KR101951775B1 - Mel-18 단백질의 인산화 검출용 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Mel-18 단백질의 인산화 검출용 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MEL-18 단백질의 인산화 여부를 검출할 수 있는 항체 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다. MEL-18 단백질의 신규한 인산-에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여, MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 발현을 특이적으로 검출할 수 있어, AKT 효소 의존적 MEL-18 인산화가 세포 내 신호전달 및 이를 통해 세포의 증식, 줄기세포 조절, 세포 사멸 등에 미치는 영향을 탐색할 수 있다. 또한, MEL-18 단백질에 의하여 매개되는 암을 포함한 각종 질병의 진단, 치료 및 예방에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

MEL-18 단백질의 인산화 검출용 항체 및 이의 용도{ANTIBODY FOR DETECTING PHOSPHORYLATION OF MEL-18 AND USE THEREOF}
본 발명은 MEL-18 단백질의 인산화 여부를 검출할 수 있는 항체 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
MEL-18은 폴리콤(polycomb) 억제 복합체(PRC-1)의 일 성분으로서, 이것은 줄기세포 조절과 정상 및 암 세포 발생에서 결정적인 후성적 조절인자이다. 추가적인 임상 증거가 필요하겠지만, 축적된 연구에 의하며 MEL-18이 유방암을 비롯한 일부 사람의 종양에서 종양 억제인자로서 작용한다는 점을 시사하고 있다.
세포 내 신호 전달에 의한 단백질의 인산화는 단백질의 활성, 구조 및 다른 단백질 등과의 결합력 등에 영향을 미침으로써 세포 내 다양한 현상들, 즉 세포 증식, 분열, 사멸 등의 조절에 관여한다. 특히 세포 내 신호 전달의 중심축을 담당하는 PI3K/AKT 신호전달계의 AKT 인산화 효소는 다양한 기질들을 인식하여 인산화시킴으로써 여러 기전을 통해 세포 내 현상을 긴밀히 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 AKT 의존적 인산화된 단백질들에 대한 특이적 항체들이 시중에 많이 개발되어 분자생물학 연구 및 질병의 진단 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, MEL-18과 AKT 인산화 효소의 관계에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다.
본 발명자들은 후성적 유전자 발현 조절에 관여하는 MEL-18 단백질이 AKT의 기질임을 새롭게 밝혔으며, 아울러 AKT에 의해 인산화되는 MEL-18 단백질의 특정 잔기 부위 발굴 및 이를 인지하는 신규 항체를 개발함으로써 AKT의 MEL-18을 통한 세포 내 신호전달 및 현상 조절을 규명하기 위한 용도, 또한 이를 이용함 치료제의 스크리닝 등에 사용할 수 있도록 하였다.
따라서, 본 발명은 후성적 유전자 발현 조절에 관여하는 MEL-18 단백질의 암의 진단, 치료 및 예후 예측에 있어서, 역할을 규명 및 이에 사용할 수 있는 항체의 필요성을 해결하기 위한 것으로, 구체적으로 MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 AKT 효소 특이적 인산-에피토프를 제시하고, 이를 특이적으로 인식 및 결합하는 항체 또는 이의 단편과 이를 이용한 용도에 관한 것이다.
본 발명은, MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 AKT 효소 특이적 인산-에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 MEL-18 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 MEL-18 단백질의 수준을 분석 또는 MEL-18 인산화 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암치료의 예후 예측용 조성물 또는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질과 MEL-18을 접촉시키는 단계; MEL-18의 Thr334 위치에서 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 후보물질과 MEL-18을 접촉하기 전 Thr334 위치의 인산화 정도와 접촉 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 시료 내의 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계;를 포함하는 대상체의 치료 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 시료에 검증 대상 항암제를 처리하고, MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 항암제 처리하기 전 MEL-18의 Thr334 위치의 인산화 정도와 처리 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 항암제의 약효에 대한 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제의 약효를 검증하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 MEL-18의 Thr334의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 MEL-18 인산화 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
MEL-18은 줄기세포 조절과 정상 및 암 세포 발생에서 결정적인 후성적 조절인자로, MEL-18을 이용한 암 치료의 예후 예측, 항암제 스크리닝, MEL-18이 관여하는 암의 메커니즘 연구는 암을 포함한 질병의 진단, 치료 및 예방에 적용될 수 있어 중요한 의미를 갖는다. 본 발명에 따르면 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 발현을 특이적으로 검출할 수 있어, MEL-18 단백질의 인산화와 관련된 암을 포함한 각종 질병의 치료의 예후를 예측할 수 있고, 이러한 메커니즘을 이용하여 항암제를 스크리닝하거나 약효를 테스트할 수 있다. 또한, AKT 효소 의존적 MEL-18 인산화와 관련된 생체 내 메커니즘 연구에도 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 인간 MEL-18 단백질(NCBI no. NP_009075.1)의 아미노산 서열을 나타내는 도이다. 밑줄 친 서열은 AKT 효소의 인산화 모티프 서열을 나타낸다.
도 2는 MEL-18 단백질과 AKT 단백질의 직접적인 결합을 공동면역침전법(co-immunoprecipitation)으로 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 효소활성 측정법을 통해 MEL-18 단백질을 기질로 이용하여 AKT 인산화 효소의 활성을 측정한 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 MEL-18 단백질 인산화 부위의 소수성/친수성 검색 결과를 보여준다.
도 5는 MEL-18 단백질 항원생산 및 항체생산의 방법 및 시간에 따른 진행도를 나타낸다.
