KR101984167B1 - Method of isolating mesenchymal stem cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 보다 간편한 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것으로, a) 개체로부터 분리된 골수가 충진된 용기를 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 원심분리하는 단계; 및 b) 생성된 버피코트(buffy coat)의 하단에 형성된 용기 총 부피의 5 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating mesenchymal stem cells more easily, comprising the steps of: a) centrifuging a vessel filled with bone marrow separated from an individual at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes; And b) collecting a fraction corresponding to 5 to 15% of the total volume of the container formed at the lower end of the produced buffy coat.
Description
본 발명은 보다 간편한 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것으로, a) 개체로부터 분리된 골수가 충진된 용기를 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 원심분리하는 단계; 및 b) 생성된 버피코트(buffy coat)의 하단에 형성된 용기 총 부피의 5 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating mesenchymal stem cells more easily, comprising the steps of: a) centrifuging a vessel filled with bone marrow separated from an individual at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes; And b) collecting a fraction corresponding to 5 to 15% of the total volume of the container formed at the lower end of the produced buffy coat.
성체 줄기세포는 중추신경계나 골수 등 각종 장기에 남아 성장기의 장기발달과 손상시의 재생에 참여하는 세포이다. 성체 줄기세포는 각종 장기에 존재하기 때문에 골수, 비장, 지방세포 등을 포함한 여러 부위에서 얻을 수 있으며, 특히 골수의 줄기세포는 다능성(다분화능)이 있어 주로 이용되고 있다. 그러나 여러 종류의 골수세포들 중에서 중간엽 줄기세포만을 분리, 배양하는 데는 어려움이 있어 이러한 문제점들을 보완하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.Adult stem cells remain in various organs, such as the central nervous system and bone marrow, and participate in the regeneration of long-term development and damage. Since adult stem cells are present in various organs, they can be obtained from various sites including bone marrow, spleen, adipocytes, etc. In particular, stem cell of bone marrow is mainly used because of its pluripotency. However, it is difficult to isolate and cultivate only mesenchymal stem cells among various kinds of bone marrow cells, and studies are actively carried out to overcome these problems.
1987년 Friedenstein 등이 쥐의 골수에서 분리한 일부 세포로 뼈를 형성하는 데 성공한 이후, 다른 많은 연구자들이 배양 용기에 부착하는 중간엽 줄기세포의 특성을 이용해 분리에 성공하였다(Friedenstein, A.J. et al., Cell Tissue Kinet. 20: 263-272, 1987; Caplan, A.I. et al., Orthop. Res. 9: 641-650, 1991; Clark, B.R. et al., Ann. NY Acad. Sci. 770: 70-78, 1995; Bruder, S.P. et al., J. Cell Biochem. 64: 278-294, 1997; Zohar, R. et al., Blood. 90: 3471-3481, 1997; Prockop, D.J. et al, Science. 276: 71-74, 1997). 이 방법으로 분리한 세포들은 그 형태가 다양하였고 실험실 배양 혹은 생체에 이식시 골화세포, 지방세포, 연골세포 혹은 근육 등으로 분화하는 다양한 양상을 보였다. 또한 생체에 주입시 뼈, 연골, 근육, 폐, 비장, 흉선 등으로 이동됨이 관찰되었다(Pereira, R.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 1142-1147, 1998; Ferrari, G. et al., Science. 279: 1528-1530, 1998).In 1987, Friedenstein et al. Succeeded in forming bones from some bone marrow-derived cells, and many other researchers succeeded in isolating them using the characteristics of mesenchymal stem cells attached to culture vessels (Friedenstein, AJ et al. , Cell Tissue Kinet. 20: 263-272, 1987; Caplan, AI et al., Orthop. Res. 9: 641-650, 1991; Clark, BR et al., Ann. Et al., J. Biol., 90: 3471-3481, 1997; Prockop, DJ et al., Science. 276: 71-74, 1997). Cells isolated by this method showed various forms, such as oocyte, adipocyte, chondrocyte, or muscle, when cultured in vitro or transplanted into a living body. In addition, when injected into living body, it was observed to be transferred to bone, cartilage, muscle, lung, spleen, thymus, etc. (Pereira, RF et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 95: 1142-1147, 1998; , G. et al., Science 279: 1528-1530, 1998).
1999년 Pittenger 등의 실험에 의하여 사람에서도 골수에서 분리한 중간엽 줄기세포가 자가 재생능력과 뼈, 연골, 지방으로 분화할 수 있는 능력이 있음을 알게 되었다. 이 실험에 의해 중간엽 줄기세포가 실험실에서의 조작이 가능함이 알려졌으며, 줄기세포치료의 개념이 도입될 수 있게 되었다. 그러나 활발한 임상 적용의 시도에도 불구하고, 아직도 골수에서 중간엽 줄기세포의 분리나 배양들이 임상시험에 적용될 수 있게 확실하게 정립된 방법이 없는 실정이다.In 1999, Pittenger et al. Found that human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow have the ability to differentiate into bone, cartilage, and fat. This experiment has shown that mesenchymal stem cells can be manipulated in the laboratory and the concept of stem cell therapy can be introduced. However, in spite of active clinical applications, there is still no definite method for the isolation and culturing of mesenchymal stem cells in bone marrow.
