KR101992170B1 - 자연살해세포의 배양 증식율 분석을 통한 면역 지수의 측정 방법 - Google Patents

자연살해세포의 배양 증식율 분석을 통한 면역 지수의 측정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자연 살해세포의 배양 증식율을 분석하여 인체의 면역 건강도의 지표가 되는 면역 지수를 측정 방법에 관한 것이고, 더 나아가 상기 방법으로부터 산정된 면역 지수를 기초로 하여 동종 혈액 유래 자연 살해세포 치료제 생산을 위한 혈액 공여자를 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 신속하게 목적하는 개체의 면역 지수를 측정할 수 있고, 이와 같은 객관화된 지표를 통하여 목적하는 개체가 자연 살해세포 치료제 생산을 위한 혈액 공여자로 적합한지에 관하여 정확하고 신속하게 판별할 수 있도록 한다.

Description

자연살해세포의 배양 증식율 분석을 통한 면역 지수의 측정 방법{Method of immune score determination by measuring NK cells proliferation}
본 발명은 자연살해세포의 배양 증식율을 분석하여 인체의 면역 건강도의 지표가 되는 면역 지수를 측정 방법에 관한 것이고, 더 나아가 상기 방법으로부터 산정된 면역 지수를 기초로 하여 동종 혈액 유래 자연살해세포 치료제 생산을 위한 혈액 공여자를 선별하는 방법에 관한 것이다.
인간에게서 면역계 이상과 불균형이 초래될 경우 염증 반응에 취약해지거나 암과 같은 난치성 질병이 발생한다. 면역력이 저하되면 바이러스 감염이나 세균의 침투에 방어하는 능력이 약해지며 이로 인해 건강을 잃을 수 있다. 또한 과도한 스트레스에 노출될 경우에도 면역력이 약해지고, 특히 암 세포 발생과 같은 정상세포의 손상과 변이가 일어날 수 있다. 인체는 이러한 변화에 대항하기 위해 매일 면역세포 (림프구)를 생성하여 방어체계를 구축하는데 이때 대표적인 림프구가 자연살해세포 (Natural Killer cell, NK cell)이다.
현재 NK 세포의 의학적 이용은 항암 치료에 초점이 맞추어져 있고, 보다 상세하게는 NK 세포를 이용하여 암 치료의 중요한 부분인 종양을 제거하거나 크기를 줄임으로써 증상을 완화하는데 목적을 가지고 있다. 여기에는 재발의 감소나 생존율을 높여야 하는 목표를 가지고 있으며 무엇보다 항암 세포 치료는 환자의 삶의 질을 높일 수 있어야 한다. 현재의 항암 화학요법이 만족스러운 암 치료에 접근하고 있지 못하며 무엇보다 항암제에 대한 환자의 저항성 (내성)과 부작용이 심각하여 암 치료에 있어서 삶의 질 향상 문제 또한 중요하다. 이러한 과제의 선택적 솔루션으로 NK 세포를 이용한 암 치료는 현재 전세계적으로 다양한 암종에 대하여 임상이 진행 중이다 (Cellular & Molecular Immunology (2013) 10, 230~252). NK 세포의 암세포 파괴는 NK 세포가 분비하는 퍼포린 (perforin) 및 그랜자임 (granzyme)등의 효소에 의한 파괴와 Fas-FasL 상호작용으로 살상하는 능력에 의하는데 NK 세포의 살상능은 폐암 (Carrega P, et al., Cancer, 112, 863-875, 2008), 간암 (Jinushi M, et al., J Hepatol., 43, 1013-1020, 2005), 유방암 (Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 33, 119-124, 2003), 자궁암 (Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 79, 224-250, 1999), 혈액암 (Tajima F., et al, Leukemia 10, 478-482, 1996) 등의 질환에서 결과가 보고되고 있다. NK 세포의 존재는 1964년 마우스에서 처음 보고되었고 이후 1975년 혈액 내에서의 발견과 MHC 비특이적 세포독성을 가진 기능의 보고가 되면서 항암면역세포 치료제로서의 개발연구가 활발히 진행되었다. 암 세포가 MHC class 1의 발현을 잃어버리거나 비정상적인 발현을 인지하게 되면 NK 세포는 세포독성을 나타내어 퍼포린과 그랜자임을 이용하여 암세포를 파괴한다.
