KR101970750B1 - Method for preparing myeloid-derived suppressor cells, myeloid-derived suppressor cells prepared thereby, and use thereof - Google Patents
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Abstract
골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제(toll-like receptor agonist, TLR agonist)를 처리하여 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법과, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 골수세포로부터 면역 관용성을 갖는 골수유래 면역반응 억제세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다. 또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포는 염증성 사이토카인 및 염증 유발 인자의 발현을 억제하고, T 세포의 활성을 억제하여 다양한 자가면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 인체에 투여하는 경우 안전하다.The present invention relates to a method for inhibiting bone marrow-derived immune responses, comprising the step of treating bone marrow cells with a toll-like receptor agonist (TLR agonist) to induce differentiation into myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) And a bone marrow-derived immunosuppressive cell produced by the method and a use thereof.
The present invention can induce a bone marrow-derived immune response-suppressing cell having immune tolerance from bone marrow cells at a high yield through a simple and easy process, thereby enabling a stable supply of a large amount of immunostimulatory bone marrow-derived immune reaction-inhibiting cells. In addition, the immunostimulatory bone marrow-derived immunosuppressive cells obtained as described above according to the present invention inhibit the expression of inflammatory cytokines and inflammation-inducing factors, inhibit the activity of T cells, effectively prevent or treat various autoimmune diseases, It is safe when administered to human body.
Description
본 발명은 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing an immunosuppressive cell derived from bone marrow, a bone marrow-derived immune reaction inhibitory cell produced thereby, and a use thereof.
골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)는 20년 전에 암을 유발시킨 동물 모델에서 증가된다고 보고되었으며, 암의 진행 및 전이에 영향을 준다고 알려졌다. 최근 이들 세포들은 면역 반응에서 기능적으로 중요한 역할을 한다고 평가되어 왔다. 암세포에 의해 유도되는 면역 억제 기전 중 하나는 암에 의한 골수(myeloid) 계열의 CD11b+Gr-1+ 표현형을 갖는 세포인 골수유래 면역반응 억제세포의 증가이다. MDSCs는 미성숙한 골수계 세포로 종양이나, 자가면역질환, 감염에서 과립구 등이 완전히 분화가 이루어지지 않아 미성숙한 상태로 존재한다. 이들 MDSCs는 암 환자뿐만 아니라 급성 염증 질환, 외상, 패혈증, 기생충 및 진균 감염에서도 증가한다고 알려져 있다.Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) have been reported to increase in animal models that induce
상기한 MDSCs의 기능은 활성화된 T 세포를 효과적으로 억제하는 역할을 한다. MDSCs가 T 세포를 조절하는 기전은 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)와 활성 산소종(reactive oxygen species; ROS), 그리고 아르기나제(arginase)라는 효소가 필수아미노산인 L-아르기닌(L-arginine)의 대사를 극대화함으로써 T 세포 활성을 억제한다고 알려져 있다. 즉, 필수아미노산인 아르기닌(arginine)을 소비하는 효소인 아르기나제-1(arginase-1)을 높은 수준으로 발현하여 주변의 아르기닌의 농도를 효과적으로 낮춘다. 아르기닌이 낮은 수준으로 존재하면 면역 세포인 T 세포가 제 기능을 하지 못하게 되며, 아르기닌에 의존하는 효소인 iNOS가 면역기능에 중요한 매개물인 산화질소(Nitric oxide, NO)를 더이상 만들지 못하게 될 뿐만 아니라 면역을 억제하는 강력한 독성 산화성물질인 과산화질소(NO2)가 만들어져 대식세포와 다른 세포계에서 세포막인지질에 산화성 손상을 야기한다. 따라서, 아르기나제와 NOS 활성화를 통해 T 림프구의 증식을 억제하고 ROS의 형성을 통해 T 림프구의 기능을 억제한다고 알려져 있다.The function of the above-mentioned MDSCs effectively suppresses activated T cells. The mechanism by which MDSCs regulate T cells is that the enzyme nitric oxide synthase, reactive oxygen species (ROS), and arginase are essential amino acids such as L-arginine ) To maximize the metabolism of T cells is known to suppress the activity. In other words, arginase-1, an enzyme that consumes arginine, an essential amino acid, is expressed at a high level, effectively lowering the concentration of arginine around it. When arginine is present at a low level, the immune cell T cell fails to function, and arginine-dependent enzyme iNOS is no longer able to produce nitric oxide (NO), an important mediator of immune function, (NO2), a potent toxic oxidizing substance that inhibits the growth of macrophages and macrophages, leading to oxidative damage to cell membrane phospholipids in macrophages and other cell systems. Therefore, it is known that the activation of arginase and NOS inhibits the proliferation of T lymphocytes and inhibits the function of T lymphocytes through the formation of ROS.
MDSCs는 공통적으로 세포 표면 항원인 CD11b와 Gr-1을 발현하지만, 그 발현 정도가 차이가 있는 이형 개체군(heterogeneous population)의 집합이다. Gr-1은 Ly-6G와 Ly-6C라는 2개의 항원 결정기를 가지며, 이로 인해 CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow를 가지는 과립형인 MDSCs와 CD11b+Ly-6G-Ly-6Chi를 가지는 단구 형태인 MDSCs로 나뉜다. 암 환자의 경우 과립형인 MDSCs가 70~80%, 단구 형태인 MDSCs가 20~30%를 차지한다고 알려져 있다. 두 개의 MDSCs는 다른 억제 기전으로 T 세포를 억제시킨다. 과립형인 MDSCs는 ROS의 발현이 높게 나타나고 단구 형태의 MDSCs는 NO의 생성이 높게 나타난다.MDSCs are a heterogeneous population of cells that express CD11b and Gr-1, the cell surface antigens, but differ in their expression levels. Gr-1 is Ly-6G and Ly-6C of the two has an antigenic determinant, thereby CD11b + Ly-6G + Ly- 6C having a low granule type MDSCs and CD11b + Ly-6G - monocytes having the Ly-6C hi Type MDSCs. It is known that granulomatous MDSCs account for 70 ~ 80% of cancer patients and MDSCs of monocyte form 20 ~ 30% of cancer patients. Two MDSCs inhibit T cells with different inhibitory mechanisms. The granule type MDSCs showed high expression of ROS and the single type MDSCs showed high NO production.
최근 연구에서는 MDSCs가 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 면역기능에 중요한 CD8 T 세포의 기능을 억제한다고 보고되었으며, 염증반응 및 패혈증 질환에서도 MDSCs가 증가하여 면역억제기능을 나타낸다고 보고되었다. 하지만 이들 세포의 세포학적 특성 및 세포분화유도 기전에 관한 연구는 미비한 실정이다. Recent studies have reported that MDSCs inhibit the function of CD8 T cells, which are important for immune function in killing cancer cells or virus-infected cells, and that MDSCs increase immunosuppression even in inflammatory and sepsis diseases. However, there are few studies on the cytotoxic characteristics and mechanisms of cell differentiation in these cells.
