KR101949889B1 - Method for preparing anticancer or immunactive polysaccharide from residues of immature citrus extract or immature citrus peel - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 청귤 추출박 또는 청피 유래의 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 종래 일반 감귤류에 비하여 면역활성과 항암기능성이 현저히 우수한 기능성 성분을 갖도록 하는 청귤 추출박 또는 청피 유래의 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing anticancer or immunosuppressive polysaccharide derived from citrus peel or chewing gum. More particularly, the present invention relates to a method for producing anticancer or immunosuppressive polysaccharide Or immunosuppressive polysaccharide of the present invention.
한국인의 사망 원인 1위는 암으로, 전통적으로 암을 극복하기 위해서 수술, 방사선요법 및 약물요법 등을 이용하고 있으나, 전이를 일으킨 종양세포에 대하여 완벽한 치료 효과를 기대하기는 아직까지 어려운 실정이다. 현재, 항암치료의 대부분은 항암제 투여에 의존하고 있으나, 항암제의 대다수가 합성화학약품으로 조혈기능 및 면역기능 이상 등의 생체 유해성 문제가 제기되면서 기존의 치료방법에 면역요법을 도입한 병용요법 등이 관심을 받고 있다.The first cause of death in Koreans is cancer, which traditionally uses surgery, radiation therapy, and drug therapy to overcome cancer, but it is still difficult to expect a complete treatment effect on metastatic tumor cells. Currently, most of the chemotherapy depends on the administration of anticancer drugs. However, since most of the anticancer drugs are synthetic chemicals, biohazard problems such as hematopoietic function and immune function abnormality are raised, I am interested.
이에, 천연물에서 추출한 면역반응 조절제에 대하여 많은 연구가 집중되고 있는데, 최근 인삼, 버섯, 곰팡이, 박테리아, 감잎 등 천연소재에서 면역 증강기능을 가지는 활성다당체들이 보고되고 있으며, T 및 B 림프구, 대식세포, NK 세포(Natural killer cell), 림포카인활성살생세포(lymphokine activated killer cell, LAK cell) 등 면역세포의 활성화시켜 체내 면역력을 증진시키는 것으로 알려져 있다. 이에, 한국등록특허 제10-0594353호 에서는 인삼의 잎 및 줄기로부터 분리한 다당체 성분을 활성성분으로 함유하는 항암제 또는 항암보조제 조성물을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제10-0078107호에서는 마치현 세포벽을 효소처리하여 다당체를 분해하는 아라비노갈락탄을 포함하는 고분자 다당체의 제조방법을 개시하고 있고, 한국등록특허 제10-0491362호에서는 식물조직체를 열수 또는 염기로 추출하여 효소액으로 처리하고, 담자균류 균사액을 접종하여 제조되는 면역활성 증진복합다당체를 개시하고 있다.Recently, active polysaccharides having immunity-enhancing functions have been reported in natural materials such as ginseng, mushroom, mold, bacteria, persimmon leaves, and the like. T and B lymphocytes, macrophages , NK cells (natural killer cells), and lymphokine activated killer cells (LAK cells). Korean Patent No. 10-0594353 discloses an anticancer agent or anticancer adjuvant composition containing a polysaccharide component isolated from leaves and stems of ginseng as an active ingredient. In Korean Patent No. 10-0078107, Korean Patent No. 10-0491362 discloses a method for producing a polysaccharide containing arabinogalactan which decomposes a polysaccharide by treating the plant tissue with an enzyme solution and extracting the plant tissue with hot water or a base, Which is prepared by inoculating an immune activity-promoting complex polysaccharide.
펙틴은 전체 분자의 많은 부분이 homogalactouronan 구성되어 있으며, 여기에 다양한 올리고 및 폴리사카라이드로 분지된 rhamnogalactouronan I(RG-I) 및 rhamnogalactouronan Ⅱ(RG-Ⅱ)가 알려져 있다[Pharmaceutical chemistry journal Volume 46, Number 4 219-221]. RG류에는 cytolkine 생산자극, macrophade 활성화, NK 세포자극활성 등 면역 활성과 항암활성 등을 비롯한 다양한 생리활성에 대한 연구 결과들이 발표되고 있으나, 이를 소재로 이용한 제품화는 미진한 실정이다.Pectin is a homogalactouronan composed of a large number of whole molecules, and rhamnogalactouronan I (RG-I) and rhamnogalactouronan Ⅱ (RG-Ⅱ), which are branched by various oligo- and polysaccharides, are known [Pharmaceutical Chemistry Journal Volume 46,
한편, 귤, 한라봉 등의 감귤류는 면역활성, 항암기능성 등 건강기능성 성분을 함유하는 과일로서 우리나라 남부지방 및 제주도에서 널리 재배되고 있으며, 음료나 건강기능 식품을 제조하는 데 널리 이용되고 있다.On the other hand, citrus fruits such as mandarin orange and hara bong are fruits which contain health functional ingredients such as immunological activity and anti-cancer function, and are widely cultivated in southern part of Korea and Jeju Island and widely used for manufacturing drinks and health functional foods.