이러한 임상 보고는 기존의 자가 혈액을 이용한 치료적 임상에서 벗어나 동종의 혈액 (blood donor)을 이용한 치료적 임상으로 옮겨가는 획기적 계기가 되었으며, 이에 따라 현재의 대부분의 NK 세포의 임상은 혈액 공여자로부터 얻어진 혈액에서 분리 및 배양된 NK 세포를 사용하고 있다.
그러나 건강한 혈액공여자라 할지라도 사람마다 면역세포의 수와 생존율이 상이하고, 동일한 공여자라고 하더라도 신체 컨디션이나 외부 환경 등에 따라 면역력이 끊임없이 변하게 되므로, 채취 시점에 따라 혈액 내를 순환하는 면역세포의 수와 생존율 등이 변화할 수 있고, NK 세포의 수와 증식율에도 차이가 발생하게 된다.
한편, NK 세포 치료제를 생산하기 위해서는 양질의 NK 세포가 다량으로 필요하므로, NK 세포 치료제의 제작에 착수하기에 앞서 다양한 혈액 공여자로부터 수득한 샘플 중 어떠한 것이 NK 세포 치료제에 적합한 지를 확인하는 작업이 필요하다. 하지만 일반적으로 각기의 혈액 샘플로부터 NK 세포의 활성 정도를 파악하는 데에는 2주 이상의 상당히 긴 시간이 소요되고 있어 치료를 시작하기까지 상당한 시간이 소요되는 문제점이 있다.
이에 최근에는 단시간 내에 치료에 사용될 수 있는 양질의 NK 세포를 얻을 수 있는 혈액 공여자를 파악하는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 자연살해세포의 배양 증식율을 분석하여 면역 지수를 측정하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 면역 지수의 측정 방법을 이용하여 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자를 선별하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 발명자들은 상기한 목적을 달성하기 위하여 예의 노력한 결과, 자연살해세포의 수와 증식율을 기초로 면역 지수를 산정하는 방법과, 이를 바탕으로 혈액공여자를 빠르게 선별하는 방법을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 자연살해세포(NK cell)를 수득하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 수득된 자연살해세포를 배양 용기 내에서 3~4일 동안 배양한 뒤 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체(cell clump)의 수를 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 측정된 평균 세포 응집체의 수를 하기 식 1에 대입하여 NK 세포 건강도를 측정하는 단계를 포함하는, 면역 지수의 측정 방법에 관한 것이다:
[식 1]
NK 세포 건강도 = A/B X 100
상기 식 1에서, A는 상기 b) 단계에서 측정된 목적하는 개체에 있어서 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수를 의미하는 것이고, B는 정상 모집단에서 측정된 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수의 평균 값을 의미하는 것이다.
본 발명에서 상기 "면역 지수"란, 질환, 특히 종양에 대한 개체의 면역 반응의 다양한 특성을 나타내는 지표를 의미하는 것으로, 종양의 치료 효과를 예측하기 위한 요소이다.
또한, 본 발명에서 상기 "NK 세포 건강도"란, 자연살해세포의 활성도를 의미하는 것으로, 자연살해세포의 증식 속도를 바탕으로 종양 세포에 대한 NK 세포의 살상능을 의미한다.
본 발명에서 상기 목적하는 개체로부터 분리된 "생물학적 시료”란, 본 발명에 따른 상기 자연살해세포가 존재할 수 있는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 분변 또는 소변과 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 말초혈액의 전혈(Whole blood)일 수 있다.
단, 본 발명에서 상기 생물학적 시료로 말초혈액을 사용하는 경우 자연살해세포를 수득하기 위하여 전혈의 적혈구를 용혈시켜 제거하는 전처리단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 생물학적 시료로부터 자연살해세포, 혹은 이를 포함하는 림프구를 수득하면, 이를 배양 용기 내에서 3~4일 동안 배양할 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 용기의 크기 및 형상은 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 단면적이 25cm2인 플라스크(T25 플라스크)를 사용할 수 있다. 자연살해세포의 배양을 위하여 일반적으로 T75 플라스크가 주로 사용되지만, 본 발명에서는 단면적이 작은 T25 플라스크를 사용함으로써 자연살해세포의 배양 효율을 높일 수 있다.
