KR101998477B1 - A mutant of L-rhamnose isomerase from Clostridium stercorarium and A method for producing of D-allose from D-allulose using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래의 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase) 변이체 및 이를 이용하여 알룰로스(D-allulose)로부터 알로스(D-allose)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 엘-람노스 이성화효소 변이체를 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 반응의 생물 촉매로서 사용할 때, 야생형 효소에 비해 알룰로스로부터 알로스 전환 효율 및 생산성이 유의적으로 증가할 수 있어, 종래 기술에 따른 알로스 생산 반응에 비해 단가가 낮은 기질을 사용하면서도 개선된 수율을 나타낼 수 있어 생산 경비를 크게 줄임과 동시에 생산 효과를 극대화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소는 알로스 생산 공정의 생체 촉매로서 유용하게 사용될 수 있다.The invention Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from the El-producing Al Ross (D-allose) from rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase) variants and alrul Ross (D-allulose) by using this, ≪ / RTI > When the mutant of the present invention is used as a biocatalyst in the reaction for producing aloses from aluloses, the conversion efficiency and productivity of alu- rous from alulose can be significantly increased as compared with the wild-type enzyme, It is possible to reduce the production cost greatly and to maximize the production effect because it can show an improved yield while using a low-cost substrate compared to the ALOS production reaction according to the technology. Therefore, the mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention can be usefully used as a biocatalyst in an alos production process.

Description

클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 알룰로스로부터 알로스의 생산 방법{A mutant of L-rhamnose isomerase from Clostridium stercorarium and A method for producing of D-allose from D-allulose using the same}A mutant of L-rhamnose isomerase from Clostridium stercorarium and a method for producing D-allose from D-allulose using from L-rhamnose isomerase the same}

본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래의 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase) 변이체 및 이를 이용하여 알룰로스(D-allulose)로부터 알로스(D-allose)를 생산하는 방법에 관한 것이다.The invention Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from the El-producing Al Ross (D-allose) from rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase) variants and alrul Ross (D-allulose) by using this, ≪ / RTI >

알로스(D-allose)는 포도당(D-glucose)의 3번 탄소 에피이성체(epimer)로서, 사이코스(psicose)로도 알려져있는 알룰로스(allulose)의 이성질체이다. 이러한 알로스는 암세포 증식을 저해하는 특징을 가져 항암물질로 사용될 수 있으며, 허혈작용에 의한 장기손상을 억제하는 기능을 가지고 있기 때문에 장기보존액으로 사용될 수 있다. 또한, 알로스는 혈소판 감소를 억제할 수 있을 뿐 아니라 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어있다(Hossain et al., J. Hepatobiliary Pancreat Surg. 10: 218-225, 2003.; Hossain et al., J. Hepatobiliary Pancreat Surg. 11: 181-189, 2004.; Hossain et al., J. Biosci. Bioeng. 101: 369-371, 2006). 따라서, 알로스는 의학적·약학적으로 사용하기 위해 주목받고 있다. 그럼에도 불구하고, 알로스는 자연계에는 극히 미량으로 존재하는 대표적인 희소성 단당이기 때문에 효과적으로 알로스를 의학적·약학적 용도로 연구 및 공급하기 위해서는 먼저 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다.D-allose is the third carbon epimer of glucose (D-glucose), an isomer of allulose, also known as psicose. These aloses can be used as long-term preservatives because they have the function of inhibiting cancer cell proliferation and can be used as anticancer materials and have the function of inhibiting organs damage by ischemic action. In addition, it has been reported that ALOS inhibits platelet reduction as well as inhibits the formation of segmented neutrophil leukocytes (Hossain et al., J. Hepatobiliary Pancreat Surg. 10: 218-225, 2003 Hossain et al, J. Hepatobiliary Pancreat Surg., 11: 181-189, 2004; Hossain et al., J. Biosci. Bioeng., 101: 369-371, 2006). Therefore, ALROSS is attracting attention for medical and pharmacological use. Nevertheless, since ALOS is a representative rare saccharide monosaccharide present in an extremely small amount in the natural world, it is necessary to secure enough ALOS in order to effectively study and supply ALOSS for medical and pharmaceutical purposes.

이와 같은 이유로 알로스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법을 개발하는 것이 필요하다는 인식이 높아지고 있다. 알로스는 현재까지 주로 화학적인 합성법을 통해 생산된 것이 산업적으로 시판되고 있다. 그러나, 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 알로스의 분리 및 정제 과정, 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발된다. For this reason, there is a growing awareness that it is necessary to develop a method for efficiently producing aloses. Alross is produced commercially through chemical synthesis methods until now. However, the chemical synthesis method has various serious problems in its production process. In fact, there is a risk of working environment requiring high temperature and high pressure, a process of separation and purification of complex aloses due to the formation of additional saccharides after chemical reaction, and environmental pollution caused by chemical waste generated in this process.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 환경 친화적이며 높은 특이성으로 당을 효율적으로 생산할 수 있는 방법으로서 미생물에 의해 발현되는 효소를 이용하여 알로스를 고수율로 얻는 생물학적 생산 방법이 연구되었다. 구체적으로 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri), 바실러스 팔리두스(Bacillus pallidus), 써모언에어로박테리움 사카롤라이티쿰(Thermoanaerobacterium saccharolyticum), 칼디셀룰로시럽터 사카롤라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)가 알로스 생산 반응에 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(대한민국 출원번호 제 10-2016-0135638호 및 비특허문헌 1 내지 비특허문헌 5). 엘-람노스 이성화효소 이외에도, 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum) 및 써모토가 레팅게(Thermotoga lettingae) 유래의 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase)를 사용하여 알로스 생산 반응을 촉매하는 방법이 보고되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 6 및 비특허문헌 7). In order to solve such a problem, a biological production method of obtaining alos with high yield by using an enzyme expressed by microorganisms has been studied as a method of efficiently producing a sugar with high environmental specificity and high specificity. Specifically Pseudomonas shoe cherry (Pseudomonas stutzeri), Bacillus sold Douce (Bacillus pallidus), Thermo frozen Aero tumefaciens saccharide Rollei tikum (Thermoanaerobacterium saccharolyticum), kaldi cellulite in syrup emitter saccharide Rollei tea kusu (Caldicellulosiruptor saccharolyticus) and B. subtilis ( It has been reported that L-rhamnose isomerase derived from Bacillus subtilis can be used for the production of aloses (Korean Patent Application No. 10-2016-0135638 and Non-Patent Document 1 to Non-Patent Document 1 Literature 5). El-rhamnose isomerase enzyme addition, Clostridium Thermo selreom (Clostridium thermocellum) and written moto the LES tingge (Thermotoga lettingae) determined by using the license boss-5-phosphate isomerase (ribose-5-phosphate isomerase) derived from Ross A method of catalyzing a production reaction has been reported (Patent Document 1, Non-Patent Document 6 and Non-Patent Document 7).

그러나, 생산성의 수율 문제에 있어서 아직까지 효소 촉매를 이용한 알로스 생산 방법에 제한점을 가진다. 구체적으로, 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래의 엘-람노스 이성화 효소를 이용한 연구 보고에서는 100 g/ℓ 이상의 고농도의 알로스 생산 반응에 사용될 수 있는 것으로 개시된 바 있으나, 부산물로 다량의 알트로스(D-altrose)가 생성되는 문제점이 있다. 이 외에도 알로스 생산 반응의 촉매로 보고된 다른 미생물 유래의 엘-람노스 이성화효소들은 부산물을 생성하지 않으나, 대부분이 10 g/ℓ 미만의 낮은 농도로 알로스 생산에 사용된다는 한계가 있다. 라이보스-5-인산 이성화효소의 경우에도 알트로스를 생성하지 않고 알로스만 생산할 수 있지만 엘-람노스 이성화 효소들보다 활성이 낮다는 단점이 있다. 그러므로 알트로스가 생성되지 않고 짧은 시간에 고수율로 알로스를 생산할 수 있는 효소의 개발이 필요하다.However, there is still a limit to the production method of aloses using enzyme catalysts in terms of productivity yield. Specifically, Pseudomonas shoe cherry (Pseudomonas stutzeri) derived from the El-but bar disclosed that can be used in the rhamnose in the studies reported by the isomerase 100 g / ℓ or more of a high concentration of Al Ross production reaction, a large amount of Altman as a by-product loss ( D-altrose) is generated. In addition, other microorganism-derived L-lambda isomerization enzymes reported as catalysts for the production of aloses do not produce by-products, but most of them are used in the production of aloses at a low concentration of less than 10 g / l. In the case of the ribose-5-phosphate isomerase, it is possible to produce only alos without producing altros, but it has a disadvantage that it is less active than the el-lambs isomerization enzymes. Therefore, it is necessary to develop enzymes that can produce alross in a short time without producing altros.

이에, 본 발명자들은 알로스 생산 반응에서 부산물을 생성하지 않으면서도 알룰로스로부터 알로스를 고수율로 생산할 수 있도록 하는 효소 자원을 개발하기 위해 노력한 결과, 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 구조 분석을 기반으로 하여 활성 부위의 잔기를 치환한 변이체를 제조하였으며, 상기 변이체가 야생형의 엘-람노스 이성화효소보다 알룰로스를 기질로 하는 알로스 전환 활성이 유의적으로 높아, 고농도의 알룰로스 기질을 포함하는 반응 조건에서 알로스의 전환 수율 및 생산성이 야생형에 비해 증가되므로, 본 발명의 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소 변이체를 알룰로스로부터 알로스 생산 반응의 효소 촉매로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have sought to develop enzyme resources to produce an Al LOS from even alrul loss without generating by-products from the egg Los production reaction and in a high yield, Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) El-derived Based on the analysis of the structure of L-rhamnose isomerase, mutants in which the residues of the active site were substituted were prepared, and the mutants were compared with wild type L-rhamnose isomerase Since the conversion activity is significantly higher and the conversion yield and productivity of the alose are increased as compared with the wild type under the reaction conditions including the high concentration of the aluulose substrate, the mutant strain of Clostridium stokerium derived from the L-rhamnose isomerase Can be usefully used as an enzyme catalyst for the production of alloys from aluloses Written, it has completed the present invention.

