KR101983907B1 - 갈색 고추 판별용 분자표지 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 저장성이 높은 갈색 고추 판별용 분자표지 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 기존의 CaSGR 유전자에서 갈색 고추를 판별하는 알려져 있는 SNP이외의 새로운 SNP를 목표로 하는 CAPS 마커를 제작하여 조기에 숙과색이 갈색 고추를 구별할 수 있으며, 다양한 원예적 형질을 가지는 고추를 육종하기 위한 육종소재로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

갈색 고추 판별용 분자표지 및 이의 용도{Molecular marker for discrimination of brown pepper and use thereof}

본 발명은 저장성이 높은 갈색 고추 판별용 분자표지 및 이의 용도에 관한 것이다.

고추 (Capsicum annuum)는 우리의 식탁위의 필수인 채소작물로써 전 세계적으로 생산량과 소비량이 급증하고 있다. 고추에 대한 소비자의 선호도는 모양, 크기, 색, 경도, 맛 등에 의해서 결정된다. 이 중 고추의 색은 중요한 원예적 특성 중 하나이며, 일반적으로 플라보노이드 (flavonoid), 카로티노이드 (carotenoid) 등의 색소에 의해 다양한 과실의 색이 나타나게 된다.

이러한 색소들은 인체에서 항산화 기능이 뛰어난 항산화 물질로 노화지연, 심혈관 질환, 동맥 경화증, 특정 유형의 암을 예방한다고 알려져있다. 착색은 녹색인 미숙과에서 색이 변하기 시작하는 breaker 단계 이후에 엽록소가 급격하게 분해되고 다양한 색소들의 합성으로 인하여 여러 숙과색을 가지게 된다. 이들 중 SGR (STAY-GREEN) 유전자에 돌연변이가 발생한 식물체들은 클로로필이 분해되지 못하고 잔존함과 동시에 카로티노이드 색소가 축적되게 되면 결과적으로 갈색의 숙과색이 나타나게 된다.

SGR 단백질은 식물의 클로로필 분해와 노화를 조절하는데 중요한 역할을 수행하며, 일반적으로 노화되는 동안에 발현이 유도된다고 알려져 있다. 정상적인 식물의 클로로필 분해과정 초기단계에서 chlorophyll α 분자에서 Mg 이온을 제거하는 반응을 거쳐 pheophorbide α(페오포르비드)로 전환되게 되며, 이후 일련의 분해 과정을 거치며 녹색이던 클로로필이 무색의 최종 분해 산물인 NCCs (nonfluorscent Chl catabolites) 형태로 액포에 저장되며 색소가 사라지게 된다. 하지만, SGR 유전자에 돌연변이가 발생하게 되면 chlorophyll α를 기질로 Mg 분자를 제거하는 기능을 수행하지 못하게 되어 클로로필 분해가 진행되지 못하게 된다. 이러한 SGR 기능은 festuca, pea, soybean, rice, arabidopsis 등 여러 식물에서 연구 되어왔다.

가지과 작물인 토마토 연구에서 SlSGR의 기능을 분석하기 위하여 인위적으로 SlSGR-RNAi (RNA interference)를 통하여 SlSGR 유전자의 발현을 knock-down 시킨 형질전환체를 만들어 연구에 사용하였다. 그 결과 형질전환체 잎에서 노화 진행이 상당히 지연되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 과실이 성숙 단계를 거치며 카로티노이드계 색소인 phytoene, β-carotein, lycopene의 함량이 wild type 과실에 비해 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 숙과에서 저장성또한 연장된 것을 확인할 수 있었다. 이뿐만 아니라 토마토에서 더욱더 많은 SGR의 기능에 대한 연구가 진행된 반면에 고추에서는 아직 연구가 미비한 실정이다.