분리 초기에 단핵세포들만을 Ficoll-paque이라는 방법을 사용하여 분리하여 세포를 배양용기에 부착시키는 방법인 Friedenstein 등이 사용한 분리 방법이 아직도 많이 사용되고 있지만 이러한 방법을 사용할 경우 세포의 특성이 일정하지 않고, 중간엽 줄기세포와 기타 단핵세포들이 같이 존재할 수 있어 단일성 세포군들을 만들기가 어렵다. 따라서 보다 동일한 세포를 얻기 위한 여러 방법이 고안되었는데 배양용기 바닥에 붙어 자라는 모든 세포를 분리하는 Luria 등의 방법은 중간엽 줄기세포가 아닌 타 줄기세포가 섞여서 분리될 수 있다는 단점이 있고(Luria et al., Transfusion, 11:345-349, 1971), 세포크기의 차이를 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법인 Hung 등의 방법 역시 중간엽 줄기세포의 순도가 일정하지 않고, 타 줄기세포가 섞일 수 있다는 단점이 있다(Hung et al., Stem Cells, 20:249-258, 2002).Although the separation method using Friedenstein et al., Which is a method of separating mononuclear cells only at the initial stage of separation by using a method called Ficoll-paque and attaching the cells to the culture container, is still widely used, Mesenchymal stem cells and other mononuclear cells may coexist, making it difficult to create unicellular clusters. Therefore, several methods have been devised to obtain more identical cells. Luria et al. Have disadvantages in that they can be separated by mixing with other stem cells rather than mesenchymal stem cells (Luria et al , Transfusion, 11: 345-349, 1971), and the method of Hung et al., Which is a method of culturing mesenchymal stem cells using cell size differences, also found that the purity of mesenchymal stem cells is not constant, (Hung et al., Stem Cells, 20: 249-258, 2002).
이러한 방법들은 모두 필수적으로 세포배양 단계를 거치므로 원래의 골수 줄기세포가 보유하고 있던 특성이 배양기간 동안 변할 수 있고, 배양방법에 따라 특성이 다른 세포를 증식시킬 수 있다. 더욱이 배양된 세포를 세포치료제로 이용시 당국의 엄격한 심사를 거쳐 의약품으로 허가를 받아야하기 때문에, 막대한 연구비용과 고급인재의 고용 등 기업의 투자가 필수불가결하다.Since all of these methods are essentially cell culture steps, the characteristics possessed by the original bone marrow stem cells can be changed during the culture period, and the cells having different characteristics can be proliferated depending on the culture method. Furthermore, when cultured cells are used as cell therapy drugs, they must be approved as medicines through rigorous screening by the authorities, so it is indispensable to invest in companies such as enormous research cost and employment of high-quality human resources.
"세포치료술"은 최소한의 조작으로 세포치료를 할 수 있는 수술법으로서, 세포배양 단계를 거치지 않기 때문에 병원에서 바로 환자에게 사용될 수 있다. 이러한 최소한의 조작법으로서, Simmons 등(Simmons et al., Blood, 78:55-62, 2002)은 중간엽 줄기세포의 세포표면 항원을 사용하는 방법으로 Sca-1, STRO-1에 대한 특이 항체로 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법을 개발하였는데, 항체를 이용한 방법이기 때문에 중간엽 줄기세포의 단일 항체가 규명되지 않은 현 시점에서는 사용하는 항체의 종류에 따라 전혀 다른 세포가 분리될 수 있고, 시간이 오래 소요되며, 오염문제가 항상 존재한다. 또 다른 예로, 조혈모세포 이식센터 등에서 사용하고 있는 백혈구성분채집술(leukapheresis)은 골수에서 분리한 세포를 바로 적용할 수 있다는 장점이 있으나, 워낙 고가의 비용이 소요되어 일반적으로 소규모 병원이나 연구소 등에서 이용하기는 어려운 실정이다."Cell therapy" is a surgical procedure that allows cell therapy with minimal manipulation. Since it does not go through a cell culture step, it can be used immediately in a hospital. As such minimal manipulations, Simmons et al. (Simmons et al., Blood, 78: 55-62, 2002) use a cell surface antigen of mesenchymal stem cells as a specific antibody to Sca-1 and STRO-1 We have developed a method for isolating mesenchymal stem cells. Since it is an antibody-based method, at the present time when a single antibody of mesenchymal stem cells has not been identified, completely different cells can be isolated depending on the type of antibody used, It takes a long time, and pollution problems always exist. As another example, leukapheresis used in hematopoietic stem cell transplantation centers can be applied directly to cells isolated from bone marrow, but it is expensive and is generally used in small hospitals and laboratories. It is difficult to do.
이에, 본 발명자들은 보다 간편하게 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있는 방법에 대하여 지속적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 골수가 충진된 용기를 특정의 조건으로 원심분리할 경우 중간엽 줄기세포가 특정의 층에만 주로 모이게 되는 사실을 발견하고, 중간엽 줄기세포가 포함된 상기 특정 층은 세포배양 단계를 거치지 않고 환자에게 바로 투여할 수 있기에, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have conducted continuous studies on a method for separating mesenchymal stem cells more easily. As a result, when a vessel filled with bone marrow is centrifuged under a specific condition, mesenchymal stem cells The present inventors have found the fact that the specific layer containing the mesenchymal stem cells can be directly administered to the patient without going through the cell culture step, thus completing the present invention.