KR 10-1282331 B1 (2013.07.09)KR 10-1282331 B1 (2013.07.09) KR 10-1217670 B1 (2012.12.26)KR 10-1217670 B1 (2012.12.26)

Menavuvu, Buetusiwa Thomas, et al. Journal of bioscience and bioengineering 101.4 (2006): 340-345. Menavuvu, Buetusiwa Thomas, et al. Journal of bioscience and bioengineering 101.4 (2006): 340-345. Poonperm, Wayoon, et al. Applied microbiology and biotechnology 76.6 (2007): 1297-1307. Poonperm, Wayoon, et al. Applied microbiology and biotechnology 76.6 (2007): 1297-1307. Lin, Chia-Jui, et al. Journal of agricultural and food chemistry 58.19 (2010): 10431-10436. Lin, Chia-Jui, et al. Journal of agricultural and food chemistry 58.19 (2010): 10431-10436. Lin, Chia-Jui, Wen-Chi Tseng, and Tsuei-Yun Fang. Journal of agricultural and food chemistry 59.16 (2011): 8702-8708. Lin, Chia-Jui, Wen-Chi Tseng, and Tsuei-Yun Fang. Journal of agricultural and food chemistry 59.16 (2011): 8702-8708. Bai, Wei, et al. Food Science and Technology Research 21.1 (2015): 13-22. Bai, Wei, et al. Food Science and Technology Research 21.1 (2015): 13-22. Park, Chang-Su, et al. Biotechnology letters 29.9 (2007): 1387-1391. Park, Chang-Su, et al. Biotechnology letters 29.9 (2007): 1387-1391. Feng, Zaiping, Wanmeng Mu, and Bo Jiang. Biotechnology letters 35.5 (2013): 719-724. Feng, Zaiping, Wanmeng Mu, and Bo Jiang. Biotechnology letters 35.5 (2013): 719-724.

이에, 본 발명자들은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 구조 분석을 기반으로 하여 활성 부위의 아미노산 잔기를 치환한 변이체를 디자인하였으며, S232A/G245S 이중 돌연변이체가 알룰로스로부터 알로스로 전환하는 전환 수율 및 생산성이 증가할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Thus, the present inventors have Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-rhamnose based on the structural analysis of isomerase (L-rhamnose isomerase) were designed variants by replacing the amino acid residues of the active site, S232A / Confirming that the G245S double mutant can increase the conversion yield and productivity of converting aluloses to aloses, thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 알룰로스(D-allulose)로부터 희소성 단당류인 알로스(D-allose)를 생산함에 있어서 부산물을 생산하지 않고 높은 생산성을 가지는 엘-람노스 이성화효소를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide an L-rhamnose isomerase having high productivity without producing a by-product in the production of D-allose, which is a rare monosaccharide, from D-allulose.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 엘-람노스 이성화효소를 이용하여 알룰로스를 알로스로 전환시키는, 알로스 생산 반응을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an alos production reaction for converting alulos to alos by using the above-mentioned el-rhamnose isomerase.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 아미노산 서열 잔기를 치환하여 제조한, 변이체 엘-람노스 이성화효소를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-prepared by substituting the amino acid sequence moiety of the rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase), the mutant El-rhamnose isomerase Lt; / RTI >

또한, 본 발명은 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 변이체 엘-람노스 이성화효소 발현용 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector for expressing a mutant EL-lambda isomerase comprising a gene encoding the mutant EL-rhamnose isomerase.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소는 야생형의 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소의 아미노산 서열로부터, 232 번째 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)으로 치환; 및 245 번째 잔기인 글리신(G)을 세린(S)으로 치환; 중 어느 하나 또는 둘 다의 치환을 하여 제조되는 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the mutant EL-rhamnose isomerase is obtained by substituting serine (S) at position 232 with alanine (A) from the amino acid sequence of the wild-type Clostridium stearicolaria- ); And the 245th residue glycine (G) is substituted with serine (S); ≪ RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI >

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 이에 따른 변이체 엘-람노스 이성화효소는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.In one preferred embodiment of the present invention, the Clostridium stokerium- derived L-rhamnose isomerase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the resulting mutant L-lambos isomerase comprises the sequence of SEQ ID NO: Or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 재조합 벡터는 pET 24a인 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the recombinant vector may be pET 24a.

또한, 본 발명은 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소를 포함하는 반응 용액에, 기질인 알룰로스(D-allulose)를 가하여 알로스로의 전환 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 알로스(D-allose) 생산 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing D-allose (D-allose), which comprises the step of inducing a conversion reaction to allose by adding D-allulose, which is a substrate, to a reaction solution containing the mutant E-rhamnose isomerase ) Production method.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 알로스 생산 반응 용액은 pH 6.5 내지 pH 8.5 범위인 것일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the allyl production reaction solution may be in the range of pH 6.5 to pH 8.5.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 기질인 알룰로스는 100 g/ℓ 내지 700 g/ℓ의 농도로 반응 용액에 포함되는 것일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the substrate alululose may be contained in the reaction solution at a concentration of 100 g / l to 700 g / l.

본 발명의 또다른 바람직한 일실시예에서, 알로스로의 전환 반응은 60℃ 내지 80℃ 범위에서 수행하는 것일 수 있다.In another preferred embodiment of the present invention, the conversion reaction to allose may be carried out in the range of 60 ° C to 80 ° C.

따라서, 본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 아미노산 서열 잔기를 치환하여 제조한 변이체 엘-람노스 이성화효소 및 이를 이용하는 알로스 생산 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention is Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-rhamnose isomerase one mutant produced by substituting the amino acid sequence residue of (L-rhamnose isomerase) El-rhamnose isomerase and Al LOS produced using the same ≪ / RTI >

본 발명에서 제공하는 변이체 엘-람노스 이성화효소는 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소의 구조 분석을 통해 활성 부위의 잔기를 치환하여 구성하였으며, 특히 G245S 점돌연변이체, S232A 점돌연변이체 및 S232A/G245S 이중 돌연변이체의 경우에서 야생형에 비해 현저히 증가된 알로스 전환 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.Mutant El provided by the present invention-rhamnose isomerase is Clostridium requester collaboration Solarium derived El - was constructed by using the structural analysis of rhamnose isomerase substituted with a residue of the active site, especially G245S point mutants, S232A point mutations And S232A / G245S double mutants showed significantly increased ALS conversion activity compared to the wild type.

본 발명의 엘-람노스 이성화효소 변이체를 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 반응의 생물 촉매로서 사용할 때, 미생물로부터 얻은 효소를 이용하여 생산 공정을 촉매하므로 종래 화학 반응에 따른 알로스 생산 공정을 생물학적 공정으로 대체할 수 있어 친환경적이다. 또한, 야생형 효소에 비해 알룰로스로부터 알로스 전환 효율 및 생산성이 유의적으로 증가할 수 있어, 종래 기술에 따른 알로스 생산 반응에 비해 단가가 낮은 기질을 사용하면서도 개선된 수율을 나타낼 수 있어 생산 경비를 크게 줄임과 동시에 생산 효과를 극대화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소는 알로스 생산 공정의 생체 촉매로서 유용하게 사용될 수 있다.When the enzyme of the present invention is used as a biocatalyst for the reaction of producing aloses from aluloses, the enzymes obtained from the microorganisms are used to catalyze the production process. Therefore, It is eco-friendly because it can be replaced by a process. In addition, the conversion efficiency and productivity of aluose from alulose can be significantly increased compared with the wild-type enzyme, and an improved yield can be obtained while using a substrate having a lower unit price than the alos production reaction according to the prior art, Can be greatly reduced and the production effect can be maximized. Therefore, the mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention can be usefully used as a biocatalyst in an alos production process.

도 1은 본 발명의 엘-람노스 이성화효소의 가상 3차 구조와 기질인 알룰로스, 생성물인 알로스를 각각 도킹한 모델로서 활성 부위에서 서로 겹치는 아미노산 잔기들을 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 엘-람노스 이성화 효소 야생형의 활성에 대한 금속 이온들의 영향을 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 야생형, G245S 변이체, S232A 변이체 및 G245A/S232A 이중 변이체 엘-람노스 이성화 효소의 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 야생형 및 G245A/S232A 이중 변이체 엘-람노스 이성화 효소의 시간에 따른 75℃ 에서의 안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 G245A/S232A 이중 변이체 엘-람노스 이성화 효소의 농도에 따른 알로스 생산성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 G245A/S232A 이중 변이체 엘-람노스 이성화 효소의 알룰로스 농도에 따른 알로스 생산성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 및 G245A/S232A 이중 변이체 엘-람노스 이성화 효소의 시간에 따른 알로스의 생산량을 나타낸 것이다.FIG. 1 is a model of a hypothetical tertiary structure of an L-rhamnose isomerase of the present invention, a substrate, allylose, and a product docked with arachose, respectively, and shows amino acid residues overlapping each other at an active site.
Figure 2 compares the effect of metal ions on the activity of the wild-type L-rhamnose isomerase of the present invention.
Figure 3 compares the activity of wild-type, G245S mutant, S232A mutant and G245A / S232A mutant E1-Rhamnose isomerase of the present invention.
Figure 4 shows the stability of the wild-type and G245A / S232A double mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention over time at 75 ° C.
Fig. 5 shows the productivity of aloses according to the concentration of the G245A / S232A double mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention.
6 shows the productivity of the G245A / S232A double mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention according to the alulose concentration.
Figure 7 shows the production of aloses according to the invention over time of the G245A / S232A double mutant EL-rhamnose isomerase.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

상술한 바와 같이, 친환경적인 방법으로 희소 단당류인 알로스(D-allose)를 생산할 수 있는 공정을 개발하고자 연구가 계속되고 있으며, 이에 따라 알로스 생산 반응에서 부산물을 생성하지 않으면서도 알룰로스로부터 알로스를 고수율로 생산할 수 있도록 하는 효소 자원을 개발하고자 하는 요구가 계속되고 있다. As described above, research has been continued to develop a process capable of producing a rare monosaccharide, D-allose, in an environmentally friendly manner. Thus, There is a continuing need to develop enzyme resources that enable the production of Ross in high yield.

따라서, 본 발명은 본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 아미노산 서열 잔기를 치환하여 제조한, 변이체 엘-람노스 이성화효소를 제공한다.Accordingly, the invention The present invention Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-prepared by substituting the amino acid sequence moiety of the rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase), the mutant El-provide rhamnose isomerase do.

또한, 본 발명은 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 변이체 엘-람노스 이성화효소 발현용 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector for expressing a mutant EL-lambda isomerase comprising a gene encoding the mutant EL-rhamnose isomerase.

본 발명의 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소는, 람노스(rhamnose)를 람눌로스(rhamnullose)로 이성화 전환할 수 있는 효소로 알려져 있다. 그러나, 엘-람노스 이성화효소는 기질 특이성이 넓어 람노스 이외의 다양한 단당류를 기질로 할 수 있고, 특히 희소당에 대하여 이성화 반응 유도 활성을 나타낼 수 있는 것으로 알려진 바 있다.The L-rhamnose isomerase derived from Clostridium stearothiocolarum of the present invention is known as an enzyme capable of isomerizing rhamnose to rhamnullose. However, it has been known that the el-rhamnose isomerase has a wide substrate specificity and can be used as a substrate for various monosaccharides other than rhamnose, and can exhibit an isomerization-inducing activity particularly for a rare saccharide.