도 6a, 6b 및 6c는 항원 주입한 혈액 혈청과 항원에 대한 ELISA 테스트 결과를 나타내는 것으로, 도 6a는 1차 면역반응 후 1차 세럼에 대한 항원과의 ELISA 테스트 결과, 도 6b는 2차 면역반응 후 2차 세럼에 대한 항원과의 ELISA 테스트 결과, 그리고 도 6c는 3차 면역반응 후 3차 세럼에 대한 항원과의 ELISA 테스트 결과를 나타낸다.
도 7은 T334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질의 항체와의 면역블롯(immunoblot) 시험 결과를 나타낸다.
도 8은 AKT 효소의 활성에 따른 MEL-18 단백질의 인산화 수준을 나타낸다.
도 9a는 AKT 의존적 MEL-18 단백질 인산화에 따른 유방암 줄기세포 수 변화를 나타내고, 도 9b는 AKT 의존적 MEL-18 단백질 인산화에 따른 종양구(tumorsphere) 형성능력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 MEL-18 인산화 특이적 항체에 대한 면역형광염색의 결과는 나타내는 사진이다.
도 11은 MEL-18 인산화 특이적 항체에 대한 면역조직화학염색의 결과를 나타내는 사진이다.
도 12a, 12b, 12c 및 12d는 본 발명의 일 실시예에 따라 MEL-18 인산화가 종양세포 성장에 미치는 영항을 확인한 것이다.
도 13a, 13b, 13c, 13d 및 13e는 본 발명의 일 실시예에 따라 MEL-18 인산화가 종양세포의 상피간엽이행, 이동 및 침윤에 미치는 영항을 확인한 것이다.
이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.
다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은, MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 AKT 효소 특이적 인산-에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 "인산-에피토프"는 단백질 상에서 특정 효소에 의하여 인산화가 일어나는 특이적 부위를 의미한다. 본 발명의 MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상의 AKT 효소 특이적 인산-에피토프는 AKT 효소가 인산화를 일으키는 특이적 모티프 서열에 의하여 인산화가 일어나는 부위를 의미하는 것으로, 바람직하게는 MEL-18 단백질의 334번에 위치한 티로신(Thr) 또는 MEL-18 단백질의 단편 상에서 MEL-18 Thr334에 해당하는 부위 일 수 있다.
본 발명의 MEL-18 단백질(NCBI Reference Sequence: NP_009075.1)은 AKT 효소의 기질로서, AKT 의존적으로 인산화되며, 구체적으로 Thr334 부위가 AKT 효소에 의존적으로 인산화된다는 사실을 본 발명에서 새롭게 밝혔다. 구체적으로, 본 발명에서는 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 AKT 효소에 의하여 인산화됨을 면역블러팅 및 효소활성 측정법을 통하여 새롭게 확인하였다. 또한, Thr334 위치에 특이적 인산화를 검출할 수 있는 항체를 제작하여 MEL-18 단백질 인산화를 특이적으로 측정할 수 있음을 확인하였다. 또한, AKT 효소 의존적 인산화된 MEL-18 단백질은 세포 내에서 암줄기세포의 증식을 억제하고, 종양구의 형성을 억제하는 효과를 나타냄을 실험적으로 확인하였다. 따라서, 본 발명의 MEL-18 인산화 단백질은 암의 예방, 진단, 치료 및 치료의 예후를 예측하는데 유용하게 사용될 수 있다는 점에서, 암 세포 발생에서 결정적인 후성적 조절인자인 MEL-18 단백질의 AKT 의존적 인산화 부위를 밝히고, 이를 특이적으로 검출할 수 있는 항체의 개발은 MEL-18을 이용한 암 치료의 예후 예측, 항암제 스크리닝, MEL-18이 관여하는 암의 메커니즘 연구는 암을 포함한 질병의 진단, 치료 및 예방에 적용될 수 있어 그 의의가 크다.
본 발명의 "항체"는 MEL-18 단백질의 인산화 부위, 특히 AKT 의존적으로 인산화 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 다클론 항체 또는 단클론 항체 또는 이의 단편일 수 있다. MEL-18의 Thr334의 인산화(인산화된 잔기 또는 인산기, pThr334)를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단클론 항체는 당업계에서 통상적인 항체 제작 방법을 통해 제작할 수 있다.
예컨대, MEL-18의 Thr334의 인산기(pThr334)를 특이적으로 인식하는 다클론 또는 단클론 항체는 당업계에 통사적인 단클론 항체 제작 방법을 통해 제작할 수 있다.
상기 항체에 마커가 표지된 2차 항체를 처리하거나, 상기 항체에 직접 마커를 컨쥬게이션시키면 마커에 의해 쉽게 MEL-18의 Thr334의 인산기(pThr334) 존재 여부를 조사할 수 있다. 이러한 마커로는 방사선 방사선 동위원소, 발광 물질, 발색 반응 효소 등을 이용할 수 있다. 예를 들어, GFP, YFP, RFP, BFP 등과 같은 형광단백질을 마커로 사용하여 표지하는 경우 다양한 형광측정법을 통해 상기 항체의 양을 측정함으로써 MEL-18의 Thr334에서의 인산화 여부를 판단할 수 있다. 또한, MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 MEL-18에 처리하고 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay) 방법을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석하여 수행할 수 있다. 이 경우 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응 시킴으로써 정량분석하거나, 아니면 직접 MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석 할 수도 있다.
일 실시예에서, 상기 항체는 pThr334를 포함하는 334 잔기의 앞 및/또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있다. 더욱 바람직하게는 pThr334의 아미노산을 포함하도록 MEL-18의 326번 내지 337번의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있다. 하기 실시예에서는 keyhole limpet hemocyanin(KLH) carrier 단백질이 붙어있는 MEL-18의 Thr334가 인산화된 펩타이드(위치 326-337, 13mer, STSRGRKMpTVNG, 서열번호 1)를 토끼에 찔러 항체를 형성시키고, 희생시켜 토끼의 혈액으로부터 정제한 항체를 MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 감지할 수 있는 항체로서 사용하였다.