또한, 일반적으로 자연살해세포의 배양 시 배양 용기 내에 배지를 지속적으로 공급하면서 자연살해세포의 증식을 유도하지만, 본 발명에서는 빠른 시일 내에 자연살해세포의 증식을 유도하기 위하여, 자연살해세포가 들어있는 T25 플라스크를 세워서 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 상기 자연살해세포는 개체로부터 분리된 말초혈액 10 내지 50 ml, 바람직하게는 10 내지 20 ml, 보다 바람직하게는 15 ml에서 분리된 것을 상기 배양 용기에 접종될 수 있다.
본 발명에서 상기 배양 배지의 조성은 특별하게 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에서 자연살해세포의 배양을 위하여 사용되는 배지라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 림프구용 무혈청 합성 배양배지 (KBM502, KBM540, KBM550, KBM570 등), AIM-V, DC medium, DMEM, RPMI-1640 또는 X-VIVO 배지 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 NK 세포 배양 전용 배지인 ALyS505NK-EX1000을 사용할 수 있다.
또한, 혈액 시료 내에 존재하는 자연살해세포는 일반적으로 비활성화된 상태로 존재한다. 본 발명에서는 자연살해세포를 자극하여 증식 배양을 유도하기 위해 인터루킨 2(interleukin 2)를 상기 배양 배지에 첨가하여 배양할 수 있다. 상기 인터루킨 2는 T 세포가 분비하는 사이토카인으로서 체내 적응면역반응에 있어서 T 세포에 의한 자연살해세포의 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 시험관 내에서 NK 세포를 활성화 시키기 위해 일반적으로 많이 사용되는 사이토카인이다. 본 발명에서 상기 인터루킨 2의 사용량은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 500 ~ 1500 IU/ml의 농도로 첨가할 수 있고, 바람직하게는 1000 IU/ml의 농도로 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 자연살해세포의 배양 조건은 통상의 세포 배양에 있어서 사용되는 조건으로 온도는 37 ℃, 이산화탄소(CO2)가 5~10 부피%, 바람직하게는 5.5~6 부피%로 포함된 조건 하에서 배양될 수도 있다. 일반적으로 자연살해세포 배양 시 이산화탄소가 5 부피%로 포함된 조건 하에서 배양하지만, 본 발명에서는 이산화탄소가 5.5~6 부피%로 포함된 조건 하에서 배양함으로써 자연살해세포의 배양 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같이 배양 용기 내에서 자연살해세포를 3~4일 동안 배양하면 배양 용기 내에 세포 응집체(cell clump)가 형성된다.
본 발명에서 상기 "세포 응집체(cell clump)"란 복수 개의 세포가 응집되어 형성된 구형의 응집 덩어리를 의미하는 것으로, 본 발명에서 상기 세포 응집체로는 최소 100 픽셀(pixels) 이상, 즉 100 ㎛ 이상의 직경을 가지는 것을 가리킨다.
본 발명에서는 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수를 측정할 수 있는데, 이때 상기 세포 응집체의 수는 육안으로 계수가 가능하지만, 바람직하게는 40배율 현미경을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수가 측정되면 그 값을 하기 식 1의 A로 대입하여 NK 세포 건강도를 측정할 수 있다.
[식 1]
NK 세포 건강도 = A/B X 100
단, 상기 식 1에서, A는 면역 지수를 측정하고자 하는 목적하는 개체에 대하여 측정된 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수를 의미하는 것이다. 또한 상기 B는 정상 모집단에서 측정된 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수의 평균 값을 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 정상 개체로 구성된 모집단에 있어서, 각 개체의 생물학적 시료로부터 분리 및 수득된 자연살해세포를 배양 용기 내에서 3~4일 동안 배양한 뒤 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체 수를 측정한 뒤 얻어진 모집단 전체의 평균값을 의미하는 것이다.