본 발명의 일 목적은 골수 세포로부터 면역 관용성(tolerogenic) 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. It is an object of the present invention to provide a method for producing tolerogenic myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) from bone marrow cells.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제조된 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating immune diseases, comprising the immunoregulatory bone marrow-derived immune reaction inhibitory cells prepared in the present invention.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 목적은 골수 세포로부터 면역 관용성(tolerogenic) 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells; MDSCs)를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. It is an object of the present invention to provide a method for producing tolerogenic myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) from bone marrow cells.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제조된 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating immune diseases, comprising the immunoregulatory bone marrow-derived immune reaction inhibitory cells prepared in the present invention.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명은 간단하고 용이한 공정을 통하여 골수 세포로부터 면역 관용성을 갖는 골수유래 면역반응 억제세포를 높은 수율로 유도할 수 있어, 대량의 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포의 안정적인 공급을 가능하도록 한다. The present invention can induce a bone marrow-derived immune response-suppressing cell having immune tolerance from bone marrow cells at a high yield through a simple and easy process, thereby enabling a stable supply of a large amount of immunostimulatory bone marrow-derived immune reaction-inhibiting cells.
또한, 본 발명에서 상기와 같이 얻어진 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포는 염증성 사이토카인 및 염증 유발 인자의 발현을 억제하고, T 세포의 활성을 억제하여 다양한 자가면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 인체에 투여하는 경우 안전하다.In addition, the immunostimulatory bone marrow-derived immunosuppressive cells obtained as described above according to the present invention inhibit the expression of inflammatory cytokines and inflammation-inducing factors, inhibit the activity of T cells, effectively prevent or treat various autoimmune diseases, It is safe when administered to human body.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하는 3가지 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 골수 세포에 처리되는 TLR 작용제의 농도별 CD11c+ 세포 비율의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 유도 여부를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스 각각의 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c, CD11b, Gr-1, F4/80, Ly6C, CD4, CD8α, CD103, PDCA-1, B220, NK1.1 및 CD49b의 표현형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 3에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에서 CD11c+, CD11b+, Gr-1+, F4/80+, Ly6C+, CD4+, CD8α+, CD103+, PDCA-1+, B220+, NK1.1+ 및 CD49b+ 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, Gr-1+CD11b+CD11c-, Gr-1highCD11b+CD11c- 및 Gr-1intCD11b+CD11c- 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, LyG 및 LyC의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 4에서 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c-CD11b+LyG+LyC-, CD11c-CD11b+LyG+LyCint, CD11c-CD11b+LyG-LyCint 및 CD11c-CD11b+LyG-LyChigh 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에서 C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스로부터 추출한 골수 세포에 다양한 TLR 작용제 처리 후 분화 유도된 세포에 있어서, CD11c-CD11b+LyG+LyC-, CD11c-CD11b+LyG+LyCint, CD11c-CD11b+LyG-LyCint 및 CD11c-CD11b+LyG-LyChigh 세포의 비율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NO2의 형성 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 NOS2 및 아르기나아제-1의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블럿으로 분선한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 IL-10의 발현 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 아르기나아제-1(Arg-1) 및 iNOS의 발현 수준과, Arg-1/iNOS의 발현 수준의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs에 있어서, CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 TNF-α, IL-6, IL-12p70 및 IFN-β의 발현 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO를 발현하는 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 실시예 6에서 골수 세포에 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 후 유도된 M-MDSCs를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL 및 IDO의 발현 수준의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포 억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포 억제능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포의 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 28은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR9 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 T 세포의 증식능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 29는 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 Foxp3의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 Foxp3의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 조절 T 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 32는 본 발명의 실시예 7에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs를 OVA-pulsed DC와 CD4 T 세포의 공배양물에 처리한 후 조절 T 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 33은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11c 및 MHC-Ⅱ의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포에 있어서 CD11b 및 F4/80의 발현 수준을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 M-CSF 처리를 하여 유도된 세포를 LPS와 IFN-γ로 자극하면서 F4/80+CD11b+ 세포의 비율의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 37은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF를 첨가하여 배양하며 T 세포의 증식 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF를 첨가하여 배양하며 T 세포의 증식 억제능과 IFN-γ의 분비능의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 실시예 8에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하여 얻어진 M-MDSCs에 GM-CSF를 첨가하며 배양하여 유도된 세포 중 CD11c+ 세포의 비율을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 40은 본 발명의 실시예 9에서 골수 세포에 3 method로 TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 후 분화 초기(TLR 자극 후 8, 18 및 36시간)에 유도되는 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β 사이토카인의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 41은 본 발명의 실시예 10에서 골수 세포에 3 method로 TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리한 후 얻어진 M-MDSCs와 수지상 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 42는 본 발명의 실시예 10에서 골수 세포에 3 method로 TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리한 후 각 처리 농도 별 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1+ 및 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1-의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 43은 본 발명의 실시예 11에서 골수 세포에 3 method로 TLR9 작용제와 함께 재조합 IL-6 단백질과 IL-6 수용체 차단제를 처리한 후 수확된 세포 중 MDSCs와 수지상 세포의 비율의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 44는 본 발명의 실시예 11에서 골수 세포에 3 method로 TLR9 작용제와 함께 재조합 IL-6 단백질과 IL-6 수용체 차단제를 처리한 후 유도된 M-MDSCs에 GM-CSF를 처리한 후 CD11c+ 세포의 유도 비율을 그래프로 나타낸 것이다.Figure 1 is a schematic diagram of three methods for treating TLR agonists in bone marrow cells in Example 1 of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of the induction of CD11c + cells by various flow cytometry analyzers after treatment with various TLR agonists on bone marrow cells in Example 1 of the present invention.
FIG. 3 shows the results of measuring the proportion of CD11c + cells after treatment with various TLR agonists in bone marrow cells in Example 1 of the present invention.
4 shows the results of measurement of changes in CD11c + cell ratio by concentration of TLR agonist treated with bone marrow cells in Example 1 of the present invention.
FIG. 5 shows the results of analysis of the induction of CD11c + MHC-II + cells by various TLR agonist treatments on the bone marrow cells of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 MyD88 - / - mice by the flow cytometry in Example 2 of the present invention .
FIG. 6 shows the results of measuring the ratio of CD11c + MHC-II + cells to various bone marrow cells of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 MyD88 - / - mice after treatment with various TLR agonists in Example 2 of the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the results of cell proliferation of CD11c, CD11b, Gr-1, F4 / 80, Ly6C, CD4, CD8a, CD103, PDCA-1 and B220 , NK1.1 and CD49b, respectively.
8 is in the induction of cell differentiation after various TLR agonist treatment on bone marrow cells in the third embodiment of the present invention, CD11c +, CD11b +, Gr- 1 +, F4 / 80 +, Ly6C +, CD4 +, CD8α +, CD103 + , PDCA-1 + , B220 + , NK1.1 +, and CD49b + cells.
FIG. 9 shows the results of analysis of the expression level of Gr-1 in cells differentiated after treatment with various TLR agonists in bone marrow cells according to Example 4 of the present invention using a flow cytometer.
10 is in the induction of cell differentiation after various TLR agonist treatment on bone marrow cells in the fourth embodiment of the invention, Gr-1 + CD11b + CD11c -, Gr-1 high CD11b + CD11c - and Gr-1 int CD11b + CD11c - < / RTI > ratio of cells.
FIG. 11 shows the results of analysis of the expression levels of LyG and LyC by flow cytometry in cells differentiated after treatment with various TLR agonists in bone marrow cells in Example 4 of the present invention.
