KR101984799B1

KR101984799B1 - 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법

Info

Publication number: KR101984799B1
Application number: KR1020180101240A
Authority: KR
Inventors: 임현필; 지민경; 박상원; 이광민; 김현승; 조훈성
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2019-05-31
Also published as: KR20180098513A

Abstract

본 발명은 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 처리함으로써 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)와 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 열처리 및/또는 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 및/또는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

타이타늄 임플란트의 표면처리 방법{Method for treating surface of Titanium implant}

본 발명은 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 처리함으로써 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)와 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 제조방법에 관한 것이다.

타이타늄은 우수한 기계적 성질과 생체적합성, 그리고 골유착성으로 인해 치과 및 정형외과 임플란트의 재료로 많이 사용된다. 임플란트의 장기적 성공을 위해서는 생체재료와 주위 조직 간 유착이 매우 중요하다. 그러나 식립된 임플란트가 구강 내에 노출되면 2주 내에 치주염을 유발하는 세균의 군락(colony)이 형성되고, 4주 내에 치은연하 세균총이 완성되어 임플란트 실패로 이어질 수 있다.

임플란트주위염이란 임플란트 표면에 형성된 세균막(biofilm)에 의해 발생하는 치주염과 비슷한 염증이다. 세균막은 여러 가지 세균총으로 이루어져 있으며, 표면에 타액 단백질이 부착되면서 획득피막(acquired pellicle)을 형성한다.

스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)는 그람 양성 통성균으로서, 구강 내에서 흔히 발견되며 섬모를 가지고 있어 다른 세균보다 치아 표면이나 조직에 부착이 용이해 초기 세균막을 주로 형성한다. 스트렙토코쿠스 무탄스에 의해 형성된 세균막은 치은 하방까지 축적되며, 상호 작용을 통하여 ‘red complex’라고 불리는 Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum 등과 같은 세균 부착을 유도하여 후기 군락 형성을 용이하게 한다. 이 중 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 그람음성균으로서 치주염 환자의 치주낭에서 흔히 발견되며, 임플란트주위염이 진행된 골유합부위에서도 관찰할 수 있다. 포르피로모나스 진지발리스는 숙주의 다양한 조직이나 세포에 침입하여 증식하므로 구강 내 포르피로모나스 진지발리스의 부착은 병원성을 이끌 수 있다.

임플란트는 자연 치아와 달리 혈관과 신경조직이 없기 때문에 특별한 증상을 느끼지 못한 채로 골조직의 손상이 심하게 진행될 확률이 높다. 이 염증이 골조직까지 확산되면 골소실이 일어난다. 따라서 임플란트 표면에 세균막의 형성을 억제하는 것은 임플란트 유지에 매우 중요하다.

임플란트주위염을 치료하는 방법에는 기계적인 제거와 소독치료, 그리고 항생제 치료 요법 등이 있다. 소독치료와 항생제등을 이용한 치료는 임플란트주위염을 치료하는데 제한적이며, 표면에 부착된 세균막을 기계적으로 제거하는 술식이 필수적이라는 한계가 있다. 그리고, 기계적으로 제거하는 요법은 임플란트 표면에 손상을 줄 가능성이 높기 때문에 탄소 섬유 큐렛 등 임플란트 표면의 손상을 최소화하는 특수화된 기구를 사용해야 하는 어려움이 있다.

따라서 임플란트주위염의 보다 효과적인 치료법 개발이 요구되고 있는 실정이다.

등록특허번호 제10-1252767호(2013.04.03. 등록)

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 처리함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)와 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착의 증가를 억제함과 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 타이타늄 임플란트를 준비하는 단계; 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계; 및 TiO₂ 나노튜브가 형성된 상기 타이타늄 임플란트의 표면을 열처리하는 단계;를 포함할 수 있다.

바람직하게는 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 부착의 증가를 방지할 수 있으며, 상기 타이타늄 임플란트는 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트일 수 있다.

바람직하게는 상기 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계는, 증류수에 1M의 인산(H₃PO₄)과 1.5wt%의 불산(HF)을 첨가하여 제조한 전해액에 전극이 연결된 타이타늄 일플란트 시편과 백금판을 침적하고, 20V의 전압을 인가하여 10분간 양극산화하여 상기 타이타늄 임플란트 표면에 다공성의 비정질 TiO₂ 나노튜브를 형성할 수 있다.

바람직하게는 상기 열처리는 소결로(sintering furnace)에서 수행하는데, 대기분위기에서 1℃/min의 조건으로 300 내지 700℃ 범위의 일정 온도로 승온시킨 후 1시간 동안 온도를 유지한 다음, 노냉하여 수행될 수 있다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과가 있다.