본 발명의 목적은 종래 감귤류를 이용한 기능성 식품 또는 약학 조성물에 비하여 면역활성 및 항암기능성이 현저히 향상된 청귤 추출박 또는 청피 유래의 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for producing anticancer or immunosuppressive polysaccharide derived from citrus fruit extract or chewing gum, wherein immune activity and anticancer function are significantly improved compared to functional foods or pharmaceutical compositions using citrus fruits.
본 발명의 일 측면에 따르면,According to an aspect of the present invention,
(a) 청귤 추출박 또는 청피의 건조분말을 열수추출하여 열수추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 열수추출물에서 잔사를 제거하고, 알코올 수용액을 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수하는 단계; 및 (c) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 투석에 의해 저분자 불순물을 제거하여 청귤 추출박 또는 청피의 열수추출 다당을 수득하는 단계;를 포함하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법이 제공된다.(a) preparing a hot-water extract by hot water extraction of a dried powder of a citrus peel or a chewing gum; (b) recovering the precipitate by removing the residue from the hot-water extract and precipitating polysaccharide by adding an alcohol aqueous solution; And (c) dissolving the precipitate in distilled water and removing low molecular impurities by dialysis to obtain a hydrothermally extracted polysaccharide of a citrus fruit extract or a chewing gum.
단계 (a)는 상기 열수추출 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조할 수 있다.Step (a) may be performed by mixing water with
단계 (b)의 상기 알코올 수용액은 증류수:알코올의 부피비(v/v)가 1:10 내지 1:30 일 수 있다.The alcohol aqueous solution of step (b) may have a volume ratio (v / v) of distilled water: alcohol of 1:10 to 1:30.
단계 (c)의 상기 투석은 40 내지 60시간 동안 수행될 수 있다.The dialysis of step (c) may be performed for 40 to 60 hours.
단계 (c)의 상기 열수추출 다당은 동결건조, 분무건조 및 감압증류 중에서 선택된 어느 하나의 과정을 추가로 수행할 수 있다.The hydrolyzed polysaccharide of step (c) may be further subjected to any one of the following processes selected from lyophilization, spray drying and vacuum distillation.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,According to another aspect of the present invention,
(1) 청귤 추출박 또는 청피의 건조분말을 효소 처리하여 효소 처리물을 제조하는 단계; (2) 상기 효소 처리물에서 잔사를 제거하고, 알코올 용매를 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수하는 단계; 및 (3) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 투석에 의해 저분자 불순물을 제거하여 청귤 추출박 또는 청피의 효소처리경 조다당을 수득하는 단계;를 포함하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법이 제공된다.(1) preparing an enzyme-treated product by enzymatically treating a dried powder of a citrus peel extract or a chewing gum; (2) recovering the precipitate by removing the residue from the enzyme-treated product and precipitating polysaccharide by adding an alcohol solvent; And (3) dissolving the precipitate in distilled water and removing low molecular impurities by dialysis to obtain an enzyme-treated light polydosaccharide of a citrus extract or chewing gum. .
단계 (1)은 효소 처리 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조할 수 있다.Step (1) may be carried out by mixing the dried powder with 10 to 30 times the weight of water before the enzyme treatment to prepare a suspension.
단계 (1)의 상기 효소처리는 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase) 및 마나나제(mananase) 중에서 선택된 1종 이상의 효소에 의해 수행될 수 있다.The enzyme treatment of step (1) may be carried out by one or more enzymes selected from pectinase, cellulase, xylanase and mananase.
단계 (1)의 상기 효소처리는 펙티넥스(Pectinex), 에코니타제(Econitase), 라피다제(Rapidase), 비스코자임(Viscozyme), 셀루클라스트 (Celluclast), 로하멘트(Rohament), 울트라플로(Ultraflo) 및 사이토라제(Cytolase) 중에서 선택된 1종 이상의 상용효소에 의해 수행될 수 있다.The enzymatic treatment of step (1) may be carried out in the following order: Pectinex, Econitase, Rapidase, Viscozyme, Celluclast, Rohament, Ultraflo) and cytolase (Cytolase).
단계 (1)의 상기 효소처리는 상기 청귤 추출박 또는 청피의 건조분말 100중량부에 대하여 0.3 내지 1.5중량부의 효소를 첨가하여 4 내지 8시간 동안 수행될 수 있다.The enzyme treatment in step (1) may be carried out for 4 to 8 hours by adding 0.3 to 1.5 parts by weight of enzyme to 100 parts by weight of the dried powder of the citrus peel or chewing gum.
