More specifically, the gene may include a nucleotide sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Can be.

폴리뉴클레오티드에 대한 '서열 상동성의 %'는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The '% sequence homology' for a polynucleotide is determined by comparing the two optimally arranged sequences with the comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).

본 발명의 실시예에 따라, 에스터라제-KG01 유전자는 바람직하게는 흑염소 반추위 미생물 유래일 수 있다. 다만, 반드시 이에 제한될 것은 아니며, 본 발명의 실시예는 에스터라제-KG01와 높은 상동성(예를 들어, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성)을 갖고, 흑염소가 아닌 다른 생물의 반추위 미생물로부터 유래한 유전자를 포함할 수 있다. 서열정렬 방법 및 서열 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들어, BLAST 등)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.According to an embodiment of the invention, the esterase-KG01 gene is preferably derived from a black goat rumen microorganism. However, the present invention is not necessarily limited thereto, and embodiments of the present invention have high homology with esterase-KG01 (eg, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, most preferably Preferably at least 95% sequence homology) and may include genes derived from rumen microorganisms of organisms other than black goats. Sequencing methods and means for determining sequence homology (eg, BLAST, etc.) are well known to those of ordinary skill in the art.

본 발명에 따른 에스터라제 단백질의 범위는 흑염소 반추위 미생물로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 에스터라제-리파아제(esterase_lipase) 도메인 계열 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.The range of esterase proteins according to the present invention includes esterase-lipase domain family proteins consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from a black goat ruminant microorganism and functional equivalents of the proteins.

상기 '기능적 동등물'이란 용어는, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 상기 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 용어는, 동일한 에스터라제 활성을 의미한다.The term 'functional equivalent' is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of amino acids. Most preferably, it refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The term 'substantially homogeneous physiological activity' means the same esterase activity.

본 발명은 또한 에스터라제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 상기 '단편', '유도체' 및 '유사체'란 용어는 본 발명에 따른 에스터라제 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.The invention also includes fragments, derivatives and analogues of the esterase protein. The terms 'fragment', 'derivative' and 'analogue' refer to a polypeptide having substantially the same biological function or activity as the esterase protein according to the present invention.

본 발명에 따른 에스터라제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 따라 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.Fragments, derivatives, and analogs of esterase proteins according to the present invention may comprise (i) polypeptides substituted with one or more conservative or non-conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) May or may not be encoded by a genetic code) or (ii) a polypeptide having substituent (s) at one or more amino acid residues, or (iii) another compound (a compound capable of extending the half-life of a polypeptide, eg Polypeptides derived from mature polypeptides bound to, for example, polyethylene glycol), or (iv) additional amino acid sequences (eg, leader sequences, secretory sequences, sequences used to purify the polypeptide, proteinogens) Sequence or fusion protein). Such fragments, derivatives and analogs defined in accordance with the present invention are well known to those skilled in the art.

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 즉 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, ie, the polynucleotide encoding a mature polypeptide, includes a coding sequence encoding only a mature polypeptide; Sequences encoding mature polypeptides and various additional coding sequences; Mature polypeptides (and any additional coding sequences) and sequences encoding noncoding sequences.

상기 '폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'란 용어는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.The term 'polynucleotide encoding a polypeptide' refers to a polynucleotide encoding a polypeptide, or a polynucleotide further comprising an additional coding and / or noncoding sequence.

또한, 본 발명은 상기에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다.The invention also relates to variants of said polynucleotides encoding polypeptides comprising the same amino acid sequence as described above, or fragments, analogs and derivatives thereof. Polynucleotide variants may be naturally occurring allelic variants or non-naturally occurring variants. Such nucleotide variants include substitutional variants, deletional variants, and insertional variants.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.As is well known to those skilled in the art, allelic variants are alternatives to polynucleotides, which may include one or more substituted, deleted or inserted nucleotides, It does not result in a substantial functional change in the polypeptide encoded by it.

본 발명에 따른 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL프로모터, trp프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지의 좌향 프로모터 (pL프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors according to the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector according to the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector according to the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter (for example, a pL promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) capable of promoting transcription It is common to include ribosomal binding sites and transcription / detoxification sequences for initiation of translation. When E. coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway and the phage left promoter (pL promoter) can be used as regulatory sites.