따라서 본 발명의 목적은 골수로부터 중간엽 줄기세포를 보다 간편하고 저비용으로 분리할 수 있는 새로운 중간엽 줄기세포의 분리방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a novel method for separating mesenchymal stem cells from bone marrow, which can be separated easily and inexpensively.
상기한 과제를 해결하고자, 본 발명은 a) 개체로부터 분리된 골수가 충진된 용기를 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 원심분리하는 단계; 및 b) 생성된 버피코트(buffy coat)의 하단에 형성된 용기 총 부피의 5 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리방법을 제공한다.In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a method for preparing a bone marrow, comprising the steps of: a) centrifuging a vessel filled with bone marrow separated from an individual at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes; And b) collecting a fraction corresponding to 5 to 15% of the total volume of the container formed at the lower end of the produced buffy coat.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법은 별도의 기구나 시료를 일체 사용하지 않으므로, 기존의 방법에 비하여 간편하고 저비용으로 중간엽 줄기세포를 고수율로 분리할 수 있으며, 분리된 세포는 세포배양 단계를 거치지 않고 환자에게 바로 시술될 수 있어, 세포치료제를 개발할 수 있는 여건이 안되는 소규모 병원이나 연구소 등에서 중간엽 줄기세포를 보다 효과적으로 사용할 수 있다.Since the method of separating mesenchymal stem cells according to the present invention does not use any separate instrument or sample, it is possible to separate mesenchymal stem cells at a high yield in a simple and low-cost manner as compared with the conventional method, It is possible to use the mesenchymal stem cells more effectively in a small hospital or a research institute where the conditions for developing a cell therapy agent can not be developed.
도 1은 10mL 용량 채혈용 주사기(boin tube)로 골수를 채취하여 본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법에 따라 원심분리하였을 때 나타나는 분획층을 보여주는 사진이다. 분획 1 내지 3은 적혈구(Red Blood Cell: RBC)층, 분획 4는 줄기세포층(Stem Cell Layer: SCL), 분획 5는 버피코트(buffy coat)층, 분획 6은 플라즈마(plasma)층이다. 플라즈마층의 상단에 지방층이 존재한다.
도 2는 20mL 용량 시린지로 골수를 채취하여 본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법에 따라 원심분리하였을 때 나타나는 분획층을 보여주는 사진이다.
도 3은 도 1의 분획 1 내지 6을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지(Gibco, USA)에서 10일 동안 배양시의 현미경 사진이다.
도 4는 도 1의 분획 1 내지 6을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양시의 CFU-F(콜로니 형성 유니트-섬유아세포) 아세이 결과를 보여주는 사진이다. 가장 좌측의 플레이트는 채취한 골수를 원심분리하지 않고 CFU-F 아세이한 결과를 나타낸다. 사진 아래의 표는 각각 세포수(위) 및 생육도(아래)를 나타낸다.
도 5는 원심분리하지 않은 골수(Mixed), 플라즈마층, 줄기세포층(분획 4) 및 적혈구층을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양시의 현미경 사진, 및 세포크기 및 과립도(granularity)의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 6은 원심분리하지 않은 골수(Mixed), 플라즈마층, 줄기세포층(분획 4) 및 적혈구층을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양시, 중간엽 줄기세포 마커인 CD29 항원 및 단핵구 마커인 CD11b 항원의 발현 여부를 나타낸 그래프이다.
도 7은 116명의 환자를 대상으로 한 플라즈마층, 줄기세포층(분획 4) 및 적혈구층의 CFU-F 아세이 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법에 사용될 수 있는 채혈용 주사기(보인 튜브)를 찍은 사진이다.FIG. 1 is a photograph showing a fraction layer obtained by centrifuging according to the method of separating mesenchymal stem cells of the present invention by collecting bone marrow with a 10 mL capacity boin tube. Fraction 1 to 3 are red blood cell (RBC) layers,
FIG. 2 is a photograph showing a fraction layer obtained by centrifuging according to the separation method of mesenchymal stem cells of the present invention by collecting bone marrow with a 20 mL capacity syringe.
FIG. 3 is a micrograph of the fractions 1 to 6 of FIG. 1 after culturing for 10 days in .alpha.-MEM medium (Gibco, USA) after erythrocyte dissolution.
FIG. 4 is a photograph showing the results of CFU-F (colony forming unit-fibroblast) cells obtained by culturing fractions 1 to 6 in FIG. 1 for 10 days in .alpha.-MEM medium after erythrocyte dissolution, respectively. The leftmost plate shows the results of CFU-F aspiration without centrifuging the harvested bone marrow. The table below shows the number of cells (above) and the degree of growth (below), respectively.
FIG. 5 is a graph showing the micrographs and the cell size and granulometry when cultured for 10 days in a-MEM medium after erythrocyte dissolution, respectively, without mixing the centrifuged bone marrow (Mixed), plasma layer, stem cell layer (fraction 4) granularity) of the microstructure.