한국 공개 특허 KR 10-2016-0053420

이에 본 발명자들은 기존의 CaSGR 유전자에서 알려진 dCAPS 마커에 의해 판별하지 못했던 갈색 고추에서 CaSGR 유전자를 분석하던 중에 CaSGR의 3번째 엑손 141 bp를 목표로 하는 CAPS 마커를 제작하였으며, 제작한 서열번호 1 및 2의 프라이머가 갈색 고추를 판별하는데 이용할 수 있음을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 CaSGR (Capsicum annuum STAY-GREEN) 3번째 엑손 141 bp를 구별하여 갈색 고추 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트, 제한효소 및 증폭반응수행시약을 포함하는 갈색 고추 판별용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 고추 시료로부터 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 갈색 고추를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명은 기존의 CaSGR 유전자에서 갈색 고추를 판별하는 알려져 있는 SNP이외의 새로운 SNP를 목표로 하는 CAPS 마커를 제작하여 조기에 숙과색이 갈색 고추를 구별할 수 있으며, 다양한 원예적 형질을 가지는 고추를 육종하기 위한 육종소재로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 붉은 고추와 갈색 고추를 나타낸 사진이다: 왼쪽에서 오른쪽으로 1. CM334, 2. ECW, 3. Yolo wonder 4. TF68, 5. AC2212, 6. Sweet Chocolate, 7. PBC891, 8. P45482, 눈금 막대 = 1cm. (1 ~ 4, 6 ~ 8, C. annuum, 5, C. chinense).
도 2는 갈색 고추에 있는 CaSGR의 대립 변이를 나타낸 그림이다:
A: CaSGR의 유전자 구조,
B: 갈색 고추에서 CaSGR 아미노산.
도 3은 갈색 고추에서 돌연변이 대립 유전자를 동정하기 위한 PCR 마커를 나타낸 그림이다:
M : 1kb DNA ladder, 1. CM334, 2. ECW, 3. Yolo wonder 4. TF68, 5. AC2212, 6. Sweet Chocolate, 7. PBC891, 8. P45482.
도 4는 모본 및 F₂ 집단에서 CaSGR의 dCAPS 마커 분석한 결과를 나타낸 사진이다: M : DNA ladder, AC : AC2212, TF : TF68, R : 붉은색 고추, B : 갈색 고추.
도 5는 갈색 고추와 적색 고추의 저장성 비교:
갈색 고추(PBC891과 P45482), 적색 고추(CM334, C01692와 TF68)은 파열 단계에서 수확하고 상온 (25 ± 1℃ 및 55 ~ 58 % 상대 습도)에서 15 일 동안 보관함.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 CaSGR (Capsicum annuum STAY-GREEN) 3번째 엑손 141 bp를 구별하여 갈색 고추 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

상기 CaSGR 유전자(Accession number: AM746208)는 서열번호 11로 표기되며, 숙과색이 갈색고추인 PBC891는 CaSGR 유전자의 117 bp 위치 다음에 아데닌(Adenine, A)의 삽입으로 인해서(도 2 및 도 3 참고), CaSGR 단백질의 아미노산 서열 141 bp 위치에서 종결코돈(Premature Termination Codon, PTC)을 형성될 수 있다(서열번호 14, 도 2 참고).

상기 CaSGR 단백질은 서열번호 13로 표기되며, 상기 숙과색이 갈색 고추(PBC891)는 A가 삽입으로 인해 조기 종결되며, 서열번호 14로 표기하였다.

본 발명에 숙과에서 갈색의 표현형을 나타내는 4가지 고추 품종의 SGR 유전자를 클로닝하여 염기서열 분석 후 빨간색 고추의 염기서열과 비교하여 다양한 SNP(single nucleotide polymorphism)을 발견하였고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 CAPC(cleaved amplified polymorphic sequences)와 서열번호 3 및 4의 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequences) 마커를 제작하였다. 기존의 갈색 고추 판별하기 위하여 제작한 dCAPS 마커는 PBC891와 같이 엑손 3번에서 A가 insertion 된 갈색 고추는 판별하기 어려우므로 PBC891에서 기존의 갈색 고추와는 다른 부위에 SNP가 있는 것을 확인하여 이 부위를 판별하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 CAPS 마커를 제작하였다(표 2, 도 2 및 도 3)

본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 배의 화분 유무 판별용 프라이머 세트이다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 또는 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2는 CAPS 마커이다.

본 발명에서 사용되는 용어“CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 마커”는 단일염기 다형성(SNPs) 중 제한효소 자리에 위치한 SNP이며, 제한 증폭 다형성 시퀀스라고도 하며, 제한효소 처리에 의한 배열차를 검출하여 식별하는 방법이다.

CAPS 마커는 품종 간에서 염기 배열의 차가 있다는 것을 알고 있는 유전자를 목적으로 해서 검출이 이루어지며, 종의 게놈 중에서 해당 유전자만을 PCR 법에 의해 선별하여 증폭한다. 대부분의 마커에서는 증폭된 유전자의 길이와 품종 간의 차가 없으나, 유전자 내부의 배열은 다르기 때문에 그 배열의 차를 인식하는 제한효소를 선발해서 처리한다. 제한효소로 절단된 DNA를 보유하는 품종과 절단되지 않는 DNA를 가지는 품종과의 차이를 구별할 수 있으며 그 길이의 차이는 전기영동법에 의해 쉽게 검출된다.