여기서, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX, pQE80L 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.Here, the vectors that can be used in the present invention are plasmids commonly used in the art (eg pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX, pQE80L series, pET series and pUC19, etc.), Phage (eg gt4B, -Charon, z1 and M13 etc.) or viruses (eg SV40 etc.) can be produced.

또한, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 일반적으로 폴리아데닐화 서열을 갖는다.In addition, when the vector according to the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the genome of the mammalian cell (e.g., metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (e.g., adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명에 따른 벡터는 선택표지(marker)로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 더 포함할 수 있다.The vector according to the present invention is a marker, and antibiotic resistance genes commonly used in the art to which the present invention belongs, such as ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin It may further comprise resistance genes for neomycin and tetracycline.

본 발명에 따른 벡터를 원핵세포에 안정적으로 형질전환시킨 후 발현시키기 위한 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 숙주세포, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 또는 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주등을 이용할 수 있다.The host cell for stably transforming the prokaryotic vector and expressing the vector according to the present invention is a host cell commonly used in the art to which the present invention belongs, for example, E. coli. JM109 , E. coli BL21 , E. coli RR1 , E. coli LE392 , E. coli B , E. coli X 1776 , E. coli Strains of the genus Bacillus, such as W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, or enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcensons and various Pseudomonas species.

또한, 본 발명에 따른 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우, 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등을 이용할 수 있다.In addition, when transforming a vector according to the present invention to eukaryotic cells, as host cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines), plant cells, and the like.

본 발명에 따른 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of transporting the vector according to the present invention into a host cell is performed by using the CaCl ₂ method or one method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983) when the host cell is a prokaryotic cell. ) And the electroporation method. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, the vector can be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, or the like. have.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 및 사과산 등과 같은 유기산; 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염)등과 같은 인산염; 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등과 같은 천연 항산화제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.Feed additives according to the present invention include organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid; Phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate) and the like; Natural antioxidants such as polyphenols, catechins, alpha-tocopherols, rosemary extracts, vitamin C, green tea extracts, licorice extracts, chitosan, tannic acid, phytic acid, and the like; have.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소 및 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들어, 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들어, 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들어, 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들어, 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들어, 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 첨가제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.Feed additives according to the present invention include adjuvant components such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antimicrobials, antioxidants, antifungal enzymes and other microbial agents in the form of live bacteria; Cereals such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feed, such as rape, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Dry ingredients consisting of sugars and dairy products such as various powdered milk and whey powders; Main components such as lipids, for example animal fats and vegetable fats, optionally liquefied by heating; It may further include one or more selected from additives such as nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, disease prevention agents and the like.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.Feed additives according to the invention may be in the form of a dry or liquid formulation, and may include excipients for feed addition. The feed additive excipients include, for example, zeolite, jade powder or rice bran, and are not necessarily limited to the above examples.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 효소 제제, 예를 들어, 리파아제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.The feed additive according to the present invention is contained in an enzyme preparation, for example, a lipase such as lipase, a phytase which decomposes phytic acid to make phosphate and inositol phosphate, starch and glycogen, etc. Amylase, an enzyme that hydrolyzes α-1,4-glycoside bonds, phosphatase, an enzyme that hydrolyzes organic phosphate esters, and maltose as two molecules of glucose It may further include one or more selected from hydrolase hydrolyzing maltase and saccharose to convert to a glucose-fructose mixture.

본 발명에 따른 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.The feed additive according to the present invention may be administered to an animal alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. In addition, the feed additives can be easily administered as top dressings or directly mixed with livestock feed or separately from the feed, in a separate oral formulation, or in combination with other ingredients.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.As is commonly known in the art, single daily or divided daily intakes may be used.

본 발명에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.Animals that may be used in the feed additives according to the present invention include, for example, cattle, chicks, chickens, domestic chickens, roosters such as edible cattle, cows, calves, pigs, piglets, sheep, goats, horses, rabbits, dogs, cats, etc. And poultry such as ducks, geese, turkeys, quails, birds, and the like, and are not necessarily limited to the above examples.

본 발명에 따른 사료 첨가제에 포함되는 본 발명에 따른 에스터라제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 지방원 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.The amount of the esterase according to the present invention included in the feed additive according to the present invention is not particularly limited, but is suitable for decomposing fat source substances while living for a long time in the digestive tract of livestock, as is commonly known in the art. Included in quantity.

