KR101975256B1 - 신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물에 관한 것으로, 당전이 효소를 사용하여 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose) 및 데옥시-글루코오스(deoxy-glucose)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 당을 아버멕틴 B1a에 추가하는 단계를 포함하여 제조된 아버멕틴 배당체는 종래의 아버멕틴에 비해 증진된 소나무재선충에 대한 살충효과가 있으므로, 소나무재선충 방제 관련 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물{Composition for controlling pine wood nematode containing novel avermectin glycoside as effective component}
본 발명은 신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물에 관한 것이다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 소나무재선충병을 일으켜 소나무와 잣나무에 심각한 피해를 입히고 있다. '소나무에이즈'라고도 불리는 이 식물병은 한번 감염되면 치료가 되지 않고 거의 모든 소나무를 고사시킨다. 우리나라의 경우, 남부지방에서는 주로 소나무가 피해를 입고 있고, 중부지방에서는 잣나무가 주로 피해를 입고 있다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 분류학상으로 후생동물아계(Metazoa), 진정후생동물(Eumetazoa), 좌우대칭동물(Bilateria), 의체강동물(Pseudocoelomata), 선충문(Nematoda, Nemata)에 속하는 동물로서 실모양을 하고 있다. 길이는 1㎜도 안되지만, 번식력이 높아 한 쌍이 20일 만에 20만 마리로 늘어날 정도이다. 소나무재선충은 스스로 나무에 침입하거나 나무 사이를 이동할 수 없고, 반드시 매개충을 통해야만 가능하다. 매개충인 솔수염하늘소(Monochamus alternatus) 또는 북방솔수염하늘소(M. saltuarius)는 주로 병든 소나무나 잣나무를 선택해 알을 낳는데, 재선충에 감염된 나무에 낳은 매개충의 알이 봄에 번데기로 될 때 재선충이 주위에 모이게 되고, 매개충이 5월 중순 ~ 7월 하순 동안 우화(羽化)할 때 몸에 붙어 있는 재선충도 함께 이동한다. 목질부를 탈출한 매개충은 건강한 나무의 새로 자란 가지(1~2년생 가지)를 주로 갉아먹으며, 이때 생긴 상처를 통하여 소나무재선충을 감염시킨다. 병든 소나무의 경우, 잎 전체가 갈색으로 변하면서 보통 1년 안에 말라죽고 만다.
1905년 일본에서 처음으로 발병한 소나무재선충병의 원인은 오랜 세월 규명되지 않다가 1970년에 이르러 비로소 원인이 밝혀졌다. 일본은 이 병에 의해 역사적 가치가 높은 조경수를 제외하고는 대부분의 소나무 자생림이 사라졌다. 우리나라의 경우에는 1988년 부산 금정산에서 처음으로 발생하였는데, 초기에는 항공 살포에 의한 매개충 박멸, 감염목의 조기 발견 및 제거, 감염목 주변나무들의 적극적인 수간 주입 등으로 부산 일대에서만 발병할 뿐 잠잠했다. 하지만, 살충제의 항공 살포에 의한 꿀벌 등의 유익충에 대한 피해, 환경오염 등의 이유로 인한 환경단체 중심의 항의 시위 및 국민들의 피해목 이동 등으로 효과적인 방제가 진행되지 못하였고, 결국에는 전국에 걸쳐서 소나무재선충병이 발병하게 되었다.
소나무재선충은 소나무속(Pinus) 뿐만 아니라, 전나무속(Abies), 가문비나무속(Picea), 잎갈나무속(Larix)의 일부 수종 등도 가해하는 것으로 알려져 있다. 경상도, 전라도 및 강릉 지역은 주로 소나무에서 발병되는 반면, 강원도 서부 지역과 경기도에서는 주로 잣나무에서 발병이 되었다. 남부지방과 중부지방의 수목 피해종의 이러한 차이는 소나무재선충을 매개하는 매개충의 차이에 의한 것으로 알려져 있다. 남부지방의 경우, 솔수염하늘소의 밀도가 높고, 중부지방의 경우 북방솔수염하늘소의 밀도가 높은데, 이들 매개충이 선호하는 식물체가 서로 다르기 때문인 것으로 추정되고 있다.
