KR101974914B1

KR101974914B1 - 저선량 방사선 특이적 반응인자 Ikaros를 이용한 하위조절 유전자 탐색 및 그 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR101974914B1
Application number: KR1020160142387A
Authority: KR
Inventors: 남선영; 주해미
Original assignee: 한국수력원자력 주식회사
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2019-05-07
Also published as: KR20180046986A

Abstract

본 발명은 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 Ikaros 전사인자의 타겟 유전자를 검색하는 방법 및 상기 검색된 유전자들을 이용하여 저선량 방사선 노출 여부를 평가하는 도구에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 야생형과 돌연변이 Ikaros 유전자 두 종류를 이용하여, 저선량 방사선에 특이적인 반응인자를 검색하는 연구 수단을 제공할 수 있고, 또한 저선량 방사선에 특이적으로 반응하는 구체적 타겟 인자로서 검색된 DDIT4, HLX, PKMYT1 RUNX3, DYRK1B 유전자들을 이용하여 저선량 방사선 피폭에 대한 검출방법을 제공하여, 사람 또는 동물의 저선량 방사선의 노출 여부 및 생체 영향 연구 중 개체 내 면역방어 조절에 대한 새로운 기전 및 기능을 확인할 수 있는 생체 검출 지표로 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

저선량 방사선 특이적 반응인자 Ikaros를 이용한 하위조절 유전자 탐색 및 그 스크리닝 방법{Exploration of the Ikaros target genes as low-dose radiation specific markers and its screening method}

본 발명은 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표로서 Ikaros 전사인자의 타겟 유전자를 검색하는 방법 및 상기 검색된 유전자들을 이용하여 저선량 방사선 노출 여부를 평가하는 도구에 관한 것이다.

에너지 부족 국가이며 다수의 원전을 운영하고 있는 우리나라에서는 후쿠시마 원전 사고, 원전주변 갑상선암 소송 등의 사건 때문에, 최근 저선량 방사선의 인체 영향에 대해 사회적으로 이슈가 되고 있어서, 저선량 방사선에 대한 대국민 불안감이, 원전사업을 운영함에 있어서, 큰 걸림돌이 되고 있다.

따라서 저선량 방사선의 인체 영향에 대한 과학적 근거를 마련할 필요가 있고, 이를 위해서는 저선량 방사선 특이적 생체 유전자 지표를 발굴하고 이에 대한 생체 영향 기전을 규명하는 것이 필수적이며 급히 필요한 과제이다.

그동안의 국제 논문에 의하면, 100mSv 이하의 저선량 방사선에 대해 "인체에 유해하다"는 논리와 "오히려 유익할 수 있다" 및 "아무런 영향이 없을 수 있다" 등 다양한 주장이 존재하며, 현재까지 전 세계적으로 저선량 영역 방사선의 정확한 인체 영향 유무를 구분하기 어려운 게 현실이고 논쟁의 대상이 되고 있는 실정이다.

방사선은 조혈조직 및 장관조직에 손상을 주어 백혈구 감소증 (leukopenia)을 유발하고 장 점막으로부터 정상 세균총 (normal flora)의 침투성을 증가시키며, 따라서 특이 또는 비특이적인 면역방어 기전이 손상되어 감염성 질환에 대한 저항성이 감소되는 등 암과 같은 질병과 연관이 많은 인자로 알려져 있다. 이러한 방사선에 의한 영향은 혈액·조직 장벽 (blood tissue barrier)의 손상과 식세포 (phagocyte) 수의 감소, 그리고 섭식된 생물을 죽이는 능력과 혈청 보체수준의 감소 및 면역반응의 장해 등으로 나타난다.

2 내지 7 Gy의 방사선에 피폭되면 림프구의 수는 현저히 감소되어, 수 시간 내에 최소수로 되었다가 시간 경과에 따라 서서히 증가되지만, 방사선에 피폭된 후 3-4주가 지나야 정상수준으로 회복될 수 있다. 한편, 0.25 내지 1 Gy 정도의 저선량 방사선을 조사하면 방사선을 조사하지 않은 동물에 비하여 항체형성이 지연되며 일시적으로 매우 높은 항체역가 (antibody peak titer)가 관찰된다. 그러나 0.25 Gy 이하의 저선량 범위에서는 일어날 수 있는 기전이 명확하지 않아, 호메시스 이론과 대립되어 현재까지 논쟁의 여지로 남아 있다 [Stebbing, 1982].