본 발명에 따른 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔, 페이스트 또는 슬러리 형태일 수 있다. 상기 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다.The detergent compositions according to the invention may be in the form of one and two part aqueous detergent compositions, non-aqueous liquid detergent compositions, cast solids, granules, particles, compressed tablets, gels, pastes or slurries. When the food composition is used, the food residue film and other small amount of the food composition can be quickly removed.

본 발명에 따른 세제 조성물은 지방의 촉매-매개 가수분해를 통한 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.Detergent compositions according to the invention may be effective in removing dried stains via catalyst-mediated hydrolysis of fats.

본 발명에 따른 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 또는 콘택트 렌즈 세정 용액과 같은 형태로 제공될 수 있다.The detergent composition according to the present invention may be provided in the form of a detergent composition for cleaning a hard surface, a detergent composition for cleaning a fabric, a detergent composition for washing dishes, a mouthwash detergent composition, a denture cleaning detergent or a contact lens cleaning solution. .

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 에스터라제 단백질을 포함하는 식품이 제공될 수 있다. 상기 에스터라제 단백질은 액체 또는 고체 형태로 사용이 가능할 수 있다. 또한, 상기 식품은 분말, 환, 음료, 차 또는 일반 식품의 첨가물일 수 있다. According to another aspect of the present invention, a food comprising the esterase protein may be provided. The esterase protein may be available in liquid or solid form. In addition, the food may be an additive of powder, pill, beverage, tea or general food.

상기 단백질은 고지방식이에서 지질의 함량을 감소시킬 수 있고, 이에 한정하는 것은 아니나, 혈행 개선 및 비만 등의 예방효과를 가질 수 있다. The protein may reduce the content of lipids in a high fat diet, but is not limited thereto, and may have a preventive effect such as improved blood circulation and obesity.

본 발명에 따른 식품에 포함되는 본 발명에 따른 에스터라제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 소화관에서 장기간 생존하면서 지방원 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.The amount of the esterase according to the present invention included in the food according to the present invention is not particularly limited, but as it is commonly known in the art, it contains an amount suitable for decomposing fat source material while living in the digestive tract for a long time. do.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are merely to illustrate the present invention is not limited to the contents of the present invention.

실시예Example

실시예Example 1: 흑염소 반추위 미생물 분리 및 DNA 추출 1: Isolation of Black Goat Ruminant Microorganism and DNA Extraction

수컷 2마리와 암컷 1마리 흑염소에 대하여 1개월간 볏짚 사료와 미네랄 보충제만으로 사육한 후, 도축을 실시하였고 이로부터 4개의 위 중에서 첫 번째 위인 반추위를 취하여 그 내용물을 확보하였다. 확보된 내용물은 먼저 거즈를 이용하여 위액상(Lq; liquid phase)과 사료 소화상(Ad; adherent phase)로 구분하여 시료를 준비하였다. 사료 소화상 Ad는 거즈로 거른 후의 찌꺼기를 다시 0.15%(volume/volume) Tween-80, PBS 용액에 현탁하여 볏짚 소화물에 부착된 미생물을 회수한 것이다. 이들에 대해 각각 5g의 침전 시료를 마련하고 이를 CTAB(hexadecylmethylammonium bromide)와 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다. Two males and one female black goat were bred for one month only with rice straw feed and mineral supplements, and then slaughtered and their contents were obtained from the rumen, the first of four stomachs. The obtained contents were first divided into gastric liquid phase (Lq; liquid phase) and feed digestive phase (Ad) using gauze to prepare a sample. Feed digestion ad was suspended in 0.15% (volume / volume) Tween-80, PBS solution after filtering with gauze to recover the microorganisms attached to rice straw digest. For each of them, 5 g of precipitate samples were prepared and total DNA was extracted using CTAB (hexadecylmethylammonium bromide) and SDS (sodium dodecyl sulfate).