본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소는, 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소로부터 활성 부위의 아미노산 잔기가 치환되어, 알룰로스로부터 알로스로 전환하기에 활성이 증가된 변이체를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소는 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소의 아미노산 서열로부터, 232 번째 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)으로 치환; 및 245 번째 잔기인 글리신(G)을 세린(S)으로 치환; 중 어느 하나 또는 둘 다의 치환을 하여 제조되는 것일 수 있다.Mutant El of the invention rhamnose isomerase is Clostridium requester collaboration Solarium derived el-a rhamnose is an amino acid residue of the active site displaced from isomerase, the activity to change to know Los increase from alrul loss variants . Specifically, the mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention comprises serine (S), which is the 232 residue, from the amino acid sequence of the Clostridium stearicolaria- derived L-rhamnose isomerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Substituted with alanine (A); And the 245th residue glycine (G) is substituted with serine (S); ≪ RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI >

보다 구체적으로, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 야생형 엘-람노스 이성화효소의 아미노산 서열로부터 232 번째 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)으로 치환하고, 245 번째 잔기인 글리신(G)을 세린(S)으로 치환한, 이중 돌연변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에 해당하며, 이는 서열번호 5의 염기서열로 암호화되는 것이 바람직하다. More specifically, serine (S), which is the 232th residue from the amino acid sequence of the wild-type L-rhamnose isomerase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, is substituted with alanine (A) and glycine The amino acid sequence of the double mutant substituted with serine (S) corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is preferably encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO:

또한, 상기 야생형 엘-람노스 이성화효소의 아미노산 서열로부터 245 번째 잔기인 글리신(G)을 세린(S)으로 치환된 점돌연변이체의 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열에 해당하며, 상기 야생형 엘-람노스 이성화효소의 아미노산 서열로부터 232 번째 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)으로 치환된 점돌연변이체의 아미노산 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열에 해당한다. Also, the amino acid sequence of the point mutant substituted with serine (S) for glycine (G), which is the 245th residue from the amino acid sequence of the wild-type EL-rhamnose isomerase, corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, - The amino acid sequence of the point mutant in which serine (S), which is the 232th residue from the amino acid sequence of the rhamnose isomerase, is replaced with alanine (A) corresponds to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소 발현용 재조합 벡터에 있어서, 상기 재조합 벡터로는 유전자 재조합 및 표적 단백질의 과발현을 위하여 당업계에서 사용되는 플라스미드 벡터라면 어떠한 것을 사용해도 무방하다. 구체적으로, 상기 재조합 벡터는 pET 24a인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In the recombinant vector for expressing the mutant EL-rhamnosidase of the present invention, any of the plasmid vectors used in the art may be used as the recombinant vector for gene recombination and overexpression of the target protein. Specifically, the recombinant vector is more preferably pET 24a, but is not limited thereto.

본 발명의 재조합 벡터를 사용하여 변이체 엘-람노스 이성화효소를 발현하기 위한 형질전환체 균주로는, 목적으로 하는 유전자를 과발현하여 활성 단백질을 생산할 수 있도록 하는 형질전환체로 사용할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 균주라면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 형질전환체 균주로서 대장균 또는 효모 등을 예시로 들 수 있으며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The transformant strain for expressing the mutant el-rhamnose isomerase using the recombinant vector of the present invention can be used as a transformant capable of overexpressing the desired gene to produce an active protein. Any known strains may be used without limitation. Specifically, Escherichia coli or yeast can be exemplified as the transformant strain, and Escherichia coli is preferably used, but is not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)를 과발현하여 이의 3차 구조를 가상으로 분석하였고, 알룰로스로부터 알로스로 전환할 때의 도킹 모델을 확인하여, 엘-람노스 이성화효소의 활성 부위 잔기를 확인하였다(도 1).In a particular embodiment of the present invention, the inventors have found that Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase) the over-expression and analyzed the tertiary structure thereof in phantom, from alrul Ross The docking model at the time of conversion to ALROS was confirmed to identify the active site residues of the L-lambda isomerase (Fig. 1).

또한, 본 발명자들은 확인한 활성 부위 잔기를 각각 치환한 점돌연변이체를 제조하였으며(표 1), 총 61 개의 점돌연변이체 활성을 확인한 결과 G245S 변이체 및 S232A 변이체의 알로스 전환 활성이 야생형에 비해 유의적으로 증가된 것을 확인하였다(도 3). 이에, 본 발명자들은 S232A/G245S 변이를 모두 포함하는 이중 돌연변이체를 제조하였으며, 이의 활성이 야생형 및 점돌연변이체에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 3).In addition, the inventors of the present invention produced a point mutant having the mutated active site residues (Table 1). As a result, the mutation activity of the G245S mutant and the S232A mutant was significantly higher than that of wild type (Fig. 3). Thus, the present inventors produced a double mutant containing all of the S232A / G245S mutants, and found that the activity thereof was significantly increased as compared with the wild-type and point mutants (FIG. 3).

또한, 본 발명자들은 제조한 S232A/G245S 이중 돌연변이체의 온도 안정성이 야생형에 비해 증가되어, 75℃에서 보관하였을 때 활성 감소 수준이 야생형이 비해 낮은 것을 확인하였다(도 4).In addition, the present inventors found that the temperature stability of the S232A / G245S double mutants prepared was higher than that of the wild type, and that the level of activity reduction when stored at 75 ° C was lower than that of wild type (FIG. 4).

따라서, 본 발명은 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 아미노산 서열 잔기를 치환하여 제조한 G245S 점돌연변이체, S232A 점돌연변이체 및 S232A/G245S 이중 돌연변이체를 제공한다. 본 발명의 엘-람노스 이성화효소 변이체는 야생형에 비해 현저히 증가된 알로스 전환 활성을 나타낼 수 있다.Accordingly, the present invention is Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase) amino G245S point mutations was prepared by replacing the sequence moiety of the body, S232A point mutants and S232A / G245S Thereby providing a double mutant. The L-rhamnose isomerase mutant of the present invention can exhibit significantly increased aldol conversion activity as compared to the wild-type.

또한, 본 발명은 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소를 포함하는 반응 용액에, 기질인 알룰로스(D-allulose)를 가하여 알로스로의 전환 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 알로스(D-allose) 생산 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for producing D-allose (D-allose), which comprises the step of inducing a conversion reaction to allose by adding D-allulose, which is a substrate, to a reaction solution containing the mutant E-rhamnose isomerase ) Production method.

본 발명의 알로스 생산 방법에 있어서, 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 변이체인 것이 바람직하다.In the method for producing an aldose of the present invention, the mutant el-rhamnose isomer is preferably a mutant having an amino acid sequence of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.

본 발명의 알로스 생산 방법에 있어서, 알로스 생산 반응은 pH 6.5 내지 pH 8.5 범위에서 수행될 수 있고, 구체적으로는 pH 7.0 내지 pH 8.0에서 수행되는 것이 바람직하며, 본 발명의 엘-람노스 이성화효소의 최적 활성을 나타내는 pH 범위가 pH 7.5라는 관점에서, 알로스 생산 반응을 pH 7.5에서 수행하는 것이 가장 높은 효율을 나타낼 것으로 기대할 수 있어, 바람직하다.In the production method of the present invention, the reaction for production of an allyl can be carried out in the range of pH 6.5 to pH 8.5, more specifically, preferably in the range of pH 7.0 to pH 8.0, From the viewpoint that the pH range exhibiting the optimum activity of the enzyme is pH 7.5, it is preferable to perform the alos production reaction at pH 7.5 because it can be expected to exhibit the highest efficiency.

본 발명의 알로스 생산 방법에 있어서, 기질인 알룰로스는 100 g/ℓ 내지 700 g/ℓ의 농도로 반응 용액에 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 구체적으로 400 g/ℓ 내지 600 g/ℓ의 농도로 반응 용액에 포함되는 것이 바람직하다.In the method of producing an alumina according to the present invention, the substrate, alululose, may be contained in the reaction solution at a concentration of 100 g / l to 700 g / l, but is not limited thereto. Specifically, it may be 400 g / In the reaction solution.

본 발명의 알로스 생산 방법에 있어서, 알룰로스로부터 알로스로의 전환 반응은 60℃ 내지 80℃ 범위에서 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 엘-람노스 이성화효소가 75℃에서 최적 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 반응은 70℃ 내지 80℃에서 수행하는 것이 보다 바람직하다.In the method of producing an allyl of the present invention, it is preferable that the conversion of alulose to aloses is carried out in the range of 60 ° C to 80 ° C, but the present invention is not limited thereto, Since it is known to exhibit optimum activity, it is more preferable that the reaction of the present invention is carried out at 70 캜 to 80 캜.

본 발명의 알로스 생산 방법에서, 추가로 금속이온을 조효소로서 포함할 수 있다. 이때 포함될 수 있는 금속 이온으로는, 망간 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 구리 이온 및 니켈 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 들 수 있으며, 구체적으로 망간 이온을 첨가하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.In the alum production method of the present invention, the metal ion may further be contained as a coenzyme. Examples of the metal ion that may be included at this time include at least one selected from the group consisting of manganese ion, nickel ion, cobalt ion, copper ion, and nickel ion. More preferably, manganese ion is added, But is not limited thereto.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 엘-람노스 이성화효소의 조효소로 사용하기에 적합한 금속 이온을 확인한 결과, 망간 이온을 1 mM 농도로 첨가하였을 때 엘-람노스 이성화효소의 알로스 전환 활성이 유의적으로 높은 것을 확인하였다(도 2).In a specific example of the present invention, the inventors of the present invention found that a metal ion suitable for use as a coenzyme of an L-rhamnose isomerase was found, and when the manganese ion was added at a concentration of 1 mM, the conversion of the L-rhamnose isomerase Activity was significantly higher (Fig. 2).

또한, 본 발명자들은 S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용하여 알로스를 생산하는 반응을 수행하기 위해 이의 최적 효소 및 기질 첨가농도를 확인한 결과, S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용한 알로스 생산 반응에서의 최적 효소 농도는 6 ㎎/㎖이며, 최적 기질 농도는 600 g/ℓ인 것으로 확인하였다(도 5 및 도 6).In addition, the present inventors confirmed the optimum concentration of the enzyme and the substrate to perform the reaction to produce aloses using the S232A / G245S double mutant. As a result, it was found that the optimal mutation of the S232A / G245S double mutant It was confirmed that the enzyme concentration was 6 mg / ml and the optimum substrate concentration was 600 g / l (FIGS. 5 and 6).

