KR102010838B1 - Alpha galactosidase cel36-KG101 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an alpha galactosidase cel36-KG101 gene derived from a black goat rumen microorganism and its use, and more particularly to a novel alpha galactosidase cel36-KG101 gene selected from a black goat rumen microorganism and a protein product thereof. And, using the same relates to a feed additive, detergent composition and a method for producing a biofuel.
Description
본 발명은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 흑염소 반추위 미생물로부터 선별한 신규한 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 단백질 산물을 제공하고, 이를 이용하여 사료첨가제, 세제 조성물 및 바이오연료를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an alpha galactosidase cel36-KG101 gene derived from a black goat rumen microorganism and its use, and more particularly to a novel alpha galactosidase cel36-KG101 gene selected from a black goat rumen microorganism and a protein product thereof. And, using the same relates to a feed additive, detergent composition and a method for producing a biofuel.
식물 세포벽의 주요 구성 성분은 셀룰로오스(celluloase), 헤미-셀룰로오스(hemi-cellulose), 펙틴(pectin)이며, 이들은 초식동물의 반추위에서 복잡하고도 효과적인 과정을 통해 미생물에 의해 분해 및 흡수된다. The major components of plant cell walls are cellulose (celluloase), hemi-cellulose and pectin, which are degraded and taken up by microorganisms through complex and effective processes in the rumen of herbivores.
반추위의 미생물은 극도의 혐기성으로, 곰팡이, 프로토조아 및 박테리아를 포함하며, 섬유소의 분해는 주로 박테리아와 곰팡이가 담당하는 것으로 알려져 있다. Rumen microorganisms are extremely anaerobic and include fungi, protozoa and bacteria, and the breakdown of cellulose is known to be primarily responsible for bacteria and fungi.
하지만 이들 미생물은 대부분 배양이 어려워 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 현재까지 알려진 바로, 반추위 미생물 중에서 식물 세포벽을 소화하는데 주요하게 관여하는 박테리아로는 파이브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes ), 루미노코커스 플라베파시엔스(Ruminococcus flavefaciens ), 루미노코쿠살버스(Ruminococcusalbus), 부티리비브릭 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibrisolvens ), 유박테리움 셀룰로솔벤스(Eubacterium cellulosolvens ), 프레보텔라(Prevotella ), 그리고 일부 클로스트리디움(Clostridium) 속에 속하는 박테리아가 밝혀져 있다. 현재까지 대부분의 반추동물의 섬유소분해효소 유전자를 발굴하기 위하여 소와 토끼, 캥거루의 소화기관의 총 미생물 DNA, 혹은 메타게놈(metagenome; 환경미생물의 총 DNA를 일컬음)에 대한 연구가 진행되었으며, 이를 통해 다수의 글루카나아제(glucanase), 및 셀룰로솜 복합체(cellulosome complex)들이 밝혀진 바 있다. However, most of these microorganisms are difficult to cultivate and are not well known. Just known to date, with the main bacteria involved to digest plant cell walls from the rumen microorganisms Ness (Fibrobacter succinogenes) I bakteo succinonitrile to five, luminometer Caucus Playa Pacifica beret Enschede (Ruminococcus flavefaciens ) , Ruminococcusalbus , Butyrivibrio fibrisolvens ( Butyrivibrio fibrisolvens), has been identified as a bacterium belonging to cellulite Solarium Te oil cake in Sol Bence (Eubacterium cellulosolvens), frame Beam telra (Prevotella), and some of Clostridium (Clostridium). To date, most of ruminant fibrinase genes have been studied to investigate the total microbial DNA or metagenome of the digestive system of cattle, rabbits and kangaroos. A number of glucanases and cellulosome complexes have been identified.
하지만, 상기 대부분은 연질의 식물 섬유소원을 먹이로 진화한 경우이다. 산업적으로는 섬유소분해효소 중 보다 경질의 섬유소원에 대한 분해능력이 요구된다. However, most of these cases have evolved to feed soft plant fibrinogen. Industrially, the ability to decompose harder fibrinogen among fibrinase is required.
흑염소는 나뭇가지 및 껍질, 그리고 초목과 같이 보다 조악한 섬유소원의 사료를 잘 소화하도록 진화하였다. 이는 흑염소의 반추위 미생물군이 다른 초식동물과 다르게 공생되어 진화되었다는 것을 의미한다. 난배양성 미생물군에 대한 유전자 탐색을 위하여 포스미드(fosmid), 코스미드(cosmid) 및 BAC(bacterial artificial chromosome) 유전자은행을 이용하여 신규 물질을 탐색하는 기술이 널리 사용되고 있다. 이러한 방법으로 현재까지 많은 섬유소분해효소 유전자가 밝혀진 바 있다.Black goats have evolved to better digest diets of coarser fibrinogens such as twigs, bark, and vegetation. This means that the rumen microbial community of black goats evolved symbioticly from other herbivores. In order to search for genes for a non-cultured microbial population, a technique for searching for new materials using phosmid, cosmid and bacterial artificial chromosome (BAC) gene banks is widely used. In this way, many fibrinase genes have been identified.
이와 같은 기술적 배경하에서 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.Under such technical background, the present inventors have completed the present invention as a result of diligent effort.
결국, 본 발명의 목적은 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.After all, it is an object of the present invention to provide an alpha galactosidase cel36-KG101 gene derived from a black goat rumen microorganism and its use.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자가 제공될 수 있다.According to an aspect of the present invention, the alpha galactosidase cel36-KG101 gene derived from a black goat rumen microorganism may be provided, which consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH36 도메인 계열인 알파 갈락토시다아제 단백질이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, an alpha galactosidase protein, which is a GH36 domain family derived from a black goat rumen microorganism, encoded from the gene and composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, may be provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a recombinant vector comprising the gene may be provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a host cell transformed with the recombinant vector may be provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료첨가제가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a feed additive for fibrin degradation enhancement comprising the alpha galactosidase protein may be provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a detergent composition comprising the alpha galactosidase protein may be provided.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.According to another aspect of the invention, there can be provided a method for producing a biofuel comprising the step of hydrolysis by adding the alpha galactosidase protein to a biomass material.
본 발명은 신규한 흑염소 반추위 미생물 유래의 섬유소분해효소 제공하며, 이를 통해 보다 경질의 섬유소원을 분해할 수 있다. 본 발명을 활용하여 사료 곡물 가격 상승에 대비한 저가의 사료 첨가제를 개발할 수 있고, 지구상에서 가장 풍부한 자원인 섬유소를 이용한 바이오연료를 개발할 수 있으며, 세제 및 식품가공 공정 등 다양한 방면에 적용할 수 있다. The present invention provides a novel fibrinolytic enzyme derived from the new black goat ruminant microorganism, through which the harder fibrinogen can be degraded. By using the present invention, it is possible to develop a low-cost feed additive in preparation for the increase in feed grain price, to develop biofuel using fiber which is the most abundant resource on the planet, and to be applied to various aspects such as detergent and food processing process. .