본 발명의 제조방법에 의하면 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 열처리 및/또는 상온 대기압 플라즈마를 이용하여 처리함으로써 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 및/또는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에 의하면 스트렙토코쿠스 무탄스 및/또는 포르피로모나스 진지발리스 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트의 표면을 처리함으로써 스트렙토코쿠스 무탄스 및/또는 포르피로모나스 진지발리스 세균의 부착의 증가를 방지함과 함께 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 양극산화한 TiO₂ 나노튜브 시편의 열처리 전후에 따른 XRD 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 TiO₂ 나노튜브 표면의 XPS 분석결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 TiO₂ 나노튜브 표면의 각 원소의 원자퍼센트를 보여주는 그래프이다.
도 4는 열처리에 따른 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다.
도 5는 플라즈마 처리에 따른 스트렙토코쿠스 무탄스 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다.
도 6은 열처리에 따른 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다.
도 7은 플라즈마 처리에 따른 포르피로모나스 진지발리스 세균의 부착능 실험에 대한 crystal violet의 값을 보여주는 그래프이다.
도 8은 조골세포의 부착 정도를 보여주는 주사전자현미경사진이다.
도 9는 조골세포 증식 평가(2일 배양, 열처리)에 대한 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 10은 조골세포 증식 평가(2일 배양, 플라즈마 처리)에 대한 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 11는 조골세포 증식 평가(4일 배양, 열처리)에 대한 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 12는 조골세포 증식 평가(4일 배양, 플라즈마 처리)에 대한 결과값을 보여주는 그래프이다.
도 13 내지 도 15는 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사(열처리) 결과를 보여주는 그래프들이다.
도 16 내지 도 18은 조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사(플라즈마 처리) 결과를 보여주는 그래프들이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시 예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

먼저, 본 발명은 타이타늄 임플란트의 표면을 처리함에 있어서, 타이타늄 임플란트의 표면을 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고 열처리 및/또는 대기압 플라즈마를 이용하여 표면을 처리하는 것에 그 기술적 특징이 있다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법은 타이타늄 임플란트를 준비하는 단계와, 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계 및 TiO₂ 나노튜브가 형성된 상기 타이타늄 임플란트의 표면을 열처리하는 단계를 포함하며, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 부착의 증가를 방지하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 타이타늄 임플란트는 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법은 타이타늄 임플란트를 준비하는 단계와, 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계 및 대기압 플라즈마를 이용하여 TiO₂ 나노튜브가 형성된 상기 타이타늄 임플란트의 표면을 처리하는 단계를 포함하며, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 타이타늄 임플란트는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법은 타이타늄 임플란트를 준비하는 단계와, 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계와, TiO₂ 나노튜브가 형성된 상기 타이타늄 임플란트의 표면을 열처리하는 단계 및 대기압 플라즈마를 이용하여 열처리된 상기 타이타늄 임플란트의 표면을 처리하는 단계를 포함하며, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시키는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 타이타늄 임플란트는 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트일 수 있다.

즉, 본 발명의 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법들은 모두 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성한 후 표면을 처리한다.

상기 양극산화공정은 상기 타이타늄 임플란트 표면에 얇고 거친 다공성의 비정질 TiO₂ 산화막을 전기 화학적으로 형성시키는 방법이다. 이렇게 양극산화공정으로 타이타늄 임플란트 표면에 비정질 TiO₂ 나노튜브를 형성하면 표면적이 향상되어 세포부착, 증식 및 분화율을 증진시켜 주변 골과 임플란트의 결합력을 향상시키고, 골 생성을 촉진시켜 치료기간을 단축시킬 수 있다.

상기 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계는, 증류수에 1M의 인산(H₃PO₄)과 1.5wt%의 불산(HF)을 첨가하여 제조한 전해액에 전극이 연결된 타이타늄 임플란트 시편과 백금판을 침적하고, 20V의 전압을 인가하여 10분간 양극산화하여 상기 타이타늄 임플란트 표면에 다공성의 비정질 TiO₂ 나노튜브를 형성한다.

상기 열처리는 상기 타이타늄 표면에 생성된 TiO₂ 나노튜브의 결정 구조를 변화시켜 세포활성은 저해하지 않고 세균부착을 억제한다. 열처리 공정을 통해 상기 TiO₂ 나노튜브는 anatase 또는 rutile 결정구조를 형성한다.

상기 열처리공정은 소결로(sintering furnace)에서 수행하는데, 대기분위기에서 1℃/min의 조건으로 300 내지 700℃ 범위의 일정 온도로 승온시킨 후 1시간 동안 온도를 유지한 다음, 노냉하여 수행한다.

그리고, 상기 타이타늄 임플란트의 표면에너지와 친수성을 변화시키기 위해 TiO₂ 나노튜브에 대기압 플라즈마를 적용하였다.

상기 대기압 플라즈마는 상온 대기압 플라즈마 발생장치를 이용하여 발생시키는데, 60 내지 150 sec 범위의 일정 시간동안 대기압 플라즈마 처리를 수행함으로써 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있다. 후술하겠지만, 대기압 플라즈마 처리를 60초 이내로 수행하면 조골세포의 부착능이 향상되지 않으며, 대기압 플라즈마 처리를 150초 이상으로 수행하면 조골세포의 부착능은 향상되나 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착이 유의하게 증가하므로 상기 범위 내에서 대기압 플라즈마 처리를 수행하는 것이 바람직하다.

상기 대기압 플라즈마 발생장치는 아르곤 99%와 산소 1%의 혼합기체를 이용하며, 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 타이타늄 임플란트의 표면에 플라즈마를 발생시켜 처리한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법은 타이타늄 임플란트 표면에 양극산화공정을 이용하여 TiO₂ 나노튜브를 형성하고, 열처리를 수행한 다음 대기압 플라즈마를 이용하여 표면 처리하게 되면, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 및 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균 부착의 증가를 방지함과 함께, 조골세포의 부착능을 향상시킬 수 있다.

실시예 1

Ⅰ. 재료준비 및 실험방법

1. 타이타늄 시편 준비

상업용 순수 타이타늄(ASTM Grade Ⅳ, Kobe Steel, Kobe, Japan) 시편을 지

름 15 mm, 두께 3mm로 제작하였다. 준비된 시편은 연마(Labopol-5, Struers, Denmark)에서 #600 SiC 연마지를 이용하여 습식 연마하였다. 연마 후 모든 시편은 표면에 존재하는 잔류 유기물 및 불순물 제거를 위해 아세톤과 에탄올, 증류수로 각각 15분씩 초음파 세척을 시행하였다.