또한, 본 발명자들은 S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용하여 위에서 확인한 반응 최적 조건으로 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 반응을 수행한 결과, 야생형 엘-람노스 이성화효소를 이용하는 반응에 비해 약 1.3 배 증가한 수준의 전환 수율 및 약 1.6 배 증가한 수준의 생산성을 나타내는 것으로 확인하였다(도 7).In addition, the present inventors have conducted a reaction for producing aloses from aluloses using the S232A / G245S double mutants at the optimal reaction conditions identified above. As a result, the present inventors have found that about 1.3 times as much as the reaction using the wild-type L-rhamnose isomerase Level conversion yield and a 1.6-fold increase in productivity (Fig. 7).

따라서, 본 발명의 엘-람노스 이성화효소 변이체를 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 반응의 생물 촉매로서 사용할 때, 야생형 효소에 비해 알룰로스로부터 알로스 전환 효율 및 생산성이 유의적으로 증가할 수 있어, 종래 기술에 따른 알로스 생산 반응에 비해 단가가 낮은 기질을 사용하면서도 개선된 수율을 나타낼 수 있어 생산 경비를 크게 줄임과 동시에 생산 효과를 극대화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이체 엘-람노스 이성화효소는 알로스 생산 공정의 생체 촉매로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, when the mutant L-rhamnose isomerase of the present invention is used as a biocatalyst for the reaction of producing aloses from alulose, the conversion efficiency and productivity of aloses from alulose can be significantly increased as compared with the wild-type enzyme , It is possible to achieve an improved yield while using a substrate having a lower unit cost than the ALOS production reaction according to the prior art, thereby greatly reducing the production cost and maximizing the production effect. Therefore, the mutant EL-rhamnose isomerase of the present invention can be usefully used as a biocatalyst in an alos production process.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

클로스트리디움 스터코라리움Clostridium stearicarumi (( Clostridium stercorariumClostridium stercorarium ) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 발현) Expression of L-rhamnose isomerase from L-rhamnose isomerase

엘-람노스 이성화효소를 제조하기 위하여, 클로스트리디움 스터코라리움의 유전자로부터 엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 분리하고, 이를 재조합 발현 벡터에 삽입하여 엘-람노스 이성화효소 과발현을 유도하였다. In order to prepare the L-rhamnose isomerase, a gene encoding the L-rhamnose isomerase was isolated from the gene of Clostridium stearicolarium and inserted into a recombinant expression vector to induce overexpression of the L-rhamnose isomerase Respectively.

구체적으로, 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 이미 특정되어 있는 클로스트리디움 스터코라리움 균주를 선별하고, 유전체 DNA를 추출하여 PCR 증폭의 주형으로 사용하였다. 증폭하고자 하는 서열로서, 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소의 공지된 DNA 염기서열(Genebank Accession Number AGC67668)을 선택하였다. PCR 증폭으로 상기 DNA 염기서열을 기본으로 하고 양 말단에 NheI과 XhoI 제한효소 서열을 첨가하도록 도안한 프라이머를 사용하여, 엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 염기서열을 대량으로 얻었다. 그런 다음, 제한효소 NheI과 XhoI을 사용하여 엘-람노스 이성화효소의 해당 염기서열 단변을 회수하고, 알칼라인 포스파테이즈를 처리한 후 발현 벡터 pET-24a에 삽입하여 pET-24a/엘-람노스 이성화효소 재조합 벡터를 제조하였다. 제조한 재조합 발현 벡터를 통상적인 형질전환 방법으로 대장균 ER 2566 균주에 형질 전환시켰다. 형질전환된 대장균은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 알로스의 생산을 위한 배양을 실시하기 전까지 냉동 보관하였다.Specifically, Clostridium stearicola strains in which a gene sequence and an amino acid sequence have already been identified were selected, and genomic DNA was extracted and used as a template for PCR amplification. As a sequence to be amplified, a known DNA base sequence (Genebank Accession Number AGC67668) of E-lambda isomerase from Clostridium stokerium was selected. A primer coding for the L-lambda isomerase was obtained in large quantities using a primer designed based on the above DNA base sequence by PCR amplification and adding NheI and Xho I restriction endonucleases at both ends. Then, the corresponding short nucleotide sequence of the el-rhamnose isomerase was recovered using restriction enzymes NheI and XhoI, and after alkaline phosphatase treatment, it was inserted into the expression vector pET-24a to obtain pET-24a / And an isomerization enzyme recombinant vector. The recombinant expression vector thus prepared was transformed into Escherichia coli strain ER 2566 by a conventional transformation method. The transformed Escherichia coli was frozen until 20% glycerine solution was added and incubated for the production of the allose.

엘-람노스 이성화효소의 단백질 구조 분석Analysis of Protein Structure of El-Rhamnose Isomerase

<2-1> 엘-람노스 이성화효소의 가상 3차구조 생성<2-1> Generation of a virtual tertiary structure of the L-Raman isomerase

본 발명에서는 클로스트리디움 스터코라리움 유래의 엘-람노스 이성화효소를 통해 알룰로오스(allulose)로부터 알로스(allose)를 생산함에 있어서, 야생형보다 알로스 생산능이 증진된 변이체 효소를 제조하고자 하였다. 클로스트리디움 스터코라리움 유래의 엘-람노스 이성화효소(이하, 야생형으로 지칭함)의 3차 구조가 밝혀져 있지 않아, 엘-람노스 이성화효소의 호몰로지 모델링 방법을 사용하기 위해 주형 단백질 구조(template protein structure)를 선별하였다. In the present invention, in the production of allose from allulose through the L-rhamnose isomerase originating from Clostridium stearicolumi, a mutant enzyme enhanced in the ability to produce an allose than wild type was prepared . The tertiary structure of the L-rhamnose isomerase (hereinafter referred to as "wild type") derived from Clostridium stearicolarium is not known. To use the homology modeling method of L-rhamnose isomerase, protein structure.

먼저, 데이터 뱅크(Protein Data Bank) 데이터베이스 내에 야생형의 아미노산 서열과 가장 상동성이 높은 구조를 선별하기 위해 Discovery studio 2017 프로그램(DS 프로그램)의 BLAST를 이용하였다. 최종적으로 주형 단백질 구조로 선별된 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans)유래의 엘-람노스 이성화효소(PDB: 3UU0)는 본 발명의 야생형 아미노산 서열과 53.64%의 상동성(identity)을 나타내었다. 바실러스 할로듀란스(Bacillus halodurans) 유래의 엘-람노스 이성화효소의 3차 구조를 주형으로 사용하여 DS 프로그램의 Build Homology models 프로토콜로 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소의 3차 구조를 가상으로 만들었다.First, BLAST of the Discovery studio 2017 program (DS program) was used to select the structure most homologous with the wild type amino acid sequence in the database of Protein Data Bank. Finally, the protein template structure of the Bacillus halo Durance (Bacillus halodurans) derived from screening to El-rhamnose isomerase (PDB: 3UU0) showed a homology (identity) of the wild-type amino acid sequence and 53.64% of the present invention. Bacillus halo Durance (Bacillus halodurans) derived from the El-rhamnose to Build Homology models protocol DS program using the three-dimensional structure as the template of the isomerase Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) derived from EL-rhamnose isomerase Of the three-dimensional structure.

<2-2> 엘-람노스 이성화효소의 활성 부위 탐색<2-2> Detection of the active site of the L-rhamnose isomerase

야생형 엘-람노스 이성화효소의 활성부위를 확인하기 위하여 DS 프로그램의 Dock Ligands (CDOCKER)를 통해 기질인 알룰로스와 생성물인 알로스를 상기 실시예 <2-1>에서 가상으로 제작한 야생형의 호몰로지 모델에 도킹하였다. 이를 통해 생성된 도킹 모델 중 가장 높은 CDOCKER score를 갖는 모델들을 각각 선별하였다. 선별된 모델에서 효소와 수용체가 상호작용할 것으로 예상되는 활성 부위를 확인하였다.In order to confirm the active site of the wild-type EL-rhamnose isomerase, alulose, which is a substrate, and alos, which is a product, were synthesized through dock ligands (CDOCKER) of the DS program using a wild type homolog Docked to the Logite model. The models with the highest CDOCKER score among the generated docking models were selected. In the selected model, the active sites where the enzyme and the receptor are expected to interact are identified.

그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 알룰로스 도킹 모델과 알로스 도킹 모델에서 공통적으로 상호작용하고 있는 아미노산을 활성 부위의 아미노산 잔기로서 확인하고, Trp190, Glu231, Ser232, Lys233, Phe235, Gly245, Asp265, His268, Asp300, Asp302 및 Asp332를 점돌연변이를 유발하기 위한 활성부위 아미노산 잔기의 후보군으로 선정하였다.As a result, as shown in FIG. 1, amino acids commonly interacting in the alulous docking model and the ALOX docking model were identified as amino acid residues of the active site and Trp190, Glu231, Ser232, Lys233, Phe235, Gly245, Asp265, His268, Asp300, Asp302 and Asp332 were selected as candidates for active site amino acid residues to induce point mutations.

엘-람노스 이성화효소의 점돌연변이체 제조Production of point mutants of L-rhamnose isomerase

야생형의 엘-람노스 이성화효소를 대상으로 하여, 상기 실시예 <2-2>에서 선정한 아미노산 잔기를 치환해 점돌연변이체를 제조하였다. 선정한 아미노산 잔기는 하기 [표 1]에 나타난 바와 같이 해당 아미노산을 치환하였으며, 총 61 가지의 다양한 점돌연변이체를 제조하였다.A mutant of point mutation was prepared by substituting the amino acid residue selected in the above Example <2-2> for the wild-type L-rhamnose isomerase. The selected amino acid residues were substituted with corresponding amino acids as shown in Table 1 below, and a total of 61 various point mutants were prepared.