본 발명의 실시예에서는, 숙과색이 갈색을 띄는 고추 품종 간에서 CaSGR 유전자의 염기 배열이 차이점이 있다는 것을 확인하여 CaSGR 유전자를 선발해서 증폭한 다음 그 염기서열의 차이가 나는 부위인 CaSGR의 3번째 엑손 141 bp을 인식하는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음 제한효소(MseI)를 처리하여 절단된 부위를 보유하는 PBC891 품종과 절단되지 않는 DNA를 가지는 숙과색이 빨간색을 띄는 CM334, ECW, Yolo wonder, TF68 및 AC2212, Sweet Chocolate, P45482의 차이를 확인할 수 있었으며, 구체적으로 PBC891 품종만이 256 bp와 56 bp로 절단되는 것을 확인하였다(도 2 및 3).

본 발명의 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

또한 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트, 제한효소 및 증폭반응수행시약을 포함하는 갈색 고추 판별용 키트를 제공한다.

상기 증폭반응수행시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 제한효소는 바람직하게는 MseI일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 고추 시료로부터 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;

상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및

상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 갈색 고추를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있으며, 바람직하게는 TOYOBO 키트를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 제한효소는 MseI인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 재료 및 방법

<1-1> 실험재료

숙과색이 빨간색인 Capsicum annuum ‘CM334’, ‘ECW’, ‘TF68’, ‘Yolo wonder’ 와 숙과색이 갈색인 C. annuum ‘Sweet chocolate’, ‘PBC891’, ‘ P45482 ’와 Capsicum chinense ‘AC2212’를 실험에 사용하였다(도 1). 이들 중 숙과색이 빨간색인 ‘TF68’과 숙과색이 갈색인 ‘AC2212’간의 교배를 통해 얻은 F₂집단 총 204개체의 표현형과 유전형분석을 실시하였다. 저장성 테스트는 각 과실을 breaker 단계에서 수확하여 챔버 조건 (24±1℃, 55~60% relative humidity and 16/8 h light/dark) 하에서 15일간 저장하였다.

<1-2> Genomic DNA 추출

고추 DNA 추출은 cetryltrimetylammonium bromide (CTAB) 방법 (Murray and Thompson 1980)을 사용하였다. 유리 비드 2개가 들어있는 2 ml 튜브에 2 cm 내외의 어린잎을 채취하였다. 시료가 들어있는 튜브에 CTAB 버퍼 (2% CTAB, 1.42 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, ddH₂O) 600μl와 β-mercaptoethanol 3 μl, 100 mg/ml L-ascorbic acid 10 μl을 첨가한 다음 균질기를 이용하여 마쇄, 65℃ heat block에서 15분 처리하였다. 그 다음 클로로폼과 이소아밀알코올을 24:1 (v/v) 비율로 섞은 용액 600 μl 첨가한 다음 inverting하고 13,000 rpm, 4℃ 조건에서 15 분 동안 원심분리 하여 층을 분리하였다. 상층액 500 μl를 새로운 1.5 ml 튜브에 옮기고 -20℃에서 보관된 100% 아이소프로판올을 500 μl 첨가한 후 섞어주었다. 4 ℃, 13,000 rpm 조건에서 15분 동안 원심 분리하여 DNA 펠렛을 만들고 용액은 제거하였다. 펠헷만 남아있는 튜브에 70% 에탄올 750 μl를 섞어준 후 4℃, 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리 하였다. 용액을 제거하고 13,000 rpm으로 1분 동안 원심 분리하여 남아있는 용액은 파이펫을 이용해 모두 제거하였다. 클린벤치내에서 10분 건조 후 펠렛만 남아있는 튜브에 100 ㎍/ml RNase가 처리된 ddH₂O를 30 μl 첨가하여 DNA 펠렛을 녹였다. 추출한 genomic DNA는 Nanodrop 2000 Sperctrophotometer (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량 후 -20℃에 보관하여 사용하였다.

<1-3> CaSGR 증폭을 위한 프라이머 제작

CaSGR 증폭을 위한 프라이머 제작을 위해 Sol Genomics Network (solgenomics.net)에서 CaSGR 유전자의 염기서열정보를 확인하였다. 이 유전자의 gDNA를 템플레이트로 하여 총 4개의 엑손을 포함하도록 프라이머를 제작하였다 (표 1). 프라이머로 사용된 DNA oligonucleotide는 Neoprobe (Neoprobe, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.

유전자 (Gene ID)	프라이머 ID	프라이머	서열번호
CaSGR (CA01g03620)	sgr-엑손1 (411 bp)	F : AGTACACGTACTTAATGCCAATC	5
		R : CGAAAGGGTAAGAATATACACAC	6
	sgr-엑손2 (247 bp)	F : ATAGGTGGCAAGGCTATTTGGA	7
		R : TGCTCTATTTGTGAATGATCACA	8
	sgr-엑손3,4 (836 bp)	F : TACTCTTAATCTTGAATCTGCCT	9
		R : GTTTGTGGAAGCAAGATTATTTG	10