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 포스미드(Fosmid) 유전자 은행 구축을 위한 메타게놈 DNA 부분절단 조건 확립 및 삽입 DNA 절단 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Ad 분획과 Lq 분획에 대한 포스미드 유전자은행 평균 삽입 크기 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 트리부티린-아가(Tributyrin-Agar) 플레이트 상에 접종 후, 트리부티린 분해에 따라 투명환이 생긴 클론 선발 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101의 뉴클레오티드 검색(nucleotide blast) 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 단백질 검색(protein blast)에 따른 주요 도메인 확인 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 단백질 검색(protein blast) 결과에 따른 주요 유사 단백질을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 단백질 검색(protein blast) 결과 중 최상위 상동 단백질과 다른 섬유소분해효소 단백질과의 유사성 검토(phylogenetic tree) 및 상동성과 추정값을 나타낸다.1 shows the results of establishing the metagenome DNA cleavage conditions and inserting DNA cleavage for constructing a Fosmid gene bank according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the results of confirming the average insertion size of the phosmid gene bank for the Ad fraction and Lq fraction according to an embodiment of the present invention.
Figure 3 shows the clone selection result of the clear ring after inoculation on the tributyrin-Agar plate according to an embodiment of the present invention, tributyrin degradation.
4 shows nucleotide blast results of alpha galactosidase cel36-KG101 according to an embodiment of the present invention.
Figure 5 shows the main domain identification results according to the alpha galactosidase cel36-KG101 protein blast according to an embodiment of the present invention.
Figure 6 shows a major analogous protein according to the alpha galactosidase cel36-KG101 protein blast results according to an embodiment of the present invention.
Figure 7 shows the similarity (phylogenetic tree) and homology and the estimation value of the highest homologous protein and other fibrinolytic protein among the results of alpha galactosidase cel36-KG101 protein blast according to an embodiment of the present invention .
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서 사용되는 용어, '바이오매스(biomass)'란, 태양광을 사용하여 이산화탄소를 고정하는 탄소동화과정을 하는 식물체와 이를 먹고 살아가는 동물체를 포함하는 생물유기체 전반을 일컫는다. 상기 바이오매스로부터 생산되는 알콜, 디젤, 수소와 같은 각종 연료는 바이오연료(biofuel)라 불리우며 이러한 바이오매스, 특히 섬유소와 같은 식물계 바이오매스는 석유로부터 얻어지는 화학물질들을 대체할 수 있는 물질로 제안되고 있다. 식물계 바이오매스는 각종 화학제품을 생산하는데 있어 석유를 원료로 하는 것보다 에너지 수지면에서 유리하다.As used herein, the term 'biomass' refers to the entire bioorganism including a plant that undergoes a carbon assimilation process to fix carbon dioxide using sunlight and an animal that eats and lives the same. Various fuels such as alcohol, diesel, and hydrogen produced from the biomass are called biofuels, and such biomass, especially plant-based biomass such as cellulose, has been proposed as a substitute for chemicals derived from petroleum. . Plant-based biomass is advantageous in energy balance than petroleum-based raw materials for producing various chemical products.
그 이유는 식물계 바이오매스의 경우는 산소를 포함하는 다양한 기능기가 포함되어 있어 기능기가 첨부된 각종 화학제품들을 생산하는 경우 더 낮은 활성화 에너지로 전환이 가능하기 때문이다.The reason is that the plant-based biomass includes various functional groups including oxygen, so that the production of various chemicals to which the functional groups are attached can be converted into lower activation energy.
본 발명에서 사용되는 용어, '바이오연료(biofuel)'란, 연료로 살아있는 유기체뿐 아니라 동물의 배설물 등 대사활동에서 나오는 부산물을 모두 포함하며, 화석연료와는 다른 신재생에너지로 바이오에탄올과 바이오디젤 등이 포함된다.The term 'biofuel' used in the present invention includes not only living organisms as fuels but also all by-products from metabolic activities such as animal excretion, and bioethanol and biodiesel as renewable energy different from fossil fuels. Etc. are included.
본 발명은 흑염소 반추위 미생물의 섬유소분해 능력에 초점을 두고, 흑염소 반추위 미생물 메타게놈에 대하여 포스미드(fosmid) 유전자은행을 구축하고, 이로부터 통상의 단백질 분해 활성을 검증하는데 활용되는 트리부티린(tributyrin)을 기질로 하여 분해 활성을 갖는 포스미드(fosmid) 클론을 선발하고, 그 클론의 플라스미드 DNA를 해독함으로써 유전정보를 확보하였다. 활성을 갖는 포스미드 클론의 플라스미드 DNA는 Qiagen Midi Prep Kit을 사용하여 추출하였으며, 추출된 DNA는 평균 400bp 길이로 100배수의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing) 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 염기서열 정보를 확보하였다. 확보된 활성 포스미드(fosmid) 플라스미드 DNA 서열정보는 Metagenemark 프로그램을 사용하여 유전자를 찾아내고, 밝혀진 유전자들에 대하여 NCBI blastp 검색을 통해 주요 도메인과 유사 유전자를 검색하여 섬유소분해효소 관련 유전자를 발굴하였다. The present invention focuses on the fibrinolytic ability of the black goat ruminant microorganism, and establishes a fosmid gene bank for the black goat rumen microorganism metagenome, and from this, tributyrin (tributyrin) is utilized to verify normal proteolytic activity. Using a) as a substrate, a fosmid clone having a degrading activity was selected, and genetic information was obtained by decoding the plasmid DNA of the clone. The plasmid DNA of the phosphid clone having activity was extracted using the Qiagen Midi Prep Kit, and the extracted DNA produced 100 times of shotgun sequencing data with an average length of 400 bp. The produced data was obtained by sequencing information in fasta format. The obtained active phosphmid plasmid DNA sequence information was searched for genes using the Metagenemark program, and the genes were identified by searching for major genes and similar genes through NCBI blastp search.
본 발명은 현재까지 공개된 알파 갈락토시다아제 유전자 서열과 매우 상이한 신규의 알파 갈락토시다아제 유전자인 것으로 확인되었다.The present invention has been identified as a novel alpha galactosidase gene that is very different from the alpha galactosidase gene sequence disclosed to date.