2. 실험방법

실험군 분류(열처리)

실험군은 열처리 조건에 따라 3그룹[H0(열처리 하지 않음), H400(400℃ 열처

리), H600(600℃ 열처리)]으로 나누었다.

실험군 분류(플라즈마)

실험군은 플라즈마 적용에 따라 6그룹[플라즈마 적용 전 : H0, H40, H600 / 플라즈마 적용 후 : H0P, H400P, H600P]으로 나누었다.

양극산화공정

양극산화는 전원 공급 장치 DC power supplier (Fine Power F-3005, SG EMD, Korea)을 이용하여 시행하였다. 전해액은 증류수에 1M 인산(H₃PO₄)과 1.5wt% 불산(HF)을 첨가하여 제조하였다. 양극에는 타이타늄 시편을, 음극에는 백금판(3mm×4mm×0.1mm)을 연결하고 시편과 백금판이 약 10mm 간격이 되도록 하였다. 전극이 연결된 시편과 백금판을 전해액에 침적하고 1분 후에 20V의 전압을 인가하여 10분간 양극산화하였다. 10분 후 시편을 전해액에서 꺼내어 흐르는 물에 약 20분 동안 세척한 후 증류수에 30분간 침적시킨 후 건조하였다.

열처리공정

열처리는 소환로(IDS Plus Ex6000 Sintering Furnace, JG Co., Korea)를 사용하여 시행하였다. 대기분위기에서 1℃/min의 조건으로 각각 400℃와 600℃로 승온시킨 후, 1시간 동안 온도를 유지시키고 노냉하였다. 열처리 후 시편은 알코올과 증류수로 각각 20분씩 초음파세척 후 건조시켰다.

플라즈마 처리

플라즈마 조사는 대기압 플라즈마 발생장치(PGS-200 Plasma generator, Expantech Co, Korea)를 이용하여 처리하였다. Ar₂(99%)/O₂(1%) 조성으로 가스를 혼합하여 300W의 파워 값에서 10L/min의 속도로 시편에 적용하였으며, 대기압 플라즈마의 불꽃과 시편과의 거리는 5mm로 유지하였다. 시편은 180rpm으로 회전하고, 플라즈마의 불꽃은 좌우측으로 이동시켜 시편에 고르게 대기압 플라즈마가 적용될 수 있도록 하였다. 1회당 12초로 10회 왕복하도록 설정하여 120초간 플라즈마 적용하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 대기압 플라즈마 발생장치의 파라미터는 아래 [표 1]과 같다.

파라미터(Parameter)	값(Value)
Average working power (W)	300
Voltage (V)	27
Frequency (MHz)	900
Atmospheric pressure (Torr)	760
Electrode type	Electrodeless
Cooling type	Air cooled
Plasma density	10¹⁵/cm³

3. 표면특성평가

접촉각

*접촉각 측정은 열처리 및 플라즈마를 조사한 표면의 친수성 변화를 비교하기 위하여 시행하였다. 표면 위에 4㎕의 증류수를 떨어뜨리고 10초 후 표면과 용액이 이루는 각을 접촉각 측정기(Video contact angle measuring device, Phoenix 300, SEO, Korea)로 측정하였다. 한 그룹당 3개의 시편 접촉각을 측정하여 평균값을 산출하였다.

표면 형태

표면 형태 변화는 Sputter coater (E-1030, Hitachi, Japan)로 진공상태에서

60초간 백금코팅 후 주사전자현미경(FE-SEM S-4700, Hitachi horiba, Japan)

을 이용하여 관찰하였다.

표면 거칠기

표면 거칠기는 비접촉 3차원 미세형상측정기(Nanosurface 3D Optical Profiler: NV-E1000, Nano System, Korea)을 이용하여 측정하였다(n=3). 한 시편 당 세 부분에서 측정한 Ra(average roughness) 값의 평균을 그 시편의 Ra 값으로 하였다.

결정상

열처리 및 플라즈마 조사 후 표면의 결정상 구조 변화는 X-선 회절분석기 (XRD, X'Pert PRO Multi Purpose X-Ray Diffractometer, PANalytical, Netherlands)를 이용하여 분석하였다. 회절 분석 조건은 CuKα선의 X선을 사용하여 분당 1.5의 속도로 20°에서 90°까지 2θ 범위에서 시행하였다.

화학조성 및 결합상태

표면의 화학적 조성 및 결합상태는 X-ray 광전자 분광 분석기(XPS, VG Mulrilab 2000, Thermo scientific, UK)을 이용하여 분석하였다. 검출된 각 원소에 대한 피크 면적 값을 정규화하여 정량비로 나타냈다.

4. 생체 세균막(biofilm) 형성 억제능 평가

세균 배양

생체 세균막(biofilm) 형성 억제능 평가는 초기 균막을 형성하는 그람 양성통성 세균 Streptococcus mutans (KCOM 1504)와 임플란트주위염을 일으키는 세균으로 알려진 그람 음성 혐기성 세균 Porphyromonas gingivalis (KCOM 2804)를 이용하였다. 두 종의 세균은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, KCOM, Gwangju, Korea)에서 분양 받아 배양하였다. S. mutans 균주는 BHI (Brain Heart Infusion, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)배지에서, P. gingivalis 균주는 TSB (Tryptic Soy Broth, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)배지에서 배양하였다. 고체 배지에 형성된 단일콜로니를 액상배지에 배양하여 1.5 × 107 CFU/ml 농도의 세균을 준비하였다. S. mutans 는 37℃ 배양기(LIB-150M, DAIHAN Labtech Co., Korea)에서, P. gingivalis 는 37℃ 혐기성 배양기(Forma Anaerobic System 1029; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다.