또한, 본 발명은 MEL-18 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 MEL-18 인산화 단백질의 수준을 분석 또는 검출하는 방법을 제공한다.
상기 MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 조사하기 위해서는 공지의 기술을 이용할 수 있다. 구체적으로, 상기 인산화 여부의 조사는 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 수행하는 것 일 수 있다.
상기, 항원-항체 반응의 반응이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합을 의미하는 것으로, 반응수준이란 항원-항체의 결합된 양, 즉 항원-항체 복합체의 양을 의미한다.
이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 측정할 수 있으며, 예를 들어, 검출 신호의 세기(크기)를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 상기 항원-항체 반응은 면역 측정하는 방법에 의하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 면역형광분석법(Immunofluorescence assay, IFA), 면역블롯팅(immunoblotting), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting) 또는 단백질 칩(protein chip) 등을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부의 조사는 MEL-18의 Thr334의 인산화(pThr334)를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅, 면역염색을 통해서, 본 발명의 항체가 MEL-18 단백질의 인산화 특이적 항체임을 확인하였다.
이러한 측면에서 본 발명의 MEL-18 인산화 단백질의 수준을 분석하는 방법 또는 단백질 검출 방법은 MEL-18 단백질의 인산화 특이적 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 면역측정 하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 측면에서 본 발명은 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 MEL-18 인산화 단백질 발현수준 측정 또는 검출용 조성물 일 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 또는 암치료의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 암 진단용 조성물에 포함되는 항체는 상기 언급한 Thr334 잔기가 인산화되고 334 잔기의 앞 및/또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있고, 더욱 구체적으로는 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 인산화되고 326번 내지 337번의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체에 대한 내용은 상기한 내용이 준용될 수 있다.
상기 조성물은 항체 외에도, 항체의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 암 진단용 조성물을 이용하면 MEL-18의 Thr334 인산기를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로써 MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 더욱 쉽게 조사하고, MEL-18의 단백질 또는 MEL-18 인산화 단백질 수준을 분석할 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 또는 암치료의 예후 예측용 키트를 제공한다.
항체는 상기 언급한 Thr334 잔기가 인산화되고 334 잔기의 앞 및/또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있고, 더욱 구체적으로는 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 인산화되고 326번 내지 337번의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체에 대한 내용은 상기한 내용이 준용될 수 있다.
상기 키트는 MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체 외에도 상기 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, AP 또는 HRP 효소 등이 마커로서 컨쥬게이션되어 있는 경우 이들의 기질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 암 진단용 키트는 예를 들어, MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체가 96-웰 플레이트에 부착되어 있고, 상기 모노클로날 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질이 별도로 포장되어 있는 형태일 수 있다. 이 경우 진단 대상으로부터 얻은 세포 또는 조직 파쇄물 샘플 등과 상기 기질을 96-웰 플레이트에 가하고, 마커를 발현시켜 모노클로날 항체의 부착 정도를 정량 분석함으로써 MEL-18의 단백질 수준을 확인하고 암을 진단 또는 암의 치료의 예후를 예측 할 수 있다.
또한, 본 발명은 후보물질과 MEL-18을 접촉시키는 단계; MEL-18의 Thr334 위치에서 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 후보물질과 MEL-18을 접촉하기 전 Thr334 위치의 인산화 정도와 접촉 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 정보의 제공은 MEL-18을 후보물질과 접촉하기 전 Thr334 위치의 인산화 수준과 접촉 Thr334 위치의 인산화 수준을 비교하여, 접촉 후 인산화 수준이 더 높아진 경우 상기 후보물질은 인산화를 촉진하는 물질로 판단하는 방법으로 정보를 제공할 수 있다.
MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부에 따라 세포 내 암줄기세포의 수 또는 종양구의 형성이 영향을 받는바, 후보물질이 인산화를 저해하는 경우 AKT 의존적 MEL-18 인산화 단백질 수준이 낮아져, 암줄기세포의 수 및 종양구의 형성의 억제가 발생하지 못하므로, 항암활성이 있다고 할 수 없고, 반대로 후보물질이 인산화를 촉진하는 경우 MEL-18 인산화 단백질의 발현량이 높아지면, 암줄기세포의 수 및/또는 종양구의 형성이 억제되므로, 상기 후보물질을 결과적으로 암을 억제하는 항암활성이 있다고 판단할 수 있다.
구체적으로, 후보물질이 MEL-18의 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것은 MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행될 수 있다. 상기 항체에 대해서는 앞서 설명한 내용이 준용될 수 있다.
예를 들어, 후보 물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것은 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 단클론 항체가 부착되어 있는 플레이트에 후보물질과 상기 단클론 항체나 그에 대한 2차 항체에 컨쥬게이션되어 있는 마커를 탐지할 수 있는 기질을 가하고 마커를 발현시켜 단클론 항체의 부착 정도를 정량 분석함으로써 판단할 수 있다.
마찬가지의 원리에 의해 본 발명은 후보물질을 세포 또는 인간을 제외한 동물에 처리하고, MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 것을 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. 구체적으로, 후보물질 처리 후 MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화 정도가, 처리 전 인산화 정도보다 높아진 경우, 또는 상기 후보물질이 MEL-18의 Thr334 위치에서의 인산화를 촉진하는 경우 상기 후보물질은 항암활성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 항암제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 MEL-18의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 항체 외에도, 항체의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.