FIG. 6 is a graph showing the results of cell proliferation of CD29 antigen and monocyte, which are mesenchymal stem cell markers, when cultured for 10 days in a-MEM medium after erythrocyte dissolution, respectively, without mixing the centrifuged mixture, plasma layer, stem cell layer (fraction 4) Lt; RTI ID = 0.0 > CD11b < / RTI > antigen.
FIG. 7 is a graph showing CFU-F results of a plasma layer, a stem cell layer (fraction 4), and a red blood cell layer in 116 patients.
8 is a photograph of a syringe for blood collection (a tube shown in the drawing) that can be used in the method of separating mesenchymal stem cells of the present invention.
놀랍게도, 본 발명자들은 골수가 충진된 용기를 특정의 조건으로 원심분리할 경우 중간엽 줄기세포가 특정의 층에만 주로 모이게 되는 사실을 발견하였다.Surprisingly, the present inventors have found that, when centrifuging a vessel filled with bone marrow under a specific condition, mesenchymal stem cells mainly accumulate only in a specific layer.
이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 a) 개체로부터 분리된 골수가 충진된 용기를 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 원심분리하는 단계; 및 b) 생성된 버피코트의 하단에 형성된 용기 총 부피의 5 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.Based on these findings, the present invention provides a method for the treatment of bone marrow, comprising: a) centrifuging the vessel filled with bone marrow separated from the subject at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes; And b) collecting a fraction corresponding to 5 to 15% of the total volume of the container formed at the lower end of the produced buffy coat.
일 측면에서, 본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법은 a) 개체로부터 분리된 골수가 충진된 용기를 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 원심분리하는 단계; 및 b) 생성된 버피코트의 하단에 형성된 용기 총 부피의 5 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계; 및 c) 채취된 분획을 중간엽 줄기세포 배양배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.In one aspect, the method for separating mesenchymal stem cells of the present invention comprises the steps of: a) centrifuging a vessel filled with bone marrow separated from an individual at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes; And b) collecting a fraction corresponding to 5 to 15% of the total volume of the container formed at the bottom of the produced buffy coat; And c) culturing the harvested fraction in a mesenchymal stem cell culture medium.
본 발명의 분리방법은 주사기 또는 튜브 등의 용기를 이용하여 개체로부터 골수를 채취한 후, 골수가 충진된 용기를 그대로 원심분리하는 것을 특징으로 한다. 원심분리는 500 내지 3000rpm에서 5 내지 30분간 수행한다. 원심분리 조건의 구체적인 예시로는, 500rpm에서 30분간, 1000rpm에서 10분간, 1000rpm에서 20분간, 2000rpm에서 10분간, 3000rpm에서 5분간 원심분리하는 방법 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 1000rpm에서 20분간 원심분리한다.The separation method of the present invention is characterized in that a vessel such as a syringe or a tube is used to collect bone marrow from an individual and centrifuge the vessel filled with bone marrow as it is. The centrifugation is carried out at 500 to 3000 rpm for 5 to 30 minutes. Specific examples of centrifugation conditions include centrifugation at 500 rpm for 30 minutes, 1000 rpm for 10 minutes, 1000 rpm for 20 minutes, 2000 rpm for 10 minutes, and 3000 rpm for 5 minutes, but not always limited thereto. Most preferably, centrifugation is carried out at 1000 rpm for 20 minutes.
본 발명의 분리방법에 사용될 수 있는 용기는 원심분리가 가능한 용기라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다. 용기의 구체적인 예로는 주사기, 튜브 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 주사기의 경우 원심분리가 가능하도록 플런저(plunger)가 주사기에서 분리가능한 것이어야 한다. 플런저가 주사기로부터 분리됨으로써 주사기를 그대로 원심분리할 수 있다. 원심분리시 주사기의 입구는 반드시 캡으로 막아 주어야 한다. 바림직한 주사기의 예로는 채혈용 주사기(boin tube) 또는 루어-락 시린지(luer-lock syringe)를 포함한다. 하기 실시예에서는 (주)벡톤디킨슨(BD)의 채혈용 주사기 및 시린지를 사용하였다.The container which can be used in the separation method of the present invention can be any container that can be centrifuged. Specific examples of containers include, but are not limited to, syringes, tubes, and the like. In the case of a syringe, the plunger should be detachable from the syringe to enable centrifugation. By separating the plunger from the syringe, the syringe can be centrifuged as it is. When centrifuging, the inlet of the syringe must be capped. Examples of suitable syringes include a boin tube or a luer-lock syringe. In the following examples, a syringe and a syringe for collecting blood from Becton Dickinson (BD) were used.
본 발명의 분리방법에 따라 원심분리를 하면, 용기의 하단에는 주로 적혈구(Red Blood Cell: RBC), 및 백혈구 중 호중구가 모이게 되고, 상단에는 플라즈마(plasma)가 존재하며, 최상단에는 지방층이 존재하고, 중간 부분에 육안으로 확인가능한 버피코트(buffy coat)가 형성된다. 버피코트는 주로 림프구, 단핵구, 백혈구, 혈소판 및 중간엽 줄기세포로 이루어지는 층이다.When centrifugation is carried out according to the separation method of the present invention, red blood cells (RBCs) and neutrophils in white blood cells are collected at the lower end of the container, plasma is present at the upper end, a fat layer is present at the upper end , And a visually identifiable buffy coat is formed in the middle portion. Buffy coats are mainly layers of lymphocytes, monocytes, leukocytes, platelets and mesenchymal stem cells.
