KR101952712B1

KR101952712B1 - 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극

Info

Publication number: KR101952712B1
Application number: KR1020170139590A
Authority: KR
Inventors: 황이택
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2019-02-27

Abstract

본 발명은 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 태양전지에 활용될 수 있는 단백질 필름 전극에 관한 것이다. 이를 위해 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극은 일면에 금속층이 코팅된 실리콘 웨이퍼; 상기 금속층에 흡착된 금속단백질(metalloprotein)층; 및 상기 금속단백질층에 흡착된 나노입자;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극{PROTEIN FILM ELECTRODE ADSORBED NANOPARTICLES}

본 발명은 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 태양전지에 활용될 수 있는 단백질 필름 전극에 관한 것이다.

태양 에너지를 연료 생산에 사용하는 것은 지속 가능하고, 환경 친화적인 과정 중에서 가장 유망한 과정 중의 하나이다. 생물학에서, 광합성은 다수의 단백질과 효소를 이용하여 빛 에너지를 화학 에너지로 변환한다. 자연계 광합성이 지닌 높은 양자 수율은 특히 인공 태양 연료 시스템 영감의 원천이 될 수 있다. 광화학계 I 및 II (PSI 및 PSII)가 지닌 높은 양자 수율을 공유하고 탐험하기 위해 연료 생산 및 물분해를 위한 생물광전지(biophotovoltaics), 광전자공학(optobioeletronics)에 적용되어 다양한 광바이오전자 전략들이 보고되고 있다. 태양 연료 생산을 위해 백금의 사용, 유기 금속 촉매 및 산화 환원(redox) 효소를 이용 하는 예들이 탐색 되고 있다.

지난 10 년간 괄목할 만한 진전이 있었음에도 불구하고 단백질의 정제에 장시간이 걸리고, 고비용 과정이라는 점, 특히, PSII 단백질은 빛에 노출된 조건에서 수명이 단축된다는 점에서 양자점(Quantum dot, QD) 또는 감광제-나노입자(DS-NP, Dye Sensitized-Nanoparticle) 에서 빛을 발생시켜 리독스 효소와 함께 수소와 탄소계 연료 등의 화학 연료를 합성하는 기술이 개발되었다. 그러나 후자의 시스템은 비효율적인 전자 전달 및 촉매 공정과의 결합과정에서 발생하는 비생산적인 전하 분리와 낮은 양자 수율을 초래하였다.

한편, cytochrome c와 플라스토시아닌(작은 구리 함유 단백질) 등의 리독스 단백질은 전하 분리 상태 및 전반적인 양자 효율을 개선하기 위해 시험되고 있다. 예를 들어 CdS 양자점으로 이루어진 광전극 용액에 산화/환원 된 cytochrome c가 첨가되어 광전류 방향(산화 또는 환원) 및 광전류 크기를 제어하는 것이 가능하게 되었다. 그러나 cytochrome c 및 플라스토시아닌은 1개의 산화/환원 활성 자리만을 가진다. 이와 같이 전하 분리 상태를 만들어내는 능력은 당연히 한정될 수 밖에 없다. 또한 1개의 산화/환원 활성 센터는 양자점이나 DS-NP가 산화/환원 활성 부위로의 효율적인 전자 전달경로 없이 cytochrome c와 플라스토시아닌에 단지 결합만 하는 많은 사례들도 보고되었다. 마지막으로, 비록 전하 분리 상태가 발생하더라도, 화학 연료의 합성을 위해 전극 촉매로 전달하기 위해 다른 경로가 필요하다. 다시 말해서, 양자 수율을 향상시키기 위해, 전자 이동을 위한 상이한 입구 및 출구 위치가 존재하는 리독스 단백질을 사용할 필요가 있다는 것을 의미한다.

이에 상기 단점들을 보완하여 양자 수율을 향상시키기 위한 단백질 전극에 대한 개발이 요구되고 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1196819호

M. Breuer, K. M. Rosso, J. Blumberger, Proc Natl Acad Sci USA 2014, 111, 611-616. G. F. White, Z. Shi, L. Shi, Z. Wang, A. C. Dohnalkova, M. J. Marshall, J. K. Fredrickson, J. M. Zachara, J. N. Butt, D. J. Richardson, T. A. Clarke, Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110, 6346-6351. E. T. Hwang, K. Sheikh, K. L. Orchard, D. Hojo, V. Radu, C. Y. Lee, E. Ainsworth, C. Lockwood, M. A. Gross, T. Adschiri, E. Reisner, J. N. Butt, L. J. C. Jeuken, Adv. Funct. Mater. 2015, 25, 2308-2315. We have identified a small error in this publication regarding the quantification of the electroactive coverage of one of the components of the dyesensitized photoanodes, namely, the decaheme protein MtrC. The values given in this paper are the corrected values for MtrC coverage. S. A. Trammell, J. A. Moss, J. C. Yang, B. M. Nakhle, C. A. Slate, F. Odobel, M. Sykora, B. W. Erickson, T. J. Meyer, Inorg. Chem. 1999, 38, 3665-3669.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 양자 수율을 향상시킬 수 있는 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적과 이점은 바람직한 실시예를 설명한 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.

상기 목적은, 일면에 금속층이 코팅된 실리콘 웨이퍼; 상기 금속층에 흡착된 금속단백질(metalloprotein)층; 및 상기 금속단백질층에 흡착된 나노입자;를 포함하는 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극에 의해 달성될 수 있다.

이때, 상기 금속층은, 금(gold)으로 형성될 수 있고, 상기 금속단백질층은, 데카헴 시토크롬(decaheme cytochrome)으로 형성될 수 있다.

구체적으로, 상기 데카헴 시토크롬은 MtrC 또는 OmcA일 수 있다.

또한, 상기 나노입자는, 감광제와 결합된 이산화 타이타늄(TiO₂) 또는 황화카드뮴 양자점(CdS Quantum dot)일 수 있다.

본 발명에 따르면, 양자 수율을 향상시킬 수 있는 단백질 필름 전극을 제공할 수 있다.

또한, 이를 활용하여 태양 전지 등 다양한 에너지 기술 분야에 적용할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