이 식물병을 방제하기 위한 방법으로는, 1) 건전한 나무에 살선충약제의 예방적인 수간 주입, 2) 매개충 방제를 위한 합성 살충제 또는 길항 미생물의 항공 살포, 3) 감염목으로부터 재선충과 매개충을 방제하기 위한 감염목의 파쇄, 연소 및 훈증 등의 방법이 있다. 이 중, 감염목의 파쇄, 연소 및 훈증 방법은 사후적 방제방법으로서, 이미 재선충에 감염된 수목을 처리하는 방법일 뿐 소나무재선충병을 예방하거나, 감염된 소나무를 치료하고 소생시키는 방법이 아니라는데 근원적 문제가 있다. 직접적으로 소나무재선충을 타겟으로 하는 방제법은 살아있는 소나무에 예방약을 수관주입하는 방법밖에 없다. 수관 주사의 경우, 국내에서는 아바멕틴을 많이 사용하고 있다. 아바멕틴(abamectin)은 방선균인 Streptomyces avermitilis에 의해 생산되는 항기생충성 항생물질인 아버멕틴(avermectin)의 혼합물로, 약 80%의 아버멕틴 B1a 및 약 20%의 아버멕틴 B1b로 이루어져있으며, 무척추동물에만 존재하는 특이한 형태의 glutamate-gated chloride channel을 표적으로 하여 염소 이온에 대한 세포질막의 투과도를 높임으로써 살충 효과를 나타낸다. 그러나 아바멕틴은 난용성으로 재선충 방제효율이 낮은 편이다. 현재 사용되고 있는 천연물 유래 신약은 배당체 형태로 존재하는 경우가 많은데, 당은 약제의 수용성 상승과 효능증진 등에 좋은 효과를 나타내는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 수용성을 증진시키고, 소나무재선충 살충에 효과적인 아바멕틴의 개발이 필요하다.
한편, 국내등록특허 제1414724호에는 당전이 효소를 이용한 안사마이신 배당체의 제조방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2007-0065931호에는 정향으로부터 분리, 정제한 유제놀을 함유하는 소나무재선충 방제약제 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 신규 아버멕틴 B1a 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물을 제공하고, 상기 유효성분의 소나무재선충 살충효과가 종래의 아버멕틴에 비해 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아버멕틴 B1a(avermectin B1a) 배당체 또는 농약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 소나무재선충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 당전이 효소(glycosyltransferase)를 사용하여 아버멕틴 B1a에 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose) 및 데옥시-글루코오스(deoxy-glucose)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 당을 추가하는 단계를 포함하는 소나무재선충 방제효과가 증진된 아버멕틴 배당체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 신규 아버멕틴 배당체를 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물에 관한 것으로, 당전이 효소를 사용하여 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose) 및 데옥시-글루코오스(deoxy-glucose)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 당을 추가하는 단계를 포함하는 아버멕틴 배당체 제조의 최적조건을 확립하였고, 상기 제조방법으로 생성된 아버멕틴 B1a 배당체의 소나무재선충 살충효과는 종래의 아버멕틴에 비해 우수하여 소나무재선충 방제 관련 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 소나무재선충에 대한 아버멕틴과 아버멕틴 배당체의 살충 효과를 확인한 결과이다. AVM은 아버멕틴 B1a이고, A-bGlucose는 아버멕틴 B1a 글루코시드이고, A-bGalactose는 아버멕틴 B1a 갈락토시드이고, A-fucose는 아버멕틴 B1a 푸코시드이며, A-deoxy Glucose는 아버멕틴 B1a 데옥시-글루코시드이다.
본 발명은 아버멕틴 B1a(avermectin B1a) 배당체 또는 농약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 농약학적으로 허용가능한 염은 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염을 포함하는 것으로, 예를 들면 금속염은 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염, 알루미늄염 등이 포함될 수 있고, 유기 염기와의 염은 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 포함될 수 있고, 무기산과의 염은 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 포함될 수 있고, 유기산과의 염은 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 포함될 수 있고, 염기성 아미노산과의 염은 알기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 포함될 수 있고, 산성 아미노산과의 염은 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 아버멕틴 B1a 배당체는 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되어지는 하나 이상의 화합물이다.