실시예Example 2: 흑염소 반추위 미생물 2: black goat rumen microorganism 포스미드Phosmid (( fosmidfosmid ) 유전자은행 구축Gene Bank Construction

Ad와 Lq에서 추출된 DNA에 대하여 포스미드(fosmid) 유전자은행을 구축하기 위한 적절한 크기로 임의 부분절단 조건을 위해 여러 HindIII 제한효소의 양을 조절한 결과, Ad는 HindIII 5units 그리고 Lq는 2.5units를 사용하도록 결정하였다(도 1). By adjusting the amount of various HindIII restriction enzymes for arbitrary partial cleavage conditions to an appropriate size for constructing a fosmid gene bank for the DNA extracted from Ad and Lq, Ad was HindIII 5 units and Lq was 2.5 units. Decided to use (FIG. 1).

부분절단된 DNA 절편들은 Pulse-Field Gel 전기영동 방법을 사용하여 10kb 에서 50kb 사이의 영역을 오려내어 이로부터 다시 인서트 DNA 단편을 수득하였다. 수득된 DNA는 말단 평활화 반응을 수행하고 이를 pCC1FOS 벡터에 리게이션(ligation) 반응으로 연결하였다. 리게이션(Ligation) 연결 반응 후, 이를 DH5alpha 대장균에 전기적 충격법으로 형질전환하여 유전자은행을 구축하였다. The cleaved DNA fragments were cut out from 10 kb to 50 kb using Pulse-Field Gel electrophoresis to obtain insert DNA fragments from them. The obtained DNA was subjected to terminal smoothing reaction and linked to the pCC1FOS vector by ligation reaction. After ligation ligation, DH5alpha Escherichia coli was transformed by electric shock to construct a gene bank.

구축된 포스미드(fosmid) 유전자은행에 대하여 평균 삽입크기를 확인하기 위하여 NotI 효소 처리를 하여 이를 전기영동으로 확인한 결과, Ad의 경우 30 kb, Lq의 경우는 31kb로 판명되었다(도 2). 이들에 대해서 각각 384 well plate 총 150 plates에 냉동보존 가능 배지에 접종하여 초저온냉동고(-70℃)에 보관하였다. As a result of electrophoresis, NotI enzyme treatment was performed to confirm the average insertion size of the constructed fosmid gene bank, and it was found to be 30 kb for Ad and 31 kb for Lq (FIG. 2). Each of them was inoculated in cryopreservable medium in 150 plates of 384 well plates, respectively, and stored in an cryogenic freezer (-70 ℃).

실시예Example 3: 3: 트리부티린Tributyrin (( tributyrintributyrin ) 분해 활성을 지닌 ) With degradation activity 포스미드Phosmid (( fosmindfosmind ) 클론 선발 Clone selection

Ad와 Lq의 포스미드 클론 전부인 115,200개 클론에 대하여 INTEGRA사의 VIAFLO 384 기기를 사용하여, 384 클론 단위로 1% 트리부티린(tributyrin) 기질이 포함된 LB-chloramphenicol 아가 플레이트에 0.5 ㎕씩 접종을 하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 아가 플레이트에서 클론 주변에 투명환이 관찰된 경우, 해당 클론이 지방 분해활성을 갖는 것으로 판단하여 선발하였다(도 3). Inoculate 0.5 μl of LB-chloramphenicol agar plate containing 1% tributyrin substrate in 384 clones using INTEGRA VIAFLO 384 instrument for 115,200 clones of all Ad and Lq phosphid clones. , 48 hours incubation at 37 ℃. When a transparent ring was observed around the clone in the cultured agar plate, the clone was judged to have lipolytic activity and was selected (FIG. 3).

실시예Example 4: 4: 트리부티린Tributyrin (( tributyrintributyrin ) 분해 활성 A) degradation activity 포스미드Phosmid 클론에 대한 염기서열 해독 Sequence Decoding for Clones

실시예 3에서 확인된 포스미드 클론 AD150B02에 대하여 포스미드 플라스미드 추출을 Qiagen plasmid midi prep kit을 사용하여 수행하였으며, 추출된 플라스미드 DNA는 파이로-시퀀싱(pyro-sequencing) 방식인 GS-Junior 플랫폼을 사용하여 평균 400bp 길이로 100배수의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing) 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 전환하여 Newbler 2.5 de novo assembler 프로그램을 사용하여 어셈블리(assembly)를 진행하였다. 총 2개의 컨티그 서열이 만들어졌으며, 20,359bp, 12,755bp의 길이로, 총 33,114bp의 메타게놈 서열 정보를 확보할 수 있었다.Phosmid plasmid extraction was performed using the Qiagen plasmid midi prep kit for the phosphid clone AD150B02 identified in Example 3, and the extracted plasmid DNA was obtained by using the GS-Junior platform, which is a pyro-sequencing method. 100 times as many shotgun sequencing data were produced. The produced data was converted to fasta format and assembled using the Newbler 2.5 de novo assembler program. A total of two contiguous sequences were made, and a total of 33,114 bp of metagenome sequence information was obtained with a length of 20,359 bp and 12,755 bp.