상기 항암제 스크리닝용 조성물을 이용하면 각 후보물질의 처리에 따른, MEL-18 단백질의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로써, MEL-18 단백질의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 더욱 쉽게 조사하고, 상기 후보물질이 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 쉽게 분석할 수 있게 된다. 상기 항체 및 항체의 양을 분석하는 방법은 앞서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 시료 내의 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계;를 포함하는 대상체의 치료 예후를 예측하는 방법을 제공한다.
상기 인산화 여부는 MEL-18 단백질의 Thr334의 인산기를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로써 더욱 쉽게 조사할 수 있고, 구체적인 내용은 앞서 설명한 내용을 준용할 수 있다.
상기 예후의 예측은 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 것 일 수 있다. 구체적으로 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 수준이 높아짐에 따라서, 암줄기세포의 수 및 종양구의 형성이 억제되는바, 항암제 처리된 또는 항암치료를 받는 대상체로부터 분리된 시료 내의 MEL-18 단백질의 인산화 수준이 치료 전의 MEL-18 단백질의 인산화 수준보다 높아진 경우, 치료의 예후가 좋다는 정보를 제공하는 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 대상체로부터 분리된 시료에 검증 대상 항암체를 처리하고, MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계; 및 상기 항암제 처리하기 전 MEL-18의 Thr334 위치의 인산화 정도와 처리 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 항암제의 약효에 대한 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제의 약효를 검증하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 시료에 처리하는 것 대신, 검증 대상 항암제를 인간을 제외한 동물에 처리하여, 항암제 처리하기 전/후의 MEL-18의 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하는 것을 포함하는 약효를 검증하는 방법을 제공한다.
MEL-18 단백질의 Thr334 위치에서의 인산화 여부를 조사하고, 상기 항암제가 인산화를 저해하는지 또는 촉진하는지를 판단하는 과정은 앞서 설명한 항암제 스크리닝 방법과 동일하다.
또한, 본 발명은 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질 또는 이의 단편 외에 유효성분의 안정을 위한 다른 성분 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질의 세포 내 발현이 높은 경우 암줄기세포의 수 및 종양구의 형성이 감소 또는 억제되는 것을 실험적으로 확인하였고, 종양 세포 내에서 MEL-18 Thr334 부위 인산화 단백질이 과발현되는 경우 종양조직의 크기가 줄어들고, 종양세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, MEL-18 Thr334 부위 인산화 단백질에 의하여 종양의 상피간엽이행(EMT), 이동 및 침윤을 제어 및 억제할 수 있음을 확인하였다. 따라서 이를 통해, MEL_18 Thr334 부위 인산화 단백질은 세포 내에서 종양세포의 성장을 억제하여 항암활성을 갖는 것을 알 수 있다.
상기 암은 MEL-18단백질 또는 AKT 인산화가 관여하는 것이면 그 종류에 상관없이 모두 포함하는 것이며, 일 실시예에 따라 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 체내 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공할 수 있다. 상기 Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질의 과발현은 인산화 단백질 자체를 투여 또는 이를 발현하는 유전자를 포함하는 벡터를 세포치료제 형태로 투여하거나, AKT 효소의 활성을 높이는 방법으로 달성될 수 있고, 이는 통상의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
[실시예 1] AKT 의존적 MEL-18 단백질 내 인산화 부위 발굴
MEL-18 단백질이 AKT 인산화 효소의 기질이 될 수 있는지 확인하기 위하여, MEL-18 단백질의 모티프 시퀀스를 분석하여, MEL-18 단백질 내에 334번째 트레오닌 잔기 부위에 AKT 특이적 모티프가 존재함을 새롭게 확인하였다.
구체적으로, human 세포주인 293T(American Type Culture Collection, ATCC; USA) 내에 Lipofectamine 2000(USA) 시약을 사용하여 MEL-18 유전자 발현 벡터(pCI-neo-MEL-18-FLAG)와 AKT 유전자 발현 벡터(pcDNA-AKT)를 함께 48시간 동안 트랜스팩션 후 단백질을 추출하였으며, 추출 단백질을 이용하여 MEL-18 단백질과 AKT 단백질 간의 직접적인 결합을 공동면역침전법(co-immunoprecipitation)을 통해 검증하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, MEL-18 단백질이 AKT 효소의 새로운 기질이 될 가능성을 확인하였다.
또한, in vitro 효소활성 측정법을 통해 MEL-18 단백질을 기질로 이용하여 AKT 인산화 효소의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 293T 세포주에 MEL-18 wild type 또는 T334 부위 인산화 비활성화 형태(MEL-18 T334A)를 인위적으로 발현시킨 후, 면역침전(immunoprecipitation)을 통해 MEL-18 단백질을 획득 후, AKT 단백질과 반응시켜, AKT에 의한 MEL-18 단백질의 인산화 활성화 정도를 면역블러팅(immunoblotting)을 통해 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, AKT는 MEL-18 단백질 인산화를 촉진하였으며, 예상 인산화 부위에 대한 비활성화 돌연변이 단백질(MEL-18 T334A)에서는 AKT에 의한 효소 활성이 나타나지 않음을 확인하였다. 따라서, 상기 실험결과를 통해서 MEL-18 단백질 334번째 트레오닌 잔기가 AKT에 의해 인산화되는 부위임을 실험적으로 증명하였다. 세포 내의 실제적인 AKT에 의한 MEL-18 단백질의 인산화를 측정하기 위해서는 MEL-18 단백질 특정 잔기의 인산화를 인지하는 새로운 항체를 제작하였다.