<1-4> Polymerase Chain Reaction ( PCR )분석

Solg e-Taq DNA 중합효소 (Solgent, Korea)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 튜브에 gDNA 템플레이트 400 ng, 10x e-Taq Reaction Buffer 2.5 μl, 각각 10 Mm dNTP mix 0.5 μl, Solg e-Taq 중합효소 0.125 μl, ddH₂O 18.875 μl, 프라이머(forward, reverse)를 각 1 μl씩 넣어 총 25 μl의 혼합물를 만들었다. 이후 T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃에서 3분간 초기 변성시키고, 95℃에서 30초 (denaturing), 57.5℃에서 30초 (annealing), 72℃에서 1분 (extension) 과정을 35회 반복 후 72℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후에는 1% 아가로스 겔에 전기 영동하여 염기서열의 증폭여부를 확인하였다.

<1-5> CaSGR 클로닝 및 염기서열분석

증폭된 PCR product로 T-blunt PCR Cloning Kit (Solgent, Korea)를 이용하여 클로닝을 진행하였다. T-Blunt™ chemically competernt cell (Solgent, Korea)과 heat-shock 방법을 이용하여 형질전환을 실시하였으며, 실험방법은 제조회사에서 제공한 방법을 따라 수행하였다. PCR과 전기영동을 이용하여 insert의 존재를 확인하였다. 이후, HiGene™ Plasmid Mini Prep Kit (BIOFACT, Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하였고 염기서열은 Solgent사에 의뢰하여 분석하였다. 분석된 염기서열을 이용하여 숙과색이 갈색인 고추들의 유전자 염기서열차이를 alignment tool (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)을 이용하여 분석하였다.

<1-6> CAPS 마커를 이용한 유전자형 분석

염기서열 분석결과를 토대로 숙과색이 빨간 고추와‘PBC891’을 구별할 수 있는 CAPS 마커를 제작하여 하기 표 2에 기재하였다. 우선, PCR을 이용하여 숙과색이 빨간색과 갈색 고추들의 gDNA를 증폭한 다음 전기영동 (1% agarose gel)을 통해 원하는 사이즈의 템플레이트가 증폭되었는지를 확인하였다. 그 다음, PCR 튜브에 증폭된 템플레이트 5μl, ddH₂O 3.9 μl, NEB buffer 21 μl, 제한 효소 MseI 0.1 μl (1 unit)를 넣어 총 10 μl의 혼합물을 만들고 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)에 37℃, 4시간 동안 MseI 효소를 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후 전기영동 (2.5% 아가로스 겔)을 통해 제한효소에 의한 PCR 산물의 커팅(cutting) 여부를 확인하였다.

마커 종류	제한효소	프라이머( 5' ▶ 3' )	서열번호
CAPS	MseI (T / TAA)	F : GAATGGAAGAAAGTTAAAGGGAAG	1
		R : AGCTTGTTGCAACTCTGGATAATT	2
dCAPS	FokI (GGAGT(N)9/)	F : TCAAAGGGATGAAGTGGTTGCAGGA	3
		R : AGGAACACGGCCGAACGATAT	4

<1-7> dCAPS 마커를 이용한 유전자형 분석

염기서열 분석결과를 토대로 숙과색이 빨간 고추와‘AC2212',‘Sweet chocolate’,‘P45482’를 구분 지을 수 있는 dCAPS 마커를 제작하여 상기 표 2에 기재하였다. 먼저, 실시예 1-4에 기재된 PCR 분석 방벙을 이용하여 숙과색이 빨간색과 갈색 고추들의 gDNA를 증폭한 다음 전기영동 (1% 아가로스 겔)을 통해 원하는 사이즈의 템플레이트가 증폭되었는지를 확인하였다. 그 다음, PCR 튜브에 증폭된 템플레이트 5μl, ddH₂O 3.9 μl, NEB buffer 21 μl, 제한효소 FokI 0.1 μl (1 unit)를 넣어 총 10 μl의 혼합물을 만들고 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)에 37℃, 4 시간 동안 FokI 효소를 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후 전기영동 (2.5% 아가로스겔)을 통해 제한효소에 의한 PCR 산물의 커팅(cutting) 여부를 확인하였다.