- 서열 발견 장소: 농촌진흥청 국립축산과학원-Place of discovery: National Institute of Animal Science, Rural Development Administration

서열 유래 흑염소: 농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원시험장 출생 흑염소 3두(수컷 2두, 암컷 1두)에 대하여 동물유전체과에서 관리이전 후 볏짚사료와 미네랄 보충제로만 한 달간 급여한 후 도축하여 얻은 반추위 미생물 시료 Sequence-derived black goat: ruminant microorganism obtained by slaughtering three months of black goats (two males, one female) from the National Institute of Animal Science, Rural Development Administration, slaughtered by feeding with straw straw and mineral supplements for one month after management transfer to the animal genome division. sample

- 포스미드 유전자은행 벡터: pCC1FosPhosmid gene bank vector: pCC1Fos

- 유전자 유래 포스미드 클론 명칭: AD150B02Gene-derived phosphide clone name: AD150B02

- 유전자의 DNA 염기서열(서열번호 1) 길이: 939 bp DNA sequence of the gene (SEQ ID NO: 1) length: 939 bp

- 유전자의 아미노산 서열(서열번호 2) 길이: 312 amino acidsThe amino acid sequence of the gene (SEQ ID NO: 2) length: 312 amino acids

- 유전자의 DNA 및 단백질 서열: 하기 표 1, 표 2 및 서열목록 첨부DNA and protein sequences of genes: Table 1, Table 2 and Sequence Listing attached

실시예Example 5: 유전자 탐색 및 유사성 조사 5: Gene search and similarity investigation

확보된 포스미드 클론의 삽입 DNA 염기서열 정보에 대해서는 MetaGeneMark 프로그램을 이용하여 유전자 영역을 탐색하였다. 탐색된 유전자 정보에 대해서는 일차적으로 NCBI의 단백질 검색(protein blast)을 통해 각 유전자의 유사 서열 정보를 얻었으며, 이 과정에서 주요 도메인 검색 결과와 유사 단백질을 참조하여 신규 지방 분해효소 유전자인 에스터라제-KG01 유전자를 발굴하였다. For the DNA sequencing information of the obtained phosmid clone, the gene region was searched using the MetaGeneMark program. As for the searched gene information, the sequence information of each gene was obtained through the protein blast of NCBI. During this process, esterase, a new lipase gene, was referred to by referring to the main domain search results and similar proteins -KG01 gene was excavated.

본 발명에 의한 에스터라제-KG01는 2016년 11월 현재 염기서열 검색(Nucleotide blast) 결과(도 4), 전체 939bp 크기의 유전자에 대해 유사한 서열이 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다. 또한 단백질 검색(protein blast) 결과, N 말단으로부터 59-146 영역에 에스터라제-리파아제 슈퍼패밀리(Esterase_lipase superfamily) 도메인이 위치하며, 29-312 영역에 걸쳐 Aes(Acetyl esterase/lipase) 멀티 도메인이 위치하고 있다(도 5). 유사한 단백질을 탐색한 결과, 소 반추위 미생물 메타게놈 분석을 통해 발견된 에스터라제/리파아제 단백질과 전체 93% 수준에서 48%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다(도 6). BLASTP 결과에서 유사한 다른 종류의 에스터라제_리파아제(esterase_lipase) 단백질 서열과 비교해 본 결과, 에스터라제-KG01 유전자의 산물은 신규한 지방 분해효소라고 할 수 있다(도 7).As of November 2016, the esterase-KG01 according to the present invention was found to have no similar sequence for a gene having a total size of 939 bp (Nucleotide blast). In addition, as a result of protein blast, the esterase_lipase superfamily domain is located at 59-146 region from the N terminus, and the Aes (Acetyl esterase / lipase) multidomain is located at 29-312 region. (FIG. 5). Searching for similar proteins showed homology of 48% at the overall 93% level with the esterase / lipase protein found through bovine rumen microbial metagenomic analysis (FIG. 6). Compared with other similar esterase_lipase protein sequences in the BLASTP results, the product of the esterase-KG01 gene is a novel lipolytic enzyme (FIG. 7).