엘-람노스 이성화효소 점돌연변이체의 목록List of El-Rhamnose isomerase enzyme mutants 야생형 잔기Wild type residue 치환한 잔기Substituted residue 제조된 점돌연변이체The prepared point mutants Trp190Trp190 Tyr(Y), Leu(L), Cys(C)
Gln(Q), Glu(E), His(H)Tyr (Y), Leu (L), Cys (C)
Gln (Q), Glu (E), His (H) W190Y, W190L, W190C, W190Q, W190E, W190HW190Y, W190L, W190C, W190Q, W190E, W190H Glu231Glu231 Asp(D), Gln(Q), Arg(R)
Cys(C), Leu(L), Trp(W)Asp (D), Gln (Q), Arg (R)
Cys (C), Leu (L), Trp (W) E231D, E231Q, E231R, E231C, E231L, E231WE231D, E231Q, E231R, E231C, E231L, E231W Ser232Ser232 Thr(T), Tyr(Y), Val(V)
Asp(D), Lys(K)Thr (T), Tyr (Y), Val (V)
Asp (D), Lys (K) S232T, S232Y, S232V, S232D, S232KS232T, S232Y, S232V, S232D, S232K Lys233Lys233 Arg(R), Glu(E), Gln(Q)
Leu(L), Trp(W)Arg (R), Glu (E), Gln (Q)
Leu (L), Trp (W) K233R, K233E, K233Q, K233L, K233WK233R, K233E, K233Q, K233L, K233W Phe235Phe235 Tyr(Y), Leu(L), Thr(T)
Asp(D), His(H)Tyr (Y), Leu (L), Thr (T)
Asp (D), His (H) F235Y, F235L, F235T, F235D, F235HF235Y, F235L, F235T, F235D, F235H Gly245Gly245 Ser(S), Val(V), Tyr(Y)
Asp(D), Lys(K)Ser (S), Val (V), Tyr (Y)
Asp (D), Lys (K) G245S, G245V, G245Y, G245D, G245KG245S, G245V, G245Y, G245D, G245K Asp265Asp265 Glu(E), Asn(N), His(H)
Cys(C), Val(V), Tyr(Y)Glu (E), Asn (N), His (H)
Cys (C), Val (V), Tyr (Y) D265E, D265N, D265H, D265C, D265V, D265YD265E, D265N, D265H, D265C, D265V, D265Y His268His268 Asp(D), Asn(N), Cys(C)
Val(V), Tyr(Y)Asp (D), Asn (N), Cys (C)
Val (V), Tyr (Y) H268D, H268N, H268C, H268V, H268YH268D, H268N, H268C, H268V, H268Y Asp300Asp300 Glu(E), Asn(N), His(H)
Cys(C), Val(V), Tyr(Y)Glu (E), Asn (N), His (H)
Cys (C), Val (V), Tyr (Y) D300E, D300N, D300H, D300C, D300V, D300YD300E, D300N, D300H, D300C, D300V, D300Y Asp302Asp302 Glu(E), Asn(N), His(H)
Cys(C), Val(V), Tyr(Y)Glu (E), Asn (N), His (H)
Cys (C), Val (V), Tyr (Y) D302E, D302N, D302H, D302C, D302V, D302YD302E, D302N, D302H, D302C, D302V, D302Y Asp332Asp332 Glu(E), Asn(N), His(H)
Cys(C), Val(V), Tyr(Y)Glu (E), Asn (N), His (H)
Cys (C), Val (V), Tyr (Y) D332E, D332N, D332H, D332C, D332V, D332YD332E, D332N, D332H, D332C, D332V, D332Y

엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 야생형으로 하고, site directed mutagenesis kit(Stratagene; SDM, QuickChange사)를 이용해 각각의 아미노산 치환의 변이가 나타날 수 있도록 DNA 변이를 유발하여, 총 61 개의 변이체 유전자를 구축하였다. 구축한 총 61 개의 변이체 유전자를 각각 재조합 벡터에 삽입하여 이를 대장균 ER2566 균주에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 ER2566 균주를 LB 배지 3 ㎖가 들어있는 시험관에 접종하여, 37 의 진탕 배양기에서 종균 배양하였다. 상기 종균 배양된 배양액의 흡광도가 600 ㎚에서 2.0에 도달하면, 종균 배양액을 LB 배지 450 ㎖가 들어있는 2 l 플라스크에 첨가하여 본배양하였다. 본배양한 배양액의 흡광도가 600 ㎚에서 0.6이 되면, 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG를 첨가하고 8 시간 동안 추가 배양하여 점돌연변이체 효소의 과발현을 유도하였다. 종균 배양 및 본 배양시 교반 속도 200 rpm 및 배양 온도 37로 배양 조건을 유지하였다가, IPTG 첨가 후에는 교반 속도 150 rpm 및 배양 온도 18로 조건을 유지하였다.The gene encoding the L-rhamnose isomerase was made into a wild-type and a DNA mutation was induced so that the mutation of the amino acid substitution could be expressed using a site directed mutagenesis kit (Stratagene; SDM, QuickChange). A total of 61 mutant genes . A total of 61 mutant genes were inserted into the recombinant vector and transformed into Escherichia coli strain ER2566. The transformed Escherichia coli ER2566 strain was inoculated into a test tube containing 3 ml of LB medium and seeded in a 37 shaking incubator. When the absorbance of the cultured broth reached 2.0 at 600 nm, the broth was added to a 2-liter flask containing 450 ml of LB medium and cultured. When the absorbance of the cultured medium reached 0.6 at 600 nm, IPTG was added to a final concentration of 0.1 mM, followed by further incubation for 8 hours to induce overexpression of the point mutant enzyme. Cultivation conditions were maintained at a stirring speed of 200 rpm and a culture temperature of 37 for seed culture and main culturing, and the conditions were maintained at a stirring speed of 150 rpm and a culture temperature of 18 after IPTG addition.

각각의 점돌연변이체를 과발현하는 대장균의 배양을 종료한 후, 형질전환체 균주의 배양액을 6,000×g로 4에서 30분 동안 원심분리하고, 0.85% 염화나트륨(NaCl)으로 두 번 세척하였다. 세척한 대장균에 100 mM 인산칼륨 완충액과 0.1 mM 단백분해 효소 저해제(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하여 초음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4에서 20 분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 제거한 다음, 세포 상등액만을 얻어 친화성 수지인 히스트랩 에이치피(His TrapTM HP) 흡착 컬럼을 장착한 고속 단백질 액체 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography system; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 과발현한 엘-람노스 이성화효소를 분리하였다. 분리된 효소를 포함하는 효소액은 다시 50 mM HEPES 완충용액(pH 7.0)으로 투석하여 반응에 사용하였다.After completion of the culture of E. coli overexpressing each point mutant, the culture medium of the transformant strain was centrifuged at 6,000 xg for 4 to 30 minutes, and washed twice with 0.85% sodium chloride (NaCl). 100 mM potassium phosphate buffer and 0.1 mM proteolytic enzyme inhibitor (phenylmethylsulfonyl fluoride) were added to the washed E. coli and disrupted with an ultrasonic wave sonicator. The cell lysate was centrifuged at 13,000 × g for 4 to 20 minutes to remove the cell pellet. Then, only the supernatant was obtained, and fast protein liquid chromatography with affinity resin, His Trap ™ HP adsorption column protein liquid chromatography system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif., USA) to separate the over-expressed L-rhamnose isomerase. The enzyme solution containing the separated enzyme was dialyzed with 50 mM HEPES buffer (pH 7.0) and used for the reaction.

엘-람노스 이성화효소의 점돌연변이체 활성 비교Comparison of the point mutant activity of the L-lambda isomerase

<4-1> 엘-람노스 이성화효소의 금속 조효소 확인<4-1> Identification of metal coenzyme in the L-rhamnose isomerization enzyme

클로스트리디움 스터코라리움 유래의 엘-람노스 이성화효소의 최적 효소 활성 환경은 75℃ 및 pH 7.0 조건으로 확인된 바 있다(대한민국 출원특허 제 10-2016-0135638호). 이에, 본 발명에서는 클로스트리디움 스터코라리움 유래의 엘-람노스 이성화효소의 조효소로서 사용될 수 있는 금속 이온에 대하여도 최적 활성을 나타내는 금속 이온을 확인하고자 하였다.The optimum enzyme activity environment of the L-rhamnose isomerase from Clostridium stearicolum was confirmed at 75 ° C and pH 7.0 (Korean Patent Application No. 10-2016-0135638). Therefore, in the present invention, the metal ions which can be used as the coenzyme of the L-rhamnose isomerase originating from Clostridium stearicolarium were also confirmed to exhibit the optimum activity.

구체적으로, 상기 [실시예 1]에서 제조한 클로스트리디움 스터코라리움 유래의 엘-람노스 이성화효소의 야생형을 수득하고, 야생형 효소 0.075 ㎎/㎖를 포함하는 50 mM HEPES 완충용액(pH 7.0)에 1 mM 금속 이온을 첨가한 다음, 기질로서 10 mM 알룰로스(allulose)를 가하여 알로스 생산 반응을 개시하였다. 10 분 동안 반응을 진행한 다음, 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 종료시키고, HPLC 분석을 통해 알룰로스로부터 알로스로의 전환 수율을 측정하여 엘-람노스 이성화효소의 활성을 확인하였다. 금속 이온으로는, 코발트, 구리, 철, 망간 및 니켈을 사용하기 위해 CoCl2, CuSO4, FeSO4, MnCl2 또는 NiCl2를 1 mM 농도로 각각의 반응액에 첨가하였으며, 이온을 첨가하지 않은 환경의 음성 대조군으로 사용하기 위해, 금속 킬레이터인 EDTA를 첨가하였다.Specifically, the wild type of the L-rhamnose isomerase from Clostridium stearicolarium prepared in [Example 1] was obtained, and a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.0) containing 0.075 mg / ml of wild- , 1 mM metal ion was added thereto, and then 10 mM allylose was added as a substrate to initiate an alos production reaction. After the reaction was carried out for 10 minutes, the reaction was terminated by addition of 200 mM HCl. The conversion of alulose to alose was measured by HPLC analysis to confirm the activity of the L-rhamnose isomerase. As the metal ions, CoCl 2 , CuSO 4 , FeSO 4 , MnCl 2 or NiCl 2 were added to each reaction solution at a concentration of 1 mM in order to use cobalt, copper, iron, manganese, and nickel. For use as a negative control for the environment, EDTA, a metal chelator, was added.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 1 mM 망간 이온을 효소로서 첨가한 조성에서 엘-람노스 이성화효소의 활성이 가장 높은 수준을 나타내는 것으로 확인하여, 이후 효소 반응에서는 망간을 조효소로 사용하여 첨가하였다(도 2).As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that the activity of the L-rhamnose isomerase was the highest in the composition in which 1 mM of manganese ion was added as an enzyme, and manganese was then added as a coenzyme in the subsequent enzyme reaction (Fig. 2).