다만, 본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1의 a의 좌측은 MtrC의 구조(pdb code: 4lm8)를 개략적으로 나타낸 도면이고, 우측은 여러 개의 헴이 돌출된 단백질 구조를 나타낸 도면이며, 도 1의 b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2의 맨 위는 TiO₂-OA(oleic acid), TiO₂-3HAP, TiO₂-NH₃ ⁺(=TiO₂-DHA)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이고, 중간은 RuP, TiO₂-NH₃ ⁺(=TiO₂-DHA), RuP-TiO₂-NH₃ ⁺의 FT-IR 스펙트럼(* 표시된 peak는 RuP 그룹의 포스페이트에 대응됨)이며, 맨 아래는 3HAP와 DHA의 FT-IR 스펙트럼(# 표시된 peak는 N-H 진동에 대응됨)을 나타낸 것이다.
도 3의 좌측은 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노 결정의 TEM 이미지를 나타낸 것이고, 우측은 크기 분포 히스토그램을 나타낸 것이다(히스토그램은 TEM 이미지로부터 무작위로 추출한 300 나노 결정의 측정으로부터 준비되었고, TiO₂-NH₃ ⁺ 나노 결정의 크기는 5.8 ± 1.0nm로 평가되었다. 이 비교적 큰 크기의 분포는 완벽한 구형에서 벗어난 나노 결정의 모양 때문이었다. 2차원 투사 화상이 TEM으로부터 취해지기 때문에 겉보기 크기 분포가 증가된다.).
도 4는 동결 건조된 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노 결정의 열중량(TG) 분석을 나타낸 것(무게%와 온도는 가열 시간(분)에 대해 플롯됨)이다.
도 5는 수용액에서 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노 결정의 제타 전위(파란색 원, 왼쪽 축) 및 유체 역학(hydrodynamic) 직경(빨간색 원, 오른쪽 축)을 나타낸 것(등전점은 유체역학 반경의 증가에 의해 제안된 바와 같이 나노 입자의 응집과 일치하는 pH 5.1에서 결정됨)이다.
도 6은 CdS-OA, CdS-COO^-, CdS-N(CH₃)₂H⁺의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 7의 (A)는 CdS-OA의 TEM 사진이고, (B)는 CdS 스펙트럼(흑색, PDF 번호 01-080-0019 10-454)과 비교하여 CdS-COO^-(흑색 선) 및 CdS-N(CH₃)₂H⁺(청색 선)의 X 선 회절(XRD) 패턴을 나타낸 것이다.
도 8은 합성된 CdS 양자점의 용액상 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 것(물에서 CdS-COO^-(검은 선) 및 CdS-N(CH₃)₂H⁺(청색 선))이다.
도 9는 수용성 버퍼용액(pH 7.4에서 20 mM MOPS, 30 mM Na₂SO₄)에서 6-OH/6-NH₃ ⁺(80/20의 비율)의 SAM으로 개질된 금 전극 상에 OmcA가 흡착되기 전(회색)과 후(검은색)의 CV(1Vs^-1, 20℃)를 나타낸 것(삽입(inset)된 것은 기준선을 뺀 산화환원 피크 최대값을 보여줌)이다.
도 10은 -0.5V(적색, 음전하)에서 +0.5V(청색, 양전하)까지 전위가 조정된 CCP4mg을 사용하여 계산된 MtrC 및 OmcA의 정전기 표면 맵을 나타낸 것이다.
도 11은 21℃에서 금 결정(crystal)의 시간에 대한 진동수(검은선, 왼쪽 축) 및 손실(회색선, 오른쪽 축)로 나타낸 QCM-D 결과(금 표면은 실험 전에 6-OH/6-NH₃ ⁺(비율 80/20) SAM으로 개질되었고, 표시된 플롯은 3회의 실험을 대표함. 금 코팅된 QCM-D 결정은 연속적으로 배양(incubated)됨 : A) OmcA(1 mM) in buffer(20 mM MOPS, 30 mM Na₂SO₄, pH 7.4); buffer only; EDTA(25 mM EDTA, pH 7.4); RuP-TiO₂-COO^-(0.2 mgmL^-1) in EDTA, EDTA / B) OmcA(1 mM) in buffer(20 mM MOPS, 30 mM Na₂SO₄,pH 7.4); buffer only; TEOA(25 mM TEOA, pH 7.4); CdS-N(CH₃)₂H⁺(0.2 mgmL^-1) in TEOA, TEOA.)이다.
도 12는 인가된 바이아스 전위의 효과를 나타낸 것이다. (A) OmcA/RuP-TiO₂-COO^-(+OmcA), RuP-TiO₂-COO^-(-OmcA)를 25mM EDTA 존재(+EDTA), 부존재(-EDTA) 하에서 측정, (B) OmcA/CdS-N(CH₃)₂H⁺(+OmcA), CdS-N(CH₃)₂H⁺를 25 mM TEOA 존재(+TEOA) 및 TEOA 부존재(-TEOA)하에서 측정, (C) OmcA/RuP-TiO₂ _-COO^-, OmcA/CdS-N(CH₃)₂H⁺의 정규화된 광전류(희생 전자 주개를 사용하여 일반화된 광전류와 광희생 전자 주개의 일반화된 광도의 차이)를 나타냄.
도 13은 decaheme/RuP-TiO₂-COO^-(왼쪽)와 decaheme/CdS-N(CH₃)₂H⁺(오른쪽)의 에너지 다이어그램을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.

도면에서 제안된 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다. 그리고, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서에서 기술한 "부"란, 특정 기능을 수행하는 하나의 단위 또는 블록을 의미한다.

각 단계들에 있어 식별부호(제1, 제2, 등)는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

도 1의 a의 좌측은 MtrC의 구조(pdb code: 4lm8)를 개략적으로 나타낸 도면이고, 우측은 여러 개의 헴이 돌출된 단백질 구조를 나타낸 도면이며, 도 1의 b는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1을 참조하여 설명하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극은 일면에 금속층이 코팅된 실리콘 웨이퍼; 상기 금속층에 흡착된 금속단백질(metalloprotein)층; 및 상기 금속단백질층에 흡착된 나노입자;를 포함한다. 즉, 도 1과 같이 금속층 상부에 금속단백질층이 형성되고, 금속단백질층 상부에 나노입자가 형성(고정)되어 전자 전달 효과를 개선함으로써 양자 수율을 향상시킬 수 있는 효과를 가진다. 또한, 이를 태양 전지와 같은 다양한 에너지 기술 분야에 적용할 수 있는 효과를 가질 수 있다.

실리콘 웨이퍼는 기재 역할을 하는 것으로, 일면에는 금속층이 코팅되어 있다. 금속층은 특별히 제한되는 것은 아니며, 금, 은 등 다양한 금속으로 형성할 수 있고, 표면이 매끄러운 금을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 금속층 대신 그래핀, 그래파이트와 같은 카본층을 형성하는 것도 가능하다. 금속층을 형성한 후에는, 금속단백질층이 효과적으로 형성될 수 있도록 아민, 싸이올 등의 다양한 케미칼(chemical)(SAM 용액)을 자기 조립 방법에 의해 결합하여 표면에 자기 조립 단층(self assembled monolayer, SAM)을 형성하는 것이 바람직하다.

금속단백질(metalloprotein)층은 실리콘 웨이퍼의 일면에 코팅된 금속층에 흡착하여 형성된다. 일반적으로, 광화학계에서 리독스 단백질의 이상적인 특성은 (a) 리독스 그룹이 나노입자로부터 전기 촉매/전극으로의 전하 이동을 허용하기 위해 단백질의 상이한 일면 또는 측면으로부터 접근 가능하고, (b) 잘 연결된 다중의 리독스 그룹에 전하(즉, 전자)가 금속단백질에 흡착된 나노입자(양자점 또는 DS-NP)로부터 신속하게 분리 될 수 있도록 연결된 산화/환원 활성 부위가 존재해야 하는 것인데, 금속단백질은 금속 보조 인자가 결합한 단백질로서, 이러한 특성을 잘 만족한다.