본 발명에 따른 에스터라제-리파아제(esterase_lipase) 도메인을 포함하고 있는 지방분해효소 에스터라제의 일종인 KG01 유전자의 산물은 사료 첨가제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 세제, 식품가공에도 이용되어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.The product of the KG01 gene, which is a kind of lipase esterase containing the esterase-lipase domain according to the present invention, can not only be used as a feed additive, but also used in detergents and food processing industries. It can be very useful.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Esterase-KG01 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof <130> NPF30584 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 939 <212> DNA <213> Capra hircus <400> 1 atggatatgc ccaagctcga aaccccctgg aagctcaccg ctccggatcc caaggtaccc 60 ggttcccagg gcgaggtgga cgtttccggc gtgacccgga aatggctgga tctcccctat 120 gcgtcccagt cccccagcca gaagctggat atcctcctgc cggaggaggg ggagggcccc 180 ttcccggtgc tgattttcat gcatggcggc gcttacctct tcggcagcaa gcgggatatg 240 cagtttctcc atgccgtgga cggcgtgaac aagggctacg ccgtggtgac ggtggagcag 300 cgtctggcct tcgaggccca gttcccctac ggcctgttcg atctgaaggc ggccatccgc 360 ttccttcggg ccaatgcgga aaagtattcc ctggatccgg accgtttcgc cctcagcggg 420 gacagcgccg gcgcttacta cgccgtcatg tgcgccgcca cccaggatat ccccggctac 480 gaggacttca ccatggggaa tccggaggtt tccagcaagg tccaggcggt ggtgggctgg 540 tatggctgct atcacctgat ggagatgctg cccccggagc cggatccgga taatccgccc 600 cctccgcccc cggcggacag gccccccatg ccggacctgt acaaattcct ggtgggggcc 660 aaacccagag agatccacgg cctgatgtat ttcaccaatc ccctgaactt cgttaccccc 720 gccttcccgc ccgttctcct gcaggcgggc actggggacc aggtggtgcc ccatgcgcag 780 agcatcatgc tccatgaaaa gatccgcgcc gtgtgcggcg aagggcgcag caccctccag 840 cttatggagg gctggaacca cggcggcttc agcttcggct ggtacgagcc ccggcatcag 900 acggaggttt tccggttcct ggaccgggtg ctgaagtag 939 <210> 2 <211> 312 <212> PRT <213> Capra hircus <400> 2 Met Asp Met Pro Lys Leu Glu Thr Pro Trp Lys Leu Thr Ala Pro Asp 1 5 10 15 Pro Lys Val Pro Gly Ser Gln Gly Glu Val Asp Val Ser Gly Val Thr 20 25 30 Arg Lys Trp Leu Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gln Ser Pro Ser Gln Lys 35 40 45 Leu Asp Ile Leu Leu Pro Glu Glu Gly Glu Gly Pro Phe Pro Val Leu 50 55 60 Ile Phe Met His Gly Gly Ala Tyr Leu Phe Gly Ser Lys Arg Asp Met 65 70 75 80 Gln Phe Leu His Ala Val Asp Gly Val Asn Lys Gly Tyr Ala Val Val 85 90 95 Thr Val Glu Gln Arg Leu Ala Phe Glu Ala Gln Phe Pro Tyr Gly Leu 100 105 110 Phe Asp Leu Lys Ala Ala Ile Arg Phe Leu Arg Ala Asn Ala Glu Lys 115 120 125 Tyr Ser Leu Asp Pro Asp Arg Phe Ala Leu Ser Gly Asp Ser Ala Gly 130 135 140 Ala Tyr Tyr Ala Val Met Cys Ala Ala Thr Gln Asp Ile Pro Gly Tyr 145 150 155 160 Glu Asp Phe Thr Met Gly Asn Pro Glu Val Ser Ser Lys Val Gln Ala 165 170 175 Val Val Gly Trp Tyr Gly Cys Tyr His Leu Met Glu Met Leu Pro Pro 180 185 190 Glu Pro Asp Pro Asp Asn Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Asp Arg Pro 195 200 205 Pro Met Pro Asp Leu Tyr Lys Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro Arg Glu 210 215 220 Ile His Gly Leu Met Tyr Phe Thr Asn Pro Leu Asn Phe Val Thr Pro 225 230 235 240 Ala Phe Pro Pro Val Leu Leu Gln Ala Gly Thr Gly Asp Gln Val Val 245 250 255 Pro His Ala Gln Ser Ile Met Leu His Glu Lys Ile Arg Ala Val Cys 260 265 270 Gly Glu Gly Arg Ser Thr Leu Gln Leu Met Glu Gly Trp Asn His Gly 275 280 285 Gly Phe Ser Phe Gly Trp Tyr Glu Pro Arg His Gln Thr Glu Val Phe 290 295 300 Arg Phe Leu Asp Arg Val Leu Lys 305 310 <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Esterase-KG01 gene from rumen microorganism of black goat and uses according <130> NPF30584 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 939 <212> DNA <213> Capra hircus <400> 1 atggatatgc ccaagctcga aaccccctgg aagctcaccg ctccggatcc caaggtaccc 60 ggttcccagg gcgaggtgga cgtttccggc gtgacccgga aatggctgga tctcccctat 120 gcgtcccagt cccccagcca gaagctggat atcctcctgc cggaggaggg ggagggcccc 180 ttcccggtgc tgattttcat gcatggcggc gcttacctct tcggcagcaa gcgggatatg 240 cagtttctcc atgccgtgga cggcgtgaac aagggctacg ccgtggtgac ggtggagcag 300 cgtctggcct tcgaggccca gttcccctac ggcctgttcg atctgaaggc ggccatccgc 360 ttccttcggg ccaatgcgga aaagtattcc ctggatccgg accgtttcgc cctcagcggg 420 gacagcgccg gcgcttacta cgccgtcatg tgcgccgcca cccaggatat ccccggctac 480 gaggacttca ccatggggaa tccggaggtt tccagcaagg tccaggcggt ggtgggctgg 540 tatggctgct atcacctgat ggagatgctg cccccggagc cggatccgga taatccgccc 600 cctccgcccc cggcggacag gccccccatg ccggacctgt acaaattcct ggtgggggcc 660 aaacccagag agatccacgg cctgatgtat ttcaccaatc ccctgaactt cgttaccccc 720 gccttcccgc ccgttctcct gcaggcgggc actggggacc aggtggtgcc ccatgcgcag 780 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Phe Thr Met Gly Asn Pro Glu Val Ser Ser Lys Val Gln Ala 165 170 175 Val Val Gly Trp Tyr Gly Cys Tyr His Leu Met Glu Met Leu Pro Pro 180 185 190 Glu Pro Asp Pro Asp Asn Pro Pro Pro Pro Ala Asp Arg Pro 195 200 205 Pro Met Pro Asp Leu Tyr Lys Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro Arg Glu 210 215 220 Ile His Gly Leu Met Tyr Phe Thr Asn Pro Leu Asn Phe Val Thr Pro 225 230 235 240 Ala Phe Pro Pro Val Leu Leu Gln Ala Gly Thr Gly Asp Gln Val Val 245 250 255 Pro His Ala Gln Ser Ile Met Leu His Glu Lys Ile Arg Ala Val Cys 260 265 270 Gly Glu Gly Arg Ser Thr Leu Gln Leu Met Glu Gly Trp Asn His Gly 275 280 285 Gly Phe Ser Phe Gly Trp Tyr Glu Pro Arg His Gln Thr Glu Val Phe 290 295 300 Arg Phe Leu Asp Arg Val Leu Lys 305 310

Claims

Esterase-KG01 gene for lipolysis derived from the black goat rumen microorganism, consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.

An esterase protein for lipolysis, which is a family of esterase-lipase domains derived from a black goat rumen microorganism, which is encoded from the gene according to claim 1 and consists of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

Recombinant vector comprising a gene according to claim 1.

A host cell transformed with the recombinant vector according to claim 3.

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