12 is a graph showing the effect of different TLR agonists on bone marrow cells in differentiation induction of CD11c - CD11b + LyG + LyC - , CD11c - CD11b + LyG + LyC int , CD11c - CD11b + LyG - LyC int and CD11c - CD11b + LyG - LyC high cells.
13 is a C57BL / 6 mice and C57BL / 6 MyD88 in Example 5 of the present invention in the induction of cell differentiation after various TLR agonists processing on the extracted bone marrow cells from mice, CD11c - - / CD11b + LyG + LyC -, CD11c - CD11b + LyG + LyC int , CD11c - CD11b + LyG - LyC int and CD11c - CD11b + LyG - LyC high cells.
FIG. 14 is a graph showing the results of measurement of changes in NO 2 formation level by stimulating M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells with LPS and IFN-γ in Example 6 of the present invention will be.
15 is a graph showing changes in the expression levels of NOS2 and arginase-1 in M-MDSCs induced by treatment with TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells of the present invention with LPS and IFN- As shown in Fig.
16 is a graph showing the results of measurement of changes in the expression level of IL-10 stimulated with LPS and IFN-y in M-MDSCs induced after treatment with TLR2 agonist and TLR9 agonist in bone marrow cells of Example 6 of the present invention .
FIG. 17 shows the expression levels of arginase-1 (Arg-1) and iNOS, stimulated with LPS and IFN-gamma in M-MDSCs induced after treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 6 of the present invention The results of FACS analysis are shown in Fig.
FIG. 18 shows the expression levels of arginase-1 (Arg-1) and iNOS while stimulating M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists with bone marrow cells in Example 6 of the present invention with LPS and IFN- And the ratio of the expression level of Arg-1 / iNOS.
19 shows the expression levels of CD124, CD115, F4 / 80 and PDCA-1 in M-MDSCs induced after treatment with TLR2 agonist and TLR9 agonist in bone marrow cells in Example 6 of the present invention by flow cytometry .
20 shows the results of measuring the proportion of cells expressing CD124, CD115, F4 / 80 and PDCA-1 in M-MDSCs induced after treatment of TLR2 agonist and TLR9 agonist in bone marrow cells in Example 6 of the present invention As shown in FIG.
FIG. 21 shows that TNF-.alpha., IL-6, IL-12p70 and IFN-.beta. Were stimulated with MMPs induced by LPS and IFN-y after treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 6 of the present invention. Of the expression level of < / RTI >
Figure 22 shows that PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL, and IDO, while stimulating M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 6 of the present invention with LPS and IFN- The results of FACS analysis are shown in Fig.
FIG. 23 is a graph showing the results of stimulation of M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonist and TLR9 agonist with bone marrow cells in Example 6 of the present invention with LPS and IFN-gamma while PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL and IDO Of the cells expressing the cells.
FIG. 24 is a graph showing the results of stimulation of M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists with bone marrow cells with LPS and IFN-gamma in Example 6 of the present invention while PD-L1, PD-L2, Tim-3, FasL and IDO The results of FACS analysis are shown in Fig.
FIG. 25 shows the results of confirming the inhibitory effect of T-cells after treating M-MDSCs induced by TLR2 agonist with bone marrow cells in Example 7 of the present invention in the co-culture of OVA-pulsed DC and CD4 T cells .
FIG. 26 shows the results of confirming the inhibitory effect of T-cells after treating M-MDSCs induced by TLR9 agonist with 3 methods on bone marrow cells of the present invention in the co-culture of OVA-pulsed DC and CD4 T cells .
27 is a graph showing changes in the proliferative activity of T cells after treating M-MDSCs induced by TLR2 agonist with 3 methods on bone marrow cells of the present invention to co-cultured OVA-pulsed DC and CD4 T cells The measured results are shown in a graph.
28 is a graph showing changes in the proliferative activity of T cells after treatment of OVA-pulsed DC and CD4 T cell co-cultures of M-MDSCs induced by treatment of TLR9 agonist with 3 methods on bone marrow cells of Example 7 of the present invention The measured results are shown in a graph.
FIG. 29 is a graph showing changes in the expression level of Foxp3 after treatment of OVA-pulsed DCs and CD4 T cells with M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonist with 3 methods on bone marrow cells in Example 7 of the present invention. As shown in Fig.
30 shows the expression levels of Foxp3 in M-MDSCs treated with a TLR2 agonist by 3 methods on bone marrow cells of the present invention after coadministered with OVA-pulsed DC and CD4 T cells, As shown in Fig.
FIG. 31 is a graph showing the ratio of regulatory T cells after treating M-MDSCs treated with TLR2 agonist with bone marrow cells in Example 7 of the present invention in the co-culture of OVA-pulsed DC and CD4 T cells The results are shown graphically.
FIG. 32 is a graph showing the ratio of regulatory T cells after treating M-MDSCs treated with TLR2 agonist with bone marrow cells in Example 7 of the present invention in the co-culture of OVA-pulsed DC and CD4 T cells The results are shown graphically.
FIG. 33 shows the expression levels of CD11c and MHC-II in cells induced by GM-CSF treatment of M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 8 according to the present invention, The results of analysis by analyzer are shown.
34 is a graph showing the effect of GM-CSF treatment on M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 8 of the present invention in the presence of CD11c + MHC -II < + & gt ; cells.
FIG. 35 shows the expression levels of CD11b and F4 / 80 in M-CSF-treated cells treated with M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonists and TLR9 agonists in bone marrow cells in Example 8 according to the present invention, The results of analysis by analyzer are shown.
FIG. 36 shows the results of M-CSF treatment of M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonist and TLR9 agonist with bone marrow cells in Example 8 of the present invention in the presence of F4 / 80 + CD11b + & lt ; / RTI & gt ; cells.
FIG. 37 shows the results of analysis of T-cell proliferation inhibitory ability by adding GM-CSF to M-MDSCs obtained by treating the bone marrow cells with TLR2 agonist and TLR9 agonist by 3 methods in Example 8 of the present invention.
FIG. 38 is a graph showing changes in T-cell proliferation inhibitory ability and IFN-γ secretion ability by adding GM-CSF to M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonists and TLR9 agonists in
FIG. 39 shows the results of measuring the ratio of CD11c + cells in the cells induced by adding GM-CSF to M-MDSCs obtained by treating TLR2 agonists and TLR9 agonists with 3 methods on bone marrow cells in Example 8 of the present invention As shown in FIG.
Figure 40 shows that TNF-a, IL-6, PGE2 induced in the early stage of differentiation (8, 18 and 36 hours after TLR stimulation) after treatment of TLR2 agonist and TLR9 agonist in bone marrow cells by the 3 methods in Example 9 of the present invention , IFN-? And IFN-? Cytokines, respectively.
FIG. 41 shows the ratio of M-MDSCs to dendritic cells obtained after treatment of TNF-.alpha., IL-6, PGE2, IFN-.alpha. And IFN-.beta. As shown in FIG.
42 is a TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α and then treated with IFN-β for each concentration CD11c in the practice instead TLR agonist in Example 10 with 3 method in bone marrow cells of the present invention - CD11b + Ly6G - Ly6C + PDCA-1 + and CD11c - CD11b + Ly6G - Ly6C + PDCA-1 - .