본 발명에서 상기 B의 값은 3~5개일 수 있고, 바람직하게는 3.5 내지 4.5개일 수 있으며, 보다 바람직하게는 4개일 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 NK 세포 건강도를 측정한 후 혹은 그 전에, d) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 시료 ml 당 림프구의 수를 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 림프구 수의 측정을 위하여 분리된 생물학적 시료는 말초혈액일 수 있고, 그 양은 10 내지 50 ml일 수 있고, 바람직하게는 10 내지 20 ml일 수 있으며, 보다 바람직하게는 15 ml일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 말초 혈액으로부터 림프구 수를 측정하는 구체적인 방법은 당해 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의할 수 있으며, 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 말초 혈액에 피콜(Ficoll paque)를 첨가하여 원심 분리하여 피콜과 플라즈마 사이에 형성된 림프구 층을 취한 뒤 버퍼를 첨가한 뒤 원심 분리하여 상층액을 제거하는 공정을 2~3회 반복하며 수행하여 림프구만을 분리하고, 자동화 세포 카운팅(automated cell counting) 등의 장비를 이용하여 림프구 수를 계수할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같은 방법을 이용하여 생물학적 시료 ml 당 림프구의 수를 측정하면, 그 값과 상기 측정된 NK 세포 건강도를 하기 식 2에 대입하여 면역 지수를 측정할 수 있다.
[식 2]
면역 지수 = NK 세포 건강도 X C/D
상기 식 2에서, C는 면역 지수를 측정하고자 하는 목적하는 개체에서 측정된 생물학적 시료 ml 당 림프구의 수를 의미하는 것이다. 또한 상기 D는 평균 정상 모집단에서 측정된 생물학적 시료 ml 당 림프구의 수의 평균값을 의미하는 것으로, 보다 상세하게는 정상 개체로 구성된 모집단의 생물학적 시료(바람직하게는, 말초 혈액)으로부터 분리된 생물학적 시료 ml 당 림프구 수의 평균값을 의미하는 것이다.
본 발명에서 상기 D의 값은 400,000/ml 내지 450,000/ml일 수 있고, 바람직하게는 400,000/ml 내지 420,000/ml일 수 있으며, 보다 바람직하게는 420,000/ml일 수 있다.
본 발명에서 상기 림프구의 수의 측정은 생물학적 시료로부터 림프구를 분리 및 수득한 뒤 바로 수행하는 것이 바람직하다.
단, 이 경우 D 값 또한 정상 개체로 구성된 모집단에 있어서 각 개체군의 생물학적 시료(바람직하게는, 말초 혈액 15ml)로부터 분리된 림프구의 수를 측정한 뒤 얻어진 모집단의 평균값일 수 있다.
본 발명에서 상기 림프구의 배양에 사용되는 배지의 조성은 특별하게 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에서 림프구의 배양을 위하여 사용되는 배지라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 림프구용 무혈청 합성 배양배지 (KBM502, KBM540, KBM550, KBM570 등), AIM-V, DC medium, DMEM, RPMI-1640 또는 X-VIVO 배지 등을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 NK세포 배양 전용배지인 ALyS505NK-EX1000을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식 1의 B 값과 식 2의 D 값을 결정하기 위한 모집단은 건강한 정상 개체로 이루어진 군으로, 상기 개체군의 수는 특별히 제한하지 않으나 적어도 20인 이상으로 구성된 것이 정확도를 높일 수 있어 바람직하다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 면역 지수 측정 방법을 포함하는, 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자로 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 상기의 방법으로 측정된 면역 지수 값이 100 이상인 경우 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자로 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
암 치료를 위한 자연살해세포 치료에 있어, 기존에는 암 환자 자신의 혈액을 이용한 자가 혈액 자연살해세포 치료제를 생산하였으나, 그 생산과 치료 효과에 한계가 뒤따르는 문제점이 있었다. 이에 최근에는 동종의 혈액을 이용한 타가 혈액 유래 NK 세포 치료제의 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 여기서 가장 중요한 요인으로는 건강한 혈액공여자의 선별이다. 하지만 종래에는 자연살해세포 치료제 생산에 적합한 혈액 공여자 인지 여부를 확인하기 위하여 적어도 3주 이상의 시간이 소요되어, 적절한 시기에 자연살해세포 치료제를 제공할 수 없는 단점이 있었다.