인공타액 코팅

인공타액 코팅은 구강 내 환경을 재현하기 위해 시행하였다. 인공타액은 adherence buffer에 1% mucin (Mucin from porcine stomach, M1778; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 첨가하여 제조하였다. 제조된 인공타액의 조성은 아래 [표 2]과 같다.

조성(Component)	양(Quantity)
KH₂PO₄	10 mM/L
KCl	50 mM/L
CaCl₂	1 mM/L
MgCl₂	0.1 mM/L
pH	7.0
Mucin	1%

세균 접종

그룹당 3개의 시편을 24-well plate에 넣고 인공타액을 분주 후 37℃ 배양기에서 2시간 동안 천천히 교반하면서 시편이 타액이 코팅되도록 하였다. 2시간 후 인공타액 제거하고 15분간 건조하였다. 시편 위에 준비된 1.5 × 107 CFU/ml의 세균을 접종하고 S. mutans 균주는 24시간, P. gingivalis 균주는 48시간 배양하였다.

세균막(biofilm) 형성 억제능 평가

Fluorescent nucleic acid staining 평가

세균막 형성 평가에 green fluorescent nucleic acid stain (SYTO 9®, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Netherlands)을 사용하였다. 세균 배양 후 시편 위 배양액을 제거하고 PBS (phosphate buffered saline) 용액을 이용하여 조심히 2번 세척하여 부착하지 않은 균을 제거하였다. 시편에 형광시약(SYTO 9® : dH2O = 1.5 ㎕ : 1 ml)을 200 ㎕씩 넣어주고 well plate는 빛이 들어가지 못하도록 알루미늄 호일에 쌓아 상온에서 15분간 반응시켰다. 15분 후 PBS 용액으로 잔여 염색 용액을 조심히 세척하고 공초점 레이저 주사현미경(Laser Confocal Scanning Microscope, Leica TCS SP5 AOBS/tandem, Leica, Germany)을 통해 관찰하였다. 시편 위 형성된 바이오필름 두께는 분석프로그램(Leica LAS AF software, Leica Microsystems, Bensheim, Germany)을 이용하여 측정하였다.

Crystal violet staining 평가

세균 배양 후 시편 위 배양액을 제거하고, 부착하지 않은 균을 제거하기 위해 PBS 용액을 이용하여 조심히 2번 세척하였다. 시편에 0.3% crystal violet 용액을 500 ㎕씩 분주하고 10분간 염색하였다. 10분 후 crystal violet 용액을 제거하고, 잔여 용액 제거를 위해 PBS 용액으로 조심히 3번 세척하고 15분간 건조하였다. 탈염액(80% ethyl alcohol ＋ 20% acetone)을 400㎕씩 분주하고 1시간 동안 교반하였다. 1시간 후 탈염액을 200㎕씩 96-well plate에 넣고 흡광도계(VersaMax ELISA Microplate Reader, Molecular Device, USA)로 595nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. 조골 세포 활성 평가

세포 배양

생쥐의 조골세포주 MC3T3-E1 세포(MC3T3-E1 Subclone 4, ATCC CRL2593, Rockville, MD, USA)를 10% fetal bovine serum (FBS)과 100U/ml penicillin이 포함된 α-MEM (α-Minimum Essential Medium, Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)배지와 함께 37℃, 5% CO2 배양기(Forma Series Ⅱ 3111 Water Jacketed CO2 Incubator, Thermo Scientific, USA)에서 배양하였다.

세포 부착 평가

그룹당 2개의 시편을 24-well plate에 넣고 준비된 세포를 4 × 104 cell/ml씩 분주하였다. 시편과 세포액이 담긴 24-well plate는 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 4시간 동안 배양하였다. 세포 배양 4시간 후, 주사전자현미경 이미지를 얻기 위하여 2.5% glutaraldehyde에서 2시간 동안 고정시켰다. PBS로 10분씩 2회 수세 과정 후 세포를 탈수시키기 위하여 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 에탄올에서 각각 5분간 1회씩, 100% 에탄올에서 10분간 3회에 걸쳐 탈수과정을 거쳤다. 탈수 후 모든 시편은 클린벤치에서 1~2시간동안 건조시켰다. 건조가 완료된 시편은 sputter coater (E-1030, Hitachi, Japan)를 이용하여 진공상태에서 60초 동안 백금 코팅한 후, 주사전자현미경(FE-SEM S-4700, Hitachi horiba, Japan)을 이용하여 세포부착 정도 및 형태를 관찰하였다.