FIG. 43 is a graph showing changes in the ratio of MDSCs and dendritic cells among the harvested cells after treatment of recombinant IL-6 protein and IL-6 receptor blocker with TLR9 agonist and 3 methods on bone marrow cells in Example 11 of the present invention .
44 is a CD11c + after processing the GM-CSF to recombinant IL-6 protein and IL-6 receptors, the M-MDSCs derived after processing a blocking agent with the embodiment TLR9 agonist in Example 11 with 3 method in bone marrow cells of the present invention The induction ratios of the cells are shown graphically.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
[실시예 1] 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제의 처리[Example 1] Treatment of a bone marrow cell with a toll-like receptor agonist
C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용하여 대퇴부 골수 세포(whole bone marrow cells)를 채취하였다. 채취한 골수 세포를 PBS로 세척한 후 적혈구 용혈 버퍼(Sigma Aldrich)를 사용하여 적혈구(red blood cells, RBCs)를 제거하였다. 상기 골수 세포를 6 웰 플레이트(1X106 세포/ml; 2 ml/웰)에 분주하고 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Lonza, Basel, Switzerland), 10% 우태아 혈청 (Lonza), 50 μM 머캅토에탄올 (Lonza), 0.1 mM 비필수 아미노산 (Lonza) 및 GM-CSF (20 ng/mL)로 보충된 완전-RPMI 1640 (c-RPMI 1640) 배지에서 5% CO2 분위기 및 37℃의 온도 조건 하에서 배양하였다. 단, 도 1에 나타낸 바와 같이, TLR2 작용제(Pam3CSK4), TLR3 작용제(poly I:C), TLR4 작용제(LPS, from Escherichia coli O111:B4), TLR7 작용제(이미퀴모드, R837) 및 TLR9 작용제(ODN1826) 각각을 50 ng/ml의 양으로 분화 개시 시점(1 method), 분화 개시 후 3일 째(2 method), 또는 분화 개시 시점과 분화 개시 후 3일 째(3 method)에 배지에 첨가하였다. 배양 3일 째에 웰에 골수 세포와 c-RPMI 1640 배지 1 ml를 추가하였다. 배양 6일 째에 세포를 수집하고, 플루오레세인(Fluorescein) 컨쥬게이트된 CD11c mAb로 염색하여 CD11c+ 세포의 비율을 측정하여 도 2 및 3에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 3 method로 처리한 경우 수지상 세포의 억제능이 강력하게 유도되었다. 또한, 3 method에 의하되 각 TLR 작용제의 처리 농도 별(TLR2 작용제 (Pam3) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR3 작용제 (Poly I:C) - 10, 100, 500 ng/ml; TLR4 작용제 (LPS) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR7 작용제 (Imiqumoid) - 1, 10, 50 ng/ml; TLR9 작용제 (CPG:ODN) - 1, 10, 50 ng/ml) CD11c+ 세포 비율을 확인하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 처리되는 TLR 작용제의 농도 의존적으로 수지상 세포의 분화가 억제되는 것을 볼 수 있었다. 하지만, TLR3 작용제를 처리한 경우는 수지상 세포 분화 억제 효과가 관찰되지 않았다. Whole bone marrow cells were harvested from C57BL / 6 mice using bone marrow harvesting scans. The collected bone marrow cells were washed with PBS and red blood cells (RBCs) were removed using a red blood cell hemolysis buffer (Sigma Aldrich). The bone marrow cells were plated in 6 well plates (1 x 10 6 cells / ml; 2 ml / well) and resuspended in 100 U / mL penicillin / streptomycin (Lonza, Basel, Switzerland), 10% fetal bovine serum mercaptoethanol (Lonza), 0.1 mM non-essential amino acids (Lonza) and GM-CSF (20 ng / mL ) supplemented with complete -RPMI 1640 (c-RPMI 1640) 5
[실시예 2] 수지상 세포의 분화 억제와 MyD88의 관계 확인[Example 2] Confirmation of the relationship between MyD88 and the inhibition of dendritic cell differentiation
추가적으로 수지상 세포 분화의 억제 효과가 MyD88 의존적으로 유도되는 지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1의 3 method와 동일한 방법으로 TLR 작용제를 처리하여 분화를 유도한 뒤, CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율을 측정하여 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.In addition, in order to confirm whether the inhibitory effect of dendritic cell differentiation was induced in MyD88-dependent manner, C57BL / 6 mice and C57BL / 6 MyD88 - / - mice were treated with TLR agonists in the same manner as in Example 3, And the ratio of CD11c + MHC-II + cells was measured. The results are shown in FIGS. 5 and 6. FIG.
도 5 및 6에서 보는 바와 같이, TLR3 작용제를 처리한 경우를 제외하고, TLR2 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제를 처리하자 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율이 감소하였으나, MyD88를 넉아웃 시킨 경우 CD11c+MHC-Ⅱ+ 세포의 비율이 80% 이상 유지되어, 수지상 세포로의 분화가 유도됨을 볼 수 있었다. As shown in FIGS. 5 and 6, treatment of TLR2 agonists, TLR4 agonists, TLR7 agonists and TLR9 agonists reduced the proportion of CD11c + MHC-II + cells, except for the treatment of TLR3 agonists, , The ratio of CD11c + MHC-II + cells was maintained at 80% or more, indicating induction of differentiation into dendritic cells.
이를 통하여 수지상 세포로의 분화는 MyD88 의존적으로 유도된다는 것을 확인할 수 있었다.It was confirmed that the differentiation into dendritic cells was induced MyD88-dependent.
[실시예 3] TLR 자극에 의해 유도되는 세포의 표현형 분석[Example 3] Phenotype analysis of cells induced by TLR stimulation
상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 골수 세포에 TLR 작용제를 처리하여 6일간 배양 후 수확된 세포의 표현형을 분석한 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 그 결과, TLR 자극으로 유도된 세포들은 수지상 세포의 표현형(CD11c, CD4, CD103, CD8a)은 모두 감소한 반면, Gr-1, Ly6C, CD11b의 발현은 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 발현 양상을 통하여 골수 세포로부터 분화 유도된 세포가 골수유래 면역반응 억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)임을 예측할 수 있었다. The results of analysis of the phenotype of the harvested cells after 6 days of treatment with the TLR agonist in bone marrow cells in the same manner as in Example 1 above are shown in FIGS. As a result, the expression of Gr-1, Ly6C, and CD11b was highly induced in the TLR-stimulated cells, while the expression of dendritic cells (CD11c, CD4, CD103, CD8a) was decreased. These results suggest that the differentiation-induced cells from bone marrow cells are myeloid-derived suppressor cells (MDSCs).
단, TLR 작용제 중에서 특히 TLR7 작용제와 TLR9 작용제를 처리한 경우 플라즈마사이토이드 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells, pDC)의 마커인 PDCA-1가 높게 유도됨을 볼 수 있었지만, pDC의 다른 마커인 B220에는 별다른 차이를 보이지 않아 pDC가 유도된 것은 아님을 알 수 있었다. Among the TLR agonists, PDCA-1, which is a marker of plasmacytoid dendritic cells (pDC), was highly induced when TLR7 agonists and TLR9 agonists were treated, but B220, another marker of pDC, And pDC was not induced.