실제 저선량 방사선은 개체성장을 촉진시키고, 생체의 면역기능 항진 및 수명을 연장시킨다는 보고가 있다 [Luckey T.D. et al., 1982]. 사람에서도 이러한 방사선 호메시스에 대한 연구 보고가 있어 Bloom 등 (1987)은 0.5 Gy 이하에서는 인체의 세포성 면역이 항진된다고 보고하였고, Nambi와 Soman (1987)은 연간 0.03 uSv (0.3 mrem) 에서는 암의 발생률을 감소시킨다고 보고하였다. 그러나 방사선 노출에 대한 인체 영향 연구 시, 100 mSv 이하의 저선량 방사선의 영향이 인체 영향으로 표현되기까지 오랜 시간이 소요되고 이를 검출하는 데 많은 한계가 있다. 결국, 이와 관련한 연구는 현상학적 효과를 관찰하는 수준일 뿐, 구체적인 영향 기전이 밝혀지지 않아 여전히 논란의 여지를 남겨 놓고 있다.

저선량방사선 영역의 대표적인 유익한 효과로, IAEA - CN-67/63 보고서에 따르면, 저선량방사선이 유전자 손상을 유발하나 우리 몸의 생체방어체계 (bio-system)가 자극을 받아 오히려 활성화(몸의 방어체계 활성반응 정도 약 107%)됨에 따라 최종적으로 돌연변이로 남을 확률이 20% 이상 감소할 수 있다고 알려져 있다. 그러나 이러한 보고는 이론과 간단한 관찰 정도의 연구에 그치고 있어서, 보다 정확한 기전을 규명할 필요가 있다.

본 발명자들은 그동안 알려진 저선량 방사선 영향 중 세포증식 효과와 관련하여, Ikaros 단백질이 저선량 방사선에 의한 인간의 B 림프구의 세포증식 증가효과를 조절한다는 것에 착안하였으며, 저선량 방사선에 특이적으로 반응할 수 있는 유전자를 찾기 위해, Ikaros 전사인자의 타겟유전자를 대상으로 검색하였다.

Ikaros 단백질은 100 mGy 이하의 저선량 방사선 노출에 반응하여 serine 391번과 393번에 특이적으로 인산화 됨이 보고된 바 있다(Cho et al, 2016). 또한, 인산화되지 않은 Ikaros 단백질은 타겟 유전자의 프로모터에 결합하여 유전자 발현을 억제하는 효과를 갖고 있으나 serine 391/393에 인산화가 이루어지면 그러한 DNA 결합 활성을 잃게 되고 타겟유전자의 프로모터로부터 떨어져 나오게 됨으로써, 타겟 유전자가 비로소 발현을 시작하게 됨을 밝혀진 바 있다.

본 발명에서는 야생형과 391/393의 serine 부위를 인산화가 될 수 없는 돌연변이 Ikaros 단백질 (IK-S391A/S393A)를 이용하여 저선량방사선에 특이적으로 반응하는 Ikaros 타겟 유전자를, RNA-Sequencing (RNA-Seq) 기술을 이용하여 탐색하고 Ingenuity Pathway analysis(IPA)를 이용하여 반응하는 유전자군을 조사하고 quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR)과 Western blot 분석법을 이용하여 발현 변화를 검증하였다.

결국 본 발명자들은, 저선량 방사선에 특이적으로 반응하는 Ikaros의 새로운 타겟 인자로서 DDIT4, HLX, PKMYT1 RUNX3, DYRK1B 유전자들을 발견하여 이를 이용한 저선량 방사선 검출방법을 제공함으로써 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 저선량 방사선 노출에 대한 특이 반응 지표가 될 수 있는 Ikaros 단백질 발현에 의해 특이적으로 영향받는 유전자를 발견하는 방법과 이러한 유전자를 이용하여 저선량 방사선에 노출 여부를 진단하는 수단을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 정상적인 Ikaros 유전자와, Ikaros 단백질의 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 인산화되지 못하게 만든 돌연변이체의 Ikaros 유전자를 클로닝하는 단계; (2) 상기 클로닝된 세포들을 과발현(overexpression)시키는 단계; (3) 상기 과발현 시킨 세포들에 저선량 방사선을 조사하는 단계; 및 (4) 상기 과발현된 두 유전자의 전사된 mRNA를 얻어, 대량 유전자 스크리닝(massive gene screenning)을 통해 정상적인 Ikaros 유전자보다 발현량이 변화한, 상기 돌연변이체의 유전자를 검출하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선 노출로 발현량이 변화하는 유전자의 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 저선량 방사선 노출 특이적 발현량 변화 유전자인 DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 염기서열을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 마커를 제공한다.