세포 증식 평가

그룹당 3개의 시편을 24-well plate에 넣고 준비된 세포를 4 × 104 cell/ml 씩 분주하였다. 시편과 세포액이 담긴 well plate는 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 24시간과 48시간 동안 배양한 후, 각 plate에 WST-8 시약(EZ-Cytox, Itsbio, Inc., Seoul, Korea)을 100㎕씩 분주하고, 다시 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 주황색으로 발색이 되면, 96-well plate에 100㎕씩 옮겨 흡광도 측정기(ELISA reader: ELx 800UV, Bio-TekInstrument.Inc., Winooski,VT, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사

세포 배양

생쥐의 조골세포주 MC3T3-E1 세포(ATCC CRL2593)를 10% fetal bovine serum (FBS), 100U/ml penicillin, 50 μg/ml ascorbic acid (AA)과 5 mM β-glycerophosphate (β-GP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)이 포함된 α-MEM (α-Minimum Essential Medium, Dulbecco’s modified Eagle’smedium, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)배지와 함께 37℃, 5% CO₂ 배양기(Forma Series Ⅱ 3111 Water Jacketed CO₂ Incubator, Thermo Scientific, USA)에서 배양하였다. MC3T3-E1 세포의 RNA 발현을 평가하기 위하여 그룹당 3개의 시편을 넣은 24-well plate에 준비된 세포를 4 × 10⁴ cell/ml 씩 분주하였다. 시편과 세포액이 담긴 well plate는 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 2일과 4일 동안 배양하였다.

RNA extraction

2일과 4일 배양 후 제조사의 지시에 따라 Trizol (InvitrogenTM, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 시편 위 부착한 세포의 total RNA를 추출하였다. Random primer와 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, Wis., USA)을 사용하여 total RNA (2000 ng)로부터 template cDNA를 합성하였다. 표적 유전자의 발현은 합성된 cDNA와 선택적 primer를 사용하여 실시간 중합연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction; real-time PCR)으로 확인하였다.

Real time-PCR 평가

Real-time PCR은 Rotor-Gene Q Thermal Cycler(Qiagen, Hidden, Germany)를 이용하여 시행하였다. 각 well에 2㎕ cDNA, 2㎕ 증류수, 2㎕ primers (10pmol/㎕), 6㎕ 2x RG SYBR PCR Master mix(Qiagen, Hidden, Germany)를 첨가하고, 유전자 증폭을 위해 95℃에서 5분간 초기변성과정을 거친 후 95℃에서 5초간의 변성과정, 60℃에서 10초간의 복원과정을 45회 반복 시행하였다. 사용된 primer의 염기서열은 다음과 같다. Alkaline phosphatase: forward(F); TACATTCCCCATGTGATGGC, reverse(R); ACCTCTCCCTTGAGTGTGGG, Collagen type Ⅰ: forward(F); CCCCAACCCTGGAAACAGAC, reverse(R); GGTCACGRRCAGTTGGTCAA, Osteocalcin: forward(F); CTCCTCAGTCTGACAAAGCCTT, reverse(R); GCTGTGACATCCATTACTTGC, β-actin: forward(F); ACTGCTGGGACTCTG, reverse(R); TGATGGCGTAGAACAG. 유전자 발현 정도는 측정된 Ct(threshold cycle) 값을 사용하여 the comparative CT(2^-ΔΔCT) method [20]로 계산하였고, 이때 β-actin을 internal control로 함께 실시하였다.

6. 통계 분석

열처리 효과

열처리에 따른 유의성 검정은 정규성을 만족한 경우, 모수 방법인 일원배치분산분석(One-way ANOVA)으로 통계 분석하였으며, Tukey test로 사후 검정하였다. 모든 결과는 P < 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다. 정규성을 만족하지 못한 경우, 비모수 방법인 Kruskal-Wallis test로 통계 분석하였으며, 두 군씩 쌍을 지어 각각 Mann-Whitney U-test를 시행하고 Bonferroni’s Method로 제1종 오류를 보정하여 P < 0.017 수준에서 유의성을 검정하였다.

플라즈마 효과

플라즈마 적용에 따른 유의성 검정은 정규성을 만족한 경우, 모수 방법인 독립표본 T 검정 (Independent t-test)으로 통계 분석하였으며, 정규성을 만족하지 못한 경우, 비모수 방법인 Mann-Whitney U-test를 시행하여 두 군을 비교하였다. 모든 결과는 P < 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

Ⅱ. 결과

1. 표면 특성 평가

접촉각

TiO₂ 나노튜브 열처리와 플라즈마 적용에 따른 접촉각 변화를 나타내었다. (아래 [표 3] 참조). H0군은 19.5±2°, H400군은 14.2±2°, H600군은 18.0±2°의 접촉각을 보였다. 플라즈마 적용 후 모든 군에서 접촉각이 감소하였다. H0P군의 접촉각은 3.3±6°였고, H400P군과 H600P군은 접촉각을 측정할 수 없을 만큼 감소하였다.

표면 형태 분석

열처리 효과

TiO₂ 나노튜브가 표면에 전체적으로 고루 형성되었고, 불규칙한 타원형이고, 밑부분은 반구 형태로 막혀있었다. H0군의 직경과 높이는 각각 111.3±2 nm, 522.6±4 nm였고, H400군의 직경과 높이는 각각 106.7±1 nm, 500.8±4 nm로 열처리 전과 크게 다르지 않았다. H600군의 직경과 높이는 각각 91.2±1nm, 498.0±7nm로 나노튜브의 간격이 더 커지고, 길이도 짧아졌다. FE-SEM의 관찰결과, 대기분위기에서는 TiO₂ 나노튜브를 약 400℃로 열처리를 하였을 경우 나노튜브 길이와 형태를 유지하였다.

플라즈마 효과

플라즈마 적용 전과 후 표면 변화가 관찰되지 않았다.