이를 통하여 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제의 처리 시 서로 다른 종류의 MDSCs가 유도됨을 알 수 있었다. It was found that different kinds of MDSCs were induced by treatment with TLR2 agonist, TLR4 agonist, TLR7 agonist and TLR9 agonist.
[실시예 4] TLR 자극에 의해 유도된 MDSCs의 표현형 확인[Example 4] Identification of phenotypes of MDSCs induced by TLR stimulation
상기 실시예 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 3 method에 따라 골수 세포에 TLR 자극을 가하여 분화 유도된 세포는 MDSCs임을 알 수 있었다. 한편, 상기 MDSC의 아형은 단핵구(monocytic)-MDSC (M-MDSCs)와 과립구(Granulocytic)-MDSC (G-MDSCs)로 나눌 수 있는데, Gr-1high 세포는 대부분 G-MDSCs에 해당하고, Gr-1low은 M-MDSCs로 분류할 수 있다. As shown in the above Example 3, according to the 3 method of Example 1, it was found that MDSCs were induced by TLR stimulation in bone marrow cells. The MDSC subtype can be divided into monocytic-MDSC (M-MDSCs) and granulocytic-MDSC (G-MDSCs). Gr-1 high cells are mostly G-MDSCs and Gr -1 low can be classified as M-MDSCs.
이에, Gr-1 항체를 이용하여 상기 실시예 1에서 3 method의 방법으로 6일간 배양 후 수확된 MDSCs에 대하여 Gr-1 발현 수준을 확인하여 도 9 및 10에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제에 의해 유도된 세포들은 Gr-1low한 MDSCs가 높게 유도되었으나, 반대로 TLR7 작용제와 TLR9 작용제로 유도된 세포들은 Gr-1high한 MDSCs가 높게 유도된 것을 확인할 수 있었다. Thus, the expression level of Gr-1 was confirmed for the MDSCs harvested after 6 days of cultivation by the
더 나아가, MDSCs의 정확한 아형을 분류하기 위하여, Ly6G와 Ly6C 항체를 이용해 그 발현 양상을 확인한 결과, 도 11 및 12에서 보는 바와 같이 TLR의 자극에 의하여 골수 세포로부터 G-MDSC (X2 세포)와 M-MDSCs (X3 세포 및 X4 세포)가 유도되었고, 그 중에서도 M-MDSCs의 비율이 높았으나, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6Cint M-MDSCs (X3 세포)가, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6Chigh M-MDSCs (X4 세포)가 유도됨을 확인할 수 있었다. Further, in order to classify the precise subtypes of MDSCs, expression patterns of Ly6G and Ly6C antibodies were examined. As shown in FIGS. 11 and 12, G-MDSC (X 2 cells) from bone marrow cells were stimulated by TLR stimulation M-MDSCs (X 3 cells and X 4 cells) were induced, and the ratio of M-MDSCs was high. However, Ly6C int M-MDSCs (X 3 cells) in TLR2 agonist and TLR4 agonist treatment, TLR7 agonist and TLR9 It was confirmed that Ly6C high M-MDSCs (X 4 cells) were induced during agonist treatment.
[실시예 5] MDSCs의 분화와 MyD88의 관계 확인[Example 5] Confirmation of the relationship between MyD88 and differentiation of MDSCs
MDSCs 각 아형별 분화가 MyD88 의존적으로 유도되는 지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스와 C57BL/6 MyD88-/- 마우스에 대하여 상기 실시예 1에서 3 method와 동일한 방법으로 수행한 뒤, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 Ly6G와 Ly6C의 그 발현 양상을 확인하였다(도 13). 그 결과, TLR2 작용제와 TLR4 작용제 처리 시 Ly6Cint M-MDSCs (X3 세포)가 유도되고, TLR7 작용제와 TLR9 작용제 처리 시 Ly6Chigh M-MDSCs (X4 세포)가 유도되는 것은 MyD88 의존적인 것임을 알 수 있었다. In order to confirm the induction of MyD88-dependent differentiation of each subtype of MDSCs, C57BL / 6 mice and C57BL / 6 MyD88 - / - mice were performed in the same manner as in
[실시예 6] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도되는 분자적 파라미터[Example 6] Molecular parameters induced by TLR2 agonists and TLR9 agonists
실시예 4에서 보는 바와 같이 골수 세포에 대하여 3 method의 TLR 자극에 의해 분화 유도된 세포가 M-MDSCs인지를 정확히 판단하기 위하여, M-MDSCs에서 유도되는 다양한 인자들을 분석하였다. 또한, 이러한 분석에서 TLR2 작용제 및 TLR4 작용제에 의해서 유도되는 Ly6Cint M-MDSCs와, TLR7 작용제 및 TLR9 작용제에 의해서 유도되는 Ly6Chigh M-MDSCs의 기능적 차이를 확인하기 위하여 TLR2-M-MDSC와 TLR9-M-MDSC를 MACS 시스템을 이용하여 분리하였다. 여기서 M-MDSCs의 활성을 유도하기 위하여 LPS와 IFN-γ를 24시간 처리하였다.As shown in Example 4, various factors derived from M-MDSCs were analyzed in order to accurately determine whether the cells differentiated by TLR stimulation of bone marrow cells were M-MDSCs. In addition, TLR2-M-MDSC TLR9- and to identify functional differences in Ly6C high M-MDSCs induced by M-int and Ly6C MDSCs induced by TLR2 and TLR4 agonist agonist in this analysis, TLR7 and TLR9 agonist agonist M-MDSC was isolated using MACS system. Here, LPS and IFN-? Were treated for 24 hours to induce the activity of M-MDSCs.
구체적으로, NO 키트를 이용하여 NO2의 형성 수준을, 웨스턴 블럿을 통해 NOS2 및 아르기나아제-1(arginase-1)의 발현 수준을, ELISA를 통하여 IL-10의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 각각 도 14, 15 및 16에 나타내었다. 또한, FACS를 통하여 아르기나아제-1 및 iNOS의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 17 및 18에 나타내었다. 도 14 내지 18에서 보는 바와 같이, TLR2 작용제와 TLR9 작용제를 처리하여 유도된 M-MDSCs를 자극하자 항염증성 사이토카인(IL-10) 및 면역 억제물질(Arg-1, NOS)의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.Specifically, the level of NO 2 formation using a NO kit, the level of expression of NOS2 and arginase-1 via Western blot, the level of expression of IL-10 through ELISA, Are shown in Figs. 14, 15 and 16, respectively. In addition, the level of expression of arginase-1 and iNOS was confirmed by FACS, and the results are shown in FIGS. 17 and 18. As shown in Figures 14-18, stimulation of M-MDSCs induced by treatment of TLR2 agonists and TLR9 agonists resulted in increased expression of anti-inflammatory cytokines (IL-10) and immunosuppressive agents (Arg-1, NOS) .