<4-2> 야생형 효소 및 점돌연변이체 효소의 활성 비교<4-2> Comparison of activity of wild-type enzyme and point mutant enzyme

점돌연변이체로서 제조한 총 61종의 엘-람노스 이성화효소가 야생형에 비해 유의적인 수준의 활성을 나타내는지 확인하고자 하였다. 이를 위해, 상기 [실시예 3]에서 제조한 총 61 종의 엘-람노스 이성화효소 변이체를 사용하여, 점돌연변이체 0.075 ㎎/㎖를 포함하는 50 mM HEPES 완충용액(pH 7.0)에 1 mM MnCl2를 첨가한 다음, 기질로서 10 mM 알룰로스(allulose)를 가하여 알로스 생산 반응을 개시하였다. 10 분 동안 반응을 진행한 다음, 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 종료시키고, HPLC 분석을 통해 알룰로스로부터 알로스로의 전환 수율을 측정하여 엘-람노스 이성화효소의 활성을 확인하였다. 각각의 점돌연변이체의 활성을 야생형과 비교하였다.Lambda isomerization enzyme as a point mutant showed a significant level of activity compared to the wild type. To this end, a total of 61 kinds of the E-lambda isomerase mutants prepared in [Example 3] were used, and 1 mM MnCl 2 (0.1 mM) was added to a 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.0) containing 0.075 mg / ml of point mutants 2 was added thereto, and 10 mM allylase was added as a substrate to initiate an alos production reaction. After the reaction was carried out for 10 minutes, the reaction was terminated by addition of 200 mM HCl. The conversion of alulose to alose was measured by HPLC analysis to confirm the activity of the L-rhamnose isomerase. The activity of each point mutant was compared to the wild type.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 야생형 효소의 활성과 비교하였을 때, G245S 변이체의 활성이 유의적으로 증가하여, 야생형보다 약 1.54 배 높은 수준의 활성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이 외에, S232A 변이체의 활성 또한 야생형에 비해 증가하여, 야생형보다 약 1.4 배 높은 수준의 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, the activity of the G245S mutant was significantly increased when compared with the activity of the wild-type enzyme, indicating that the activity was about 1.54 times higher than that of wild type. In addition, the activity of the S232A mutant was also increased compared to that of the wild type, indicating that the activity was about 1.4 times higher than that of the wild type.

엘-람노스 이성화효소의 이중 돌연변이체 제조Preparation of double mutants of L-rhamnose isomerase

<5-1> 엘-람노스 이성화효소의 S232A/G245S 이중 돌연변이체 제조<5-1> Production of S232A / G245S double mutant of L-lambda isomerase

엘-람노스 이성화효소의 활성 부위 구조 분석을 기반으로 하여 제조한 돌연변이 중, G245S 변이체 및 S232A 변이체에서 야생형에 비해 알로스 전환 활성이 유의적으로 증가하는 것으로 확인하였으므로, 점돌연변이체의 변이된 잔기를 조합하여 S232A/G245S의 이중 돌연변이체를 제조하였다. 이중 돌연변이체를 제조, 발현 및 수득하는 과정은 상기 [실시예 3]에서 수행한 과정과 동일한 방법을 수행하여 S232A/G245S의 이중 돌연변이체를 제조하고 이를 과발현하였다. 과발현한 S232A/G245S의 이중 돌연변이체는 상기 실시예 <4-2>와 동일 방법을 수행하여 점돌연변이체와 함께 활성을 비교하였다.As a result of confirming that the ALS conversion activity was significantly increased in the G245S mutant and S232A mutant among the mutants prepared based on the analysis of the active site structure of the L-rhamnose isomerase, the mutant residues of the point mutants Were combined to prepare a double mutant of S232A / G245S. A double mutant of S232A / G245S was prepared and overexpressed by performing the same procedure as described in [Example 3], for the process of preparing, expressing and obtaining a double mutant. The overexpressed double mutants of S232A / G245S were compared with the point mutants in the same manner as in Example <4-2> above.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 S232A/G245S의 이중 돌연변이체는 점돌연변이체보다 활성 수준이 높은 것을 확인하였으며, 야생형과 비교하였을 때는 약 2.1 배 증가된 수준의 활성을 나타내는 것으로 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, the double mutants of S232A / G245S were found to have higher activity levels than the point mutants, and the activity was found to be about 2.1 times higher than that of the wild type.

<5-2> S232A/G245S의 이중 돌연변이체의 온도 안정성 조사<5-2> Investigation of temperature stability of double mutants of S232A / G245S

S232A/G245S의 이중 돌연변이체의 활성이 야생형 및 점돌연변이에 비해 유의적으로 증가할 수 있음을 확인하여, 온도 안정성을 함께 확인하고자 하였다. 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 S232A/G245S의 이중 돌연변이체 0.075 ㎎/㎖를 포함하는 50 mM HEPES 완충용액(pH 7.0)을 총 3 시간 동안 75℃에서 방치하면서, 30 분 간격으로 일정량의 효소액을 수득하여 1 mM MnCl2를 첨가한 다음, 10 mM의 기질 알룰스를 첨가하여 알로스 생산 반응을 개시하였다. 10 분간의 반응이 종료되면, 최종 농도 200 mM 염화수소를 첨가하여 반응을 종결시킨 다음 알로스의 전환 수율을 HPLC 분석을 통해 측정하였다. 대조군으로 비교하기 위해, 야생형 효소를 동일 조건에서 반응하여 온도 안정성을 확인하였다.The activity of the double mutants of S232A / G245S was found to be significantly higher than that of the wild type and point mutants. A 50 mM HEPES buffer solution (pH 7.0) containing 0.075 mg / ml of the S232A / G245S double mutant prepared in Example <5-1> was kept at 75 DEG C for 3 hours, Of the enzyme solution, 1 mM MnCl 2 was added, and then 10 mM of substrate alulase was added to initiate the reaction to produce the aloses. After completion of the reaction for 10 minutes, the reaction was terminated by adding 200 mM hydrogen chloride to the final concentration, and the conversion yield of the alum was determined by HPLC analysis. For comparison as a control group, wild type enzymes were reacted under the same conditions to confirm the temperature stability.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 대조군인 야생형 엘-람노스 이성화효소는 1.5 시간 동안 75℃에서 방치하였을 때, 상대 활성이 약 49%인 것으로 확인하였다. 이에 비해, S232A/G245S 이중 돌연변이체는 1.5 시간 동안 75℃에서 방치하였을 때 상대 활성이 약 80% 수준으로 유지되어, 야생형의 엘-람노스 이성화효소보다 높은 온도 안정성을 나타내는 것으로 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 4, the control wild-type L-rhamnose isomerase was found to have a relative activity of about 49% when it was left at 75 캜 for 1.5 hours. In contrast, the S232A / G245S double mutant retained about 80% relative activity when left at 75 ° C for 1.5 hours, indicating higher temperature stability than the wild-type L-rhamnose isomerase.

S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용한 알로스 생산 조건의 확립Establishment of alos production conditions using S232A / G245S double mutants

<6-1> 알로스 생산 반응을 위한 최적 조건의 확인<6-1> Identification of Optimum Condition for Alloz Production Reaction

본 발명에서 제조한 S232A/G245S 이중 돌연변이체가 야생형의 엘-람노스 이성화효소에 비해 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 전환 반응에서 높은 활성을 나타낼 수 있는 것으로 확인하여, 변이체 효소를 이용하여 알로스 생산 반응을 수행하기 위한 효소 농도 및 기질 농도의 최적의 조건을 확립하고자 하였다.It was confirmed that the S232A / G245S double mutant prepared in the present invention can exhibit high activity in the conversion reaction to produce aloses from alulose as compared with the wild type of E-rhamnose isomerase. Thus, the mutant enzyme And to establish optimal conditions for enzyme concentration and substrate concentration for the reaction.

먼저, 효소 농도를 확인하기 위해, pH 7.0 완충 용액 내 S232A/G245S 이중 돌연변이체의 농도를 1 ㎎/㎖ 내지 18 ㎎/㎖의 조건으로 다양한 변화를 주고, 75℃ 온도에서 600 g/ℓ 알룰로스와 함께 30 분 동안 알로스 생산 반응을 수행하였다. 반응을 종결한 후, 생산된 알로스 농도를 분석하였다.First, in order to confirm the enzyme concentration, the concentration of the S232A / G245S double mutant in the pH 7.0 buffer was varied from 1 mg / ml to 18 mg / ml under various conditions, and 600 g / For 30 minutes. After the reaction was terminated, the concentration of produced aloses was analyzed.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 반응 개시 시에 첨가한 효소 농도가 1 ㎎/㎖ 내지 6 ㎎/㎖으로 증가할 때까지는 생산된 알로스의 농도가 급증하다가, 6 ㎎/㎖ 이상의 효소 농도로 반응을 개시하는 경우에는 알로스 생산 농도의 증가 폭이 유의적으로 증가하지 않는 것을 확인하였다. 이에 따라, S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용한 알로스 생산 반응에서의 최적 효소 농도를 6 ㎎/㎖으로 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, until the enzyme concentration added at the initiation of the reaction was increased from 1 mg / ml to 6 mg / ml, the concentration of the produced enzyme rose sharply, and the enzyme concentration of 6 mg / , The increase of the alos production concentration was not significantly increased. Thus, the optimum enzyme concentration in the reaction for production of aloses using S232A / G245S double mutants was confirmed to be 6 mg / ml.

또한, 반응 개시시의 최적 기질 농도를 함께 확인하였다. S232A/G245S 이중 돌연변이체 6 ㎎/㎖를 포함하는 pH 7.0 완충 용액에 100 g/ℓ 내지 700 g/ℓ의 다양한 조건으로 변화를 주어 알룰로스 기질을 첨가한 다음, 30 분 동안 알로스 생산 반응을 수행하였다. 반응을 종결한 후, 생산된 알로스 농도를 분석하였다.The optimum substrate concentration at the start of the reaction was also confirmed. The alulose substrate was added to pH 7.0 buffer solution containing 6 mg / ml of the S232A / G245S double mutant under various conditions of 100 g / l to 700 g / l, Respectively. After the reaction was terminated, the concentration of produced aloses was analyzed.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 반응 개시 시에 첨가한 기질의 농도가 100 g/ℓ 에서 600 g/ℓ으로 증가함에 따라 생산된 알로스 농도 역시 비례적으로 증가하였으며, 600 g/ℓ 이상의 기질 농도로 반응을 개시하는 경우에는 알로스 생산 농도의 증가 폭이 유의적으로 증가하지 않는 것을 확인하였다. 이에 따라, S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용한 알로스 생산 반응에서의 최적 기질 농도를 600 g/ℓ으로 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 6, as the concentration of the substrate added at the initiation of the reaction increased from 100 g / l to 600 g / l, the produced alum was also proportionally increased, and the substrate of 600 g / , The increase in the concentration of alos production was not significantly increased. Thus, the optimal substrate concentration in the reaction for production of aloses using S232A / G245S double mutants was confirmed to be 600 g / l.