[실시예 2] MEL-18 인산화 부위에 대한 펩타이드 제작 및 항원생산
실시예 2-1. 항원(antigen) 펩타이드 디자인 및 합성
실시예 1에서 발굴한 인산화-에피토프에 대한 항체를 생산하기 위하여, 인산화 위치(T334) 전후로 아미노산 선택 후, 총 10-15mer 길이의 펩타이드를 합성하였다.
구체적으로, 도 4에 나타낸 바와 같이 T334 위치 전후로 친수성(hydrophilicity)이 높음을 확인하였고, 항원성이 높은 부분으로 예측하여, 이를 토대로 MEL-18 단백질의 326 위치의 아미노산 내지 337 위치의 아미노산을 갖는, 13mer 크기의 인산화 부위 및 비인산화 부위에 대한 펩타이드를 제작하였다.
인산화 펩타이드 (서열번호 1): C-STSRGRKM(p)TVNG (326-337 aa, 밑줄은 인산화부위)
비인산화 펩타이드 (서열번호 2): C-STSRGRKMTVNG (326-337 aa)
실시예 2-2. 항원 생산
실시예 2-1에서 합성한 MEL-18 펩타이드를 KLH(keyhole Limpets Hemocyanin)와 컨쥬게이션(conjugation)하여 항원으로 사용하였고, BSA(Bovine serum albumin)와 컨쥬게이션(conjugation)한 펩타이드를 엘라이자(ELISA) 시험용으로 사용하였다. 도 5의 일정에 따라 항원 및 항체를 생산하였다.
[실시예 3] 다클론 항체(polyclonal antibody)생산
실시예 2-2에서 제작한 항원을 토끼에 찔러 항체를 형성시키고, 토끼의 혈액으로부터 p-MEL-18 항체를 정제하는 방법으로, MEL-18 인산화 부위에 특이적인 다클론 항체를 생산하였다.
우선, 상기 항원을 토끼(New Zealand white)에 주사하기 전에 면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 음성대조군(negative control)으로 사용하였다.
1차 면역(primary immunization)은 항원을 컴플리트 아쥬반트(complete Freund’s adjuvant, sigma)와 혼합하여 피하(SC)주사하고, 4주 후 인컴플리트 아쥬반트(incomplete Freund’s adjuvant, sigma)와 혼합한 항원으로 1차 부스팅(boosting)을 진행하였다. 1주 후 1차 혈액(blood) 1ml를 채취하여 ELISA 테스트를 진행하고, 2주 간격으로 부스팅(boosting)과 채혈(bleeding)을 진행하였다. 3차 부스팅(boosting)하고, 1주 후 토끼 심장으로부터 채혈하고 최종 혈청(final serum)을 분리하여 ELISA 테스트 하였다.
순차적으로 2차 면역반응 및 3차 면역반응을 수행하고, ELISA 테스트를 실시하였다.
도 6a, 6b 및 6c에 나타낸 바와 같이, 1차 세럼에 대한 ELISA 테스트 결과 1:100,000에서 OD > 1.0으로 확인되었고, 2차 세럼에 대한 ELISA 테스트 결과 1:50,000~1:100,000에서 OD > 1.0으로 확인되었으며, 3차 세럼에 대한 ELISA 테스트 결과 1:100,000에서 OD > 1.0으로 확인되었다. 상기 결과를 통해, ELISA 역가(titer)가 높은 수준을 유지함을 확인하였고, 생산된 MEL-18 인산화에 대한 항체의 특이성을 높이기 위해 친화도 정제를 추가적으로 수행하였다.
[ 실시예 4] MEL -18 인산화 특이적 항체에 대한 면역블러팅 ( immunoblotting ) 테스트
실시예 3에서 생산된 MEL-18 단백질 인산화(T334) 항체가 인산화된 MEL-18 단백질에 특이적으로 작용하는 것을 확인하기 위하여, MEL-18 야생형(wild type) 및 MEL-18의 334번 위치의 아미노산 잔기를 T334A로 치환한 비활성화 돌연변이를 각각 과발현시킨 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 MEL-18 단백질의 인산화 수준을 면역블럿(immunoblot)을 통해 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, MEL-18 야생형 과발현 세포주에서는 인산화된 MEL-18 단백질의 발현이 검출되는 반면, MEL-18 T334A 과발현 세포주에서는 밴드가 검출되지 않았는바, 실시예 3에서 제작한 항체가 MEL-18 단백질의 T334 잔기 특이적으로 인식 및 결합함을 확인하였다.
또한, AKT 효소 의존적인 MEL-18 단백질 인산화(T334)를 확인하기 위하여, 293T 세포주에 AKT 효소의 활성화 형태(Constitutive active, CA)와 비활성화 형태(dominant negative, DN)를 인위적으로 발현시킨 후, MEL-18 단백질 인산화 수준을 면역블러팅(immunoblotting)을 통해 확인하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, T334 부위의 MEL-18 단백질의 인산화는 AKT 효소의 활성화에 의해 증가되었으며, 반면 AKT의 비활성화에 의해서는 유도되지 않았다. 따라서, MEL-18 단백질은 AKT 효소의 기질로, AKT 효소 의존적으로 T334 잔기가 인산화되며, 본 발명의 항체가 상기 인산화-에피토프를 특이적으로 인식 및 결합할 수 있음을 확인하였다.
[ 실시예 5] MEL -18 인산화 특이적 항체에 대한 면역형광염색 / 면역세포화학 (immunofluorescent staining/ immunocytochemistry) 테스트
본 발명에 따른 항체의 T344 인산화에 대한 특이적 성질을 확인하기 위하여, MEL-18 WT 또는 MEL-18 T334A를 각각 과발현시킨 유방암 세포주 MDA-MB-231에 대하여, 본 발명의 P-MEL-18 (T334 특이적) 항체로 면역형광염색을 수행하였다. 이때 대조군으로는 전체 MEL-18에 대한 항체(MEL-18)를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다.