금속단백질은 데카헴 단백질 계열인 데카헴 시토크롬(decaheme cytochrome)을 사용할 수 있다. Shewanella의 종으로부터 유래된 데카헴 단백질 계열은 합성 화합물에서 잘 모방하기 어려운 매우 잘 정렬된 리독스 위치를 지니고 있다. 그들의 헴(heme)은 헴(heme) 중 8 개가 모양을 이루어 비틀거리는 십자가로 배열되어 있다. 단백질을 가로 지르는 2 개의 말단 표면에 접촉하는 7 nm 크기의 와이어 형태로 별도의 4개의 헴 와이어가 직각 방향으로 뻗어 있으며 양쪽 끝의 단백질 표면에도 접촉하고 있다. 인접한 헴은 매우 빠른 내부 단백질 전자 교환에 최적인 환원 전위를 지니고, 전자적인 결합을 위해 근접하여 위치한다. 데카헴 단백질은 외막의 세포 밖 측면에 위치하고 있다.

데카헴 시토크롬은 MtrC 또는 OmcA를 사용할 수 있다. MtrC 및 OmcA는 구조상 동일하고, 둘 다 외부막 관련 시트크롬이며, 혐기성 호흡 과정 중 S. oneidensis가 전자를 세포 외로 전달하여 미네랄의 환원에 중요한 역할을 한다. OmcA는 MtrC보다 덜 하전되었으며, 추정 pI(등전점)는 각각 6.2와 5.6 이다.

나노입자는 금속단백질층의 일면에 흡착되어 고정된다. 나노입자는 전자를 발생시킬 수 있는 나노 사이즈의 입자를 의미하는 것으로서, 금속단백질층의 표면에 흡착될 수 있다면 금속이든 비금속이든 모두 가능하고, 평균 직경이 5~50nm인 것이 바람직하다. 나노입자는 이산화 타이타늄(TiO₂)또는 황화카드뮴(CdS)을 코어로 갖는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 감광제와 결합된 이산화 타이타늄(일 예로, RuP-TiO₂) 또는 황화카드뮴 양자점을 사용할 수 있다. 또한, 나노입자는 리간드 껍질(ligand shell)로 표면 처리되어 사용되는 것이 바람직하고, 리간드는 카르복실산이나 아민 등을 사용할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[제조예]

물질(Materials)

4-Morpholine propane sulfonic acid(MOPS), 4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid(HEPES), sodium sulfate, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) disodium salt dehydrate, triethanolamine(TEOA), 8-mercaptooctanol, 6-mercaptohexanol, 8-amino-1-octanethiol hydrochloride, ethanol, 6-amino-1-hexanethiol hydrochloride, cadmium oxide(99.998%), octadecene(ODE, 90%), oleic acid(OA, 90%), sulfur(99.998%), 3-mercaptopropionic acid(MPA, ≥99%), 2-(dimethylamino)ethanethiol hydrochloride(DMAET, 95%), tetramethylammonium hydroxide pentahydrate(TMAOH, 99%)는 Sigma Aldrich(UK)에서 구입하였고, isopropanol, methanol, chloroform, dichloromethane은 Fisher Chemicals에서 구입하였으며, titanium tetraisopropoxide, oleic acid, hexadecylamine, methyl 3,4-dihydroxybenzoate(DHBA)는 Wako Pure Chemical Industries Ltd에서 구입하였고, EPOTEK 307은 Epoxy technology로부터 구입하였다. 모든 시약 및 용매는 추가 정제없이 사용하였다. [Ru(bpy)2(4,4'-(PO₃H₂)₂ bpy)](Br)₂(RuP; bpy=2,2'-bipyridine)는 공지된 방법에 따라 합성하였다. OmcA와 MtrC는 95% 이상의 순도로 정제되었다. OmcA와 MtrC의 발현 구조는 재조합된 C 말단 폴리 히스티딘 서열을 포함하고 있지만 단백질은 전통적인 히스택 친화성 크로마트그래피(his-tag affinity chromatography)로 정제할 수 있다. LC-MS 분석은 재조합된 C- 말단 서열이 부분적으로 소실되고 엔테로 키나아제 프로테아제 포함된 시퀀스(sequence) 또는 그 근처에서 종결(termination)되었다. 초순수(Milli-Q water, 18.2 MΩ cm)가 전반적으로 사용되었다.

RuP-TiO ₂ 나노입자의 합성

전구체인 titanium tetraisopropoxide 1 mmol과 modifiers로 3 mmol 의 올레산과 0.5 mmol의 hexadecylamine 을 전처리를 위해 120℃에서 5 분 동안 가열하고, 혼합물을 내압식의 Hastelloy^® sphere을 지닌 (Hastelloy^®) 용기 (내부 부피 = 5 mL)에 넣었다. 이는 전구체와 modifier가 잘 섞이게 하기 위한 것이다. 이후에 solvothermal 반응이 용기 내에서 400℃에서 10분 동안 일어났다. 유기 리간드 처리된 나노 결정을 사이클로 헥산(3 mL)을 사용하여 생성 혼합물로부터 추출하였다. 생성물을 에탄올(3 mL)을 사용하여, 생성된 사이클로헥산 상으로부터 항용매 제제로서 침전 시키고 원심 분리를 사용하여 분리시켰다. 원심 분리된 생성물을 사이클로헥산(3 mL)과 에탄올(3 mL)의 혼합물로 2회 세척하였다. 세척된 생성물을 사이클로헥산(5 mL)에 용해시켜 올레산으로 캡핑된 TiO₂ 나노입자가 합성되었다.

TiO₂-COO^- 입자는 올레산으로 캡핑된 TiO₂ 나노입자(2 mL, 0.7 중량%)를 methyl-3,4-dihydroxy benzoate(MDB)(2 mL 에탄올 중 25 mg)용액에 첨가한 후, Triethylamine(200 mg)을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 교반하여 리간드 교환을 완료시켰다. MDB의 카테콜 그룹이 올레산과 치환반응이 일어나고, 원심분리를 통해 남은 MDB와 올레산을 분리시켰다. 원심분리한 나노입자를 사이클로헥산(4.5 ml)과 에탄올(4.5 mL) 혼합물로 세척한 후, 물(9 mL)에 분산시키고, 50 ㎕ KOH aqua(5 M)를 첨가하여 30분간 교반시킨 후, 추가적으로 30분 초음파 분산시키면 MDB 내의 에스터 결합이 가수분해되어 최종적으로 3,4-dihydroxybenzoic acid(DHBA)-TiO₂가 합성된다. 아세톤(5 mL)을 첨가하고 입자를 원심 분리에 의해 분리하였다. 마지막으로, 입자를 물(4 mL)에 분산시키기 전에 아세톤(5 mL)과 물(4 mL)의 혼합물로 세척하였다. 세척한 DHBA-TiO₂를 물(4 mL)에 분산시키면 카르복실 그룹이 치환된 Ti0₂(TiO₂-COO^-)가 합성된다.