하지만, 본 발명에서는 면역 지수의 측정이 1주일 이내에, 빠르게는 5일 이내에 가능하여 그에 따라 자연살해세포 치료제의 생산에 적합한 혈액 공여자 인지 여부를 신속하게 판별할 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 신속하게 목적하는 개체의 면역 지수를 측정할 수 있고, 이와 같은 객관화된 지표를 통하여 목적하는 개체가 자연살해세포 치료제 생산을 위한 혈액 공여자로 적합한지에 관하여 정확하고 신속하게 판별할 수 있도록 한다.
도 1은 실시예 1에서 측정된 모집단 혈액 공여자 후보군 개체(n=21) 각각에서 총 림프구 수 대비 살아있는(viable) 림프구 수의 비율을 측정한 결과를 생존율(cell viability)로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에서 혈액 공여자에 속하는 개체 3명(혈액 공여자 3, 4 및 5)에 있어서 자연살해세포 배양 3일 후 저배율 현미경(40배)을 이용하여 세포 응집체를 관찰한 사진을 나타낸 것으로 각기 다른 배양증식율을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에서 혈액 공여자에 속하는 개체 1명(혈액 공여자 2)에 있어서 자연살해세포 배양 3일 후 저배율 현미경(40배)을 이용하여 세포 응집체를 관찰한 사진을 나타낸 것으로, T25 플라스크 내에 증식하는 자연살해세포의 증식을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 혈액 공여자에 속하는 개체 1명(혈액 공여자 2)에 있어서 자연살해세포 배양 3일 후 저배율 현미경(40배)을 이용하여 세포 응집체를 관찰한 사진을 나타낸 것으로, 자연살해세포의 세포 응집체 수의 결정 방법을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2에서 혈액 공여자에 속하는 개체 2명(혈액 공여자 1 및 2)에 있어서 자연 살해세포 배양 3일 후 저배율 현미경(40배)과 고배율 현미경(200배)을 이용하여 세포 응집체를 관찰한 사진을 나타낸 것으로, 혈액 공여자의 선별 결정을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[ 준비예 1] 말초 혈액의 채취와 림프구의 분리
혈액 공여자 후보군에 속하는 개체 21명으로부터 EDTA 튜브를 사용하여 말초 혈액 15ml를 채혈하였다. 이를 50ml 코닝 원심분리 튜브(corning centrifuge tube)에 넣은 뒤 동량의 피콜 (Ficoll paque)을 첨가한 후 3000rpm에서 30분간 원심 분리하였다. 이때, 피콜에 올려진 혈액의 상태 (점도 등)에 따라 원심분리의 시간을 최대 40분까지 활용할 수 있다. 10ml 피펫(pipet)을 이용하여 피콜과 플라스마 (plasma) 사이에 생긴 림프구층만을 취한 뒤 새로운 튜브에 옮겨 담았다. 이후 DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)를 동일한 용량으로 튜브에 채우고 세포를 고르게 섞어 세척한 후 1500rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 원심분리 후 상층액을 최대한 제거하고, 다시 DPBS 15ml를 넣어 피펫팅(pipetting)으로 세포를 세척한 후 같은 조건에서 원심 분리하였다. 상기와 같은 피콜을 이용한 림프구의 수확 시 일반적으로 DPBS 세척을 총 3번 이상 수행하지만, 세척과 원심 분리 과정에서 림프구의 손실이 있으므로 림프수의 수와 생존율을 결정하는데 오차범위를 최대한 줄이기 위하여, 피콜 분리 후 총 2번의 세척으로 세포 세척 과정으로 마무리하였다.