구체적으로, 세포는 8x104의 농도로 4-챔버 슬라이드글라스에 접종한 다음 하룻 밤 동안 놓아두고, 세척하고 5분 동안 차가운 메탄올로 고정하였다. 3% BSA로 1시간 동안 블록킹한 다음, 4 ℃에서 하룻밤 동안 세포를 anti-MEL-18(MEL-18 전체에 대한 항체) 와 p-MEL-18 T334(T334의 인산화에 특이적인 항체)로 각각 염색하였다. 그 다음 anti-rabbit immunoglobulin/R-PE(1:400, P9795, Sigma)과 함께 1시간 더 인큐베이팅하고, DAPI로 10분 동안 추가적으로 염색하여 핵을 시각화하였다. 면역형광을 확인하기 위해서 형광 현미경(fluorescence microscope, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하였다.
도 10에 나타낸 바와같이, 본 발명의 T344 특이적 항체(P-MEL-18)로 염색 시, MEL-18 WT에서는 인산화된 MEL-18 발현이 염색되는 반면, MEL-18 T334A 세포주에서는 염색되지 않는 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 본 발명의 P-MEL-18 항체가 T334에 특이적인 항체임을 확인 할 수 있다.
[ 실시예 6] MEL -18 인산화 특이적 항체에 대한 면역조직화학 염색 (immunohistochemistry, IHC) 테스트
본 발명에 따른 항체의 T344 인산화에 대한 특이적 성질을 확인하기 위하여, MEL-18 WT 및 T334A 과발현 세포주(MEL-18 T334A)를 이종이식(xenograft)한 마우스에서 생성된 종양의 조직을 추출하여 P-MEL-18 (T334) 항체로 면역조직화학염색 수행하였다. 대조군으로는 전체 MEL-18에 대한 항체(MEL-18)를 사용하여 면역조직화학염색을 수행하였다.
구체적으로, 5주령 암컷 NOD/SCID(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient) 마우스를 한국생명공학 연구소에서 구입하였다. 생체 내 종양 유발능력을 측정하기 위해서, Matrigel에 재현탁한 MDA-MB-231 세포를 쥐의 유방 지방 패드에 한계밀도(500 내지 10,000 세포)로 주입 하였다. 종양 크기는 5-6 주 동안 매주 두 번 측정하였다. 각 마우스 그룹의 종양 유발(tumor-initiation) 빈도는 L-Calc 소프트웨어(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada, http://www.stemcell.com)를 사용하여 계산하였고, 종양 부피는 문헌에 개시된 바와 같이, 1/2x장직경(long diameter)x단직경(short diameter)에 따라서 계산하였다(Cho et al., Nature Communications 2015, 6, 7821). 동물 실험은 한양 대학교 동물 관리 및 사용위원회(서울, 한국)에 의해 승인되었고 이에 준수하여 수행되었다.
이종 이식 마우스로부터 얻은 종양을 해부하고, 10 % 포르말린으로 고정시킨 후, 파라핀 블록에 넣어두었다. 그 다음 면역 조직 화학은 이전에 기술 된 바와 같이 3 개의 독립적인 이종 이식 마우스의 종양의 연속 절편을 사용하여 수행 하였다(cart et al., Oncogene 2011, 30, 4578-4589; Shin et al., Journal of cellular physiology 2011, 226, 1340-1352).
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 인산화 특이적 항체로 염색 시, MEL-18 WT에서는 인산화된 MEL-18 발현이 염색되었으나, MEL-18 T334A(인산화 부위 변이 단백질)에서는 항체에 의한 염색이 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 P-MEL-18 항체는 T334 특이적 항체임을 확인하였다.
[실시예 7] MEL-18 인산화에 따른 세포 내 기능 연구
실시예 3에서 생산된 MEL-18 단백질 인산화(T334) 항체를 이용하여, MEL-18 단백질의 인산화가 세포 내 기능을 확인하기 위하여, MEL-18 야생형(wild type) 및 MEL-18의 334번 위치의 아미노산 잔기를 T334A로 치환한 비활성화 돌연변이를 각각 과발현시킨 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 줄기세포의 수 및 종양구 형성정도를 확인하였다.
구체적으로, 유방암 줄기세포의 수를 확인하기 위해 각각의 세포주를 알로피코시아닌-컨쥬게이트 CD44(allophycocyanin(APC)-conjugated CD44, 1:200, cat# 559942, BD Biosciences, USA), 피코에리트린-컨쥬게이트 CD24(phycoerythrin(PE)-conjugated CD24, 1:200, cat# 555428, BD Biosciences), 플루오레세인이소티오시안염-컨쥬게이트 상피 표면 항원(fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated epithelial surface antigen(ESA), 1:200, cat# F0860, Dako, USA) 항체로 4℃에서 15분 간 염색하였다. 이후 CD44+/CD24-/ESA+ 세포주의 수를 FACS Canto(Becton Dickinson, USA)를 이용하여 측정하였다.
종양구 형성정도를 확인하기 위해서 5 x 103세포주를 B27(Invitrogen, USA), 10 ng/ml 섬유아세포 증식인자(basic fibroblast growth factor(bFGF), Peprotech, USA), 10 ng/ml EGF, 4 ng/ml 헤파린(heparin, Sigma-Aldrich, USA)를 포함한 DMEM-GlutaMAX (Invitrogen, USA) 배양액에서 6 well ultra-low attachment surface plate (Corning, USA)에 일주일 간 키운 뒤. 100 ㎛ 이상 크기로 자란 종양구의 수를 측정하였다.