아민 작용기 입자(TiO₂-NH₃ ⁺)는 올레산으로 캡핑된 TiO₂ 나노입자(2 mL, 0.7 중량 %)를 N-(3,4-dihydroxyphenyl)acetimide(2 mL 에탄올 중 25 mg)용액에 첨가한 후, Triethylamine(200 mg)을 첨가하여 실온에서 2 시간 동안 교반하여 리간드 교환을 완료시켰다. 나노입자는 원심 분리를 이용하여 분리한 다음 KOH(5M, 50 mL)가 혼합된 에탄올(4 mL)에 분산시키고 1 시간 동안 교반하여 아미드 결합을 아민기로 가수 분해시켰다. 에탄올(3 mL)을 첨가하고 입자를 원심 분리에 의해 분리하였다. 마지막으로, 입자를 물(3 mL)에 분산시키기 전에 아세톤(5 mL)과 물(1 mL)의 혼합물로 세척하였다.

RuP-TiO₂-NH₃ ⁺ 입자와 RuP-TiO₂-COO^-는 같은 방법으로 제조하였다. 즉, RuP(1mM)의 수용액을 TiO₂ 용액에 1 μ용ol RuP/5 mg TiO₂ 의 비율로 첨가하여 1시간 동안 혼합 시켜서 RuP가 TiO₂ 표면에 흡착을 유도하였다. 1시간 후 빛을 피할 수 있는 조건에서 보관하였다.

CdS 나노입자의 합성

CdS 나노입자는 소수성, 올레산으로 캡핑된 CdS 양자점(CdS-OA)을 표준 고온 주입 방법과 양성(CdS-N(CH₃)₂H⁺) 또는 음성(CdS-COO^-) 리간드 교환 절차를 통해서 합성되었다. CdS-OA 합성을 위해 간단히, CdO(0.64 g) 및 OA(29 ml)를 ODE(89 mL)에 혼합하여 Ar 조건하에 280℃로 가열하였다. 황산 용액(0.08 g 황산 in 24 mL ODE)을 신속하게 첨가하고, 반응을 2 분 동안 계속 한 다음 수조에서 급냉 시켰다. 입자는 헥산 : 메탄올을 1 : 1의 몰 비로 혼합한 용액(100 mL) 및 과량의 아세톤을 사용하여 원심분리 하였다. 원심 분리 후, 헥산(20 mL)에 혼합하기 전에, 용매 및 비용매로서 각각 헥산 및 아세톤을 사용하여 입자를 추가로 2회 세척 하였다.

CdS-COO^-는 다음과 같이 제조하였다. CdS-OA 용액(2 mL)을 pH 11의 MPA 용액(0.5 mL in 메탄올 : 클로로폼이 1 : 1의 몰 비로 혼합된 용액 10 mL)에 첨가 하였다. 용액을 16 시간 이상 동안 교반한 후 원심 분리(5000g, 5분) 및 용매로서 메탄올 및 아세톤으로 각각 세척하였다. 최종 침전물을 탈 이온수(1 mL)에 분산시켰다.

CdS-N(CH₃)₂H⁺는 다음과 같이 제조하였다. CdS-OA 용액(1 mL)을 Schlenk 플라스크에 첨가하고 용매를 제거하였다. 입자를 Ar조건 하에 CHCl₃(0.5 mL)에 재혼합하여, DMAET 용액(1 mL, 메탄올 중 1M)을 첨가하였다. 혼합물을 빛으로부터 보호하고, 16 시간 동안 격렬하게 교반하였다. 입자를 과량의 아세톤으로 침전 시키고 원심 분리(5000g, 5 분)한 후, 입자를 탈 이온수(0.5 mL)에 분산시키기 전에 추가로 2 회 세척하였다.

단백질 필름 전극 제조

금(gold)이 코팅된 실리콘 웨이퍼인 TSG(template stripped gold)는 다음과 같이 준비하였다. Edwards Auto 306을 사용하여 실리콘 웨이퍼(IDB Technology Ltd, UK)상에서 150 nm 두께의 금(99.95 %; Goodfellow)을 증발시켜 표면에 코팅시킨다. 증발 후, 1.2 cm² 유리 슬라이드를 Epo-Tek 377 glue를 이용하여 120℃에서 2시간 배양시킨다. 갓 분리 된 유리 슬라이드를 이용하여, 0.8 mM 8-mercaptooctanol / 0.2 mM 8-amino-1-octanethiol 또는 0.8 mM 6-mercaptohexanol / 0.2 mM 6-amino-1-hexanethiol 용액을 이용하여 물에 4℃에서 최소 2일 동안 TSG 표면을 노출시킴으로써 자기 조립 단층(SAM)을 제조 하였다. 과량의 티올을 물로 부드럽게 씻어 내고 전극을 질소 기체를 이용하여 건조시켰다.

단백질 필름을 제조하기 위해, 전기 화학 셀을 이용하였다. SAM으로 변형된 TSG는 유리 전기 화학 셀 용기에 작업 전극으로 배치된다. 상대 전극은 백금 와이어를, 기준 전극은 포화 수은 / 수은 황산 전극(Hg / HgSO₄; Radiometer analtical, 프랑스)을 사용하였다. 모든 퍼텐셜(potential)은 Hg / HgSO₄ 기준 전극에 대해 0.649 mV vs SHE를 사용하는 표준 수소 전극(SHE)으로 치환한 수치를 이용한다. 2 mL 전해질 완충액 (20 mM MOPS, pH 7.4의 30 mM Na₂SO₄)에서 'blank' cyclic voltammograms(CV)을 측정 한 후, 완충액을 제거하고 완충액에서 50㎕ MtrC(0.87 mM) 또는 OmcA(1.2 mM)를 작업 전극 표면에 직접 첨가하고 20℃에서 1분 동안 배양하여 단백질 필름 전극(OmcA film 및 MtrC film)을 제조하였다. 전극을 2 mL 버퍼로 3 회 이상 세척하였다.

[실시예]

단백질 필름 전극(OmcA film 또는 MtrC film) 상에 RuP-TiO₂ 또는 CdS를 흡착시키기 위해, 단백질 필름 전극 표면에 50μL의 RuP-TiO₂ 나노입자 또는 CdS 나노입자(전형적으로 25 mM EDTA 또는 25 mM TEOA 중 0.2~0.5 mg mL^- ¹)를 첨가 하였다. 5~10 분 동안 인큐베이션 한 후, 전기 화학 장치를 여러 번 세척하여 결합되지 않은 RuP-TiO₂ 또는 CdS를 제거 하였다. 같은 방법으로 리간드 껍질(카르복실산, 아민)로 표면처리된 나노입자도 흡착하였다. OmcA film에 RuP-TiO₂-COO^- 나노입자가 흡착된 것을 실시예 1, RuP-TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자가 흡착된 것을 실시예 2, CdS-N(CH₃)₂H⁺ 나노입자가 흡착된 것을 실시예 3, CdS-COO^- 나노입자가 흡착된 것을 실시예 4로 하였다. 또한, MtrC film에 RuP-TiO₂-COO^- 나노입자가 흡착된 것을 실시예 5, RuP-TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자가 흡착된 것을 실시예 6, CdS-N(CH₃)₂H⁺ 나노입자가 흡착된 것을 실시예 7, CdS-COO^- 나노입자가 흡착된 것을 실시예 8로 하였다.