<6-2> S232A/G245S 이중 돌연변이체를 이용한 알로스 생산성 확인<6-2> Confirmation of productivity of aloses using S232A / G245S double mutants

이상으로 확인한 효소 농도 및 기질 농도를 적용하여, 6 ㎎/㎖ 농도로 S232A/G245S 이중 돌연변이체를 포함하는 pH 7.0 완충 용액에 600 g/ℓ 알룰로스를 가하여 75℃ 에서 총 60 분 동안 알룰로스로부터 알로스로 전환하는 반응을 수행하였다. 대조군으로서 야생형 효소를 이용하여 동일 조건에서 알로스 생산 반응을 수행하여 생산된 알로스 농도를 비교하였다.The enzyme concentration and the substrate concentration were applied and 600 g / l of alulose was added to a pH 7.0 buffer solution containing S232A / G245S double mutant at a concentration of 6 mg / ml, and the mixture was incubated at 75 ° C for 60 minutes from the alulose The reaction was carried out to convert it to alos. As a control, wild type enzymes were used to perform the alos production reaction under the same conditions, and the concentrations of the produced aloses were compared.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 S232A/G245S 이중 돌연변이체 600 g/ℓ의 알룰로스로부터 반응시간 40 분 후에 199.24 g/ℓ의 알로스가 생산되는 것으로 확인하여, 약 33%의 전환수율 및 299 g/ℓ/h의 생산성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이에 비해, 대조군인 야생형 엘-람노스 이성화효소를 이용한 알로스 생산 반응에서는, 반응 개시 60 분 후에 약 26%의 전환수율 및 156 g/ℓ/h의 생산성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이중 돌연변이체와 야생형 효소의 전환 수율 및 생산성을 비교하면, 본 발명에서 제조한 S232A/G245S 이중 돌연변이체가 약 1.3 배 높은 전환 수율을 나타내며, 약 1.6 배 높은 생산성을 나타내는 것으로 확인하였다. 이를 종래 알룰로스로부터 알로스를 생산하는 효소와 비교하면, 현재까지 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum) 유래의 라이보스-5-인산 이성화효소(ribose-5-phosphate isomerase) 변이체가 알로스 생산성을 41.2 g/ℓ/h으로 나타내어 가장 높은 생산성을 나타내는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1). 본 발명의 엘-람노스 이성화효소의 S232A/G245S 이중 돌연변이체는 상기 라이보스-5-인산 이성화효소 변이체보다 약 7.3 배 높은 생산성으로 알로스를 생산하는 것으로 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that 199.24 g / l of alos was produced from the allylose of the S232A / G245S double mutant at a reaction time of 600 g / l, and a conversion yield of about 33% and a yield of 299 g / l / h. In contrast, in the alos production reaction using the wild type L-rhamnose isomerase as a control, it was confirmed that the conversion yield was about 26% and the productivity was 156 g / l / h after 60 minutes from the start of the reaction. Comparison of the conversion yield and productivity of the double mutant and the wild type enzyme revealed that the S232A / G245S double mutant produced in the present invention exhibited about 1.3 times higher conversion yield and 1.6 times higher productivity. When compared with the enzyme to produce the Al from the prior Ross alrul loss, the loss productivity is Clostridium Thermo selreom (Clostridium thermocellum) Origin of Lai boss-5-phosphate isomerase (ribose-5-phosphate isomerase) variants Al to date 41.2 g / l / h, which is known to exhibit the highest productivity (Patent Document 1). It was confirmed that the S232A / G245S double mutant of the L-Rhamnose isomerase of the present invention produced about 7.3 times higher productivity than the above-mentioned ribose-5-phosphate isomerase mutant.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described specific portions of the present invention in detail, those skilled in the art will appreciate that these specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereto will be. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP <120> A mutant of L-rhamnose isomerase from Clostridium stercorarium and A method for producing of D-allose from D-allulose using the same <130> 1061304 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S232A/G245S double mutant of L-rhamnose isomerase <400> 1 Met Tyr Leu Tyr Asn Lys Asp Arg Ile Glu Gln Asp Tyr Lys Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ile Tyr Ala Ala Tyr Gly Val Asp Thr Asp Arg Val Met Glu 20 25 30 Glu Met Lys Thr Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp 35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ile Met 50 55 60 Ala Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Asn Gly Asp Glu Leu Arg 65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Lys Ala Leu Ser Leu Ile Pro Gly Lys His Arg Val 85 90 95 Asn Ile His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Gly Gly Lys Lys Val Asp Arg 100 105 110 Asp Glu Ile Thr Val Glu His Phe Gln Arg Trp Ile Asp Trp Ala Arg 115 120 125 Glu Lys Gly Ile Gly Ile Asp Phe Asn Pro Thr Phe 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Leu Leu Leu His Val Ser Arg Gly Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val 290 295 300 Val Ile Phe Asn Asp Asp Thr Leu Ala Ile Ala Gln Glu Ile Lys Arg 305 310 315 320 Cys Asp Ala Tyr Arg Lys Val His Ile Ala Leu Asp Phe Phe Asp Ala 325 330 335 Ser Ile Asn Arg Ile Thr Ala Trp Val Thr Gly Thr Arg Ala Thr Leu 340 345 350 Lys Ala Ile Met Tyr Ser Leu Leu Glu Pro Thr His Leu Leu Val Glu 355 360 365 Ala Glu Lys Asp Gly Asn Leu Gly Asn Arg Leu Ala Leu Met Glu Glu 370 375 380 Phe Lys Ala Leu Pro Phe Gly Ala Val Trp Asn Lys Tyr Cys Ala Glu 385 390 395 400 Asn Asn Val Pro Val Gly Ser Ala Trp Leu Glu Glu Val Arg Lys Tyr 405 410 415 Glu Glu Glu Val Leu Ser Leu Arg Lys 420 425 <210> 4 <211> 425 <212> PRT <213> Clostridium stercorarium <400> 4 Met Tyr Leu Tyr Asn Lys Asp Arg Ile Glu Gln Asp Tyr Lys Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ile Tyr Ala Ala Tyr Gly Val Asp Thr Asp Arg Val Met Glu 20 25 30 Glu Met Lys Thr Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp 35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly 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atggaagaaa tgaaaacaat cccggtttca 120 attcactgct ggcagggcga tgacgttgta gggtttgaaa atgcgggcgg aacgtccagc 180 ggcggaataa tggccaccgg aaattacccc ggcagggcgc gtaacggcga tgagttaaga 240 caggacatgg acaaagcgtt gagtttaatc cccgggaaac acagggttaa tattcatgcg 300 atgtatgcag agaccggcgg taaaaaagtg gatcgggacg aaataaccgt tgaacatttt 360 cagcgctgga tagactgggc aagggaaaaa ggtatcggaa tagatttcaa tcccacgttt 420 tttgcacatc ctctcgccga ttcaggttat actctttcaa atcccgatga aaaaatacgt 480 aaattctgga tagaacatgc caaacgttca agagaaattg ccgcggcaat aggtaaggcg 540 ttaaattcac cttgcgtgaa caatatatgg attcctgacg gttcaaagga tttgcctgcc 600 gacaggataa caaaacggca aatattgaaa gaagctcttg atgaaatact ggataagaaa 660 tacgacagaa actttcttgt cgattcagtg gaagcaaagc ttttcggcat cggttccgaa 720 agctatgttg taagttccca cgaattctat atgggatatg tgatgagccg tgacgatgta 780 attctttgcc ttgatgccgg acatttccat cccaccgaaa caatagccga caaaatttct 840 tcaattctgg ccttcaagga tgaactgctg ctgcatgtga gccgcggggt acgctgggac 900 agcgaccatg tggttatatt caatgacgat actttggcga 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Asp          35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ile Met      50 55 60 Ala Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Asn Gly Asp Glu Leu Arg  65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Lys Ala Leu Ser Leu Ile Pro Gly Lys His Arg Val                  85 90 95 Asn Ile His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Gly Gly Lys Lys Val Asp Arg             100 105 110 Asp Glu Ile Thr Val Glu His Phe Gln Arg Trp Ile Asp Trp Ala Arg         115 120 125 Glu Lys Gly Ile Gly Ile Asp Phe Asn Pro Thr Phe Phe Ala His Pro     130 135 140 Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Pro Asp Glu Lys Ile Arg 145 150 155 160 Lys Phe Trp Ile Glu His Ala Lys Arg Ser Ser Glu Ile Ala Ala Ala                 165 170 175 Ile Gly Lys Ala Leu Asn Ser Pro Cys Val Asn Asn Ile Trp Ile Pro             180 185 190 Asp Gly Ser Lys Asp Leu Pro Ala Asp Arg Ile Thr Lys Arg Gln Ile         195 200 205 Leu Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Lys Lys Tyr Asp Arg Asn     210 215 220 Phe Leu Val Asp Ser Val Glu Ala Lys Leu Phe Gly Ile Gly 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Tyr Ser Leu Leu Glu Pro Thr His Leu Leu Val Glu         355 360 365 Ala Glu Lys Asp Gly Asn Leu Gly Asn Arg Leu Ala Leu Met Glu Glu     370 375 380 Phe Lys Ala Leu Pro Phe Gly Ala Val Trp Asn Lys Tyr Cys Ala Glu 385 390 395 400 Asn Asn Val Val Gly Ser Ala Trp Leu Glu Glu Val Arg Lys Tyr                 405 410 415 Glu Glu Glu Val Leu Ser Leu Arg Lys             420 425 <210> 3 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S232A single mutant of L-rhamnose isomerase <400> 3 Met Tyr Leu Tyr Asn Lys Asp Arg Ile Glu Gln Asp Tyr Lys Ala Ala   1 5 10 15 Lys Glu Ile Tyr Ala Ala Tyr Gly Val Asp Thr Asp Arg Val Met Glu              20 25 30 Glu Met Lys Thr Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp          35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ile Met      50 55 60 Ala Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Asn Gly Asp Glu Leu Arg  65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Lys Ala Leu Ser Leu Ile Pro Gly Lys His Arg Val                  85 90 95 Asn Ile His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Gly Gly Lys Lys Val Asp Arg             100 105 110 Asp Glu Ile Thr Val Glu His Phe Gln Arg Trp Ile Asp Trp Ala Arg         115 120 125 Glu Lys Gly Ile Gly Ile Asp Phe Asn Pro Thr Phe Phe Ala His Pro     130 135 140 Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Pro Asp Glu Lys Ile Arg 145 150 155 160 Lys Phe Trp Ile Glu His Ala Lys Arg Ser Ser Glu Ile Ala Ala Ala                 165 170 175 Ile Gly Lys Ala Leu Asn Ser Pro Cys Val Asn Asn Ile Trp Ile Pro             180 185 190 Asp Gly Ser Lys Asp Leu Pro Ala Asp Arg Ile Thr Lys Arg Gln Ile         195 200 205 Leu Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Lys Lys Tyr Asp Arg Asn     210 215 220 Phe Leu Val Asp Ser Val Glu Ala Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ser Glu 225 230 235 240 Ser Tyr Val Val Gly Ser His Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Val Met Ser                 245 250 255 Arg Asp Asp Val Ile Leu Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr             260 265 270 Glu Thr Ile Ala Asp Lys Ile Ser Ser Ile Leu Ala Phe Lys Asp Glu         275 280 285 Leu Leu His Val Ser Arg Gly Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val     290 295 300 Val Ile Phe Asn Asp Asp Thr Leu Ala Ile Ala Gln Glu Ile Lys Arg 305 310 315 320 Cys Asp Ala Tyr Arg Lys Val His Ile Ala Leu Asp Phe Phe Asp Ala                 325 330 335 Ser Ile Asn Arg Ile Thr Ala Trp Val Thr Gly Thr Arg Ala Thr Leu             340 345 350 Lys Ala Ile Met Tyr Ser Leu Leu Glu Pro Thr His Leu Leu Val Glu         355 360 365 Ala Glu Lys Asp Gly Asn Leu Gly Asn Arg Leu Ala Leu Met Glu Glu     370 375 380 Phe Lys Ala Leu Pro Phe Gly Ala Val Trp Asn Lys Tyr Cys Ala Glu 385 390 395 400 Asn Asn Val Val Gly Ser Ala Trp Leu Glu Glu Val Arg Lys Tyr                 405 410 415 Glu Glu Glu Val Leu Ser Leu Arg Lys             420 425 <210> 4 <211> 425 <212> PRT <213> Clostridium stercorarium <400> 4 Met Tyr Leu Tyr Asn Lys Asp Arg Ile Glu Gln Asp Tyr Lys Ala Ala   1 5 10 15 Lys Glu Ile Tyr Ala Ala Tyr Gly Val Asp Thr Asp Arg Val Met Glu              20 25 30 Glu Met Lys Thr Ile Pro Val Ser Ile His Cys Trp Gln Gly Asp Asp          35 40 45 Val Val Gly Phe Glu Asn Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Gly Ile Met      50 55 60 Ala Thr Gly Asn Tyr Pro Gly Arg Ala Arg Asn Gly Asp Glu Leu Arg  65 70 75 80 Gln Asp Met Asp Lys Ala Leu Ser Leu Ile Pro Gly Lys His Arg Val                  85 90 95 Asn Ile His Ala Met Tyr Ala Glu Thr Gly Gly Lys Lys Val Asp Arg             100 105 110 Asp Glu Ile Thr Val Glu His Phe Gln Arg Trp Ile Asp Trp Ala Arg         115 120 125 Glu Lys Gly Ile Gly Ile Asp Phe Asn Pro Thr Phe Phe Ala His Pro     130 135 140 Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Thr Leu Ser Asn Pro Asp Glu Lys Ile Arg 145 150 155 160 Lys Phe Trp Ile Glu His Ala Lys Arg Ser Ser Glu Ile Ala Ala Ala                 165 170 175 Ile Gly Lys Ala Leu Asn Ser Pro Cys Val Asn Asn Ile Trp Ile Pro             180 185 190 Asp Gly Ser Lys Asp Leu Pro Ala Asp Arg Ile Thr Lys Arg Gln Ile         195 200 205 Leu Lys Glu Ala Leu Asp Glu Ile Leu Asp Lys Lys Tyr Asp Arg Asn     210 215 220 Phe Leu Val Asp Ser Val Glu Ser Lys Leu Phe Gly Ile Gly Ser Glu 225 230 235 240 Ser Tyr Val Val Gly Ser His Glu Phe Tyr Met Gly Tyr Val Met Ser                 245 250 255 Arg Asp Asp Val Ile Leu Cys Leu Asp Ala Gly His Phe His Pro Thr             260 265 270 Glu Thr Ile Ala Asp Lys Ile Ser Ser Ile Leu Ala Phe Lys Asp Glu         275 280 285 Leu Leu His Val Ser Arg Gly Val Arg Trp Asp Ser Asp His Val     290 295 300 Val Ile Phe Asn Asp Asp Thr Leu Ala Ile Ala Gln Glu Ile Lys Arg 305 310 315 320 Cys Asp Ala Tyr Arg Lys Val His Ile Ala Leu Asp Phe Phe Asp Ala                 325 330 335 Ser Ile Asn Arg Ile Thr Ala Trp Val Thr Gly Thr Arg Ala Thr Leu             340 345 350 Lys Ala Ile Met Tyr Ser Leu Leu Glu Pro Thr His Leu Leu Val Glu         355 360 365 Ala Glu Lys Asp Gly Asn Leu Gly Asn Arg Leu Ala Leu Met Glu Glu     370 375 380 Phe Lys Ala Leu Pro Phe Gly Ala Val Trp Asn Lys Tyr Cys Ala Glu 385 390 395 400 Asn Asn Val Val Gly Ser Ala Trp Leu Glu Glu Val Arg Lys Tyr                 405 410 415 Glu Glu Glu Val Leu Ser Leu Arg Lys             420 425 <210> 5 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S232A / G245S double mutant of L-rhamnose isomerase_DNA gene          seauence <400> 5 atgtatttat acaacaagga cagaattgag caggactaca aagccgcaaa ggaaatatac 60 gcagcatatg gtgttgatac cgacagggtt atggaagaaa tgaaaacaat cccggtttca 120 attcactgct ggcagggcga tgacgttgta gggtttgaaa atgcgggcgg aacgtccagc 180 ggcggaataa tggccaccgg aaattacccc ggcagggcgc gtaacggcga tgagttaaga 240 caggacatgg acaaagcgtt gagtttaatc cccgggaaac acagggttaa tattcatgcg 300 atgtatgcag agaccggcgg taaaaaagtg gatcgggacg aaataaccgt tgaacatttt 360 cagcgctgga tagactgggc aagggaaaaa ggtatcggaa tagatttcaa tcccacgttt 420 tttgcacatc ctctcgccga ttcaggttat actctttcaa atcccgatga aaaaatacgt 480 aaattctgga tagaacatgc caaacgttca agagaaattg ccgcggcaat aggtaaggcg 540 ttaaattcac cttgcgtgaa caatatatgg attcctgacg gttcaaagga tttgcctgcc 600 gacaggataa caaaacggca aatattgaaa gaagctcttg atgaaatact ggataagaaa 660 tacgacagaa actttcttgt cgattcagtg gaagcaaagc ttttcggcat cggttccgaa 720 agctatgttg taagttccca cgaattctat atgggatatg tgatgagccg tgacgatgta 780 attctttgcc ttgatgccgg acatttccat cccaccgaaa caatagccga caaaatttct 840 tcaattctgg ccttcaagga tgaactgctg ctgcatgtga gccgcggggt acgctgggac 900 agcgaccatg tggttatatt caatgacgat actttggcga tagcgcagga gattaagaga 960 tgcgacgcat accggaaggt tcacattgcc ctcgatttct ttgatgcgtc aataaacaga 1020 atcaccgcat gggtaaccgg aacaagggca acactgaaag ctattatgta ttcattgctt 1080 gagcccacac acctgctggt tgaagcggaa aaagacggta atctcggaaa caggcttgcg 1140 ctgatggaag aatttaaggc gctgcctttt ggtgcggtat ggaacaaata ctgtgctgaa 1200 aacaatgtac ctgttggatc ggcatggctg gaagaagtga ggaaatacga ggaagaagtg 1260 ctgtccttaa gaaag 1275