표면 거칠기

비접촉 3차원 미세형상측정기를 이용하여 표면형상을 관찰하였으며, H0군의 Ra값은 424.7±38 nm, H400군은 396.0±07 nm, H600군은 462.8±28nm였다. 플라즈마 적용 후 H0P군의 Ra값은 432.9±22 nm, H400P군은 376.0±42 nm, H600P군은 428.6±10 nm였다. 열처리 및 플라즈마 적용에 따른 표면 거칠기의 변화는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P > 0.05).

결정상 평가

열처리 전

도 1(a)는 1M H₃PO₄ + 1.5wt.%HF solution에서 20V 전압으로 10분간 양극산화한 TiO₂ 나노튜브 시편(H0군)의 XRD분석 결과이다. 2θ 값이 35도에서 (010)면, 38.4도에서 (002)면, 40.2도에서 (011)면, 53도에서 (012)면, 63도에서 (110)면, 70도에서 (013)면, 74도에서 (020)면 그리고, 76도에서 (112)면의 타이타늄의 피크가 관찰되었다. 이는 X-선이 시편의 1~2 ㎛를 투과하므로, 약 500nm의 길이를 가진 TiO₂ 나노튜브의 아랫부분인 타이타늄 모재가 검출된 것으로 사료된다.

열처리 후

도 1(b) 및 도 1(c)는 CP-Ti grade 4 시편을 1M H₃PO₄ + 1.5wt.%HF 전해액에서 20V 전압으로 10분간 양극산화한 후 대기(100Pa)분위기에서 1℃/min의 승온 속도로 각각 400℃, 600℃ 온도에서 1시간씩 유지하여 열처리한 시편의 X-선 회절분석 결과이다. 400℃의 경우(H400군) 타이타늄의 (010), (002), (011), (012), (110), (013), (112) 면과, TiO₂ anatase (011), (020), (015), (121) 면이 관찰되었다. 600℃(H600군)에서는 피크 강도는 조금 다르지만, 400℃(NH400군)에서 관찰되었던 면들과, 새로 TiO₂ rutile (110), (011), (111), (120, (121) 면이 관찰되었다. TiO₂ 나노튜브를 600℃에서 열처리하면 타이타늄과 TiO₂ anatase상과 TiO₂ rutile상이 혼재되어 있음을 알 수 있다.

화학조성 및 결합상태 평가

XPS 분석

도 2를 참조하면, 모든 TiO₂ 나노튜브 표면에서 C(1s), F(1s), O(1s), Ti(2p1), Ti(2p3)가 검출되었음을 알 수 있다. 더 정확한 결합에너지 값과 화학결합을 알아보기 위하여 narrow 분석을 시행하였다.

열처리 효과

H0군의 C1s 피크는 3개의 피크(285.0 eV, 286.7 eV, 288 .7 eV)가 주로 검출되었는데, 이 중 285.0 eV 피크는 C-C 또는 C-H 결합탄소를, 286.7 eV 피크는 C-O 결합탄소를, 288.7 eV 피크는 C=O 결합탄소를 의미한다. O1s 피크의 3개의 피크 (529.9 eV, 531.3 eV, 532.6 eV)중에서 529.9 eV 피크는 TiO₂에 해당하며, 531.3 eV 피크는 O-H 수산화기를, 532.6 eV의 피크는 C-O 결합 또는 C=O 결합과 관련이 있다. Ti2p 피크는 Ti 고유 피트인 더블 피크가 464.1 eV, 458.3 eV에서 관찰되었다. 이는 TiO₂에 해당한다. 열처리에 의해 H400군의 O1s 피크 (530.0 eV, 531.5 eV, 532.6 eV)와 Ti2p 피크 (464.5 eV, 458.7 eV) 그리고 H600군의 O1s 피크 (530.1 eV, 531.6 eV, 532.7 eV)와 Ti2p 피크 (464.7 eV, 458.9 eV)가 높은 결합에너지 쪽으로 약간 이동되었다.

플라즈마 효과

플라즈마 적용 후 H0P군의 C1s 피크가 감소하였고, 292.1 eV와 281.2 eV 사이 낮은 피크는 높은 결합에너지 쪽으로 약간 시프트되었다. 그리고 283.6 eV, 281.9 eV에서 또 다른 C1s 피크가 관찰되었다. 이는 C₂H₄와 C^4-과 관련이 있다. 그리고 O1s 피크는 528.7 eV와 528.1 eV가 더 관찰되었는데 이는 O₂를 의미한다. Ti2p 피크는 Ti2p1/2 피크가 461.7 eV, Ti2p3/2 피크가 456.1eV에서 관찰되었다. 이는 Ti₂O₃와 TiO₂에 해당한다. H400P군은 289.7 eV에서 또 다른 C1s 피크가 관찰되었다. 이는 carboxyle(plasma O₂)와 Ar과 관련이 있다. Ti2p 피크는 Ti2p1/2 피크가 465 eV, Ti2p3/2 피크가 459 eV에서 관찰되었다. 이는 TiO₂ rutile과 TiO₂에 해당한다. H600P군의 Ti2p 피크는 460.9 eV가 더 관찰되었다. 이는 티타늄 화합물 TiOx와 연관된 것으로 여겨진다. 플라즈마 적용은 TiO₂ 나노튜브의 Ti2p와 O1s 피크를 높은 결합에너지 쪽으로 약간 이동시켰다. 분석에서 검출된 F의 경우 양극산화과정에서 전해액에 첨가되어 있는 불소가 TiO₂ 나노튜브 표면에 잔류하고 있기 때문으로 사료된다.