[비교예]

실시예와 동일한 방법으로 OmcA 또는 MtrC가 흡착되지 않고, self assembled monolayer(SAM)로 조립된 금전극에서도 수행하여 나노입자를 흡착시켰다.

[실험예]

RuP-TiO ₂ 및 CdS 나노입자의 특성

투과 전자 현미경(TEM, HitachiH7650, Hitachi)은 200 keV에서 고해상도 이미지를 기록하는데 사용되었다. X-선 회절(XRD) 패턴은 4.00°min^-1의 주사율로 CuKa 방사(l = 1.5418λ)를 사용하여 값을 얻었다. 제타 전위 측정은 Malvern Instruments 나노 복합체 크기 분석기(NanoZS, Worcestershire, UK)를 사용하여 수행되었다. FT-IR 스펙트럼은 ATR 모드의 Thermo Scientific Nicolet iS50 FTIR 분광기, 자외선 분광법은 Varian Cary 50 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 수행되었다. 열 중량 측정(TG) 분석(TG8120, Rigaku)은 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자의 표면에 부착된 치환기 또는 분자의 양을 측정하기 위해 수행되었다. TG 분석을 위해 2.03 mg의 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자를 넣고, 탈수를 위해 150℃에서 2시간 동안 온도를 유지 한 다음, 20℃ min^-1의 속도로 800℃로 상승시켰다.

TiO₂-NH₃ ⁺의 FT-IR 스펙트럼은 ~1600cm^-1에서 N-H 굴곡 진동을 나타내어 올레산으로 부터 3HAP 로의 리간드 교환 및 DHA으로의 가수 분해가 일어났음을 확인하였다(도 2 참조). 리간드 교환 동안 결정상 또는 입자 크기의 변화는 일어나지 않았다.

합성 및 리간드 교환 공정 후의 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자의 크기는 5.8±1.0 나노미터로 TEM 분석에 의해 측정되었다(도 3 참조). 이는 알려진 TiO₂-COO^-의 크기와 유사하였다(6.8 ㎚±0.7 ㎚). TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자의 DHA의 양은 열중량 분석 (도 4 참조)에 의해 정량되었고, 이전에 TiO₂-COO^-에 대해 측정된 7.26%와 비교하면 12.27%(w/w)인 것으로 나타났다. TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자(측정된 표면적 107±37 nm² 및 부피 105±53 nm³) 및 DHA의 분자량(125.13 gmol^-1) 및 아나타제(anatase)상의 밀도(3.8 gcm^- ³)를 고려하면, 나노 입자에 붙어있는 DHA 분자는 2.5 nm^-2(TiO₂-COO^-의 경우 1.4 nm^- ²)로 측정된다. 제타 전위 측정(도 5 참조)은 pH 5.1에서 pI를 나타내고, 이는 아민으로 변형된 나노입자에 대해 초기 예상보다 낮았다. 그러나, 어떤 아닐린의 pKa는 매우 민감하여 고리 치환체 및 콘주게이션 형태의 pKa가 4.9 의 값을 지닌다는 사실에 비추어 아미노페놀보다 훨씬 낮다. 또한, TiO₂ 중심의 표면은 제타 전위에 크게 기여할 수 있다(TiO₂ 나노입자의 제타 전위는 그 모양과 합성에 크게 의존하는 것으로 알려져 있다). FT-IR 분석과 결합하여, TiO₂ 나노입자에서 3HAP 리간드가 DHA로 가수 분해된다는 것을 알 수 있었다. TiO₂-COO^-의 제타 전위는 4.5로 알려져 있고, pH 7에서, TiO₂-COO^-및 TiO₂-NH₃ ⁺ 는 각각 34±5 및 20±5 mV였다. RuP로 캡핑된 TiO₂-COO^-에 대해 알려진 것과 같이 TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자는 UV-vis 분광법에 의해 RuP-TiO₂보다 작은 48±19 nmol(mg TiO₂)^-1로 (90 내지 20 nmolmg^- ¹)로 측정되었다. 이러한 값의 차이에도 불구하고, RuP의 흡착은 두 입자 모두에 대해 제타 전위에 유사한 영향을 미치며, 이는 pH 7에서 약 10~15 mV 이다 (RuP-TiO₂-COO^-의 경우 약 23±5 및 RuP-TiO₂-NH₃ ⁺의 경우 약 12±5 mV). RuP-TiO₂-NH₃ ⁺는 건조된 상태에서, FT-IR 스펙트럼은 RuP로부터 포스포네이트 공명 특성을 나타내었다(도 2 참조).

올레산 캡핑된 CdS 양자점(CdS-OA)은 고온 주입법에 의해 제조되었고, CdS-N(CH₃)₂H⁺ 와 CdS-COO^-는 리간드 교환에 의해 양전하 또는 음전하 표면 전하를 갖는 수용성 양자점(QD)으로 합성되었다. 리간드 교환은 FT-IR(도 6 참조)에 의해 확인되었고, 결정상(XRD, 도 7 참조) 또는 입자 크기(d = 4.4 nm; UV-vis adsorption λ_max = 430 nm에 기초함; 도 8 참조)에 변화가 없음이 관찰되었다. pH 7에서의 제타 전위는 각각 입자의 상이한 리간드가 반영되여 CdS-N(CH₃)₂H⁺ 및 CdS-COO^-에 각각 38±2 및 -39±6 mV 인 것으로 밝혀졌다.

단백질 필름 전극의 특성

(1) 전압 전류법(cyclic voltammetry, CV)

전압 전류법 측정은 PGSTAT 128N 전위차계, SCANGEN 및 ADC10M 모듈 및 FRA2 주파수 분석기(Ecochemie)가 장착된 Autolab 전기 화학 분석기(Eco-chemie, Utrecht, Netherlands)를 사용하여 20℃에서 측정되었다. CV 실험은 400 mV ~ -500 mV(SHS)의 전위 창에서 1Vs^-1의 스캔 속도로 사이클링하기 전에 5초 동안 0.19V에서 전위를 유지한 후 수행되었다. 분석은 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어 Q-Soas를 이용하였고, 전파의 영향을 최소화하기 위해 모든 실험을 패러데이 케이지에서 수행했으며 산소 환원을 피하기 위해 아르곤 가스로 퍼징을 수행하였다.