본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자가 제공될 수 있다.According to an aspect of the present invention, the alpha galactosidase cel36-KG101 gene derived from a black goat rumen microorganism may be provided, which consists of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자는 알파 갈락토시다아제 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.The alpha galactosidase cel36-KG101 gene according to the present invention may be DNA or RNA encoding an alpha galactosidase protein. DNA includes cDNA, genomic DNA or artificial synthetic DNA. DNA can be single stranded or double stranded. DNA may be a coding strand or a non-coding strand.
바람직하게는, 본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 보다 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로부터 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.Preferably, the alpha galactosidase cel36-KG101 according to the present invention may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. More specifically, the gene may include a nucleotide sequence having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, most preferably at least 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Can be.
폴리뉴클레오티드에 대한 '서열 상동성의 %'는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The '% sequence homology' for a polynucleotide is determined by comparing the two optimally arranged sequences with the comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
본 발명의 실시예에 따라, 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101는 바람직하게는 흑염소 반추위 미생물 유래일 수 있다. 다만, 반드시 이에 제한될 것은 아니며, 본 발명의 실시예는 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101와 높은 상동성(예를 들어, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성)을 갖고, 흑염소가 아닌 다른 생물의 반추위 미생물로부터 유래한 유전자를 포함할 수 있다. 서열정렬 방법 및 서열 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들어, BLAST 등)은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.According to an embodiment of the invention, the alpha galactosidase cel36-KG101 may preferably be derived from the black goat rumen microorganism. However, the present invention is not necessarily limited thereto, and embodiments of the present invention have a high homology with alpha galactosidase cel36-KG101 (for example, 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more). , Most preferably at least 95% homology), and may include genes derived from rumen microorganisms of organisms other than black goats. Sequencing methods and means for determining sequence homology (eg, BLAST, etc.) are well known to those of ordinary skill in the art.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 유전자로부터 인코딩되며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 흑염소 반추위 미생물 유래의 GH36 도메인 계열인 알파 갈락토시다아제 단백질이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, an alpha galactosidase protein, which is a GH36 domain family derived from a black goat rumen microorganism, encoded from the gene and composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, may be provided.
본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제 단백질의 범위는 흑염소 반추위 미생물로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 GH36 도메인 계열 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.The range of alpha galactosidase protein according to the present invention includes a GH36 domain family protein consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from a black goat rumen microorganism and a functional equivalent of the protein.
상기 '기능적 동등물'이란 용어는, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 상기 '실질적으로 동질의 생리활성'이란 용어는, 동일한 알파 갈락토시다아제 활성을 의미한다.The term 'functional equivalent' is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of amino acids. Most preferably, it refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The term 'substantially homogeneous physiological activity' means the same alpha galactosidase activity.
본 발명은 또한 알파 갈락토시다아제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 상기 '단편', '유도체' 및 '유사체'란 용어는 본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 의미한다.The invention also includes fragments, derivatives and analogues of alpha galactosidase protein. The terms 'fragment', 'derivative' and 'analogue' refer to a polypeptide having substantially the same biological function or activity as the alpha galactosidase protein according to the present invention.
본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제 단백질의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 따라 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지되어 있다.Fragments, derivatives and analogs of the alpha galactosidase protein according to the present invention may comprise (i) polypeptides substituted with one or more conservative or nonconservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) The amino acid residue may or may not be encoded by a genetic code) or (ii) a polypeptide having substituent (s) at one or more amino acid residues, or (iii) another compound (a compound capable of extending the half-life of the polypeptide). Polypeptides derived from mature polypeptides bound to, for example, polyethylene glycol, or (iv) additional amino acid sequences (eg, leader sequences, secretory sequences, sequences used to purify the polypeptide, protenogens ( proteinogen) sequence or a fusion protein). Such fragments, derivatives and analogs defined in accordance with the present invention are well known to those skilled in the art.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 즉 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, ie, the polynucleotide encoding a mature polypeptide, includes a coding sequence encoding only a mature polypeptide; Sequences encoding mature polypeptides and various additional coding sequences; Mature polypeptides (and any additional coding sequences) and sequences encoding noncoding sequences.
상기 '폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드'란 용어는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.The term 'polynucleotide encoding a polypeptide' refers to a polynucleotide encoding a polypeptide, or a polynucleotide further comprising an additional coding and / or noncoding sequence.
또한, 본 발명은 상기에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다.The invention also relates to variants of said polynucleotides encoding polypeptides comprising the same amino acid sequence as described above, or fragments, analogs and derivatives thereof. Polynucleotide variants may be naturally occurring allelic variants or non-naturally occurring variants. Such nucleotide variants include substitutional variants, deletional variants, and insertional variants.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 주지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안(alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.As is well known to those skilled in the art, allelic variants are alternatives to polynucleotides, which may include one or more substituted, deleted or inserted nucleotides, It does not result in a substantial functional change in the polypeptide encoded by it.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a recombinant vector comprising the gene may be provided.
본 발명에 따른 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pL프로모터, trp프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E. coli)이 이용되는 경우, 대장균 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지의 좌향 프로모터 (pL프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.Vectors according to the invention can typically be constructed as vectors for cloning or expression. In addition, the vector according to the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector according to the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, a strong promoter (for example, a pL promoter, trp promoter, lac promoter, T7 promoter, tac promoter, etc.) capable of promoting transcription It is common to include ribosomal binding sites and transcription / detoxification sequences for initiation of translation. When E. coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway and the phage left promoter (pL promoter) can be used as regulatory sites.
여기서, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX, pQE80L 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4B, -Charon, z1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.Here, the vectors that can be used in the present invention are plasmids commonly used in the art (eg pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX, pQE80L series, pET series and pUC19, etc.), Phage (eg gt4B, -Charon, z1 and M13 etc.) or viruses (eg SV40 etc.) can be produced.
또한, 본 발명에 따른 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 일반적으로 폴리아데닐화 서열을 갖는다.In addition, when the vector according to the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the genome of the mammalian cell (e.g., metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (e.g., adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
본 발명에 따른 벡터는 선택표지(marker)로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 더 포함할 수 있다.The vector according to the present invention is a marker, and antibiotic resistance genes commonly used in the art to which the present invention belongs, such as ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin It may further comprise resistance genes for neomycin and tetracycline.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a host cell transformed with the recombinant vector may be provided.