<1-8> CaSGR 유전자 기능 분석을 위한 VIGS

VIGS(Virus-Induced Gene Silencing) 테스트를 위하여 우선 Numex Halloween의 숙과에서 total RNA를 추출하여 SolGent의 DiaStar™ RT Kit with RNase Inhibitor를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성방법은 제조회사에서 제시한 방법으로 진행하였다. PCR 튜브에 Numex Halloween의 숙과의 cDNA 1 μl, 버퍼 2.5 μl, dNTP 0.5 μl, Pfu 중합효소 0.125 μl, ddH₂O₁₈.875μl 와 forward, reverse 프라이머 각 1 μl을 첨가하여 총 25 μl의 혼합물을 만든 후 T-100 Thermal Cycler (BIO-RAD, USA)을 이용하여 PCR을 진행하였다. 후보유전자 (CaSGR)를 클로닝하기 위한 PCR 조건은 95℃에서 3분간 초기 변성시키고, 95℃에서 30초(denaturing), 58℃에서 30초(annealing), 72℃에서 1분(extension) 과정을 35회 반복 후 72℃에서 5분간 반응시켰다. 후보유전자와 reporter gene (An2)을 연결하기 위해 PCR 산물을 각각 50 ng/ul씩 혼합하여 위와 동일한 조건의 PCR을 수행하였다. 후보유전자 클로닝을 위해 벡터와 insert의 상동성에 기반을 둔 ligation independent cloning (lic) 방법을 이용하였다. 증폭된 PCR 산물과 TRV2에 T4 polymerase를 이용하여 25℃에서 1시간 ligation하였다. Heat-shock 방법으로 E.coli에 형질전환을 실시하였으며, 실험방법은 제조회사에서 제공한 방법에 따라 수행하였다. 전기영동을 통해 insert의 존재를 확인한 후 construct의 정확성을 확인하기 위해 HiGene™ Plasmid Mini Prep Kit (BIOFACT, Korea)을 사용하여 Plasmid DNA를 분리하였으며 Solgent사에 의뢰하여 염기서열을 해독하였다. 이후 construct가 확인된 플라스미드는 동결융해 방법을 사용하여 아그로박테리움 형질전환을 하였다. 이후 아그로박테리움 인필터레이션을 위해 100 mM 아세토시린곤 100 ul, 100 mM MES 5 ml, 100mM MgCl₂ 5 ml 첨가하여 ddH₂O로 총 50 ml을 맞추어 c세포 현탁 시 사용할 완충용액을 제조하였다. TRV1과 TRV2를 포함하는 아그로박테리움을 완충용액과 혼합하여 2~3시간 반응시킨 후, 파종 후 2주 된 식물체의 떡잎 뒤편 기공으로 바늘이 없는 주사기를 이용해 주입하여 접종시켰다. 아그로박테리움 인필터레이션이 된 식물은 생장 챔버 16℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 25℃에서 4주 간 생장시켰다.

<1-9> 클로로필 추출 및 HPLC 분석

고추 숙과에서 태좌를 제거한 과피를 액체질소로 급속 냉동시킨 후 막자사발을 이용하여 곱게 마쇄 한 다음 2 ml tube에 sample powder 100 mg과 6 mm 유리 비드 2개를 넣어준다. 이후 클로로필 추출과정은 광이 차단된 조건에서 진행하였으며 추출에 사용된 용매는 모두 HPLC grade를 사용하였다. Sample powder에 80% 아세톤 500 ul를 첨가한 후 FastPrep-24™ (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 20초씩 3번 균질화 하였다. 이후 4℃ 암조건에서 10분 동안 incubation 하고 vortexing 이후 원심분리 (4℃/ 13,000 rpm)하였다. 상층액을 새로운 2 ml 튜브에 옮겨담았다. 다음과 같은 과정을 4번 반복 진행하였다. 추출물은 MICRO-CENVAC (NB-503CIR, N-BIOTEK)을 이용하여 45℃에 2시간 동안 건조하였다. 클로로필 추출물에 500 ㎕의 methyl t-butyl ether를 첨가한 후 15분 동안 실온, 암조건에서 incubation하였다. 이후 vortex후 485 ㎕의 MeOH를 첨가하여 다시 vortex 하였다. 클로로필 현탁액은 0.22 syringe filter를 이용해 filtering 한 후 HPLC vial로 옮겨주었다. 클로로필 분석을 위해 Agilent HPLC (1260 infinity)와 Chemstation 소프트웨어가 사용되었다.

< 실시예 2> 결과 및 고찰

<2-1> CaSGR 염기서열 분석

숙과가 빨간색의 표현형을 가지는 4가지 계통의 고추와 갈색의 표현형을 가지는 4가지 계통의 고추의 gDNA를 이용하여 고추 과실 숙기 동안에 클로로필의 분해를 조절하는 CaSGR 유전자의 염기서열 분석을 실시하였으며 이들 간의 염기서열 차이를 분석하였다. CaSGR 유전자는 총 4개의 엑손과 3개의 인트론을 포함하고 있었으며, 그 중 3번째 엑손 49 bp 위치에서 갈색의 표현형을 가지는 AC2212, Sweet chocolate, P45482에서 Thymine (T) 하나가 Cytosine (C)로 유전자 변이가 나타났으며 아미노산 서열 114 bp 위치에서 Tryptophan (W)이 Arginine (R)로 치환됨을 확인하였다. 또한 숙과색이 갈색고추인 PBC891는 CaSGR 유전자의 117 bp 위치 다음에 아데닌(Adenine, A)의 삽입으로 인해서(도 2 및 도 3 참고), CaSGR 단백질의 아미노산 서열 141 bp 위치에서 종결코돈(Premature Termination Codon, PTC)을 형성되었다(서열번호 14, 도 2). CaSGR 유전자의 엑손 부위는 아미노산 합성에 직접적으로 관여하는 염기 서열로써 이 지역에 변이가 생기거나 PTC가 형성될 경우 CaSGR 단백질의 발현에 영향을 주어 숙과색이 갈색의 표현형을 나타낼 것으로 예상할 수 있다.