음전하를 띤 금전극에 흡착된 MtrC 또는 OmcA 필름은 어떤 산화/환원 신호도 관찰되지 않았다. 대조적으로, 양전하 또는 중성 SAM에서, OmcA(도 9 참조)는 400 ~ 0 mV 사이의 산화 및 환원 신호가 관찰되었다. 이는 중성 pH에서, OmcA는 MtrC와 마찬가지로 전반적인 음전하를 띄지만(도 10 참조) OmcA는 pI(등전위점)이 더 높다(추정된 pI는 OmcA 및 MtrC의 경우 각각 6.2 및 5.6 임). 또한, 양으로 대전된 SAM은 c-type heme의 음으로 하전된 프로피오네이트(propionate) 그룹과 유리하게 상호 작용하여, 전자가 전극과 신속하게 교환되는 오리엔테이션을 유도할 것으로 기대되었다. 실제로, CV 그래프는 1000 mVs^-1 스캔 속도에서도 거의 완전히 가역적인 산화/환원 신호를 나타내며, k₀ > 100 s^-1(k₀는 제로 과전압에서의 전자 전달 속도)로 빠른 계면 전자 전달 속도를 보였다. 산화/환원 신호의 형태는 스캔 속도를 변화시킬 때 크게 변화하지 않지만, 표준화된 피크 면적(즉, heme군의 전기 활성 커버리지)은 1000 mVs^-1의 스캔 속도까지 바뀌지는 않는다. 이는 heme 사이의 전자 교환이 또한 매우 빠르다는 점을 예측가능하고, 이전에 보고 된 바와 같이 100 s^-1이상으로 예측되는 것과 일치하는 값이다. OmcA와 MtrC 모두에 대해 가장 높은 전기적 활성 범위를 보이는 SAM 조건은 알킬체인의 최적 길이가 두 decaheme cytochromes에 대해 약간 달랐지만, 알코올과 아민 종결 알칸 티올의 80/20 혼합물로 구성된 SAM을 사용하여 달성된 점은 유사하였다(하기 표 1 참조). SAM에서 알칸 티올의 사슬 길이가 OmcA와 MtrC에 다르게 영향을 미치는 이유는 분명하지 않지만, 짧은 사슬 길이는 보다 유동적이거나 무질서화 된 SAM을 만들 수 있다고 가정되며, 이는 OmcA에게는 유리한 조건으로 보인다.

[표 1] QCM-D 및 CV로 결정된 다른 SAM-개질(modified)된 금 전극상의 OmcA 및 MtrC 커버리지(coverage)

([a] 비율은 CV(electroactive coverage) 및 QCM-D에서 측정함, [b] 전기 활성 범위는 여러 전극 사이에서 매우 다양하여 정확한 측정이 제한됨, [c] 8-NH₃ ⁺=8-mercaptooctylamine; 6-NH₃ ⁺=6-mercaptohexylamine; 8-OH=8-mercaptooctanol; 6-OH=6-mercaptohexanol)

피크 면적에 기초하여, 전기 활성 커버리지 (Г_ea)는 하기 수학식 1에 따라 정량화 될 수 있으며, 여기서 n은 전자의 수(OmcA와 MtrC의 경우 10), F는 패러데이 상수, A는 전극 면적(0.25 cm²), ν는 스캔 속도이다. 표 1에서 Г_ea 가 MtrC에 비해 OmcA가 훨씬 더 높음을 즉시 알 수 있습니다.

[수학식 1]

Г_ea = (피크 면적) / nFAν

조립된(engineered) OmcA 및 MtrC 구조체가 C-말단 엔테로 키나아제 프로테아제 서열(DDDDK)을 코딩하는 플라스미드로부터 생성되어 표면 노출 된 heme 10에 부가적인 음전하를 제공할 수 있음을 알 수 있었다(도 1 및 10 참조). LC-MS는 MtrC가 C-말단 분해를 겪었으며 어떤 경우에는 제제(preparations)가 이질성을 보임을 증명하였다. 이질성이 관찰된 경우, 질량 차이는 음으로 하전 된 아스파르트산 서열의 질량과 상관 관계가 있었다. 전기 화학적 비교를 통해 다른 MtrC 정제방법은(저분자량 단백질 포함)가 '전자 사일런트 (electro-silent)' 현상을 보였고, 중요한 산화/환원 신호 CV(Г_ea < 0.02 pmolcm^- ²)를 보이지 않았다. LC-MS와 CV 결과 간의 이러한 상관 관계는 조립된(engineered) MtrC(및 조립된 C-말단을 갖는 조립된(engineered) OmcA)의 C-말단에서 아스파르트산 잔기가 금전극상의 데카헴(decaheme)을 오리엔테이션시키는데 결정적인 역할을 한다는 것을 시사한다.

(2) Quartz Crystal Microbalance with Dissipation(QCM-D)

QCM-D 측정은 Q-Sense E4(QSense AB)를 사용하여 수행되었다. 금 코팅 된 QCM-D 결정을 초음파 처리를 사용하여 2 wt % SDS 세제로 10 분 동안 세척하고, 추가로 물과 질소 가스 하에서 건조시켰다. 이어서, QCM-D 결정을 UV / 오존 (UVOCS Inc T10x10 / OES / E, UK)으로 20 분 동안 처리 하였다. 오존 처리에 의해 표면에 형성된 금 산화물은 40-60℃에서 프로판올에서 30 분 동안 배양함으로써 환원시켰다. 신선하게 세척한 QCM-D 결정을 48℃에서 2 일 동안 SAM 용액(8-mercaptooctanol, 6-mercaptohexanol, 8-amino-1-octanethiol hydrochloride, ethanol, 6-amino-1-hexanethiol hydrochloride 등을 적절히 혼합하여 물에 녹인 용액을 의미)으로 표면 처리 시킨 다음 물로 세척하였다. QCM-D 실험은 21℃에서 수행되었고, 유속은 70 μL / min으로 유지되었다. 모든 단백질 흡착 실험은 완충액(20 mM MOPS, 30 mM Na₂SO₄, pH 7.4)에서 수행되었고, OmcA 또는 MtrC와의 인큐베이션(1 mM) 및 RuP-TiO₂ 또는 CdS(0.2 mg mL^-1)를 수행 후 세번째 배음의 손실(dissipation, ΔD) 및 진동수(Δf) 변화를 바탕으로 분석하였다. 다섯 번째, 일곱 번째, 아홉 번째, 열한 번째 및 13 번째 배음도 측정 되었다. 단백질 및 나노입자의 흡착양은 Sauerbrey 방정식(즉, 사용 된 장비 및 결정에 대해 17.7 ngcm^-1 Hz^-1)을 사용하여 계산하였다.

단백질 필름 전극의 흡착 양상은 QCM-D를 사용(도 11A 참조)하여 질량 및 점성의 변화를 통해 특성 분석하였다. OmcA / MtrC의 고정화 시 작은 손실(dissipation) 변화가 관찰되었으며, 이는 데카헴 단백질이 표면에 강성 필름을 형성함을 의미하고, Sauerbrey 방정식을 사용하여 적용 범위를 추정 할 수 있다. 단단히 결합된 물 때문에 단백질의 질량이 25 % 증가한다고 가정하면, QCM-D에 의한 적용 범위는 두 가지 단백질과 SAM 표면에 대해 3.6~3.7 pmolcm^-2로 추정된다(표 1 참조). OmcA와 MtrC는 비슷한 분자량(각각 83과 75 kDa)과 크기(9.5 x 6.0 x 5.0 nm³)를 가진다. 데카헴 단백질의 오리엔테이션에 따라 단층 단백질 필름은 5.5 pmolcm^-2(직립 배향) 또는 2.9 pmolcm^-2(엎어진 배향)이며, 따라서 QCM-D 데이터는 잘 패킹된 단일층의 필름이 흡착됨을 증명하는 것이다.