본 발명에 따른 벡터를 원핵세포에 안정적으로 형질전환시킨 후 발현시키기 위한 숙주세포는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 숙주세포, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 또는 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주등을 이용할 수 있다.The host cell for stably transforming the prokaryotic vector and expressing the vector according to the present invention is a host cell commonly used in the art to which the present invention belongs, for example, E. coli. JM109 , E. coli BL21 , E. coli RR1 , E. coli LE392 , E. coli B , E. coli X 1776 , E. coli Strains of the genus Bacillus, such as W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, or enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marcensons and various Pseudomonas species.
또한, 본 발명에 따른 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우, 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등을 이용할 수 있다.In addition, when transforming a vector according to the present invention to eukaryotic cells, as host cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines), plant cells, and the like.
본 발명에 따른 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of transporting the vector according to the present invention into a host cell is performed by using the CaCl 2 method or one method (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983) when the host cell is a prokaryotic cell. ) And the electroporation method. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, the vector can be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, or the like. have.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 포함하는 섬유소 분해 증진용 사료첨가제가 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a feed additive for fibrin degradation enhancement comprising the alpha galactosidase protein may be provided.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 및 사과산 등과 같은 유기산; 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염)등과 같은 인산염; 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등과 같은 천연 항산화제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.Feed additives according to the present invention include organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid; Phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate) and the like; Natural antioxidants such as polyphenols, catechins, alpha-tocopherols, rosemary extracts, vitamin C, green tea extracts, licorice extracts, chitosan, tannic acid, phytic acid, and the like; have.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소 및 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들어, 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들어, 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들어, 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들어, 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들어, 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 첨가제;로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.Feed additives according to the present invention include adjuvant components such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antimicrobials, antioxidants, antifungal enzymes and other microbial agents in the form of live bacteria; Cereals such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feed, such as rape, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Dry ingredients consisting of sugars and dairy products such as various powdered milk and whey powders; Main components such as lipids, for example animal fats and vegetable fats, optionally liquefied by heating; It may further include one or more selected from additives such as nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, disease prevention agents and the like.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 상기 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등이 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.Feed additives according to the invention may be in the form of a dry or liquid formulation, and may include excipients for feed addition. The feed additive excipients include, for example, zeolite, jade powder or rice bran, and are not necessarily limited to the above examples.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 효소 제제, 예를 들어, 리파아제(lipase)와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다.The feed additive according to the present invention is contained in an enzyme preparation, for example, a lipase such as lipase, a phytase which decomposes phytic acid to make phosphate and inositol phosphate, starch and glycogen, etc. Amylase, an enzyme that hydrolyzes α-1,4-glycoside bonds, phosphatase, an enzyme that hydrolyzes organic phosphate esters, and maltose as two molecules of glucose It may further include one or more selected from hydrolase hydrolyzing maltase and saccharose to convert to a glucose-fructose mixture.
본 발명에 따른 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다.The feed additive according to the present invention may be administered to an animal alone or in combination with other feed additives in an edible carrier. In addition, the feed additives can be easily administered as top dressings or directly mixed with livestock feed or separately from the feed, in a separate oral formulation, or in combination with other ingredients.
본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.As is commonly known in the art, single daily or divided daily intakes may be used.
본 발명에 따른 사료 첨가제가 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.Animals that may be used in the feed additives according to the present invention include, for example, cattle, chicks, chickens, domestic chickens, roosters such as edible cattle, cows, calves, pigs, piglets, sheep, goats, horses, rabbits, dogs, cats, etc. And poultry such as ducks, geese, turkeys, quails, birds, and the like, and are not necessarily limited to the above examples.
본 발명에 따른 사료 첨가제에 포함되는 본 발명에 따른 알파 갈락토시다아제의 양은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바와 같이 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다.The amount of alpha galactosidase according to the present invention, which is included in the feed additive according to the present invention, is not particularly limited, and as long as it is known in the art to which the present invention pertains for a long time in the digestive tract of livestock, It is included in an amount suitable to decompose the substance.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 포함하는 세제 조성물이 제공될 수 있다.According to another aspect of the present invention, a detergent composition comprising the alpha galactosidase protein may be provided.
본 발명에 따른 세제 조성물은 1부 및 2부 수성 세제 조성물, 비수성 액체 세제 조성물, 성형 고체(cast solid), 과립 형태, 입자 형태, 압축 정제, 겔, 페이스트 또는 슬러리 형태일 수 있다. 상기 세제 조성물을 사용하여 음식물의 찌든 때, 음식물 잔류막 및 기타 소량의 식품 조성물을 신속하게 제거할 수 있다.The detergent compositions according to the invention may be in the form of one and two part aqueous detergent compositions, non-aqueous liquid detergent compositions, cast solids, granules, particles, compressed tablets, gels, pastes or slurries. When the food composition is used, the food residue film and other small amount of the food composition can be quickly removed.
본 발명에 따른 세제 조성물은 전분 다당류의 촉매-매개 가수분해를 통한 말라붙은 얼룩 제거에 효과적일 수 있다.The detergent composition according to the present invention may be effective for removing dried stains through catalyst-mediated hydrolysis of starch polysaccharides.
본 발명에 따른 세제 조성물은 단단한 표면을 세정하는 세제 조성물, 직물을 세정하는 세제 조성물, 설거지용 세제 조성물, 구강 세정용 세제 조성물, 의치 세정용 세제 또는 콘택트 렌즈 세정 용액과 같은 형태로 제공될 수 있다.The detergent composition according to the present invention may be provided in the form of a detergent composition for cleaning a hard surface, a detergent composition for cleaning a fabric, a detergent composition for washing dishes, a mouthwash detergent composition, a denture cleaning detergent or a contact lens cleaning solution. .
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 바이오매스 물질에 상기 알파 갈락토시다아제 단백질을 첨가하여 가수분해시키는 단계를 포함하는 바이오연료의 제조방법이 제공될 수 있다.According to another aspect of the invention, there can be provided a method for producing a biofuel comprising the step of hydrolysis by adding the alpha galactosidase protein to a biomass material.
본 발명에 따른 바이오매스 물질은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질이며, 본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 전처리하는 단계; 전처리한 바이오매스를 효소로 가수분해시키는 단계; 및 가수분해된 바이오매스 물질을 발효시키는 단계;로 이루어지며, 상기 바이오연료의 제조방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려진 바이오연료(Biofuel)의 제조방법을 통해 수행될 수 있다.The biomass material according to the present invention is a biomass material containing a high molecular weight carbohydrate, the method for producing a biofuel according to the present invention comprises the steps of pretreatment of a biomass material containing a high molecular weight carbohydrate; Hydrolyzing the pretreated biomass with an enzyme; And fermenting the hydrolyzed biomass material. The method for preparing the biofuel may be performed through a method for preparing a biofuel commonly known in the art.