또한 본 발명은 저선량 방사선 노출 특이적 발현량 변화 유전자인 DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 정도 측정을 통하여 진단하는 것을 특징으로 하는 저선량 방사선 노출 여부 진단 키트를 제공한다.

바람직하게는, 상기 유전자의 발현 정도 측정을 qRT-PCR 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에 따르면, 야생형과 돌연변이 Ikaros 유전자 두 종류를 이용하여, 저선량 방사선에 특이적인 반응인자를 검색하는 연구 수단을 제공할 수 있고, 또한 저선량 방사선에 특이적으로 반응하는 구체적 타겟 인자로서 검색된 DDIT4, HLX, PKMYT1 RUNX3, DYRK1B 유전자들을 이용하여 저선량 방사선 피폭에 대한 검출방법을 제공하여, 사람 또는 동물의 저선량 방사선의 노출 여부 및 생체 영향 연구 중 개체 내 면역방어 조절에 대한 새로운 기전 및 기능을 확인할 수 있는 생체 검출 지표로 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 야생형 (WT) Ikaros 유전자와, 인산화를 못하게 만든 돌연변이 (IK-STA) Ikaros 유전자를 과발현시킨 세포를 이용하여, RNA-Seq 방법과 IPA 방법을 통해 저선량 방사선 특이적 유전자를 검출하고, qRT-PCR 방법과 Western blot 방법을 통하여 검증하는 전체 과정을 설명하는 도식이다.
도 2는 도 1에 도시된 방법에 따라 검색된 결과인, 저선량 방사선 특이적 인산화 Ikaros 단백질에 의해 조절을 받는 유전자들(DDIT4, HLX, PKMYT1 RUNX3, DYRK1B)의 발현 여부를 RT-PCR 방법과 Western blot 방법을 이용하여 검증한 결과로, (A)는 각 유전자가 야생형 (WT) Ikaros 유전자일 때와, 돌연변이 (IK-STA) Ikaros 유전자일 때로 나누어, RT-PCR 결과 발현량을 비교한 그래프이고, (B)는 각 유전자가 야생형 (WT) Ikaros 유전자일 때와, 돌연변이 (IK-STA) Ikaros 유전자일 때로 나누어, Western blot 결과 각 단백질의 발현량을 비교한 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에서 '저선량 방사선'이란, 0.1 Gy 이하 선량의 방사선을 말한다. 이 때 방사선은, 알파선, 베타선, 감마선, 전자선, 자외선 및 X선 중 어느 하나를 말한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 정상적인 Ikaros 유전자와, Ikaros 단백질의 아미노산 잔기 중에서 serine 391과 serine 393이 인산화되지 못하게 만든 돌연변이체의 Ikaros 유전자를 클로닝하는 단계; (2) 상기 클로닝된 세포들을 과발현(overexpression)시키는 단계; (3) 상기 과발현 시킨 세포들에 저선량 방사선을 조사하는 단계; 및 (4) 상기 과발현된 두 유전자의 전사된 mRNA를 얻어, 대량 유전자 스크리닝(massive gene screenning)을 통해 정상적인 Ikaros 유전자보다 발현량이 변화한, 상기 돌연변이체의 유전자를 검출하는 단계;를 포함하는 저선량 방사선 노출로 발현량이 변화하는 유전자의 검출 방법을 제공한다. 저선량 방사선에 노출되면, Ikaros 유전자에 의해 하위조절 유전자들이 발현되는데, 이러한 유전자는 Ikaros 유전자 돌연변이체에 의해서는 발현이 감소되므로, 정상적 Ikaros 유전자 경우는 인산화에 의해, 돌연변이체 경우보다 증가하게 된다.

상기 유전자의 발현 정도 측정을 qRT-PCR(실시간 RT-PCR) 방법으로 측정하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 저선량 방사선에 특이적으로 발현되는 유전자 검색

(도 1)에서 전체 과정을 도식으로 설명하는 것과 같이, 야생형 (wild type) Ikaros 유전자와, 391번과 393번의 serine이 alanine으로 치환된 것으로 인산화가 될 수 없는 Ikaros 유전자를 인간세포 발현 백터를 이용하여 클로닝 하였다.