도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 MEL-18 야생형 과발현 유방암 세포주에서는 암줄기세포(CD44+/CD24-/ESA+ 발현 세포)의 숫자 및 종양구(tumorsphere)의 형성이 감소되었으며, MEL-18 T334A 과발현 세포주에서는 암줄기세포의 감소가 확인되지 않은바, AKT효소에 의한 인산화된 MEL-18 단백질이 유방암 줄기세포의 자가재생(self-renewal)을 억제하여 암의 줄기세포의 수와 종양구의 형성 억제를 통해 암 억제 역할을 수행함을 확인하였다.
[실시예 8] MEL-18 인산화에 따른 세포 내 기능 연구- 종양세포 성장 제어
MEL-18 인산화 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여, MDA-MB-231 유방암 세포주에서 MEL-18 단백질의 인산화 여분에 따른 종양세포 증식 억제, 그리고 EMT, 종양 이동 및 침윤 제어의 차이를 확인하였다.
8-1. MEL-18 인산화의 종양세포 증식 억제 효과 규명
(1) 세포 수준에서 MEL-18 인산화의 효과 규명
세포증식 효과는 MTT 분석을 통해서 확인하였다. 구체적으로, MDA-MB-231 유방암 세포주를 대조군으로 하고(대조군, CON), MEL-18 야생형을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 WT) 및 MEL-18의 T334A로 인산화 부위를 변이시킨 단백질을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 T334A)를 실험군으로 하여 실험을 실시하였다.
세포 증식여부는 CellTiter 96 비방사성 세포 증식 분석 키트(CellTiter 96 nonradioactive cell proliferation assay kit, Promega)를 사용하여 측정하였다. 제조자의 사용설명과 같이, 세포를 96-well plate 상에 접종하고, 3-[4,5- 디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT) 염료 용액과 함께 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이트하고, 가용화/정지용액을 첨가하여 중단시켰다. 포르마잔 생성물은 마이크로 플레이트 판독기(Bio-Rad)를 사용하여 570 nm 흡광도에서 측정하였고, 그 결과는 도 12a에 나타내었다.
또한, 연-한천 콜로니 형성 분석을 통해서, 세포 증식여부를 확인하였다. 구체적으로 앵커리지-독립 종양 성장(anchorage-independent tumor growth)을 측정하기 위해, PBS 중의 2% 한천으로 6-well plate를 코팅하였다. 그 다음, MDA-MB-231 세포(2×104 세포/웰)를 0.3% 한천에서 한천 배지(bottom agar)에 도말하고, 15 일 동안 인큐베이트 하였다. 100mm 이상의 콜로니를 현미경을 이용하여 계수 하였다. 그 결과는 도 12b에 나타내었다.
도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 유방암 세포주에서 MEL-18 야생형(WT) 과발현 시 세포증식 억제되는 반면, MEL-18 T334A(인산화 부위 변이 단백질) 과발현 시 세포증식이 오히려 회복됨을 확인할 수 있다. 따라서, MEL-18 인산화 단백질의
(2) 동물모델에서 MEL-18 인산화의 효과 규명
동물모델에서 MEL-18 인산화의 효과를 규명하기 위하여, 동소 종양 이종이식 및 면역 조직화학분석을 실시하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포주를 대조군으로 하고(대조군, CON), MEL-18 야생형을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 WT) 및 MEL-18의 T334A로 인산화 부위를 변이시킨 단백질을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 T334A)를 실험군으로 하여 실험을 실시하였다.
구체적으로, 5주령 암컷 NOD/SCID(non-obese diabetic/severe combined immunodeficient) 마우스를 한국생명공학 연구소에서 구입하였다. 생체 내 종양 유발능력을 측정하기 위해서, Matrigel에 재현탁한 MDA-MB-231 세포를 쥐의 유방 지방 패드에 한계밀도(500 내지 10,000 세포)로 주입하였다. 종양 크기는 5-6 주 동안 매주 두 번 측정하였다. 각 마우스 그룹의 종양 유발(tumor-initiation) 빈도는 L-Calc 소프트웨어(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada, http://www.stemcell.com)를 사용하여 계산하였고, 종양 부피는 문헌에 개시된 바와 같이, 1/2x장직경(long diameter)x단직경(short diameter)에 따라서 계산하였다(Cho et al., Nature Communications 2015, 6, 7821). 동물 실험은 한양 대학교 동물 관리 및 사용위원회(서울, 한국)에 의해 승인되었고 이에 준수하여 수행되었다.
이종 이식 마우스로부터 얻은 종양을 해부하고, 10 % 포르말린으로 고정시킨 후, 파라핀 블록에 넣어두었다. 그 다음 마우스 종양조직에 대한 Ki67 (cell proliferation marker) 면역조직화학 염색을 실시하였다. 면역조직화학 염색은 이전에 기술 된 바와 같이 3 개의 독립적인 이종 이식 마우스의 종양의 연속 절편을 사용하여 수행 하였다(cart et al., Oncogene 2011, 30, 4578-4589; Shin et al., Journal of cellular physiology 2011, 226, 1340-1352). 이종이식 종양의 크기를 확인한 결과는 도 12c에 나타내었고, 면역염색을 통해 관찰한 결과는 도 12d에 나타내었다.