일 구체예에서, (주)벡톤디킨슨(BD)의 10mL 용량 채혈용 주사기(boin tube)로 골수를 채취하여 1000rpm에서 10분간 1회 원심분리를 하면, 버피코트가 약 0.2mL 형성되는 것을 육안으로 확인할 수 있다(도 1).In one specific example, the bone marrow was collected with a 10 mL capacity boil tube of Becton Dickinson (BD) and centrifuged once at 1000 rpm for 10 minutes, and about 0.2 mL of buffy coat was formed visually (Fig. 1).
다른 구체예에서, (주)벡톤디킨슨(BD)의 20mL 용량 시린지로 골수를 채취하여 1000rpm에서 10분간 2회 원심분리를 하면, 버피코트가 약 0.5 mL 형성되는 것을 육안으로 확인할 수 있다(도 2).In another embodiment, bone marrow is collected in a 20-mL capacity syringe of Becton Dickinson (BD), Inc., and centrifuged twice at 1000 rpm for 10 minutes to visually confirm that about 0.5 mL of buffy coat is formed ).
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 적혈구층을 분획 1 내지 4로 나누고, 버피코트를 포함하는 층을 분획 5로, 플라즈마층을 분획 6으로 나누었다. 이때, 최상단의 지방층은 폐기하였다. 각 층을 플런저를 이용하여 주사기에서 배출시킨 후, α-MEM 배지(Gibco, USA)에서 10일 동안 배양한 결과, 놀랍게도 중간엽 줄기세포가 주로 분획 4에만 존재한다는 사실을 발견하였다.As shown in Fig. 1, the present inventors divided the erythrocyte layer into fractions 1 to 4, divide the layer containing the buffy coat into
분획 1 내지 6을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양한 후 CFU-F(콜로니 형성 유니트-섬유아세포) 아세이를 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 사진 아래의 표는 각각 세포수(위) 및 생육도(아래)를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 분획 4의 세포수가 40.876 × 104로서 분획 1 내지 3, 5 및 6에 비하여 월등히 높았다. 이러한 결과로부터 중간엽 줄기세포가 분획 4에 주로 존재한다는 것을 알 수 있었다. 한편 트립판 블루를 이용하여 세포 생육도를 측정하였는데, 분획 4가 94.2%, 분획 5가 95.6%로 유사하였다.Fractions 1 to 6 were each incubated in a-MEM medium for 10 days after erythrocyte dissolution, and CFU-F (colony forming unit-fibroblast) cells were cultured. The results are shown in FIG. The table below shows the number of cells (above) and the degree of growth (below), respectively. As shown in FIG. 4, the cell number of
도 4의 가장 좌측의 플레이트는 채취한 골수를 원심분리하지 않고 CFU-F 아세이한 결과를 나타낸 것인데, 세포수가 154.666 × 104로서 분획 4의 세포수보다 높게 측정되었으나, 이는 분획 4의 플레이트가 세포로 꽉 차서 더 이상 자라지 않았기 때문이라 판단되었다.The leftmost plate in Fig. 4 shows the result of CFU-F aseptically without centrifuging the collected bone marrow. The cell number was measured as 154.666 x 10 < 4 & gt ;, which was higher than that of
한편 본 발명자들은 분리된 각층에서 배양된 세포가 실제로 어떤 특성을 가지고 있는지를 확인하기 위해 원심분리하지 않은 골수(Mixed), 플라즈마층, 분획 4(줄기세포층) 및 적혈구층을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양하여 세포 모양을 현미경으로 관찰하였고, 세포크기 및 과립도(granularity)의 관계를 확인하였다(도 5).Meanwhile, the inventors of the present invention found that a mixture of undifferentiated marrow (mixed), plasma layer, fraction 4 (stem cell layer) and erythrocyte layer were mixed with α- The cells were cultured in MEM medium for 10 days, and the cell shape was observed under a microscope. The relationship between the cell size and the granularity was confirmed (FIG. 5).
도 5에 나타난 바와 같이, 분획 4(줄기세포층) 및 플라즈마층은 원심분리하지 않은 골수(Mixed)와 유사한 세포크기 및 과립도를 나타내었다. 반면 적혈구층은 이들과 달리 세포크기가 작으면서 과립도도 작은 개체군(population)이 많이 포함된 것으로 나타났다. 세포크기가 작으면서 과립도도 작은 세포는 주로 적혈구, 단핵구 등인데, 적혈구층에 이러한 세포가 많이 포함되었음을 알 수 있었다. As shown in FIG. 5, fraction 4 (stem cell layer) and plasma layer showed cell size and granularity similar to those of non-centrifuged mixed. On the other hand, the red blood cell layer was found to contain a small population of cells with a small cell size and a small granularity. Cells with small cell size and small granularity are mostly red blood cells, mononuclear cells, etc., and these cells were found to be contained in the red blood cell layer.