<2-2> TF68 x AC2212 F2 집단의 표현형 조사

TF68 x AC2212 F2 집단 204 개체에서 숙과색 표현형을 조사하였다. 그 결과 숙과색이 빨간색을 나타내는 146개체와 갈색을 나타내는 58개체를 관찰하였고 3:1로 분리된 것을 확인할 수 있었다 (표 3). 따라서 이집단의 숙과색은 CaSGR 단일열성유전자에 의해 조절 되는 것으로 예상된다.

	기대비율	관찰빈도	χ2 test	P-value
유전자형	1:2:1	58 (SGR/SGR):89 (SGR/-):57 (-/-)	3.32ns	0.1898
표현형	3:1	146(red): 58(brown)	1.28ns	0.2577

<2-3> 갈색 고추 판별용 CAPS 마커 개발

CaSGR 유전자의 선행된 연구에서 3번째 엑손 114bp의 SNP를 목표로 하는 dCAPS 마커가 알려져 있다 (Yelena Borovsky and Ilan Paran 2007). 이 마커를 이용하여 AC2212, Sweet chocolate, P45482를 판별할 수 있었다. 이 부위의 서열이 특정 제한효소로 절단되지 않아 인위적으로 포워드(forward) 프라이머에 하나의 미스센스(missense) 서열을 유도하여 FokI 제한효소를 이용하였다. FokI 제한효소를 처리하였을 때 숙과색이 빨간색인 고추는 PCR amplicon이 180 bp와 36bp로 절단되고, 갈색 고추는 절단되지 않아 206bp에 위치하게 된다.

상기 dCAPS 마커 갈색을 띄는 고추인 PBC891를 구별하지 못하므로, PBC891의 3번째 엑손 141 bp의 SNP를 목표로 하는 기존에 알려지지 않은 새롭게 제작한 CAPS 마커(서열번호 1 및 서열번호 2)를 MseI 제한효소를 처리하였을 때 숙과색이 빨간색인 고추는 PCR amplicon이 절단되지 않아 326 bp, PBC891은 256 bp와 56 bp로 절단되게 된다(표 2 및 도 3).

또한, AC2212를 구별할 수 있는 dCAPS 마커를 이용하여 TF68xAC2212 F2 집단에 적용한 결과 F2 집단 204개체 중 homozygous 빨간색 58개체, homozygous 갈색 57개체, heterozygous 89개체를 확인할 수 있었다. 이를 표현형과 비교해 본 결과 마커와 일치함을 알 수 있었다(도 4). 이로써 고추 숙과에서 갈색의 표현형은 CaSGR 단일 유전자에 의해 발생하는 것으로 판단할 수 있으며, 서열번호 1 및 2의 프라이머와 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하면 갈색 고추의 판별이 가능한 것을 확인하였다.

<2-4> VIGS system을 이용한 CaSGR 유전자 기능 확인

CaSGR 유전자의 기능을 확인하기 위해 안토시아닌 합성에 관여하는 유전자인 An2를 reporter gene으로 한 CaSGR::An2 construct를 만들어 식물체 전반에 자색을 나타내는 고추에 An2의 silencing과 CaSGR::An2의 co-silencing을 유도하였다. 이들의 silencing 결과 미숙과에서 짙은 자색을 나타내는 대조구와는 달리 An2의 silencing을 유도한 개체는 안토시아닌 합성이 저해되어 초록색의 표현형을 나타내는 것을 확인할 수 있었다 (도 6A). 이들 잎을 채취하여 RNA를 추출하고, 합성한 cDNA를 이용하여 qRT-PCR로 CaSGR의 발현량을 측정하였다. 그 결과 AN2만을 silencing한 개체와 CaSGR과 AN2를 co-silencing한 개채의 발현량을 비교하였을 때 co-silencing한 개체에서 CaSGR의 발현량이 현저하게 낮아진 것을 확인할 수 있었다 (도 6B). 이 결과로 VIGS 방법이 유전자의 기능을 규명하는 데 유용한 방법임을 확인할 수 있었다.