QCM-D 결과의 유사성은 전기적 활성 범위와는 현저히 대조적인데, 이는 두 단백질(표 1 참조)에서 매우 다르다. OmcA 필름에서는 80/20 비율의 6-mercapto-hexanol(6-OH)/6-mercapto-hexylamine(6NH₃ ⁺) SAMs 조건이, MtrC 필름의 경우 80/20 비율의 8-mercapto-octanol(8-OH)/8-mercapto-octylamine(8-NH₃ ⁺) SAMs조건이 가장 높은 전기 활성 커버리지를 제공한다는 것을 알 수 있다.

금속 입자가 흡착된 단백질 필름 전극의 특성(Decaheme Cytochrome / RuP-TiO₂ 및 Decaheme Cytochrome / CdS의 특성)

(1) QCM-D(RuP-TiO₂)

QCM-D는 SAM 또는 OmcA / MtrC 단백질 필름 전극에 직접 RuP-TiO₂ 및 CdS 나노입자의 흡착을 정량하는 용도로도 사용되었다(도 11 참조). RuP-TiO₂-COO^-가 단백질 필름표면에 흡착할 때 진동수(frequency)가 급격하게 감소하고 손실(dissipation)이 증가한다. Sauerbrey 방정식에 근거하여, RuP-TiO₂-COO^-나노입자(6.8 ~ 0.7 nm 직경)는 OmcA 필름 및 SAM 표면에서 각각 7.0±0.2 pmolcm^-2, 6.2±0.2 pmolcm^-2 농도로 흡착된다(하기 표 2 참조, 나노입자의 커버리지는 입자 개수로 주어진다). TiO₂ 나노입자(6.8 nm 직경의 완벽한 구형의 육각형을 가정함)로 조밀하게 흡착된 단일층이 4.2 pmolcm²이라면 RuP-TiO₂-COO^-의 일부가 OmcA 표면에 응집이 있음을 나타낸다. 흡착된 RuP-TiO₂-COO^- 의해 CV에 측정된 MtrC와 OmcA의 전기 활성 범위는 약 70 % 감소하는데, 이는 우리가 단백질 필름의 오리엔테이션에 영향을 미쳐서 전극과 전자 결합을 변화시키는 것이다. 전기 활성 범위의 감소는 또한 OmcA / MtrC의 탈착 또는 변성에 의해 설명 될 수도 있으나, 광전기화학 반응을 통해 RuP-TiO₂-COO^-에 의해 단백질 필름의 오리엔테이션만에 영향을 끼쳤다고 예측된다.

[표 2] 서로 다른 SAM으로 개질(modified)된 금 전극상의 서로 다른 타입의 나노입자/데카헴 시토그롬 이중층의 전체 및 전기활성 커버리지(커버리지는 QCM-D 및 전기활성 범위에 의해 결정됨)

([a] 비율은 나노입자 고정화 전후의 전기 활성 범위로부터 측정함, [b] 비특허문헌 3에 개시된 데이터임, [c] 나노입자의 범위를 계산하기 위해, 데카헴 필름에 흡착시 표면에서 해리되지 않는다고 가정함, [n.d] 데이터 없음)

(2) 전압전류법(RuP-TiO₂)

RuP-TiO₂ 나노입자의 표면 화학이 OmcA / MtrC와의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 테스트했다. OmcA와 MtrC는 표면에 양전하 영역없이 음전하를 띠기 때문에(도 10 참조), RuP-TiO₂-NH₃ ⁺의 흡착양이 향상 될 것으로 기대했다. 그러나 예상과는 달리 RuP-TiO₂-NH₃ ⁺ 나노입자의 흡착양은 OmcA 또는 MtrC에서 훨씬 낮았다(표 2 참조). 25 % 미만의 커버리지가 얻어졌고(RuP-TiO₂-COO^-의 166 %와 비교), 빛에 노출 시 훨씬 낮은 광전류가 관찰되었다(표 3 참조).

[표 3] 다른 유형의 나노입자 광전지(NPs photoanodes) 및 나노입자/데카헴 광전지(NPs/decaheme photoanodes)의 광전기화학적 성질^[a]

([a] 희생 전자 주개(donor)로 25mM EDTA(RuP-TiO₂) 또는 25mM TEOA(CdS)를 사용하여 0.4V vs. SHE에서 광전류를 측정함, [b] 비특허문헌 3에 개시된 데이터임)

(3) QCM-D(CdS)

OmcA / MtrC와의 상호 작용에 나노입자의 영향을 알아보기 위해 CdS 나노입자를 테스트하였다. CdS 나노입자는 음전하를 띤 표면 리간드(CdS-COO-) 또는 양전하를 띤 표면 리간드 CdS-N(CH₃)₂H⁺로 합성되었다. QCM-D를 사용하여 CdS-N(CH₃)₂H⁺ 나노 입자의 표면 커버리지는 OmcA 필름과 SAM 표면에서 각각 4.7±0.2 pmolcm^-2 및 6.3±0.3 pmolcm^-2로 단일층 범위의 ~50 %와 ~65 %로 계산되았다(도 11B 참조). 유사한 커버리지 범위는 MtrC에서도 관찰되었다(표 2 참조). CdS-COO-은 단백질 또는 SAM 표면에 5-10%만이 흡착됨을 보여준다(표 2 참조). CdS-N(CH₃)₂H⁺ 고정화 후, 전기 활성 OmcA / MtrC 커버리지는 거의 완전히 사라져서, 대부분의 십자형 시토크롬 분자는 CdS에 의해 재배열되거나 제거된다. QCM-D 추적으로는 CdS와의 결합시, 데카헴 시토크롬이 제거된 어떠한 징후도 나타나지 않았고, CdS가 표면상의 단백질을 대체하면서도 여전히 CdS 나노입자에 부착된 채로 남아 있음을 시사한다. QCM-D 실험에서의 손실(dissipation) 신호는 RuP-TiO₂-COO^- 와 비교하여 CdS에 대한 다른 상호 작용을 있음을 시사한다. 더 높은 에너지 손실(dissipation) 표면에 대한 높은 점탄성 커플링에 기인하며, 따라서 RuP-TiO₂-COO^- 입자는 단백질 데카헴층에 훨씬 덜 단단한 결합이 이루어짐을 예측할 수 있다(도 11 참조).