또한, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs의 표현형을 확인하기 위하여 CD124, CD115, F4/80 및 PDCA-1의 다양한 마커의 발현 수준을 분석한 결과, 도 19 및 20에서 보는 바와 같이 CD124는 TLR2 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 높게 발현되었고, CD115, F4/60 및 PDCA-1은 TLR2 자극 후 유도된 M-MDSCs에서 낮게 발현되었다. In addition, the expression levels of various markers of CD124, CD115, F4 / 80 and PDCA-1 were analyzed in order to confirm the phenotype of M-MDSCs induced by treatment with TLR2 agonist and TLR9 agonist, As shown, CD124 was highly expressed in M-MDSCs induced after TLR2 stimulation and CD115, F4 / 60 and PDCA-1 were expressed low in M-MDSCs induced after TLR2 stimulation.
추가적으로, TLR2 작용제 및 TLR9 작용제를 처리한 경우 유도된 M-MDSCs에 있어서 ELISA를 이용하여 염증성 사이토카인의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 도 21에 나타내었고, FACS를 이용하여 면역 억제 인자의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 22 내지 24에 나타내었다. 그 결과, TLR2 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs는 TLR9 작용제 처리 후 유도된 M-MDSCs 보다 활성화 되었을 때 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. In addition, the expression levels of inflammatory cytokines were analyzed using ELISA on M-MDSCs induced by treatment with TLR2 agonists and TLR9 agonists. The results are shown in Fig. 21, and the expression level of immunosuppressive factors using FACS And the results are shown in Figs. 22 to 24. As a result, it was confirmed that M-MDSCs induced after TLR2 agonist treatment inhibited the expression of inflammatory cytokines when activated than M-MDSCs induced after TLR9 agonist treatment.
[실시예 7] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs에 의한 T 세포의 증식 억제 및 조절 T 세포의 분화 확인[Example 7] Inhibition of T cell proliferation and differentiation of regulatory T cells by M-MDSCs induced by TLR2 agonist and TLR9 agonist
이하에서는 M-MDSCs의 또 다른 특징 중 하나는 T 세포의 증식 억제능과 조절 T 세포의 분화 유도를 확인하였다. 보다 상세하게는 OVA-pulsed DC와 OT-II 마우스의 CellTrace-labeled CD4 T 세포의 공배양(co-culture)을 통하여 T 세포를 활성화 시키고, 상기 실시예 1에서 3 method에 의해 분화 유도된 M-MDSCs를 추가한 뒤 T 세포 억제능을 확인하여 그 결과를 도 25 내지 28에 나타내었고, Foxp3의 발현 수준을 확인하여 조절 T 세포의 비율을 확인해 그 결과를 도 29 내지 32에 나타내었다. Hereinafter, one of the other characteristics of M-MDSCs was confirmed to be the ability to inhibit proliferation of T cells and induce differentiation of regulatory T cells. More specifically, T cells were activated by co-culture of OVA-pulsed DCs and CellTrace-labeled CD4 T cells of OT-II mice, and the M cells induced by differentiation of M- After addition of MDSCs, T cell inhibition was confirmed. The results are shown in FIGS. 25 to 28, and the expression level of Foxp3 was confirmed to confirm the ratio of regulatory T cells. The results are shown in FIGS. 29 to 32.
도 25 내지 32에서 보는 바와 같이, TLR2 자극 후 유도된 M-MDSCs와 TLR9 자극 후 유도된 M-MDSCs 모두 수 의존적으로 T 세포의 증식을 억제하였고, Foxp3+ CD4 T 세포의 분화를 현저히 유도한 것을 볼 수 있었다. As shown in FIGS. 25 to 32, both M-MDSCs induced after TLR2 stimulation and M-MDSCs induced after TLR9 stimulation inhibited T-cell proliferation in a number-dependent manner and significantly induced differentiation of Foxp3 + CD4 T cells I could see.
[실시예 8] TLR2 작용제와 TLR9 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs의 2차 분화 차이점 평가[Example 8] Evaluation of the secondary differentiation of M-MDSCs induced by TLR2 agonist and TLR9 agonist
상기 실시예 1에서 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSCs 각각을 6-웰 플레이트(1X106 cells/ml; 2 ml/well)에 분주한 뒤 10% 우태아 혈청, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 20 ng/ml GM-CSF 또는 M-CSF가 보충된 cRPMI 1640에서 5일 동안 배양하고 세포를 수확하였다. 상기 배양으로 수지상 세포의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 수지상 세포의 항-CD11c와 항-MHC-II를 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 33 및 34에 나타내었다. 또한, 상기 배양으로 큰포식 세포의 분화가 유도되었는지 확인하기 위하여 큰포식 세포의 항-CD11b와 항-F40/80으로 염색 후 유세포분석기 FACSverse를 통하여 분석하여 그 결과를 도 35 및 36에 나타내었다.M-MDSCs differentiated according to the 3 method in Example 1 were divided into 6-well plates (1 × 10 6 cells / ml; 2 ml / well), and then 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin / The cells were cultured for 5 days in cRPMI 1640 supplemented with 50 nM mercaptoethanol, 0.1 mM nonessential amino acid and 20 ng / ml GM-CSF or M-CSF and the cells were harvested. Anti-CD11c and anti-MHC-II of dendritic cells were stained and analyzed by flow cytometry analyzer FACSverse to confirm the induction of differentiation of dendritic cells. The results are shown in FIGS. 33 and 34. In addition, in order to confirm whether the differentiation of large proximal cells was induced by the above culture, the cells were stained with anti-CD11b and anti-F40 / 80 of large phagocytic cells and analyzed by flow cytometer FACSverse. The results are shown in FIGS.
도 33 내지 36에서 보는 바와 같이, TLR2 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 일부 큰포식 세포로 분화가 유도되었지만, 수지상 세포로는 거의 분화가 되지 않은 반면, TLR9 작용제에 의해 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포와 큰포식 세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. As shown in FIGS. 33 to 36, M-MDSCs induced by TLR2 agonist induced differentiation into some large predominant cells but hardly differentiated into dendritic cells, whereas M-MDSCs induced by TLR9 agonist And it was confirmed that the differentiation into dendritic cells and large predominant cells was induced.
추가적으로 T 세포의 존재 하에서 상기 실시예 1의 3 method에 따라 분화 유도된 M-MDSCs 각각에 GM-CSF를 첨가하여 배양하며 T 세포의 증식 억제능과 수지상 세포로의 2차 분화 정도를 평가하였다. 그 결과 도 37 및 38에서 보는 바와 같이, TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs에서는 이러한 변화를 보이지 않고 지속적으로 T 세포 증식 억제 및 IFN-γ 억제능을 보인 반면, TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는 GM-CSF 존재 시 T 세포 증식 억제능 및 IFN-γ 억제능이 현저하게 감소한 것을 볼 수 있었다. In addition, GM-CSF was added to each of the differentiated M-MDSCs according to the 3 method of Example 1 in the presence of T cells, and the ability to inhibit T-cell proliferation and secondary differentiation to dendritic cells was evaluated. As a result, as shown in FIGS. 37 and 38, M-MDSCs induced by TLR2 stimulation did not exhibit such a change but showed continuous inhibition of T cell proliferation and IFN-γ, whereas TLR9 stimulated M-MDSCs Inhibited T cell proliferation and IFN-γ inhibition in the presence of GM-CSF.