[ 실시예 1] 분리된 림프구의 생존율과 수의 측정
(1) 목적하는 개체에서 림프구의 생존율 측정
상기 준비예 1에서 분리한 21명의 개체군으로부터 분리한 림프구를 세척한 후 이하의 NK 세포의 배양 전 총 림프구의 생존율을 결정하였다. 구체적인 시험 방법으로 림프구와 트립판 블루 염색 시약을 1:1로 희석한 뒤 자동화 세포수 측정장비를 이용하여 림프구의 생존율(cell viability)을 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, 상기 21명의 개체군 중 임의의 2명의 혈액 공여자(혈액 공여자 1 및 2)에 있어서 림프구의 수를 측정하여, 상기 준비예 1에서 수득한 말초혈액 1 ml 당 포함된 림프구의 수(이하, '개체의 림프구 수'이라 한다.)를 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.
구분 림프구 수(/ml)
혈액 공여자 1 143,000
혈액 공여자 2 420,000
(2) 건강한 모집단 개체군에서의 림프구 수의 평균값 도출
건강한 모집단 개체군의 림프구 수의 평균값을 결정하기 위하여 20명 이상의 개체군이 확보되는 것이 바람직하나, 더욱 정확한 평균값을 도출하기 위하여 건강한 개체 50명에 대하여 상기 준비예 1과 동일한 방법으로 림프구를 수득한 뒤 상기 실시예 1의 (1)과 동일한 방법으로 말초 혈액 1ml 당 림프구의 수를 측정하여 그 평균 값(이하, '모집단 림프구 수의 평균값'이라 한다.)을 계산한 결과, 420,000/ml가 얻어졌다.
[ 실시예 2] NK 세포 건강도의 측정
(1) 목적하는 개체에서 NK 세포 응집체 수의 측정
상기 실시예 1의 (1)에서 혈액 공여자 후보군에 속하는 개체로부터 분리된 림프구를, 5ml의 NK 배양 배지가 들어있는 T25 플라스크 (25㎠ 플라스크)에 접종한 뒤 이산화탄소가 포함된 37℃의 습윤 배양기에 넣어 배양하였다. 단, NK 세포를 자극하여 증식 배양을 유도하기 위해 NK 세포 배양 전용배지 (ALyS505NK-EX1000)를 사용하였다. 상기 배지에서 3일 동안 배양한 후 40 배율 현미경으로 T25 플라스크 내 세포 응집체를 관찰하였다. 관찰 사진은 도 2 내지 4에 나타낸 바와 같다. 상기 세포 응집체의 수를 측정함에 있어서, 도 3에서 보는 바와 같이 T25 플라스크의 1.5 mm2 면적 당 분포된 평균 세포 응집체의 수를 측정한 것이고, 세포 응집체로는 도 4에서 보는 바와 같이 기준 직경이 100 픽셀(pixels) (100 ㎛) 이상인 세포 응집체의 수만을 측정하였다(이하, '개체의 NK 세포 응집체의 수'라 한다.).
도 4에 나타낸 혈액 공여자 1 및 2에 있어서, T25 플라스크의 1.5 mm2 면적 당 분포된 평균 세포 응집체의 수는 하기 표 2와 같다.
구분 1.5 mm2 면적 당 평균 세포 응집체의 수
혈액 공여자 1 2개
혈액 공여자 2 5개
(2) 건강한 모집단 개체군에서의 NK 세포 응집체 수의 도출
건강한 개체 50명에 대하여 상기 실시예 2의 (1)과 동일한 방법으로 T25 플라스크의 1.5 mm2 면적 당 평균 세포 응집체의 수를 측정한 뒤, 모집단 전체의 평균 값(이하, '모집단 NK 세포 응집체 수의 평균값'이라 한다.)을 계산하였다. 그 값으로 평균 4가 도출되었다.
(3) NK 세포 건강도의 측정
상기 (1)에서 혈액 공여자 1 및 2에 대하여 측정된 개체의 NK 세포 응집체의 수를 A로, 상기 (2)에서 측정된 모집단 NK 세포 응집체 수의 평균값을 B로 하여 하기 식 1에 대입해 NK 세포 건강도를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 3과 같다.
[식 1]
NK 세포 건강도 = A/B X 100
구분 NK 세포 건강도
혈액 공여자 1 50
혈액 공여자 2 125
[ 실시예 3] 면역 지수의 측정
상기 실시예 1의 (1)에서 혈액 공여자 1 및 2에 대하여 측정된 개체의 림프구 수를 C로, 상기 실시예 1의 (2)에서 측정된 모집단 림프구 수의 평균값을 D로 하고, 상기 실시예 2에서 측정된 NK 세포 건강도를 하기 식 2에 대입하여 면역 지수를 측정하였고, 그 결과는 하기 표 4와 같다.