금속 입자가 흡착된 단백질 필름 전극의 특성(Decaheme / RuP-TiO₂-COO^- 및 Decaheme / CdS-N(CH₃)₂H⁺ 의 광전기화학 반응)

150 W, 4.5 cm(15 V) 할로겐 램프(OSRAM) 및 광섬유가 장착된 차가운 광원(Kruss KL5125, 독일)을 2 cm 거리 기분으로 빛이 금전극 표면에 도달하게 하였고, 빛의 세기는(전극 면적 = 0.25 cm²)는 별도로 측정하여 약 50 mW(즉, 200 mWcm^-2) 값을 얻었다. 광전기화학(Photoelectrochemical) 측정은 위에서 언급한 Autolab 전기 화학 분석기를 사용하여 작용 전극과 Pt 상대 전극 사이의 빛으로 인해 발생하는 전류를 측정하였다. 자외선 방출로 TiO₂를 직접 여기 시키지 않았다는 것을 확인하기 위해 UV 필터(cut-off 375 nm)를 이용한 대조 실험을 수행하였다. 선형 스위프 전압전류법(Linear sweep voltammetry, LSV)은 조절된 빛의 노출하에서 모든 샘플의 광전기화학적 성질을 결정하는데 사용 되었다. 스캔 속도는 5mVs^- ¹로 -450mV와 +450mV(vs SHE) 사이에서 측정하였다. 크로노암페로메트리(Chronoamperometry) 측정의 경우, 전위를 +400mV(vs SHE)로 설정하였고, 전극은 일반적으로 10초(40초 동안 꺼짐) 동안 켜졌다. 크로노암페로그램(Chronoamperograms)과 전압곡선(voltammograms)은 Q-Soas로 수정되었고, 모든 실험은 19±2℃에서 수행하였다.

빛에 노출 시, 희생 전자 주개인 EDTA의 존재 하에 광전류가 RuP-TiO₂-COO^- 의 여기시 쉽게 관찰된다. OmcA / RuP-TiO₂-COO^- 시스템(도 12 참조)과 알려진 MtrC / RuP-TiO₂-COO^- 시스템에서 공통적으로 관찰할 수 있다. OmcA / RuP-TiO₂-COO^- 시스템은, 450nAcm^-2의 빛의 강도, +400 mV에서 0.2 Wcm^-2 산화 광전류가 발생하였고(도 12A 참조), 포텐셜이 -200 mV에서 -400 mV (도 12A 및 4B 참조)로 감소할 때, 광전류는 백그라운드 레벨(즉, 희생 전자 주개인 EDTA가 없는 조건)로 감소하였다. 이 전위 범위에서 OmcA와 MtrC는 환원되어 광여기된 RuP-TiO₂에서 전자를 받아 들일 수 없다(도 13 참조). 이러한 결과는 광유도된 전자 전달이 OmcA / MtrC를 통해 진행됨을 확인시켜 주는 것이다. 위에서 언급했듯이, RuP-TiO₂-COO^- 의 흡착 시, OmcA와 MtrC의 전기 활성 범위는 70 %까지 감소했다(표 2 참조). 이것은 시토크롬 분자의 일부의 오리엔테이션 변화로 귀결되며, 계면 전자 전달을 감소를 유도하는 것이다. 그들의 전기 화학적 신호가 CV에 의해 더 이상 관측되지 않는 정도의 비율로 존재한다.

MtrC / RuP-TiO₂-COO^- 시스템에서 광전류는 최대 0.2Wcm²의 세기까지 선형적으로 의존한다는 것이 알려져있다. 또한, 희생 전자 주개의 종류 또는 농도를 변화시킬 때 강한 영향이 없음을 알고있다(EDTA, TEOA 및 아스코르브산을 100mM까지의 농도와 비교함). MtrC와 OmcA 간에는 차이가 없으므로(표 3 참조), 우리는 광전류가 RuP-TiO₂-COO^- 의 흡수 단면에 의해 제한된다는 것을 예측할 수 있다(EDTA에서부터 RuP, TiO₂, 시토크롬/산화전극에 이르기까지). 계면 전자 이동 단계는 속도 제한이 없다는 것을 의미한다. 데카헴 시토크롬 종류와 상관없이, 또한 TiO₂ 입자가 DHBA(-COO^-) 또는 DHA(-NH₃ ⁺)의 기능기를 가졌는지와 관계없이, RuP-TiO₂ 입자당 약 0.8~1.5 전자쌍이 빛에 의해 생성됨이 측정되었다.

CdS-N(CH₃)₂H⁺ 에 대한 광전류의 크기는 RuP-TiO₂-COO^- 에서 얻은 것과 매우 유사하다(도 12B 참조). CdS 나노입자의 경우 희생 전자 주개로서 EDTA보다 TEOA 이용시 높은 광전류가 관찰되었고 TEOA 및 CdS 나노입자와의 결과가 제시되었다. 그러나 전위가 200mV 미만으로 감소하면 CdS-N(CH₃)₂H⁺ 에서는 스위칭 거동이 관찰되지 않았고(도 12B 및 13C 참조), 이는 전자 전달이 Cd에서 전극으로 직접 진행되어 데카헴을 우회함을 시사한다. 즉, 데카헴 시토크롬 표면에 CdS-N(CH₃)₂H⁺가 흡착 시(표 2 참조), 전기적 활성 커버리지가 완전히 사라지게 되는 것이다. 위에서 언급했듯이, QCM-D 데이터는 데카헴 시토크롬이 CdS 나노입자의 흡착 시 제거된다는 것을 나타내지 않았으며(도 12B 참조), CdS가 표면의 데카헴 시토크롬을 치환하지만 CdS 입자에 결합된 데카헴은 여전히 남아 있음을 의미한다.

실험 결과의 정리

OmcA / RuP-TiO₂-COO^- 시스템 및 MtrC / RuP-TiO₂-COO^- 시스템은 OmcA / MtrC 도관을 통한 전자 전달을 확인하는 광스위칭 거동을 나타낸다. 희생 전자 주개 물질의 존재 하에서 빛에 노출 시, OmcA / RuP-TiO₂-COO^- 및 MtrC / RuP-TiO₂-COO^- 시스템은 비슷한 광전류를 발생시킨다. 광전류가 빛 세기에 선형적으로 의존하고 희생 전자 주개 물질의 종류가 광전류의 크기에 영향을 미치지 않는다는 사실은 광전류가 RuP-TiO₂ 입자 표면의 얇은 층이 광을 흡수하는 능력에 의해 제한된다는 것을 시사한다.

RuP-TiO₂ 시스템과 달리 바이오하이브리드 시스템에서 CdS-N(CH₃)₂H⁺에 의해 생성된 광 전류는 OmcA 또는 MtrC의 리독스 상태에 의존하지 않으므로 CdS에서 전극으로의 직접적인 전자 이동을 제안하고 데카헴 단백질을 우회한다.(하지만 CdS가 단백질위에 결합시 더 많은 양이 흡착될 수 있기 때문에 광전류의 세기를 증가시킬 수 있다.) 이러한 행동의 차이는 CdS가 전극 표면에 흡착된 OmcA / MtrC를 교체한 것으로 예상된다.

본 명세서에서는 본 발명자들이 수행한 다양한 실시예 가운데 몇 개의 예만을 들어 설명하는 것이나 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고, 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.

Claims

일면에 금(gold)으로 형성된 금속층이 코팅된 실리콘 웨이퍼;
상기 금속층에 흡착된 금속단백질(metalloprotein)층; 및
상기 금속단백질층에 흡착된 나노입자;를 포함하되,
상기 금속단백질층은 OmcA로 이루어지고,
상기 나노입자는 리간드 껍질(ligand shell)로 표면 처리된 황화카드뮴 양자점(CdS Quantum dot)으로서, CdS-N(CH₃)₂H⁺ 또는 CdS-COO^-인 것을 특징으로 하는, 나노입자가 흡착된 단백질 필름 전극.
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