본 발명에 따른 바이오연료의 제조방법에 있어서, 상기 바이오매스는 전분질계(곡물, 감자류 등), 셀룰로오스계(초본, 임목, 왕겨 등), 당질계(사탕수수, 사탕무 등) 또는 단백질계(가축분뇨, 사체, 미생물 균체 및 이들로부터 유래하는 종이와 음식물찌꺼기 등 유기성 자원)등의 고분자량의 탄수화물일 수 있으며, 반드시 상기의 예시에 한정되지 않는다.In the method for producing a biofuel according to the present invention, the biomass is starch-based (grains, potatoes, etc.), cellulose-based (herbaceous, tree, chaff, etc.), sugar-based (sugarcane, sugar beet, etc.) or protein-based (livestock) Carbohydrates of high molecular weight, such as manure, carcasses, microbial cells and organic resources such as paper and food waste derived from them, and the like.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are merely to illustrate the present invention is not limited to the contents of the present invention.
실시예Example
실시예Example 1: 흑염소 반추위 미생물 분리 및 DNA 추출 1: Isolation of Black Goat Ruminant Microorganism and DNA Extraction
수컷 2마리와 암컷 1마리 흑염소에 대하여 1개월간 볏짚 사료와 미네랄 보충제만으로 사육한 후, 도축을 실시하였고 이로부터 4개의 위 중에서 첫 번째 위인 반추위를 취하여 그 내용물을 확보하였다. 확보된 내용물은 먼저 거즈를 이용하여 위액상(Lq; liquid phase)과 사료 소화상(Ad; adherent phase)로 구분하여 시료를 준비하였다. 사료 소화상 Ad는 거즈로 거른 후의 찌꺼기를 다시 0.15%(volume/volume) Tween-80, PBS 용액에 현탁하여 볏짚 소화물에 부착된 미생물을 회수한 것이다. 이들에 대해 각각 5g의 침전 시료를 마련하고 이를 CTAB(hexadecylmethylammonium bromide)와 SDS (sodium dodecyl sulfate)를 이용하여 총 DNA를 추출하였다. Two males and one female black goat were bred for one month only with rice straw feed and mineral supplements, and then slaughtered and their contents were obtained from the rumen, the first of four stomachs. The obtained contents were first divided into gastric liquid phase (Lq; liquid phase) and feed digestive phase (Ad) using gauze to prepare a sample. Feed digestion ad was suspended in 0.15% (volume / volume) Tween-80, PBS solution after filtering with gauze to recover the microorganisms attached to rice straw digest. For each of them, 5 g of precipitate samples were prepared and total DNA was extracted using CTAB (hexadecylmethylammonium bromide) and SDS (sodium dodecyl sulfate).
실시예Example 2: 흑염소 반추위 미생물 2: black goat rumen microorganism 포스미드Phosmid (( fosmidfosmid ) 유전자은행 구축Gene Bank Construction
Ad와 Lq에서 추출된 DNA에 대하여 포스미드(fosmid) 유전자은행을 구축하기 위한 적절한 크기로 임의 부분절단 조건을 위해 여러 HindIII 제한효소의 양을 조절한 결과, Ad는 HindIII 5units 그리고 Lq는 2.5units를 사용하도록 결정하였다(도 1). By adjusting the amount of various HindIII restriction enzymes for arbitrary partial cleavage conditions to an appropriate size for constructing a fosmid gene bank for the DNA extracted from Ad and Lq, Ad was
부분절단된 DNA 절편들은 Pulse-Field Gel 전기영동 방법을 사용하여 10kb 에서 50kb 사이의 영역을 오려내어 이로부터 다시 인서트 DNA 단편을 수득하였다. 수득된 DNA는 말단 평활화 반응을 수행하고 이를 pCC1FOS 벡터에 리게이션(ligation) 반응으로 연결하였다. 리게이션(Ligation) 연결 반응 후, 이를 DH5alpha 대장균에 전기적 충격법으로 형질전환하여 유전자은행을 구축하였다. The cleaved DNA fragments were cut out from 10 kb to 50 kb using Pulse-Field Gel electrophoresis to obtain insert DNA fragments from them. The obtained DNA was subjected to terminal smoothing reaction and linked to the pCC1FOS vector by ligation reaction. After ligation ligation, DH5alpha Escherichia coli was transformed by electric shock to construct a gene bank.
구축된 포스미드(fosmid) 유전자은행에 대하여 평균 삽입크기를 확인하기 위하여 NotI 효소 처리를 하여 이를 전기영동으로 확인한 결과, Ad의 경우 30 kb, Lq의 경우는 31kb로 판명되었다(도 2). 이들에 대해서 각각 384 well plate 총 150 plates에 냉동보존 가능 배지에 접종하여 초저온냉동고(-70℃)에 보관하였다. As a result of electrophoresis, NotI enzyme treatment was performed to confirm the average insertion size of the constructed fosmid gene bank, and it was found to be 30 kb for Ad and 31 kb for Lq (FIG. 2). Each of them was inoculated in cryopreservable medium in 150 plates of 384 well plates, respectively, and stored in an cryogenic freezer (-70 ℃).
실시예Example 3: 3: 트리부티린Tributyrin (( tributyrintributyrin ) 분해 활성을 지닌 ) With degradation activity 포스미드Phosmid (( fosmindfosmind ) 클론 선발 Clone selection
Ad와 Lq의 포스미드 클론 전부인 115,200개 클론에 대하여 INTEGRA사의 VIAFLO 384 기기를 사용하여, 384 클론 단위로 1% 트리부티린(tributyrin) 기질이 포함된 LB-chloramphenicol 아가 플레이트에 0.5 ㎕씩 접종을 하고, 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양된 아가 플레이트에서 클론 주변에 투명환이 관찰된 경우, 해당 클론이 지방 분해활성을 갖는 것으로 판단하여 선발하였다(도 3). Inoculate 0.5 μl of LB-chloramphenicol agar plate containing 1% tributyrin substrate in 384 clones using INTEGRA VIAFLO 384 instrument for 115,200 clones of all Ad and Lq phosphid clones. , 48 hours incubation at 37 ℃. When a transparent ring was observed around the clone in the cultured agar plate, the clone was judged to have lipolytic activity and was selected (FIG. 3).