또한, 상기에서와 마찬가지로 임의로 에틸렌을 처리해본 결과 CaSGR::An2의 co-silencing을 유도한 개체는 잎에서 처리 5일 후에도 여전히 클로로필이 분해되지 않아 녹색을 나타내었다. 반면에 AN2만을 silencing을 유도한 개체는 처리 후 시간이 지남에 따라 클로로필이 급격하게 분해되어 잎이 노란색으로 변한 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 따라서 CaSGR 유전자가 고추의 잎에서 클로로필의 분해를 조절하는 데 관여한다는 것을 재확인할 수 있었다.

<2-5> HPLC를 이용한 클로로필 추출

고추 숙과에서 갈색의 표현형이 나타나게 되는 원인이 클로로필의 잔존 때문인지 확인하기 위해 숙과에서 클로로필의 함량을 측정하였다. 숙과 (Breaker+10 stage)의 태좌를 제외한 과피에서 클로로필을 추출하여 HPLC를 이용하여 측정하였다. 그 결과 빨간색 고추인 TF68의 경우에는 과실이 성숙하는 동안에 클로로필이 모두 분해되어 잔류하는 클로로필이 검출되지 않았다. 반면에 갈색 고추의 경우에는 과실이 성숙하는 동안에도 클로로필이 분해되지 못하고 많은 양이 잔류하는 것을 확인할 수 있었다 (표 4).

결과적으로, 클로로필이 잔류와 카로티노이드의 축적으로 인해 갈색의 표현형을 나타나는 것을 확인하였다.

함량 (μg g-1 FW)	클로로필 b	클로로필 a
AC2212	19791.23 ±1398.17**	26477.59 ± 2334.66**
Sweet Chocolate	845.40 ± 23.34**	676.91 ±40.45**
P45482	7845.16 ± 509.96**	11074.22 ± 833.45**
PBC891	4589.44 ± 178.88**	5653.91 ± 399.60**
TF68	n.d.	n.d.

<2-6> 고추 과실의 저장성 결과

고추 과실이 성숙하는 동안의 저장성을 확인하기 위하여, 수확한 과실은 챔버 (24±1℃, 55~60 % relative humidity and 16/8 h light/dark) 환경에서 15일 동안 저장하고 3일에 한번씩 무게를 측정하였다.

그 결과, 갈색 고추 (PBC891, P45482)의 경우 15일째 무게 손실률이 약 40 % 였지만, 빨강 고추 (CM334, C01692 and TF68)의 경우 15일째 무게 손실률이 작게는 70%에서 크게는 80%까지 갈색 고추에 비해 큰 손실률을 보이는 것을 확인하였다(도 5).