또한 본 발명자들은 분획 4(줄기세포층)의 세포가 실제로 중간엽 줄기세포가 맞는지 확인하기 위해, 중간엽 줄기세포 마커인 CD29 항원 및 단핵구 마커인 CD11b 항원의 발현 여부를 FACS로 분석하였다. 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 줄기세포층의 세포는 중간엽 줄기세포 마커인 CD29 항원은 발현하지만(99.87%), 단핵구 마커인 CD11b 항원은 거의 발현하지 않는 것(0.68%)으로 관찰되었다.In order to confirm whether the cells of fraction 4 (stem cell layer) are actually mesenchymal stem cells, the present inventors analyzed the expression of CD11 antigen and monocyte marker CD11b antigen, which are mesenchymal stem cell markers, by FACS. As a result, as shown in FIG. 6, the cells of the stem cell layer express the CD29 antigen (99.87%), which is a mesenchymal stem cell marker, and the CD11b antigen, which is a mononuclear marker, is almost not expressed (0.68%).
한편 본 발명자들은 116명의 환자를 대상으로 플라즈마층, 분획 4(줄기세포층) 및 적혈구층에 대하여 CFU-F 아세이를 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 각 층의 CFU-F 수를 세어 각 층의 CFU-F 합계를 MSC 100%로 하고, 각 층의 CFU-F 퍼센트(%)를 아래와 같이 계산하였다.On the other hand, the present inventors performed CFU-F acinar for the plasma layer, fraction 4 (stem cell layer) and erythrocyte layer in 116 patients, and the results are shown in FIG. The number of CFU-Fs in each layer was counted, and the sum of CFU-F of each layer was set to 100% of MSC, and the CFU-F percent (%) of each layer was calculated as follows.
적혈구층의 MSC% = 적혈구층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of red cell layer = CFU-F of erythrocyte layer / CFU-F of each layer
줄기세포층의 MSC% = 줄기세포층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of stem cell layer = CFU-F of stem cell layer / total CFU-F of each layer
플라즈마층의 MSC% = 플라즈마층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of plasma layer = CFU-F of plasma layer / CFU-F of each layer
그 결과, 중간엽 줄기세포의 약 80% 이상이 분획 4(줄기세포층)에 존재한다는 사실을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that about 80% or more of mesenchymal stem cells are present in fraction 4 (stem cell layer).
이러한 사실에 기초하여, 분획 4를 줄기세포층(Stem Cell Layer: SCL)이라고 명명하였다. 본 명세서에서 다르게 언급하지 않는 한, 용어 "분획 4"는 "줄기세포층"과 동일한 개념으로 사용된다.Based on this fact,
분획 4(줄기세포층)은 버피코트의 하단에 형성된 층으로, 용기 총 부피의 약 5 내지 15%에 해당하는 부피, 바람직하게는, 약 10%에 해당하는 부피를 차지한다. 따라서 본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법은 버피코트의 하단에 형성된 용기 총 부피의 약 5 내지 15%, 바람직하게는 약 10%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함한다. 이와 같이 채취된 분획을 배양할 경우 중간엽 줄기세포를 고수율로 수득할 수 있다.Fraction 4 (stem cell layer) is a layer formed at the bottom of the buffy coat and occupies a volume corresponding to about 5 to 15%, preferably about 10%, of the total volume of the container. Therefore, the method of separating mesenchymal stem cells of the present invention comprises the step of collecting a fraction corresponding to about 5 to 15%, preferably about 10% of the total volume of the container formed at the bottom of the buffy coat. When the fraction thus collected is cultured, mesenchymal stem cells can be obtained in high yield.
일 구체예에서, (주)벡톤디킨슨(BD)의 10mL 용량 채혈용 주사기(boin tube)로 골수를 채취하여 1000rpm에서 10분간 1회 원심분리를 하면, 버피코트가 약 0.2mL 형성되고, 그 하단에 형성된 용기 총 부피의 10%에 해당하는 약 1mL의 분획을 채취할 수 있다(도 1).In one specific example, bone marrow is collected in a 10 mL capacity boil tube of Becton Dickinson (BD), and centrifuged once at 1000 rpm for 10 minutes to form about 0.2 mL of a buffy coat, About 1 mL of the fraction corresponding to 10% of the total volume of the container formed in the container (FIG. 1).
다른 구체예에서, (주)벡톤디킨슨(BD)의 20mL 용량 시린지로 골수를 채취하여 1000rpm에서 10분간 2회 원심분리를 하면, 버피코트가 약 0.5 mL 형성되고, 그 하단에 형성된 용기 총 부피의 10%에 해당하는 약 2mL의 분획을 채취할 수 있다(도 2).In another embodiment, bone marrow is collected in a 20 mL volume syringe of Becton Dickinson (BD), Inc. and centrifuged twice at 1000 rpm for 10 minutes to form about 0.5 mL of buffy coat, and the total volume of the container Approximately 2 mL of fraction corresponding to 10% can be collected (FIG. 2).