또한, 이러한 조건에서 CD11c의 2차 분화 정도를 확인한 결과 도 39에서 보는 바와 같이 TLR2 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는 안정적으로 세포 특성을 유지한 반면, TLR9 자극에 의해 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포로 분화가 유도되었음을 확인할 수 있었다.As a result of confirming the degree of secondary differentiation of CD11c under these conditions, as shown in FIG. 39, M-MDSCs induced by TLR2 stimulation stably maintained cell characteristics, whereas M-MDSCs induced by TLR9 stimulation Cell differentiation was induced.
이를 통하여, TLR2 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 추가적으로 성장인자를 처리하여도 수지상 세포로 분화가 유도되지 않고 M-MDSCs의 특성을 안정적으로 유지하는 반면, TLR9 작용제에 의해 분화 유도된 M-MDSCs는 수지상 세포로의 2차 분화가 유도되는 것을 알 수 있었다. Thus, M-MDSCs induced by TLR2 agonists stably maintain the characteristics of M-MDSCs without being induced to differentiate into dendritic cells even when growth factors are further treated, whereas M-MDSCs induced by TLR9 agonists induced M- MDSCs induced secondary differentiation into dendritic cells.
[실시예 9] TLR2 및 TLR9에 의해 유도된 M-MDSCs에 있어서 사이토카인의 영향[Example 9] Influence of cytokines on M-MDSCs induced by TLR2 and TLR9
이하에서는 TLR2 작용제와 TLR9 작용제의 처리에 따라 분화 유도된 M-MDSCs 각각에 있어서 표현형, T 세포 억제능, 조절 T 세포 형성능 및 수지상 세포로의 분화 차이가, 상기 TLR 자극에 의해 유도되는 사이토카인의 분비 차이로 인한 것임을 가정하고 실험을 진행하였다. 따라서, 골수 세포에 TLR2 작용제와 TLR9 작용제의 처리 후 분화 초기(TLR 작용제 자극 후 8, 18 및 36시간)에 유도되는 사이토카인을 분석하였다. 그 결과, 도 40에서 보는 바와 같이 TLR2 작용제로 처리한 경우 TNF-α, IL-6 및 PGE2가 유도되었고, TLR9 작용제로 처리한 경우 TNF-α, IL-6, IFN-α 및 IFN-β가 유도되었는데, 특히 TLR2 작용제로 처리한 경우 TLR9 작용제로 처리한 경우에 비하여 IL-6의 유도 정도가 두드러지는 것을 확인할 수 있었다. 단, 데이터에는 나타내지 않았으나, TLR2 및 TLR9 자극 시 IFN-γ, IL-15, IL-1β, TGF-β, IL-4, IL-12p70, IL-10 및 FLT2L은 유도되지 않은 것을 확인할 수 있었다.Hereinafter, the phenotypic, T-cell inhibitory, regulatory T cell-forming ability, and differentiation into dendritic cells in the differentiation-induced M-MDSCs upon treatment with the TLR2 agonist and the TLR9 agonist, The experiment was carried out assuming that the difference was due to the difference. Therefore, cytokines induced in the bone marrow cells after TLR2 agonist and TLR9 agonist treatment at the early stage of differentiation (8, 18 and 36 hours after TLR agonist stimulation) were analyzed. As a result, TNF-α, IL-6 and PGE2 were induced when treated with a TLR2 agonist and TNF-α, IL-6, IFN-α and IFN-β when treated with a TLR9 agonist Induced IL-6 induction, especially when treated with a TLR2 agonist, as compared to TLR9 agonists. However, IFN-γ, IL-15, IL-1β, TGF-β, IL-4, IL-12p70, IL-10 and FLT2L were not induced in TLR2 and TLR9 stimulation.
[실시예 10] 사이토카인에 의한 M-MDSCs 분화 연관성 분석[Example 10] Analysis of association of M-MDSCs with cytokines
상기 실시예 9에서 확인한 바와 같이 TLR 자극에 의해 유도되는 사이토카인에 의한 M-MDSCs 형성 및 2차 분화 억제와의 관련성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 3 method 방법에 의하되, TLR 작용제 대신에 TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β를 처리하고 배양 6일 째에 M-MDSCs와 수지상 세포의 형성 유무를 확인하였다. 도 41에서 보는 바와 같이, IL-6, PGE2, IFN-α 및 IFN-β의 처리 시 농도 의존적으로 M-MDSCs가 형성되고 수지상 세포의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. In order to confirm the relationship between M-MDSCs formation and secondary differentiation inhibition by cytokines induced by TLR stimulation as described in Example 9, the 3 method method of Example 1 was used instead of the TLR agonist TNF-α, IL-6, PGE2, IFN-α and IFN-β were treated and the formation of dendritic cells with M-MDSCs was confirmed on the 6th day of culture. As shown in FIG. 41, it was confirmed that M-MDSCs were formed in a concentration-dependent manner in the treatment of IL-6, PGE2, IFN-? And IFN- ?, and the dendritic cell differentiation was inhibited.
추가적으로 TLR9 작용제 처리 시 유도되었던 PDCA-1+ M-MDSCs 형성이 이러한 사이토카인에 의한 것인지 확인하기 위하여 상기와 같이 배양 6일 째에 얻어진 세포에 대하여 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1+ 및 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1-의 분포를 확인하였다. 그 결과 도 42에서 보는 바와 같이, 특히 IL-6 자극 시 CD11c-CD11b+Ly6G-Ly6C+PDCA-1-의 표현형을 갖는 M-MDSCs가 다량 유도되는 것을 확인할 수 있었다.In order to confirm whether PDCA-1 + M-MDSCs formation induced by TLR9 agonist treatment was caused by these cytokines, CD11c - CD11b + Ly6G - Ly6C + PDCA-1 + The distribution of CD11c - CD11b + Ly6G - Ly6C + PDCA - 1 - was confirmed. It was confirmed that the M-MDSCs having a phenotype of a large amount induction - CD11b + Ly6G - - Ly6C + PDCA-1 As a result, especially IL-6 when stimulated CD11c, as shown in Figure 42.
[실시예 11] TLR9 및 IL-6에 의한 M-MDSC의 유도능 평가[Example 11] Evaluation of induction ability of M-MDSC by TLR9 and IL-6
이에 IL-6를 통한 M-MDSCs의 분화 및 기능 평가를 위하여, 상기 실시예 1의 3 method 방법에 따라 TLR9 작용제와 함께 재조합 IL-6 또는 IL-6 수용체 차단제(IL-6 receptor blocker)를 처리한 후 배양 6일째 세포를 수확하였다. 각 처리에 따라 수확된 세포 중 MDSCs와 수지상 세포의 비율을 확인한 결과 도 43에서 보는 바와 같이, IL-6를 처리한 경우 PDCA-1+ M-MDSCs로의 분화는 증가하였고, 수지상 세포로의 분화는 더욱더 감소하였으며, IL-6 수용체 차단제를 처리한 경우에는 수지상 세포로의 분화는 증가하였고, PDCA-1+ M-MDSC로의 분화는 감소한 것을 확인할 수 있었다. In order to differentiate M-MDSCs by IL-6 and to evaluate their function, a recombinant IL-6 or IL-6 receptor blocker (TLR9 agonist) was treated with the TLR9 agonist according to the 3 method method of Example 1 Cells were harvested at 6 days after culture. As shown in FIG. 43, when the ratio of MDSCs and dendritic cells among the harvested cells was examined, IL-6 treatment increased PDCA-1 + M-MDSCs differentiation and dendritic cell differentiation In addition, IL-6 receptor blocker treatment resulted in increased dendritic cell differentiation and decreased PDCA-1 + M-MDSC differentiation.