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Figure 112017109598217-pat00003
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본 발명의 일 구현 예에 따른 소나무재선충 방제용 조성물은 농약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 부형제는 농업 분야에서 통상적으로 사용되고 있는 것으로, 예를 들면, 규조토, 소석회 등의 산화물, 인회석 등의 인산염, 석고 등의 황산염, 클레이, 카올린, 벤토나이트, 산성백토, 석영, 실리카 등의 광물질 분말 등의 고체 담체와 충진제, 항응집제, 계면활성제, 유화제, 방부제 등을 추가하여 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식물에 처리하여 활성성분이 신속방출, 서방출, 지연된 방출을 할 수 있도록 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 제형화할 수 있다. 제형화를 위해서는 통상적으로 사용하는 계면활성제, 희석제, 분산제, 보조제 등의 첨가제를 활성성분과 배합하여 수화제, 현탁제, 유제, 유탁제, 미탁제, 액제, 분산성 액제, 입상수화제, 입제, 분제, 액상수화제, 수면부상성입제, 정제 등 각종 형태로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 소나무재선충 방제용 조성물은 예를 들어 직접 분사 가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 소나무재선충 방제용 조성물은 분사, 분무, 살포, 흩뿌림 또는 붓기에 의해 사용될 수 있다. 사용 형태는 의도한 목적에 의존하는데, 모든 경우에 본 발명에 따른 조성물의 분포가 가능한 한 미세하고 균일하도록 해야 한다.
본 발명의 소나무재선충 방제용 조성물은 다양한 형태로 제제화할 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 용매 및/또는 담체를 첨가함으로서 제조될 수 있다. 종종, 비활성 첨가제 및 표면-활성 물질, 예를 들어 유화제 또는 분산제를 제제에 혼합한다. 적합한 표면-활성 물질은 방향족 술폰산(예를 들어 리그노술폰산, 페놀-술폰산, 나프탈렌- 및 디부틸나프탈렌술폰산), 지방산, 알킬- 및 알킬아릴설포네이트, 알킬 라우릴 에테르, 지방 알코올 설페이트의 알칼리 금속, 알카라인 토금속, 암모늄염, 설페이트화 헥사-, 헵타- 및 옥타데칸올, 지방 알코올 글리콜 에테르의 염, 설포네이트 나프탈렌 및 이의 유도체, 포름알데히드의 축합물, 나프탈렌 또는 나프탈렌술폰산, 페놀 및 포름알데히드의 축합물, 폴리옥시에틸렌옥틸 페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸-, 옥틸- 또는 노닐페놀, 알킬페닐 또는 트리부틸페닐 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알코올, 이소트리데실 알코올, 지방 알코올/에틸렌옥사이드 축합물, 에톡실화 피마자유, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 또는 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알코올 폴리글리콜 에테르 아세테이트, 소르비톨 에스테르, 리그닌-술파이트 폐액 또는 메틸셀룰로오스일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 소나무재선충 방제용 조성물은 식물체 흡수 및 효과를 증진시키기 위하여 확산제 및 침투제, 또는 계면활성제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 아버멕틴 B1a(avermectin B1a) 배당체 또는 농약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 소나무재선충을 방제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속일 수 있고, 바람직하게는 소나무속일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 아버멕틴 B1a(avermectin B1a) 배당체를 함유하는 조성물의 처리는 수간주입 처리, 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리일 수 있고, 바람직하게는 수간주입 처리일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 당전이 효소(glycosyltransferase)를 사용하여 아버멕틴 B1a에 글루코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose) 및 데옥시-글루코오스(deoxy-glucose)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 당을 추가하는 단계를 포함하는 소나무재선충 방제효과가 증진된 아버멕틴 배당체의 제조방법에 관한 것이다.
상기 당전이 효소는 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis) 균주 유래 당전이 효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 바실러스 리체니포르미스( B. licheniformis ) 유래 당전이 효소의 발현 및 정제
아버멕틴을 당화시키기 위해 바실러스 리체니포르미스 균주 유래의 당전이 효소를 사용하였다. 바실러스 리체니포르미스 균주의 당전이 효소 유전자(BLC)가 클로닝된 대장균 E.coli BL21로부터 일반적인 대장균 유전자 발현 방법으로 당전이 효소를 발현하였다. 상기 당전이 효소인 BLC 효소는 수용성 형태로 발현이 되었으며, His-tag 친화 컬럼 크로마토그래피(His-tag affinity column chromatography)를 이용하여 50mM 및 100mM 이미다졸(imidazole)에 용리하여 정제하였다.