본 발명의 분리방법에 있어서, 골수를 분리하는 개체는 포유동물로서 사람, 소, 돼지, 말, 개, 염소, 토끼, 쥐 등이 포함된다. 중간엽 줄기세포를 포함하는 치료제는 주로 인간용으로 개발되고 있고, 당업계의 당면 과제 역시 인간의 골수로부터 중간엽 줄기세포를 보다 더 쉽고 간편하게 저비용으로 분리해내는 것인 바, 본 발명의 분리방법 역시 그 주요 타겟은 사람의 골수이다.In the separation method of the present invention, the individual for separating bone marrow includes mammals such as human, cow, pig, horse, dog, goat, rabbit, rat and the like. The therapeutic agent containing the mesenchymal stem cells is mainly developed for human use and the present problem in the related art also separates the mesenchymal stem cells from the human bone marrow more easily and easily at a low cost, The main target is also a human bone marrow.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리방법은 별도의 기구나 시료를 일체 사용하지 않으므로, 기존의 방법에 비하여 간편하고 저비용으로 중간엽 줄기세포를 고수율로 분리할 수 있다.Since the method of separating mesenchymal stem cells according to the present invention does not use any separate instrument or sample, the mesenchymal stem cells can be separated at a high yield in a simple and inexpensive manner as compared with the conventional method.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on the following examples. It should be understood, however, that these examples are for the purpose of promoting understanding of the present invention and are not to be construed as limiting the scope of the present invention.
실시예Example
실시예Example 1: 주사기 원심분리 1: Centrifugation of syringe
골수제공자의 엉덩이 부분을 국소마취제로 마취시킨 후, (주)벡톤디킨슨(BD)의 10mL 용량 채혈용 주사기(boin tube)를 엉덩이뼈에 찔러 골수를 채취하였다. 주사기의 플런저를 부러뜨려 제거하고 캡으로 주사기 입구를 막은 후, 원심분리기에 넣고 1000rpm에서 10분간 원심분리하였다.Bone marrow donors were anesthetized with a local anesthetic and the bone marrow was collected by stabbing a 10-mL capacity booster tube of Becton Dickinson (BD) into the hip bone. The plunger of the syringe was broken off and capped with a cap to close the inlet of the syringe, then put into a centrifuge and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes.
그 결과, 주사기의 하단에는 주로 적혈구가 모이게 되고, 상단에는 플라즈마가 존재하며, 최상단에는 지방층이 존재하고, 중간 부분에 육안으로 확인가능한 버피코트가 생겼다. 도 1에 나타난 바와 같이, 주사기의 눈금 9 위쪽으로 약 0.5 mL의 지방층을 육안으로 확인할 수 있었고, 눈금 5 아래쪽으로 약 0.2 mL의 버피코트를 육안으로 확인할 수 있었다.
As a result, mainly red blood cells were collected at the lower end of the syringe, a plasma was present at the upper end, a fat layer was present at the upper end, and a buffy coat visible in the middle portion was formed. As shown in FIG. 1, about 0.5 mL of the fat layer was visually confirmed on the
실시예Example 2: 주사기 원심분리 2: Syringe centrifugation
10mL 용량 채혈용 주사기 대신 (주)벡톤디킨슨(BD) 20mL 용량 시린지를 이용하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 골수를 채취한 후 1000rpm에서 10분간 2회 원심분리하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 주사기의 눈금 18 위쪽으로 약 1.5 mL의 지방층을 육안으로 확인할 수 있었고, 눈금 10 아래쪽으로 약 0.5 mL의 버피코트를 육안으로 확인할 수 있었다.Bone marrow was collected in the same manner as in Example 1 using a 20 mL volume syringe of Becton Dickinson (BD) (Inc.) instead of a 10 mL capacity syringe for blood sampling, and centrifuged twice at 1000 rpm for 10 minutes. As a result, as shown in FIG. 2, a fat layer of about 1.5 mL was visually confirmed above the scale 18 of the syringe, and a buffy coat of about 0.5 mL was visually confirmed below the
실시예Example 3: 배양 및 3: Culture and CFUCFU -F(-F ( 콜로니Colony 형성 formation 유니트Unit -섬유아세포) - fibroblasts) 아세이ASEAN
실시예 1에서 원심분리한 10mL 용량 채혈용 주사기를, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 적혈구층을 분획 1 내지 4로 나누고, 버피코트를 포함하는 층을 분획 5로, 플라즈마층을 분획 6으로 나누었다. 이때, 최상단의 지방층은 폐기하였다. 각 층을 플런저를 이용하여 주사기에서 배출시킨 후, 각각 적혈구 용해시키고 α-MEM 배지(Gibco, USA)에서 10일 동안 배양한 후 현미경으로 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다.1, the erythrocyte layer was divided into fractions 1 to 4, the layer containing the buffy coat was divided into
또한 분획 1 내지 6에 대하여 CFU-F 아세이를 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 사진 아래의 표는 각각 세포수(위) 및 생육도(아래)를 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 분획 4의 세포수가 40.876 ×104로서 분획 1 내지 3, 5 및 6에 비하여 월등히 높았다. 이러한 결과로부터 중간엽 줄기세포가 분획 4에 주로 존재한다는 것을 알 수 있었다. 한편 트립판 블루를 이용하여 세포 생육도를 측정하였는데, 분획 4가 94.2%, 분획 5가 95.6%로 유사하였다.The fraction 1 to 6 was also subjected to CFU-F acetic acid, and the results are shown in FIG. The chart in the photograph of FIG. 4 shows the number of cells (above) and the degree of growth (below), respectively. As shown in FIG. 4, the cell number of
도 4의 가장 좌측의 플레이트는 채취한 골수를 원심분리하지 않고 CFU-F 아세이한 결과를 나타낸 것인데, 세포수가 154.666 × 104로서 분획 4의 세포수보다 높게 측정되었으나, 이는 분획 4의 플레이트가 세포로 꽉 차서 더 이상 자라지 않았기 때문이라 판단되었다.