Normalized atomic percentage of XPS

XPS 피크로부터 각 원소의 원자퍼센트를 그래프로 나타내었다. 도 3을 참조하면, H0군 표면의 탄소 함량은 37.1 at%, 산소의 함량은 47.9 at%, 불소의 함량은 1.8 at%로 관찰되었다. 플라즈마 적용한 H0P군의 탄소는 20.7 at%로 감소하였고, 산소는 60.7 at%, 불소는 3.2at%로 증가하였다. H400군 표면의 탄소 함량은 40.3at%, 산소의 함량은 46.6 at%, 불소의 함량은 0.3 at%로 관찰되었다. 플라즈마 적용한 H400P군의 탄소는 16.5 at%로 감소하였고, 산소는 64.9 at%, 불소는 0.5 at%로 증가하였다. H600군 표면의 탄소 함량은 31.2 at%, 산소의 함량은 52.6 at%, 불소의 함량은 0.8 at%로 관찰되었다. 플라즈마 적용한 H600P군의 탄소는 9.5 at%로 감소하였고, 산소는 70.4 at%, 불소는 1 at%로 증가하였다.

2. 세균막(biofilm) 형성 억제능 평가

Fluorescent nucleic acid staining 평가

스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)

TiO₂ 나노튜브의 열처리 및 플라즈마 적용에 따른 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)의 세균막 두께 변화를 아래 [표 4]에 나타내었다.

열처리 효과

H0군, H400군, H600군의 S. mutans biofilm 두께는 각각 38.1±5 ㎛, 22.1±2 ㎛, 40.9±1 ㎛가 관찰되었다. H400군은 H0군과 H600군에 비해 S.mutans biofilm 두께가 통계적으로 유의하게 감소하였다 (P < 0.017).

플라즈마 효과

플라즈마 적용한 H0P군, H400P, H600P군의 S. mutans biofilm 두께는 각각 11.1±1 ㎛, 17.4±1 ㎛, 32.9±2 ㎛로 관찰되었다. 플라즈마 적용 후 모든 군에 서 S. mutans biofilm 두께가 통계적으로 유의하게 감소하였다 (P < 0.05).

포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)

TiO₂ 나노튜브의 열처리 및 플라즈마 적용에 따른 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) biofilm 두께 변화를 아래 [표 5]에 나타내었다.

열처리 효과

H0군, H400군, H600군의 P. gingivalis biofilm 두께는 각각 25.5±1 ㎛, 28.4±4 ㎛, 26.4±4 ㎛가 관찰되었다. 열처리에 따른 P. gingivalis biofilm 두께의 통계적 유의한 차이는 없었다(P > 0.017).

플라즈마 효과

플라즈마 적용한 H0P군, H400P, H600P군의 P. gingivalis biofilm 두께는 각각 30.4±4 ㎛, 30.9±2 ㎛, 24.5±4 ㎛로 관찰되었다. 플라즈마 적용에 따른 P.gingivalis biofilm 두께의 통계적 유의한 차이는 관찰되지 않았다(P > 0.05).

Crystal violet(CV) assay 평가

스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)

열처리 효과

도 4를 참조하면, H400군과 H600군은 H0군에 비해 S. mutans의 부착이 유의하게 감소하였음을 알 수 있다(P < 0.017).

플라즈마 효과

도 5를 참조하면, H600군은 플라즈마 적용 후 S. mutans의 부착이 유의하게 감소하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)

열처리 효과

도 6을 참조하면, H400군은 H0군에 비해 P. gingivalis의 부착이 유의하게 증가하였고, H600군은 H400군에 비해 P. gingivalis의 부착이 유의하게 감소하였음을 알 수 있다 (P < 0.017).

플라즈마 효과

도 7을 참조하면, H0군은 플라즈마 적용 후 P. gingivalis의 부착이 유의하게 증가하였고, H600군은 플라즈마 적용 후 P. gingivalis의 부착이 유의하게 감소하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

3. 조골세포 활성 평가

세포 부착의 현미경적 평가

시편에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 4시간 배양 후 주사전자현미경으로 세포의 부착상태를 관찰하였다. 도 8을 참조하면, 모든 시편에서 MC3T3-E1 세포들이 잘 부착된 양상을 관찰할 수 있었다.

세포 증식 평가

열처리 효과(2일 배양)

도 9를 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후, H400군은 H0군과 H600군에 비해 세포의 증식이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.017).

플라즈마 처리 효과(2일 배양)

도 10을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후, H0군은 플라즈마 적용 후 세포의 증식이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

열처리 효과(4일 배양)

도 11을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 4일 배양 후, H400군은 H0군과 H600군에 비해 세포의 증식이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.017).

플라즈마 처리 효과(4일 배양)

도 12를 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 4일 배양 후, H0군과 H600군은 플라즈마 적용 후 세포의 증식이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

조골세포 분화 관련 골기질 유전자 발현 조사(real time PCR)

열처리 효과(Alkaline phosphatase, ALP)

도 13을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 열처리에 따른 ALP의 발현의 유의한 차이는 없었으나(P > 0.017), 4일 배양 후 H0군은 H400군과 H600군에 비해 ALP의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

열처리 효과(Type I collagen, Col1)

도 14를 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 열처리에 따른 Col1의 발현의 유의한 차이는 없었으나(P > 0.017), 4일 배양 후 H0군과 H600군은 H400군에 비해 Col1의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

열처리 효과(Osteocalcin, OCN)

도 15를 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 열처리에 따른 OCN의 발현의 유의한 차이는 없었으나(P > 0.017), 4일 배양 후 H400군은 H0군에 비해 OCN의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 있다(P < 0.05).