실시예 2. 아버멕틴 배당체의 생성 및 구조 분석
상기 발현 및 정제한 당전이 효소를 이용하여 아버멕틴 배당체를 생성하였다.
(1) 아버멕틴 글루코시드(glucoside)의 생성
실시예 1에서 정제한 당전이 효소 및 UDP-글루코오스를 이용하여 아버멕틴 B1a를 당화 시켰다. 구체적으로 500mM Tris(pH8.0), 1mM MgCl2, 2mM UCP-글루코오스, 1mM 아버멕틴 B1a 및 0.2㎎/㎖ BLC를 포함하는 반응액을 이용하여, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 아버멕틴 B1a의 HPLC-UV 스펙트럼과 비교를 통해 당화반응 후 새로운 피크(peak)가 생성된 것을 확인하였고, 상기 피크의 질량분석(MS) 결과, 1033.8(M-H)-의 m/z값이 측정되었으며, HR-ESI MS 분석으로부터 1033.5327(M-H)-의 m/z값을 획득함으로써 C54H82O19의 아버멕틴 배당체가 형성된 것을 확인하였다.
아버멕틴 배당체의 구조를 분석하기 위해 CDCl3를 용매로 하여 1H 및 13C-NMR을 측정하였으며, 측정결과는 하기 표 1에 나타내었다. 1H-NMR 스펙트럼(800㎒) 분석 결과, 아버멕틴과 비교하여 chemical shift가 4.41ppm이고, coupling constant가 7.6㎐인 피크(peak)로부터 β-configuration으로 당이 결합하고 있는 것으로 판단하였다. 또한, 13C-NMR 스펙트럼(200㎒) 분석 결과, 글루코오스에 해당하는 신호들이 관측되었고, 특히, 105.1ppm에서의 아노머 탄소(anomeric carbon) 피크로부터 분리 정제된 아버멕틴에 당이 결합하고 있는 것으로 판단하였다.
2D-NMR(1H-1H COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY)을 이용하여 아버멕틴 글루코시드의 글루코오스 결합위치를 확인한 결과, HMBC 스펙트럼에서 아버멕틴 배당체에 함유된 글루코오스의 아노머 양성자(anomeric proton)가 아버멕틴 2번째 당의 4번째 탄소에 long-range coupling하였고, 아버멕틴의 2번째 당의 4번째 양성자가 아버멕틴 글루코시드의 글루코오스의 아노머 탄소와 long-range coupling하여 글루코오스의 C-1이 2번째 당의 C-4에 O-glucosylation하고 있음을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여, 아버멕틴 글루코시드는 분자식 C54H82O19의 아버멕틴 B1a 4"-β-D-글루코시드(화학식 1)로 규명하였다.
Figure 112017109598217-pat00005
(2) 아버멕틴 갈락토시드(galactoside)의 생성
상기 아버멕틴 글루코시드와 동일한 방법으로 UDP-갈락토오스를 이용하여 당화반응시킨 후, 아버멕틴 B1a의 HPLC-UV 스펙트럼과 비교를 통해 당화반응 후 새로운 피크(peak)가 생성된 것을 확인하였고, 상기 피크의 질량분석(MS) 결과, 1033.9(M-H)-의 m/z값이 측정되었으며, HR-ESI MS 분석으로부터 1033.5465(M-H)-의 m/z값을 획득함으로써 C54H82O19의 아버멕틴 배당체가 형성된 것을 확인하였다.
아버멕틴 배당체의 구조를 분석하기 위해 CDCl3+CD3OD를 용매로 하여 1H 및 13C-NMR을 측정하였으며, 측정결과는 상기 표 1에 나타내었다. 1H-NMR 스펙트럼(800㎒) 분석 결과, 아버멕틴과 비교하여 chemical shift가 4.42ppm이고, coupling constant가 7.6㎐인 피크(peak)로부터 β-configuration으로 당이 결합하고 있는 것으로 판단하였다. 또한, 13C-NMR 스펙트럼(200㎒) 분석 결과, 글루코오스에 해당하는 신호들이 관측되었고, 특히, 105.1ppm에서의 아노머 탄소(anomeric carbon) 피크로부터 분리 정제된 아버멕틴에 당이 결합하고 있는 것으로 판단하였다.