상기와 같이 각 처리에 따라 유도된 M-MDSCs가 수지상 세포로 2차 분화되는 지 확인하기 위하여, 실시예 8에서의 수지상 세포 분화법과 같은 방법으로 5일 동안 배양하였다. 그 결과 도 44에서 보는 바와 같이, IL-6를 추가로 처리한 경우 TLR9 작용제만 처리한 경우에 비하여 M-MDSCs의 수지상 세포로의 분화 정도가 현저히 감소하여 M-MDSCs를 유지하였고, IL-6 수용체 차단제를 처리한 경우에는 그 분화 정도가 증가한 것을 볼 수 있었다.In order to confirm whether the M-MDSCs induced by each treatment were secondarily differentiated into dendritic cells as described above, the cells were cultured for 5 days in the same manner as in the dendritic cell differentiation method in Example 8. As a result, as shown in FIG. 44, when the IL-6 was further treated, the degree of differentiation of M-MDSCs into dendritic cells was remarkably decreased to maintain the M-MDSCs, When the receptor blocker was treated, the degree of differentiation was increased.
이를 통하여 골수세포에 TLR9 작용제와 같이 세포 내부에 존재하는 톨 유사 수용체의 작용제를 처리하는 경우 IL-6를 함께 처리하면 수지상 세포로 분화가 유도되지 않는 안정적인 면역 관용성 골수유래 면역반응 억제세포를 얻을 수 있음을 알 수 있다. In this case, when IL-6 is treated together with an agonistic agonist such as TLR9 agonist in the bone marrow cells, a stable immune tolerant bone marrow-derived immune response suppressor cell in which differentiation is not induced is obtained .
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (18)
상기 톨 유사 수용체 작용제는 톨 유사 수용체 7의 작용제 또는 톨 유사 수용체 9의 작용제이고,
상기 골수유래 면역반응 억제세포는 PDCA-1+ MDSC를 포함하는 것인, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.And inducing differentiation into bone marrow-derived myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) by treating toll-like receptor agonist (TLR agonist) in isolated bone marrow cells,
Wherein said toole-like receptor agonist is an agonist of tole-like receptor 7 or an agonist of tole-like receptor 9,
Wherein said bone marrow-derived immunosuppressive cells comprise PDCA-1 + MDSC.
상기 톨 유사 수용체 작용제는 골수 세포의 분화 개시 이전, 분화 개시 시점 또는 분화 중에 1회 이상 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said toole-like receptor agonist is treated at least once before the onset of differentiation of bone marrow cells, at the onset of differentiation, or during differentiation.
상기 톨 유사 수용체 작용제는 골수 세포의 분화 개시 시점에 처리된 후, 분화 개시 후 3일 이내에 1회 이상 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said toole-like receptor agonist is treated at the time of initiation of differentiation of bone marrow cells and then treated at least once within 3 days after initiation of differentiation.
상기 톨 유사 수용체 작용제는 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 양으로 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said toole-like receptor agonist is treated in an amount of 10 ng / ml to 1000 ng / ml.
상기 골수 세포에 톨 유사 수용체 작용제와 함께 인터루킨-6(interleukin-6)를 추가로 처리하는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said bone marrow cells are further treated with a tole-like receptor agonist and interleukin-6.
상기 인터루킨-6는 1 내지 100 ng/ml의 양으로 처리되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법. 6. The method of claim 5,
Wherein said interleukin-6 is treated in an amount of 1 to 100 ng / ml.
상기 골수유래 면역반응 억제세포로 분화를 유도하는 단계는 골수 세포를 성장인자 및 톨 유사 수용체 작용제를 포함하는 배지에서 배양하며 수행되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said step of inducing differentiation into said bone marrow-derived immunosuppressive cells is carried out by culturing bone marrow cells in a medium containing a growth factor and a toole-like receptor agonist.
상기 골수 세포의 분화는 성장인자를 포함하는 배지에 상기 골수 세포를 접종하여 5일 내지 10일 배양하며 수행되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.3. The method of claim 2,
Wherein the differentiation of the bone marrow cells is carried out by inoculating the bone marrow cells into a medium containing growth factors and culturing for 5 days to 10 days.
상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.9. The method of claim 8,
The growth factor may be selected from the group consisting of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor factor, M-CSF), stem cell factor (SCF), FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3 and interlukin 3 (IL-3) Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI >
상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 첨가되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.9. The method of claim 8,
Wherein the growth factor is added in an amount of 10 ng / ml to 500 ng / ml.
상기 골수유래 면역반응 억제세포는 단핵구 골수유래 면역반응 억제세포(monocytic myeloid-derived suppressor cells, M-MDSCs)인, 골수유래 면역반응 억제세포의 제조 방법.The method according to claim 1,
Wherein said bone marrow-derived immune response-suppressing cells are monocytic myeloid-derived suppressor cells (M-MDSCs).
상기 톨 유사 수용체 작용제는 톨 유사 수용체 7의 작용제 또는 톨 유사 수용체 9의 작용제이고,
상기 골수유래 면역반응 억제세포는 PDCA-1+ MDSC를 포함하는 것인, 조성물.A composition for inducing differentiation of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) comprising a toll-like receptor agonist (TLR agonist)
Wherein said toole-like receptor agonist is an agonist of tole-like receptor 7 or an agonist of tole-like receptor 9,
Wherein said bone marrow-derived immunosuppressive cells comprise PDCA-1 + MDSC.
상기 톨 유사 수용체 작용제는 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 양으로 포함되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.13. The method of claim 12,
Wherein the toll-like receptor agonist is contained in an amount of 10 ng / ml to 1000 ng / ml.
상기 조성물은 인터루킨-6(interleukin-6)를 추가로 더 포함하는, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.13. The method of claim 12,
Wherein the composition further comprises interleukin-6 (interleukin-6).
상기 인터루킨-6는 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 양으로 포함되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.15. The method of claim 14,
Wherein said interleukin-6 is contained in an amount of 10 ng / ml to 1000 ng / ml.
상기 조성물은 성장인자를 더 포함하는, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.13. The method of claim 12,
The composition for inducing differentiation of bone marrow-derived immune response suppressor cells further comprising a growth factor.
상기 성장인자는 과립구-큰포식 세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 큰포식 세포 콜로니 자극 인자(macrophage colony stimulating factor, M-CSF), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF), FMS-유사 티로신 키네이즈 3(FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3) 및 인터루킨 3(interlukin 3, IL-3)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.17. The method of claim 16,
The growth factor may be selected from the group consisting of granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor factor, M-CSF), stem cell factor (SCF), FMS-like tyrosine kinase 3, Flt3 and interlukin 3 (IL-3) A composition for inducing differentiation of bone marrow-derived immune response suppressor cells.
상기 성장인자는 10 ng/ml 내지 500 ng/ml의 양으로 포함되는, 골수유래 면역반응 억제세포의 분화 유도용 조성물.17. The method of claim 16,
Wherein the growth factor is contained in an amount of 10 ng / ml to 500 ng / ml.
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