플라즈마 처리 효과(Alkaline phosphatase, ALP)

도 16을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 H0군은 플라즈마 적용 후 ALP의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있으며(P < 0.05), 4일 배양 결과 H0군은 플라즈마 적용 후 ALP의 발현이 유의하게 감소하였고, H400군은 ALP의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

플라즈마 처리 효과(Type I collagen, Col1)

도 17을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 H400군과 H600은 플라즈마 적용 후 Col1의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있으며(P < 0.05), 4일 배양 결과 플라즈마 적용 후 모든 군에서 Col1의 발현이 유의하게 감소하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

플라즈마 처리 효과(Osteocalcin, OCN)

도 18을 참조하면, 시편 위에 4 × 10⁴ cell/ml의 MC3T3-E1 세포를 분주하고 2일 배양 후 H0군은 플라즈마 적용 후 OCN의 발현이 유의하게 증가하였음을 알 수 있으며(P < 0.05), 4일 배양 결과 플라즈마 적용 후 H0군과 H600군은 OCN의 발현이 유의하게 증가하였고, H400군은 감소하였음을 알 수 있다(P < 0.05).

Ⅲ. 결론

본 발명의 실시예서는 타이타늄 표면에 TiO₂ 나노튜브 산화막을 형성하여 표면적을 향상시켰고, 다양한 조건의 열처리를 통해 TiO₂ 산화막 구조를 변경하였으며, 또한 TiO₂나노튜브에 대기압 플라즈마를 적용하여 재료의 표면에너지와 친수성을 변화시켜 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 열처리 효과

타이타늄 임플란트 표면에 형성된 TiO₂ 나노튜브의 400℃ 열처리는 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)의 부착은 유의하게 감소시키고, 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)의 부착은 유의하게 증가시켰다 (P < 0.017). 그리고 MC3T3-E1 세포의 증식을 유의하게 증가시키고(P < 0.017), OCN의 발현을 유의하게 증가시켰다(P < 0.05). 그리고, 타이타늄 임플란트 표면에 형성된 TiO₂ 나노튜브의 600℃ 열처리는 스트렙토코쿠스 무탄스 세균의 부착을 유의하게 감소시키고(P < 0.017), 포르피로모나스 진지발리스 세균의 부착과 MC3T3-E1 세포의 증식 및 분화에는 유의한 영향을 주지 않았다(P > 0.017, P > 0.05).

2. 플라즈마 효과

타이타늄 임플란트 표면에 형성된 TiO₂ 나노튜브에 열처리하지 않은 상태에서의 플라즈마 적용은 포르피로모나스 진지발리스 세균의 부착을 유의하게 증가시키고(P < 0.05), MC3T3-E1 세포의 증식과 OCN의 발현을 유의하게 증가시켰다(P < 0.05). 600℃ 열처리한 TiO₂나노튜브에 플라즈마의 적용은 스트렙토코쿠스 무탄스 세균과 포르피로모나스 진지발리스 세균의 부착을 유의하게 감소시키고(P < 0.05), MC3T3-E1 세포의 증식과 OCN의 발현을 유의하게 증가시켰다(P < 0.05).

정리하면, 본 발명의 실시예에 따른 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법에 의하면, TiO₂ 나노튜브의 열처리는 초기 균막 형성과 관련된 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균의 부착을 억제하고, 열처리하지 않은 TiO₂ 나노튜브와 600℃ 열처리한 TiO₂ 나노튜브에 플라즈마를 적용하면 임플란트주위염을 유발하는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 부착을 억제시킬 수 있으며, TiO₂ 나노튜브의 열처리와 플라즈마 적용은 MC3T3-E1 세포의 증식 및 분화를 증진시키는 효과가 있음을 확인하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능하다 할 것이다.

Claims

스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균에 의해 오염된 타이타늄 임플란트를 준비하는 단계;
양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계;
상기 타이타늄 임플란트의 표면을 열처리하여 상기 TiO₂ 나노튜브가 anatase 또는 rutile 결정구조를 갖도록 하는 단계; 및
열처리된 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 대기압 플라즈마 발생장치를 이용하여 플라즈마를 발생시켜 처리하는 단계를 포함하되,
상기 대기압 플라즈마 발생장치는 아르곤 99%와 산소 1%의 혼합기체를 이용하며, 300W의 파워에서 10 L/min의 속도로 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 플라즈마를 발생시켜 60~150sec 동안 처리하며,
상기 양극산화공정을 이용하여 상기 타이타늄 임플란트의 표면에 TiO₂ 나노튜브를 형성하는 단계는, 증류수에 1M의 인산(H₃PO₄)과 1.5wt%의 불산(HF)을 첨가하여 제조한 전해액에 전극이 연결된 타이타늄 일플란트 시편과 백금판을 침적하고, 20V의 전압을 인가하여 10분간 양극산화하여 상기 타이타늄 임플란트 표면에 다공성의 비정질 TiO₂ 나노튜브를 형성하고,
상기 열처리는 소결로(sintering furnace)에서 수행하는데, 대기분위기에서 1℃/min의 조건으로 300 내지 700℃ 범위의 일정 온도로 승온시킨 후 1시간 동안 온도를 유지한 다음, 노냉하여 수행하는 것을 특징으로 하는 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법.
제 1 항에 있어서,
스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans) 세균 부착의 증가를 방지하는 것을 특징으로 하는 타이타늄 임플란트의 표면처리 방법.
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