2D-NMR(1H-1H COSY, HMQC, HMBC 및 NOESY)을 이용하여 아버멕틴 갈락토시드의 갈락토오스 결합위치를 확인한 결과, HMBC 스펙트럼에서 아버멕틴 배당체에 함유된 갈락토오스의 아노머 양성자(anomeric proton)가 아버멕틴 2번째 당의 4번째 탄소에 long-range coupling하였고, 아버멕틴의 2번째 당의 4번째 양성자가 아버멕틴 갈락토시드의 갈락토오스의 아노머 탄소와 long-range coupling하여 갈락토오스의 C-1이 2번째 당의 C-4에 O-glucosylation하고 있음을 확인하였다.
상기 결과를 종합하여, 아버멕틴 갈락토시드는 분자식 C54H82O19의 아버멕틴 B1a 4"-β-D-갈락토시드(화학식 2)로 규명하였다.
(3) 아버멕틴 푸코시드(fucoside)의 생성
상기 아버멕틴 글루코시드와 동일한 방법으로 GDP-L-푸코오스를 이용하여 당화반응시킨 후, 아버멕틴 B1a의 HPLC-UV 스펙트럼과 비교를 통해 당화반응 후 새로운 피크(peak)가 생성된 것을 확인하였고, 상기 피크의 질량분석(MS) 결과, 1017.8(M-H)-의 m/z값이 측정되었으며, HR-ESI MS 분석으로부터 1017.5393(M-H)-의 m/z값을 획득함으로써 C54H82O18의 아버멕틴 배당체가 형성된 것을 확인하였으며, 아버멕틴 B1a 4"-β-L-푸코시드(화학식 3)로 규명하였다.
(4) 아버멕틴 데옥시-글루코시드(deoxy-glucoside)의 생성
상기 아버멕틴 글루코시드와 동일한 방법으로 TDP-2-데옥시-글루코오스를 이용하여 당화반응시킨 후, 아버멕틴 B1a의 HPLC-UV 스펙트럼과 비교를 통해 당화반응 후 새로운 피크(peak)가 생성된 것을 확인하였고, 상기 피크의 질량분석(MS) 결과, 1017.8(M-H)-의 m/ z값이 측정되었으며, HR-ESI MS 분석으로부터 1017.5422(M-H)-의 m/z값을 획득함으로써 C54H82O18의 아버멕틴 배당체가 형성된 것을 확인하였으며, 아버멕틴 B1a 4"-β-2-데옥시-D-글루코시드(화학식 4)로 규명하였다.
실시예 3. 아버멕틴 배당체의 정제
(1) 아버멕틴 글루코시드(glucoside)
효소 반응을 실시하여 배당체를 형성한 후 동량의 에틸아세테이트를 이용하여 총 2회 반복 추출함으로써 에틸아세테이트 추출물을 얻었다. 에틸아세테이트 추출물은 MPLC(실리카겔 4g flash column, flow rate: 5.0㎖/min)에서 메틸클로라이드(CH3Cl):메탄올(MeOH)이 100:0, 99:1, 98:2, 95:5, 90:10, 80:20, 50:50, 30:70의 부피비로 혼합된 용매를 이용하여 단계적으로 용출하였으며, 용출 분획중 메틸클로라이드(CH3Cl):메탄올(MeOH)이 90:10의 부피비로 혼합된 층에서 아버멕틴 배당체를 1차 분리하였다. 1차 분리된 아버멕틴 배당체는 65%(v/v) 아세토나이트릴을 용매로한 RP-TLC를 이용하여 R f 값 0.5에서 2차 분리하였다. 2차 분리된 아버멕틴 배당체를 Prep-HPLC(J'sphere ODS-H80, flow rate:2.0㎖/min)에서 40~100%(v/v) 아세토나이트릴 용매를 이용하여 구배(gradient) 용출하여 머무름 시간 7.853분에서 아버멕틴 배당체를 최종분리하였다.