실시예Example 4: 4: 트리부티린Tributyrin (( tributyrintributyrin ) 분해 활성 A) degradation activity 포스미드Phosmid 클론에 대한 염기서열 해독 Sequence Decoding for Clones
실시예 3에서 확인된 포스미드 클론 AD147L03에 대하여 포스미드 플라스미드 추출을 Qiagen plasmid midi prep kit을 사용하여 수행하였으며, 추출된 플라스미드 DNA는 파이로-시퀀싱(pyro-sequencing) 방식인 GS-Junior 플랫폼을 사용하여 평균 400bp 길이로 100배수의 샷건 시퀀싱(shotgun sequencing) 데이터를 생산하였다. 생산된 데이터는 fasta 형식으로 전환하여 Newbler 2.5 de novo assembler 프로그램을 사용하여 어셈블리(assembly)를 진행하였다. 총 2개의 컨티그 서열이 만들어졌으며, 각 12,780bp, 9,669bp의 길이로, 총 22,449bp의 메타게놈 서열 정보를 확보할 수 있었다.Phosmid plasmid extraction was performed using the Qiagen plasmid midi prep kit for the phosphide clone AD147L03 identified in Example 3, and the extracted plasmid DNA was obtained by using the GS-Junior platform, which is a pyro-sequencing method. 100 times as many shotgun sequencing data were produced. The produced data was converted to fasta format and assembled using the Newbler 2.5 de novo assembler program. A total of two contiguous sequences were created, and a total of 22,449 bp of metagenome sequence information was obtained with lengths of 12,780 and 9,669 bp, respectively.
- 서열 발견 장소: 농촌진흥청 국립축산과학원-Place of discovery: National Institute of Animal Science, Rural Development Administration
서열 유래 흑염소: 농촌진흥청 국립축산과학원 가축유전자원시험장 출생 흑염소 3두(수컷 2두, 암컷 1두)에 대하여 동물유전체과에서 관리이전 후 볏짚사료와 미네랄 보충제로만 한 달간 급여한 후 도축하여 얻은 반추위 미생물 시료 Sequence-derived black goat: ruminant microorganism obtained by slaughtering three months of black goats (two males, one female) from the National Institute of Animal Science, Rural Development Administration, slaughtered by feeding with straw straw and mineral supplements for one month after transfer to the animal genome division. sample
- 포스미드 유전자은행 벡터: pCC1FosPhosmid gene bank vector: pCC1Fos
- 유전자 유래 포스미드 클론 명칭: AD147L03Gene-derived phosmid clone name: AD147L03
- 유전자의 DNA 염기서열(서열번호 1) 길이: 2,160 bp DNA sequence of the gene (SEQ ID NO: 1) length: 2,160 bp
- 유전자의 아미노산 서열(서열번호 2) 길이: 719 amino acidsThe amino acid sequence of the gene (SEQ ID NO: 2) length: 719 amino acids
- 유전자의 DNA 및 단백질 서열: 하기 표 1, 표 2 및 서열목록 첨부DNA and protein sequences of genes: Table 1, Table 2 and Sequence Listing attached
실시예Example 5: 유전자 탐색 및 유사성 조사 5: Gene search and similarity investigation
확보된 포스미드 클론의 삽입 DNA 염기서열 정보에 대해서는 MetaGeneMark 프로그램을 이용하여 유전자 영역을 탐색하였다. 탐색된 유전자 정보에 대해서는 일차적으로 NCBI의 단백질 검색(protein blast)을 통해 각 유전자의 유사 서열 정보를 얻었으며, 이 과정에서 주요 도메인 검색 결과와 유사 단백질을 참조하여 신규 알파 갈락토시다아제 유전자를 발굴하였다. For the DNA sequencing information of the obtained phosmid clone, the gene region was searched using the MetaGeneMark program. For the searched gene information, the sequence information of each gene was obtained through protein blast of NCBI. In the process, new alpha galactosidase gene was identified by referring to the main domain search results and similar proteins. It was.
본 발명에 의한 알파 갈락토시다아제 Cel36-KG101는 2016년 11월 현재 염기서열 검색(Nucleotide blast) 결과(도 4), 전체 2,160bp 크기의 유전자에 대해 Paenibacillus sp.의 유전체 일부와 유사한 서열을 보이지만, 272bp 영역에 대해 74% 정도의 유사성으로 서로 완전히 다르다고 판단되며, 따라서 Cel36-KG101 유전자의 서열은 현재까지 보고되지 않았다고 결정할 수 있다. Alpha galactosidase Cel36-KG101 according to the present invention is the Nucleotide blast results as of November 2016 (Fig. 4), Paenibacillus for the gene of the entire 2,160bp size Although the sequence is similar to that of a part of the genome of sp ., it is judged to be completely different from each other with about 74% similarity to the 272bp region, and thus, it can be determined that the sequence of the Cel36-KG101 gene has not been reported to date.
또한, 단백질 검색(protein blast) 결과, 글리코실 하이드롤라아제 패밀리 36 도메인(glycosyl hydrolase family 36 domain)이 위치하는 것이 확인되었으며, GalA(alpha-galactosidase) 도메인은 10-638 영역에 걸쳐 위치하고 있다(도 5). 유사한 단백질을 탐색한 결과, Paenibacillus sp .의 알파 갈락토시다아제와 전체 99% 수준에서 51%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다(도 6). BLASTP 결과에서 유사한 다른 종류의 알파 갈락토시다아제 단백질 서열과 비교해 본 결과, ce136-KG101 유전자의 산물은 알파 갈락토시다아제 계통의 섬유소분해효소라고 할 수 있다(도 7).In addition, as a result of protein blast, the glycosyl hydrolase family 36 domain was located, and the GalA (alpha-galactosidase) domain was located over the 10-638 region (Fig. 5). Searching for similar proteins, Paenibacillus sp . Alpha galactosidase was found to have 51% homology at the total 99% level (FIG. 6). As compared with other similar types of alpha galactosidase protein sequences in BLASTP results, the product of ce136-KG101 gene can be said to be a fibrinolytic enzyme of the alpha galactosidase family (FIG. 7).