클로닝한 야생형 Ikaros와 돌연변이형 Ikaros 클론들은 인간세포주인 293T에서 과발현시킨 후, 0.05 Gy의 방사선을 조사하였고, 세포 용해물(cell lysate)을 추출하여 그로부터 전체 RNA를 분리/정제하였다. 추출된 각 RNA들은, 이바이오젠 (한국)에서 제공하는 차세대 유전자 탐색기술인 RNA-Seq 방법을 이용하여, 야생형의 Ikaros가 과발현된 세포와 비교했을 때, 돌연변이 (IK-STA) Ikaros 유전자가 과발현된 세포에서 유전자발현이 변화되는 유전자들을 대상으로 검색하였다.

이러한 유전자들은 Ikaros의 타겟 유전자면서, 특히 Ikaros에 의해 발현이 억제되는 유전자들로 구분될 수 있다. 이들 유전자들을 대상으로 0.8 배율 이하로 감소하는 유전자를 315개로 확인하였으며, 이들을 대상으로 IPA(Ingenuity Pathway 분석) 단계를 수행하여, 세포내에서 중요한 역할을 하는 유전자 22개를 추출하였다.

실시예 2. 저선량 방사선에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현양상을 qRT-PCR 방법으로 검증

상기 실시예 1.에서 검색된 22개의 유전자들 중 유의적이고 재현성이 높은 것을 기준으로 DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2) 유전자를 선정하였다. 이들 유전자의 발현양상을 검증하기 위해, 야생형 (WT)과 인산화돌연변이형 (STA) Ikaros를 293T 세포주에서 과발현시켰다. 과발현을 시키고 24시간이 경과한 후, 세포들로부터 전체 RNA를 분리/정제하였다. 정제된 RNA는 iScript reverse transcriptase (역전사 효소, Bio-Rad사)를 이용하여 효소 제공사에서 권장하는 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Go-Taq qPCR kit (Promega) 와 7500 real time PCR system (Applied Biosystem)을 이용하여 제공사에서 권장하는 방법에 따라 qPCR 작업을 수행하였다. 그 결과, (도 2)의 (A)의 그래프와 같이, DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2)의 mRNA 발현 수준이 야생형(wild type)과 비교하여 돌연변이형(IK-STA) Ikaros 과발현 세포에서 유의적으로 감소함을 확인하였다.

실시예 3. 저선량 방사선에 특이적으로 발현되는 유전자의 발현양상을 Western blot 방법으로 검증

상기 실시예 2에서 확인된 DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2) 유전자들을 대상으로 단백질 수준에서도 발현 변화과 일치하는지를 확인하기 위해 Western blot 작업을 수행하였다. 우선 야생형 (WT)과 인산화돌연변이 (STA)를 293T 세포주에 과발현시켰다. 과발현을 시킨지 24시간이 경과한 후, 세포용해물을 추출하였으며, 추출된 세포용해물을 8% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 방법으로 분리하였고, 분리된 단백질들을 Western blot 분석법으로 분석하였다. 구체적으로, 상기 SDS-PAGE 작업이 끝난 젤에 포함된 단백질은 nitrocellulose 멤브레인(membrane)에 옮겨져 블랏 (blot)으로 제작되었다. 단백질이 포함된 블랏을 3% 탈지분유 (skim milk)가 포함된 PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween 20) 용액으로 1시간 동안 차단(blocking)시켰다. 그 다음, 항-DDIT4, HLX, PKMYT1 RUNX3, DYRK1B 항체를 3% skim milk/PBST에 1:1000으로 희석한 후, blot에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. 그런 다음, 상기 블랏을 PBST로 세척하고, 3% skim milk/PBST에 1:5000으로 희석한 2차 항체, 항-토끼 IgG-HRP (anti-rabbit IgG-HRP) (Cell signaling, 미국)로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, PBST로 세척하였다. 상기와 같이 세척된 블랏에 ECL Prime (enhanced chemiluminescent Prime) (GE Healthcare, 미국)을 처리하고, LAS-4000 image reader를 이용하여 발광된 영상을 얻었다. 그 결과, (도 2)의 (B)에서 볼 수 있는 바와 같이, DDIT4(NM_019058.2), HLX(NM_021958.3), PKMYT1(NM_001258450.1), RUNX3(NM_001031680.2) 및 DYRK1B(NM_004714.2)의 단백질 발현 수준이 야생형(wild type)과 비교하여 돌연변이형(IK-STA) Ikaros 과발현 세포에서 유의 적으로 감소함을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

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저선량 방사선 노출 특이적 발현량 변화 유전자인 DDIT4(NM_019058.2)의 유전자의 염기 서열을 포함하는 저선량 방사선 노출 여부 진단용 조성물.
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