도 12c 및 도 12d에 나타낸 바와 같이, MEL-18 WT 세포주를 이종이식한 마우스에서는 종양의 크기가 줄어드는 반면, MEL-18 T334A 세포주를 이종이식하여 MEL-18 단백질의 인산화를 억제한 마우스에는 종양크기가 오히려 회복되는 것을 알 수 있다. 따라서, MEL-18 단백질의 인산화가 종양세포의 크기를 줄어들게 하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
8-2. MEL -18 인산화의 EMT (Epithelial- mesenchymal transition), 종양 이동(migration) 및 침윤 (invasion) 제어
실험은 MDA-MB-231 유방암 세포주를 대조군으로 하고(대조군, CON), MEL-18 야생형을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 WT) 및 MEL-18의 T334A로 인산화 부위를 변이시킨 단백질을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주(MEL-18 T334A)를 실험군으로 하여 실험을 실시하였다.
MDA-MB-231 세포의 이동(migration) 및 침입(invasion) 능력은 이전의 공개된 논문에 기술된 바와 같이 측정하였다(Lee 등, Oncogene, 2013, 33, 1325-1335). 종양이동 분석을 위해, 세포를 transwell assay(Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, MD, USA)의 상부 챔버에 접종하고, 15 시간 동안 인큐베이트하였다. 침윤 분석을 위해, 세포를 24 시간 동안 BioCoat Matrigel Invasion Chambers(BD Biosciences)의 상부 구획에서 플레이팅 하였다. 하부 챔버에서 이동 또는 침입 세포를 고정시키고, Diff-Quik 염색 키트(Sysmex, Kobe, Japan)를 이용해서 염색한 후, 광학 현미경으로 계수 하였다.
도 13a에 나타낸 바와 같이, MEL-18 야생형(WT) 단백질을 과발현 한 MDA-MB-231 세포주를 현미경 관찰 시, 간엽세포와 같은(mesenchymal-like) 모양에서 상피세포와 같은(epithelial-like) 모양으로 세포의 형태가 변모한 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 13b 및 13c에 나타낸 바와 같이, 간엽성 마커(Mesenchymal marker)들의 발현은 감소하는 반면, 상피성 마커(epithelial marker (E-cadherin))의 발현은 증가된 것을 확인할 수 있다. 그러나, 인산화 부위가 변이된 MEL-18 T334A 단백질 과발현 시, 상기한 현상들이 회복되는 것을 알 수 있다. 따라서, MEL-18 단백질 인산화가 상피간엽이행(Epithelial-mesenchymal transition) 현상을 제어할 수 있음을 알 수 있다.
도 13d 및 13e에 나타낸 바와 같이, MEL-18 인산화 유무에 따른 암세포 이동 및 침윤능을 확인해 보면, MEL-18 야생형(WT)을 과발현시킨 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 세포이동 및 침윤이 억제되는 반면, 인산화 부위가 변이된 MEL-18 T334A 단백질 과발현시킨 세포주에서는, WT 대비 T334A 과발현 시 이러한 현상들 회복됨을 확인할 수 있다. 따라서, MEL-18 단백질 인산화가 종양세포의 이동 및 침윤을 제어할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (17)

  1. MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 AKT 효소 특이적 인산-에피토프로 Thr334 잔기의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 단편은 MEL-18 단백질 상에서 Thr334 잔기가 인산화되고; Thr334 잔기의 앞 또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 특이적으로 인식하는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 단편은 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 인산화되고; 326번 내지 337번의 아미노산을 포함하는 펩타이드에 대한 항체인, 항체 또는 이의 단편.
  5. MEL-18 단백질 상에서 또는 이의 단편 상에서 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 MEL-18 인산화 단백질의 수준을 분석 또는 MEL-18 인산화 단백질을 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 인산화 여부의 조사는 MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 Thr334 위치의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 이용한 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 단편은 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 인산화되고; Thr334 잔기의 앞 또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 특이적으로 인식하는 것인, 방법
  8. MEL-18 단백질 또는 이의 단편 상에서 Thr334 잔기의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 암치료의 예후 예측용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 단편은 MEL-18 단백질의 Thr334 잔기가 인산화되고; Thr334 잔기의 앞 또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 특이적으로 인식하는 것인, 조성물.
  10. 후보물질과 MEL-18을 접촉시키는 단계;
    MEL-18의 Thr334 위치에서 인산화 여부를 조사하는 단계; 및
    상기 후보물질과 MEL-18을 접촉하기 전 Thr334 위치의 인산화 정도와 접촉 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인산화 여부의 조사는 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 이용한 항원-항체 반응을 통해서 수행되는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 단편은 MEL-18 단백질 상에서 Thr334 잔기가 인산화되고; Thr334 잔기의 앞 또는 뒤의 1 내지 15개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 특이적으로 인식하는 것인, 방법.
  13. MEL-18의 Thr334의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물.
  14. 대상체로부터 분리된 시료 내의 MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계;를 포함하는 대상체의 치료 예후를 예측하는 방법.
  15. 대상체로부터 분리된 시료에 검증 대상 항암제를 처리하고, MEL-18 단백질의 Thr334 위치의 인산화 여부를 조사하는 단계; 및
    상기 항암제 처리하기 전 MEL-18의 Thr334 위치의 인산화 정도와 처리 후 Thr334 위치의 인산화 정도를 비교하여 항암제의 약효에 대한 정보를 제공하는 단계;를 포함하는 항암제의 약효를 검증하는 방법.
  16. Thr334 잔기가 인산화된 MEL-18 단백질을 포함하는 항암용 조성물.
  17. MEL-18의 Thr334의 인산화를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 MEL-18 인산화 단백질 검출용 조성물.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Annals of Oncology, Volume 21, Issue 12, 1 December 2010, Pages 2361-2369
Molecular Cell 28, 107-120, October 12, 2007

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