The leftmost plate in Fig. 4 shows the result of CFU-F aseptically without centrifuging the collected bone marrow. The cell number was measured as 154.666 x 10 < 4 & gt ;, which was higher than that of
실시예Example 4: 4: CD29CD29 항원 발현 확인 Confirmation of antigen expression
원심분리하지 않은 골수(Mixed), 플라즈마층, 분획 4(줄기세포층) 및 적혈구층을 각각 적혈구 용해 후 α-MEM 배지에서 10일 동안 배양시의 세포 모양을 현미경으로 관찰하였고, 및 세포크기 및 과립도(granularity)의 관계를 확인하였다(도 5).Cell morphology was observed under a microscope for 10 days of incubation in α-MEM medium after erythrocyte dissolution, without centrifugation (Mixed), plasma layer, fraction 4 (stem cell layer) and erythrocyte layer, And the relationship of granularity was confirmed (FIG. 5).
도 5에 나타난 바와 같이, 분획 4(줄기세포층) 및 플라즈마층은 원심분리하지 않은 골수(Mixed)와 유사한 세포크기 및 과립도를 나타내었다. 반면 적혈구층은 이들과 달리 세포크기가 작으면서 과립도도 작은 개체군(population)이 많이 포함된 것으로 나타났다. 세포크기가 작으면서 과립도도 작은 세포는 주로 적혈구, 단핵구 등인데, 적혈구층에 이러한 세포가 많이 포함되었음을 알 수 있었다. As shown in FIG. 5, fraction 4 (stem cell layer) and plasma layer showed cell size and granularity similar to those of non-centrifuged mixed. On the other hand, the red blood cell layer was found to contain a small population of cells with a small cell size and a small granularity. Cells with small cell size and small granularity are mostly red blood cells, mononuclear cells, etc., and these cells were found to be contained in the red blood cell layer.
또한 분획 4(줄기세포층)의 세포가 실제로 중간엽 줄기세포가 맞는지 확인하기 위해, 중간엽 줄기세포 마커인 CD29 항원 및 단핵구 마커인 CD11b 항원의 발현 여부를 FACS로 분석하였다. 그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 줄기세포층의 세포는 중간엽 줄기세포 마커인 CD29 항원은 발현하지만(99.87%), 단핵구 마커인 CD11b 항원은 거의 발현하지 않는 것(0.68%)으로 관찰되었다.
In order to confirm whether the cells of fraction 4 (stem cell layer) are actually mesenchymal stem cells, the expression of CD11 antigen and monocyte marker CD11b antigen, which are mesenchymal stem cell markers, were analyzed by FACS. As a result, as shown in FIG. 6, the cells of the stem cell layer express the CD29 antigen (99.87%), which is a mesenchymal stem cell marker, and the CD11b antigen, which is a mononuclear marker, is almost not expressed (0.68%).
실시예Example 5: 5: CFUCFU -F -F 아세이ASEAN
116명의 환자를 대상으로 플라즈마층, 분획 4(줄기세포층) 및 적혈구층에 대하여 CFU-F 아세이를 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 각 층의 CFU-F 수를 세어 각 층의 CFU-F 합계를 MSC 100%로 하고, 각 층의 CFU-F 퍼센트(%)를 아래와 같이 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.CFU-F was performed on plasma layer, fraction 4 (stem cell layer) and erythrocyte layer in 116 patients, and the results are shown in FIG. The CFU-F number of each layer was counted, and the CFU-F sum of each layer was set to 100% of MSC. The CFU-F percent (%) of each layer was calculated as follows and the results are shown in Table 1 below.
적혈구층의 MSC% = 적혈구층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of red cell layer = CFU-F of erythrocyte layer / CFU-F of each layer
줄기세포층의 MSC% = 줄기세포층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of stem cell layer = CFU-F of stem cell layer / total CFU-F of each layer
플라즈마층의 MSC% = 플라즈마층의 CFU-F 수 / 각 층의 CFU-F 합계MSC% of plasma layer = CFU-F of plasma layer / CFU-F of each layer
상기 표 1에 나타나 바와 같이, 중간엽 줄기세포의 약 80% 이상이 분획 4(줄기세포층)에 존재한다는 사실을 확인할 수 있었다.As shown in Table 1, it was confirmed that about 80% or more of mesenchymal stem cells are present in fraction 4 (stem cell layer).
Claims (10)
b) 생성된 버피코트(buffy coat)의 하단에 형성된 용기 총 부피의 10 내지 15%에 해당하는 분획을 채취하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 분리방법.a) centrifuging the 10 mL container filled with bone marrow separated from the subject for 10 minutes at 1000 rpm or centrifuging the 20 mL container filled with bone marrow separated from the subject at 1000 rpm for 20 minutes; And
b) collecting a fraction corresponding to 10 to 15% of the total volume of the container formed at the bottom of the produced buffy coat.
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| AMND | Amendment | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| N231 | Notification of change of applicant |