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for discrimination of brown pepper and use thereof <130> PN1710-380 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR CAPS marker forward primer <400> 1 gaatggaaga aagttaaagg gaag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR CAPS marker reverse primer <400> 2 agcttgttgc aactctggat aatt 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR dCAPS marker forward primer <400> 3 tcaaagggat gaagtggttg cagga 25 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR dCAPS marker reverse primer <400> 4 aggaacacgg ccgaacgata t 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR forward primer <400> 5 agtacacgta cttaatgcca atc 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaSGR reverse primer <400> 6 cgaaagggta agaatataca cac 23 <210> 7 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atgtacattg ccacattagt ggaggccatt ttatgttaga cttatttgct 420 agactcagat actatatctt ctgcaaagaa ctccctgtgg ttctgaaggc ttttgttcat 480 ggagatgaga atttactaaa gaattatcca gagttgcaac aagctttagt ttgggtatat 540 tttcactcaa acattcaaga attcaacaaa gtagaatgtt ggggcccact caaagatgca 600 gcctccccct catcaagtgg ggtaggtggg ggtatgaata caagttttac aagcaatagc 660 aacatcaagt ggaatttacc aaagccttgt gaagagactt gtacatgttg ctttccccca 720 atgagtgtta tcccttggcc ttctactact aatgtggaaa atgggaccat acaacaaggc 780 ttgcaagagc agcaaagctg a 801 <210> 12 <211> 802 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 12 atggggactt tgactgcttc tctagtagct ccatctaagc tcaaccctga aaagcatagc 60 tctctttttg tatacaaaac tagaagaaag tcccacaaga atcaatccat agtccctgtg 120 gcaaggctat ttggaccagc tatatttgaa gcatcaaagt tgaaggtact tttcttggga 180 gttgatgaga aaaagcaccc aggaaagttg ccaagaacat atacactgac tcatagtgat 240 attacttcta aactcacttt ggcaatctct caaaccatca ataactctca gttgcaaggt 300 tggtataata gacttcaaag ggatgaagtg gttgcagaat ggaagaaagt taaagggaag 360 atgtcactcc atgtacattg ccacattagt ggaggccatt ttatgttaag acttatttgc 420 tagactcaga tactatatct tctgcaaaga actccctgtg gttctgaagg cttttgttca 480 tggagatgag aatttactaa agaattatcc agagttgcaa caagctttag tttgggtata 540 ttttcactca aacattcaag aattcaacaa agtagaatgt tggggcccac tcaaagatgc 600 agcctccccc tcatcaagtg gggtaggtgg gggtatgaat acaagtttta caagcaatag 660 caacatcaag tggaatttac caaagccttg tgaagagact tgtacatgtt gctttccccc 720 aatgagtgtt atcccttggc cttctactac taatgtggaa aatgggacca tacaacaagg 780 cttgcaagag cagcaaagct ga 802 <210> 13 <211> 266 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 13 Met Gly Thr Leu Thr Ala Ser Leu Val Ala Pro Ser Lys Leu Asn Pro 1 5 10 15 Glu Lys His Ser Ser Leu Phe Val Tyr Lys Thr Arg Arg Lys Ser His 20 25 30 Lys Asn Gln Ser Ile Val Pro Val Ala Arg Leu Phe Gly Pro Ala Ile 35 40 45 Phe Glu Ala Ser Lys Leu Lys Val Leu Phe Leu Gly Val Asp Glu Lys 50 55 60 Lys His Pro Gly Lys Leu Pro Arg Thr Tyr Thr Leu Thr His Ser Asp 65 70 75 80 Ile Thr Ser Lys Leu Thr Leu Ala Ile Ser Gln Thr Ile Asn Asn Ser 85 90 95 Gln Leu Gln Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Gln Arg Asp Glu Val Val Ala 100 105 110 Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Lys Met Ser Leu His Val His Cys His 115 120 125 Ile Ser Gly Gly His Phe Met Leu Asp Leu Phe Ala Arg Leu Arg Tyr 130 135 140 Tyr Ile Phe Cys Lys Glu Leu Pro Val Val Leu Lys Ala Phe Val His 145 150 155 160 Gly Asp Glu Asn Leu Leu Lys Asn Tyr Pro Glu Leu Gln Gln Ala Leu 165 170 175 Val Trp Val Tyr Phe His Ser Asn Ile Gln Glu Phe Asn Lys Val Glu 180 185 190 Cys Trp Gly Pro Leu Lys Asp Ala Ala Ser Pro Ser Ser Ser Gly Val 195 200 205 Gly Gly Gly Met Asn Thr Ser Phe Thr Ser Asn Ser Asn Ile Lys Trp 210 215 220 Asn Leu Pro Lys Pro Cys Glu Glu Thr Cys Thr Cys Cys Phe Pro Pro 225 230 235 240 Met Ser Val Ile Pro Trp Pro Ser Thr Thr Asn Val Glu Asn Gly Thr 245 250 255 Ile Gln Gln Gly Leu Gln Glu Gln Gln Ser 260 265 <210> 14 <211> 140 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 14 Met Gly Thr Leu Thr Ala Ser Leu Val Ala Pro Ser Lys Leu Asn Pro 1 5 10 15 Glu Lys His Ser Ser Leu Phe Val Tyr Lys Thr Arg Arg Lys Ser His 20 25 30 Lys Asn Gln Ser Ile Val Pro Val Ala Arg Leu Phe Gly Pro Ala Ile 35 40 45 Phe Glu Ala Ser Lys Leu Lys Val Leu Phe Leu Gly Val Asp Glu Lys 50 55 60 Lys His Pro Gly Lys Leu Pro Arg Thr Tyr Thr Leu Thr His Ser Asp 65 70 75 80 Ile Thr Ser Lys Leu Thr Leu Ala Ile Ser Gln Thr Ile Asn Asn Ser 85 90 95 Gln Leu Gln Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Gln Arg Asp Glu Val Val Ala 100 105 110 Glu Trp Lys Lys Val Lys Gly Lys Met Ser Leu His Val His Cys His 115 120 125 Ile Ser Gly Gly His Phe Met Leu Arg Leu Ile Cys 130 135 140

Claims (5)

1. 서열번호 12로 표시되는 CaSGR(Capsicum annuum STAY -GREEN) 유전자의 409bp 위치의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 갈색 고추 PBC891 판별용 조성물.
2. 제 1항의 프라이머 세트, 제한효소 및 증폭반응수행시약을 포함하는 갈색 고추 PBC891 판별용 키트.
3. 제 2항에 있어서, 상기 증폭반응수행시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 갈색고추 PBC891 판별용 키트.
4. 고추 시료로부터 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
   상기 증폭 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및
   상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물 크기를 확인하는 단계를 포함하는 갈색 고추 PBC89를 판별하는 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 제한효소는 MseI인 것인 갈색 고추 PBC89를 판별하는 방법.

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