Claims (9)

서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 클로스트리디움 스터코라리움(Clostridium stercorarium) 유래 엘-람노스 이성화효소(L-rhamnose isomerase)의 아미노산 서열로부터,
232 번째 잔기인 세린(S)을 알라닌(A)으로 치환; 및 245 번째 잔기인 글리신(G)을 세린(S)으로 치환; 중 어느 하나 또는 둘 다의 치환을 하여 제조한, 변이체 엘-람노스 이성화효소.
From the amino acid sequence of rhamnose isomerase (L-rhamnose isomerase), - Clostridium requester collaboration Solarium (Clostridium stercorarium) El origin consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4
Substituting alanine (A) for serine (S) which is the 232th residue; And the 245th residue glycine (G) is substituted with serine (S); &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; mutant &lt; / RTI &gt; el-rhamnose isomerase.
삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 변이체 엘-람노스 이성화효소는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 변이체 엘-람노스 이성화효소.
The mutant EL-lambda isomerase according to claim 1, wherein said mutant EL-rhamnose isomerase comprises an amino acid sequence of any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
제 1항의 변이체 엘-람노스 이성화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는, 변이체 엘-람노스 이성화효소 발현용 재조합 벡터.
A recombinant vector for expressing a mutant EL-lambda isomerase, comprising a gene encoding the mutant E-rhamnose isomerase of claim 1.
제 4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET 24a인 것을 특징으로 하는, 변이체 엘-람노스 이성화효소 발현용 재조합 벡터.
5. The recombinant vector according to claim 4, wherein the recombinant vector is pET24a.
제 1항의 변이체 엘-람노스 이성화효소를 포함하는 반응 용액에, 기질인 알룰로스(D-allulose)를 가하여 알로스로의 전환 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 알로스(D-allose) 생산 방법.
A method for producing D-allose comprising the step of inducing a conversion reaction to allose by adding D-allulose, which is a substrate, to a reaction solution containing the mutant E-rhamnose isomerase of claim 1 .
제 6항에 있어서, 상기 반응 용액은 pH 6.5 내지 pH 8.5 범위인 것을 특징으로 하는, 알로스 생산 방법.
7. The method of claim 6, wherein the reaction solution is in the range of pH 6.5 to pH 8.5.
제 6항에 있어서, 상기 기질인 알룰로스는 100 g/ℓ 내지 700 g/ℓ의 농도로 반응 용액에 포함되는 것을 특징으로 하는, 알로스 생산 방법.
7. The method according to claim 6, wherein the substrate alululose is contained in the reaction solution at a concentration of 100 g / l to 700 g / l.
제 6항에 있어서, 상기 알로스로의 전환 반응은 60℃ 내지 80℃ 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 알로스 생산 방법.
The method according to claim 6, wherein the conversion reaction to the allose is carried out in the range of 60 ° C to 80 ° C.
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