본 발명에 따른 GH36 도메인을 포함하고 있는 섬유소분해효소 알파 갈락토시다아제의 일종인 cel36-KG101 유전자의 산물은 사료 첨가제로서 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 세제, 식품가공 및 바이오연료 생산에도 이용되어 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.The product of the cel36-KG101 gene, which is a kind of fibrinolytic alpha galactosidase containing the GH36 domain according to the present invention, can be used not only as a feed additive but also in detergents, food processing and biofuel production. It can be used very usefully.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Alpha galactosidase cel36-KG101 gene from rumen microorganism of black goat and uses thereof <130> NPF30583 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2160 <212> DNA <213> Capra hircus <400> 1 atgatcactt ttgacggtga aaaaaggctg tttcatctgc gcaatgattt tctttccctg 60 gtgctttgcc tccggcccga cgaagaaggc gcggaagaat tgctgatggc ttatctgggc 120 gcgccgctgg ataacgccgc ggcatgcctg tacctgacgg atctgaacga aggcgcgtcc 180 tttgattcct tgcgtcaagc gctgccctac gcctgcccca cggaagggcg gggcgattac 240 cggccctctc tggtgtgcgc atcggacggc cagggccagc gctgcaccga gcttttctat 300 cattcccacc gcatcgaacc gggcaagccc tccctggccg gtcttcccgc cgcctacgtg 360 gaaaaagcgg aagaagcgga taccctgtac atcaccctgc gggacgggct caccggcctg 420 tgtgccgagc tgcgctatac cttgtacgtc cgccggcccg cagccgcggt cagtattctg 480 tacagtaacg gcggcgaaaa ggccctgacg ctgctgaacg cgggaagcgc ctgcgtcacc 540 ctgccgggcc ggtacgattt tctccatctg cacggagcct gggccaaaga acggtccgtc 600 gaacgggtat cccccgccgc gctcacccgc tccatcgcct ccgcccgggg 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1500 ggcctgtacc gggtgctgga agcggttacc tccgctttcc cccgcgtcct ctttgagagc 1560 tgctccggcg gcggcggacg gtttgacgca ggcatgctgc attacatgcc ccagacctgg 1620 accagcgatg acaccgacgc cgtggaacgc ctgcgcatcc agtacggcac cagtctgtgc 1680 tatcccgtca gcgccatggg ggctcatgtg tccgccgtgc ccaatcatca ggtgagcagg 1740 atcacgtcca tgcggatgcg gggcgacgtg gccctgggcg gaaattttgg atacgagctg 1800 gatctgtccg tccaaacgcc ggaagatacg gaggaaatct gccgccaggt caaactggta 1860 aaggccctcc gccgcaccac ccagcaaggt gtgttcaccc gtctgcaaag cccctttgag 1920 gacaacattg ccgcctggca gtttgcggac ggaaaccggg tgatcctttg cgcttaccgg 1980 gtgctgaacc gtcccagcgc cgcccccgtc cgcatccgcc tgcgggatgt gccggaaggg 2040 acctataccg cccccgacgg cgtccccgtt accgccgggg acctgatgcg cgccggcgtg 2100 ccccttgctt tcccccggta cgattttgcc tcctgcgtga tggtttttga acgggtataa 2160 2160 <210> 2 <211> 719 <212> PRT <213> Capra hircus <400> 2 Met Ile Thr Phe Asp Gly Glu Lys Arg Leu Phe His Leu Arg Asn Asp 1 5 10 15 Phe Leu Ser Leu Val Leu Cys Leu Arg Pro Asp Glu Glu Gly Ala Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Met Ala Tyr Leu Gly Ala Pro Leu Asp Asn Ala Ala Ala 35 40 45 Cys Leu Tyr Leu Thr Asp Leu Asn Glu Gly Ala Ser Phe Asp Ser Leu 50 55 60 Arg Gln Ala Leu Pro Tyr Ala Cys Pro Thr Glu Gly Arg Gly Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Pro Ser Leu Val Cys Ala Ser Asp Gly Gln Gly Gln Arg Cys Thr 85 90 95 Glu Leu Phe Tyr His Ser His Arg Ile Glu Pro Gly Lys Pro Ser Leu 100 105 110 Ala Gly Leu Pro Ala Ala Tyr Val Glu Lys Ala Glu Glu Ala Asp Thr 115 120 125 Leu Tyr Ile Thr Leu Arg Asp Gly Leu Thr Gly Leu Cys Ala Glu Leu 130 135 140 Arg Tyr Thr Leu Tyr Val Arg Arg Pro Ala Ala Ala Val Ser Ile Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Asn Gly Gly Glu Lys Ala Leu Thr Leu Leu Asn Ala Gly Ser 165 170 175 Ala Cys Val Thr Leu Pro Gly Arg Tyr Asp Phe Leu His Leu His Gly 180 185 190 Ala Trp Ala Lys Glu Arg Ser Val Glu Arg Val Ser Pro Ala Ala Leu 195 200 205 Thr Arg Ser Ile Ala Ser Ala Arg Gly Ala Ser Gly His Glu His Asn 210 215 220 Pro Phe Ala Val Leu Ala Ala Pro Asp Thr Thr Glu Phe Ser Gly Glu 225 230 235 240 Cys Leu Gly Ala Ala Leu Val Tyr Ser Gly Asp Phe Leu Ile Ser Ala 245 250 255 Asp Glu Asn Ala Tyr Ala Ser Thr Arg Leu Ile Leu Gly Leu Asn Pro 260 265 270 Arg Thr Phe Ser Trp Arg Leu Asn Pro Gly Asn Gln Phe Gln Ser Pro 275 280 285 Glu Ala Leu Leu Val Tyr Ser Asp Arg Gly Leu Asn Ala Met Ser Gln 290 295 300 Ala Phe His Ser Leu Ile Arg Gln Arg Val Cys Arg Gly Tyr Trp Arg 305 310 315 320 Asp Arg Glu Arg Pro Val Leu Ile Asn Asn Trp Glu Ala Thr Tyr Phe 325 330 335 Asn Phe Ser His Glu Lys Ile Leu Thr Ile Ala Arg Ala Ala Ala Gln 340 345 350 Ala Gly Ile Glu Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Arg Arg 355 360 365 Asn Ser Asp Asn Cys Ser Leu Gly Asp Trp Thr Val Asn Arg Glu Lys 370 375 380 Leu Pro Gly Gly Leu Ser Ala Leu Ala Arg Asp Ile Asn Ala Leu Gly 385 390 395 400 Leu Lys Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Ser Pro Asp Ser 405 410 415 Asp Leu Tyr Arg Ala His Pro Asp Trp Cys Leu His Ala Glu Gly Arg 420 425 430 Arg Arg Thr Thr Ala Arg Gln Gln Leu Ile Leu Asp Met Ser Arg Arg 435 440 445 Asp Val Gln Asp Tyr Val Val Glu Ala Val Ser Ser Val Leu Arg Ser 450 455 460 Ala Pro Ile Glu Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn Arg Asn Phe Lys Glu 465 470 475 480 Ala Gly Ser Ala Leu Leu Ala Asp Gly Arg Gln Gly Glu Thr Ala His 485 490 495 Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Leu Glu Ala Val Thr Ser Ala 500 505 510 Phe Pro Arg Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Arg Phe 515 520 525 Asp Ala Gly Met Leu His Tyr Met Pro Gln Thr Trp Thr Ser Asp Asp 530 535 540 Thr Asp Ala Val Glu Arg Leu Arg Ile Gln Tyr Gly Thr Ser Leu Cys 545 550 555 560 Tyr Pro Val Ser Ala Met Gly Ala His Val Ser Ala Val Pro Asn His 565 570 575 Gln Val Ser Arg Ile Thr Ser Met Arg Met Arg Gly Asp Val Ala Leu 580 585 590 Gly Gly Asn Phe Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Ser Val Gln Thr Pro Glu 595 600 605 Asp Thr Glu Glu Ile Cys Arg Gln Val Lys Leu Val Lys Ala Leu Arg 610 615 620 Arg Thr Thr Gln Gln Gly Val Phe Thr Arg Leu Gln Ser Pro Phe Glu 625 630 635 640 Asp Asn Ile Ala Ala Trp Gln Phe Ala Asp Gly Asn Arg Val Ile Leu 645 650 655 Cys Ala Tyr Arg Val Leu Asn Arg Pro Ser Ala Ala Pro Val Arg Ile 660 665 670 Arg Leu Arg Asp Val Pro Glu Gly Thr Tyr Thr Ala Pro Asp Gly Val 675 680 685 Pro Val Thr Ala Gly Asp Leu Met Arg Ala Gly Val Pro Leu Ala Phe 690 695 700 Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Cys Val Met Val Phe Glu Arg Val 705 710 715 <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Alpha galactosidase cel36-KG101 gene from rumen microorganism of black goat and uses <130> NPF30583 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2160 <212> DNA <213> Capra hircus <400> 1 atgatcactt ttgacggtga aaaaaggctg tttcatctgc gcaatgattt tctttccctg 60 gtgctttgcc tccggcccga cgaagaaggc gcggaagaat tgctgatggc ttatctgggc 120 gcgccgctgg ataacgccgc ggcatgcctg tacctgacgg atctgaacga aggcgcgtcc 180 tttgattcct tgcgtcaagc gctgccctac gcctgcccca cggaagggcg gggcgattac 240 cggccctctc tggtgtgcgc atcggacggc cagggccagc gctgcaccga gcttttctat 300 cattcccacc gcatcgaacc gggcaagccc tccctggccg gtcttcccgc cgcctacgtg 360 gaaaaagcgg aagaagcgga taccctgtac atcaccctgc gggacgggct caccggcctg 420 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tcccccggta cgattttgcc tcctgcgtga tggtttttga acgggtataa 2160 2160 <210> 2 <211> 719 <212> PRT <213> Capra hircus <400> 2 Met Ile Thr Phe Asp Gly Glu Lys Arg Leu Phe His Leu Arg Asn Asp 1 5 10 15 Phe Leu Ser Leu Val Leu Cys Leu Arg Pro Asp Glu Glu Gly Ala Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Met Ala Tyr Leu Gly Ala Pro Leu Asp Asn Ala Ala Ala 35 40 45 Cys Leu Tyr Leu Thr Asp Leu Asn Glu Gly Ala Ser Phe Asp Ser Leu 50 55 60 Arg Gln Ala Leu Pro Tyr Ala Cys Pro Thr Glu Gly Arg Gly Asp Tyr 65 70 75 80 Arg Pro Ser Leu Val Cys Ala Ser Asp Gly Gln Gly Gln Arg Cys Thr 85 90 95 Glu Leu Phe Tyr His Ser His Arg Ile Glu Pro Gly Lys Pro Ser Leu 100 105 110 Ala Gly Leu Pro Ala Ala Tyr Val Glu Lys Ala Glu Glu Ala Asp Thr 115 120 125 Leu Tyr Ile Thr Leu Arg Asp Gly Leu Thr Gly Leu Cys Ala Glu Leu 130 135 140 Arg Tyr Thr Leu Tyr Val Arg Arg Pro Ala Ala Ala Val Ser Ile Leu 145 150 155 160 Tyr Ser Asn Gly Gly Glu Lys Ala Leu Thr Leu Leu Asn Ala Gly Ser 165 170 175 Ala Cys Val Thr Leu Pro Gly Arg Tyr Asp Phe Leu His 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Leu Gly 385 390 395 400 Leu Lys Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Ser Pro Asp Ser 405 410 415 Asp Leu Tyr Arg Ala His Pro Asp Trp Cys Leu His Ala Glu Gly Arg 420 425 430 Arg Arg Thr Thr Ala Arg Gln Gln Leu Ile Leu Asp Met Ser Arg Arg 435 440 445 Asp Val Gln Asp Tyr Val Val Glu Ala Val Ser Ser Val Leu Arg Ser 450 455 460 Ala Pro Ile Glu Tyr Val Lys Trp Asp Met Asn Arg Asn Phe Lys Glu 465 470 475 480 Ala Gly Ser Ala Leu Leu Ala Asp Gly Arg Gln Gly Glu Thr Ala His 485 490 495 Arg Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val Leu Glu Ala Val Thr Ser Ala 500 505 510 Phe Pro Arg Val Leu Phe Glu Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Arg Phe 515 520 525 Asp Ala Gly Met Leu His Tyr Met Pro Gln Thr Trp Thr Ser Asp Asp 530 535 540 Thr Asp Ala Val Glu Arg Leu Arg Ile Gln Tyr Gly Thr Ser Leu Cys 545 550 555 560 Tyr Pro Val Ser Ala Met Gly Ala His Val Ser Ala Val Pro Asn His 565 570 575 Gln Val Ser Arg Ile Thr Ser Met Arg Met Arg Gly Asp Val Ala Leu 580 585 590 Gly Gly Asn Phe Gly Tyr Glu Leu Asp Leu Ser Val Gln Thr Pro Glu 595 600 605 Asp Thr Glu Glu Ile Cys Arg Gln Val Lys Leu Val Lys Ala Leu Arg 610 615 620 Arg Thr Thr Gln Gln Gly Val Phe Thr Arg Leu Gln Ser Pro Phe Glu 625 630 635 640 Asp Asn Ile Ala Ala Trp Gln Phe Ala Asp Gly Asn Arg Val Ile Leu 645 650 655 Cys Ala Tyr Arg Val Leu Asn Arg Pro Ser Ala Ala Pro Val Arg Ile 660 665 670 Arg Leu Arg Asp Val Pro Glu Gly Thr Tyr Thr Ala Pro Asp Gly Val 675 680 685 Pro Val Thr Ala Gly Asp Leu Met Arg Ala Gly Val Pro Leu Ala Phe 690 695 700 Pro Arg Tyr Asp Phe Ala Ser Cys Val Met Val Phe Glu Arg Val 705 710 715
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