(2) 아버멕틴 갈락토시드(galactoside)
효소 반응을 실시하여 배당체를 형성한 후 에틸아세테이트를 이용하여 2번 반복추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻었다. 에틸아세테이트 추출물을 메틸클로라이드(CH3Cl):메탄올(MeOH)을 10:1의 부피비로 혼합한 용매로 실리카겔을 이용한 TLC를 실시하여 R f 값이 0.23에서 아버멕틴 갈락토시드를 얻었다.
(3) 아버멕틴 푸코시드(fucoside)
효소 반응을 실시하여 배당체를 형성한 후 에틸아세테이트를 이용하여 2번 반복추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻었다. 에틸아세테이트 추출물을 메틸클로라이드(CH3Cl):메탄올(MeOH)을 10:1의 부피비로 혼합한 용매로 실리카겔을 이용한 TLC를 실시하여 R f 값이 0.25에서 아버멕틴 푸코시드를 얻었다.
(4) 아버멕틴 데옥시-글루코시드(deoxy-glucoside)
효소 반응을 실시하여 배당체를 형성한 후 에틸아세테이트를 이용하여 2번 반복추출하여 에틸아세테이트 추출물을 얻었다. 에틸아세테이트 추출물을 메틸클로라이드(CH3Cl):메탄올(MeOH)을 10:1의 부피비로 혼합한 용매로 실리카겔을 이용한 TLC를 실시하여 R f 값이 0.4에서 아버멕틴 데옥시-글루코시드를 얻었다.
실시예 4. 아버멕틴 배당체의 소나무재선충에 대한 살충효과 확인
96 웰 플레이트를 사용하여 한 웰 당 25~30마리의 재선충이 포함된 용액 98㎕씩을 분주하였다. 그 후, 실시예 3에서 정제한 아버멕틴 배당체 또는 아버멕틴 B1a를 다양한 농도로 희석하여 한 웰 당 2㎕씩 처리하여 최종농도가 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 100μM이 되도록 하였으며, 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 현미경 관찰을 통해 사멸한 재선충의 수를 계산하였으며, 모든 실험은 세 번씩 반복하여 진행하였다. 재선충 사멸율(%)은 하기 식 1을 통해 계산하였으며, 나선모양 또는 곡선이나 일자모양이지만 움직임이 조금이라도 있는 경우 살아있는 재선충으로 계수하였고, 곡선이나 일자모양이며 움직임이 전혀 없는 경우는 사멸한 재선충으로 계수하였다.
[식 1]
재선충 사멸율(%)=(사멸한 재선충 수/전체 재선충 수)×100
그 결과, 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이 아버멕틴 B1a에 비해 아버멕틴 배당체에서 소나무재선충에 대한 살충 효과가 증진되었으며, 특히 아버멕틴 글루코시드의 살선충효과가 가장 우수한 것을 확인하였다.
시료 IC50(μM)
아버멕틴 7.30±2.35
아버멕틴 글루코시드 0.23±0.02
아버멕틴 갈락토시드 1.07±0.13
아버멕틴 푸코시드 0.89±0.04
아버멕틴 데옥시-글루코시드 0.69±0.23

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아버멕틴 B1a(avermectin B1a) 배당체 또는 농약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충 방제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112019007558100-pat00006

    [화학식 2]
    Figure 112019007558100-pat00007

    [화학식 3]
    Figure 112019007558100-pat00008

    [화학식 4]
    Figure 112019007558100-pat00009
  2. 삭제
  3. 제1항의 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 소나무재선충을 방제하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물은 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속인 것을 특징으로 하는 소나무재선충을 방제하는 방법.
  5. 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis) 균주 유래 당전이 효소(glycosyltransferase)를 사용하여 아버멕틴 B1a에 글루 코오스(glucose), 갈락토오스(galactose), 푸코오스(fucose) 및 데옥시-글루코오스(deoxy-glucose)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 당을 추가하는 단계를 포함하는 소나무재선충 방제효과가 증진된 하기 화학식 1 내지 4로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아버멕틴 배당체의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112019007558100-pat00011

    [화학식 2]
    Figure 112019007558100-pat00012

    [화학식 3]
    Figure 112019007558100-pat00013

    [화학식 4]
    Figure 112019007558100-pat00014
  6. 삭제
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