[식 2]
면역 지수 = NK 세포 건강도 X C/D
구분 면역 지수
혈액 공여자 1 17
혈액 공여자 2 125
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 혈액 공여자 2는 면역 지수가 125로 계산되었고, 실제로 상기 혈액 공여자 2로부터 수득된 혈액 시료로부터 양질의 자연살해세포를 다량으로 수득할 수 있어 NK 세포 치료제를 제작하기에 적합하였다.
하지만, 혈액공여자 1은 면역 지수 계산 결과, 17 정도에 불과하였고, 실제로도 상기 혈액 공여자 1에서 수득된 혈액 시료로부터는 자연살해세포를 충분한 양을 얻을 수 없어 NK 세포 치료제를 제작하기에 부적합하였다.
상기 결과를 이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (15)

  1. a) 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 자연살해세포(NK cell)를 수득하는 단계;
    b) 상기 a) 단계에서 수득된 자연살해세포를 배양 용기 내에서 3~4일 동안 배양한 뒤 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체(cell clump)의 수를 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 측정된 평균 세포 응집체의 수를 하기 식 1에 대입하여 NK 세포 건강도를 측정하는 단계;
    d) 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료로부터 시료 ml 당 림프구의 수를 측정하는 단계; 및
    상기 d) 단계에서 측정된 시료 ml 당 림프구의 수를 하기 식 2에 대입하여 면역 지수를 측정하는 단계를 포함하는, 면역 지수의 측정 방법:
    [식 1]
    NK 세포 건강도 = A/B X 100
    (상기 식 1에서, A는 상기 b) 단계에서 측정된 목적하는 개체에 있어서 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수를 의미하고, B는 정상 모집단에서 측정된 배양 용기 1.5mm2 당 평균 세포 응집체의 수의 평균 값을 의미한다.)
    [식 2]
    면역 지수 = NK 세포 건강도 X C/D
    (상기 식 2에서, C는 면역 지수를 측정하고자 하는 목적하는 개체에서 측정된 시료 ml 당 림프구의 수를 의미하고, 상기 D는 정상 모집단에서 측정된 시료 ml 당 림프구의 수의 평균 값을 의미한다.)
  2. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 생물학적 시료는 말초 혈액인, 면역 지수의 측정 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 생물학적 시료의 양은 10 내지 50 ml인, 면역 지수의 측정 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 배양 용기는 단면적이 25cm2인 플라스크인, 면역 지수의 측정 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 자연살해세포의 배양은 37 ℃의 온도 및 이산화탄소(CO2)가 5.5~6 부피%로 포함된 조건 하에서 수행되는, 면역 지수의 측정 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 세포 응집체는 직경이 100 픽셀(pixels) 이상인 것인, 면역 지수의 측정 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 B의 값은 3 내지 5인, 면역 지수의 측정 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계의 생물학적 시료는 말초 혈액인, 면역 지수의 측정 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계의 생물학적 시료의 양은 10 내지 50 ml인, 면역 지수의 측정 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계는, 목적하는 개체의 생물학적 시료로부터 림프구를 분리한 뒤 림프구의 수를 측정하여 수행되는, 면역 지수의 측정 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계는, 목적하는 개체의 생물학적 시료에 피콜(Ficoll paque)를 첨가하여 원심 분리하여 피콜과 플라즈마 사이에 형성된 림프구 층을 취한 뒤 버퍼를 첨가하고 원심 분리하여 상층액을 제거하는 공정을 2~3회 반복하여 분리된 림프구의 수를 측정하는 것인, 면역 지수의 측정 방법.
  14. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항의 면역 지수 측정 방법을 포함하는, 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자의 선별 방법.
  15. 제1항에서 측정된 면역 지수 값이 100 이상인 경우 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자로 판별하는 단계를 포함하는, 자연살해세포 치료제의 생산을 위한 혈액 공여자의 선별 방법.
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