단계 (3) 이후, (4) 상기 조다당의 건조분말에 에탄올 수용액을 가하여 침전물을 회수하여 청귤 추출박 또는 청피의 정제 다당을 회수하는 단계;를 추가로 수행할 수 있다.After step (3), (4) a step of recovering the purified polysaccharide of the citrus fruit extract or cheongju by adding an aqueous ethanol solution to the dried powder of the above-mentioned saccharide to recover the precipitate.
단계 (4)는 2회 내지 5회 반복 수행할 수 있다.Step (4) can be repeated two to five times.
단계 (3) 이후, (4´) 상기 조다당을 젤투과크로마토그래피(gel permeation chromatography)에 의해 분자량에 따라 분리하여 정제 다당을 수득하는 단계;를 추가로 수행할 수 있다.After step (3), (4 ') separating the crude polysaccharide according to the molecular weight by gel permeation chromatography to obtain purified polysaccharide can be further carried out.
단계 (4´)에서 수득된 상기 정제 다당은 농축, 투석 및 건조 공정을 순차적으로 수행할 수 있다.The purified polysaccharide obtained in step (4 ') can be sequentially subjected to concentration, dialysis and drying processes.
본 발명의 청귤 추출박 또는 청피 유래의 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법에 따라 제조된 조다당 또는 정제다당은 종래 한라봉, 감귤 등의 감귤류에서 추출된 다당에 비하여 면역 및 항암활성을 현저히 향상시킬 수 있다.The crude polysaccharide or purified polysaccharide prepared according to the method of the present invention for producing anticancer or immunosuppressive polysaccharide derived from a chewy gum extract or chewing gum can remarkably improve immune and anticancer activity compared with polysaccharides extracted from citrus fruits such as hara bong, have.
도 1은 본 발명의 청귤 추출박 또는 청피 유래 다당의 제조방법을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 실시예 4에 따라 제조된 분획 다당의 용출곡선이다.
도 3은 시험예 1에 따른 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 시험예 2에 따른 대식세포에 대한 세포독성 및 사이토카인 생산에 미치는 영향에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 시험예 3에 따른 대식세포에 대한 세포독성 및 사이토카인 생산에 미치는 영향에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 시험예 4에 따른 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I의 NK cell 자극활성 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 시험예 5에 따른 청귤 추출박 유래 정제 다당 CCE-I의 정맥투여를 통한 항전이 활성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 8 내지 도 10은 시험예 6에 따른 NK cell 기능이 제어된 mouse에서의 청귤 추출박 유래 효소처리 다당 획분의 항전이 활성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 시험예 7에 따른 청귤 추출박 유래 조다당 CCE-0의 경구투여에 의한 자연살해세포의 종양살해능(NK cell activity) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 시험예 8에 따른 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0의 경구투여에 의한 항전이 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a flow chart showing a method for producing a citrus fruit extract or chewing gum polysaccharide of the present invention.
Fig. 2 is an elution curve of fractionated polysaccharide prepared according to Example 4. Fig.
Fig. 3 shows the results of HPLC analysis according to Test Example 1. Fig.
Fig. 4 shows the results on the cytotoxicity and cytokine production of macrophages according to Test Example 2. Fig.
Fig. 5 shows the results on the cytotoxicity and cytokine production on macrophages according to Test Example 3. Fig.
6 shows the results of NK cell stimulation activity of the enzyme-treated purified fraction CCE-I derived from the citrus peel-derived foil according to Test Example 4. FIG.
7 shows the result of the antitumor activity test by intravenous administration of the purified polysaccharide CCE-I derived from the citrus peel extract-like extract according to Test Example 5. FIG.
FIGS. 8 to 10 show the results of the antitumor activity test of an enzyme-treated polysaccharide fraction derived from a citrus peel extract in a mouse to which NK cell function was controlled according to Test Example 6. FIG.
FIG. 11 shows the results of NK cell activity analysis of natural killer cells by oral administration of crude polysaccharide CCE-0 derived from citrus peel extracts according to Test Example 7. FIG.
Fig. 12 shows the result of the antioxidant activity analysis by oral administration of an enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 derived from a citrus peel-derived foil according to Test Example 8. Fig.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The present invention is capable of various modifications and various embodiments, and specific embodiments are illustrated in the drawings and described in detail in the detailed description. It is to be understood, however, that the invention is not to be limited to the specific embodiments, but includes all modifications, equivalents, and alternatives falling within the spirit and scope of the invention. DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
도 1은 본 발명의 청귤 추출박 또는 청피 유래 다당의 제조방법을 나타낸 흐름도이다. 도 1을 참조하여 이하 본 발명의 청귤 추출박 또는 청피 유래 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법을 설명하도록 한다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a flow chart showing a method for producing a citrus fruit extract or chewing gum polysaccharide of the present invention. Hereinafter, with reference to FIG. 1, a method for producing anti-cancer or immune-active polysaccharide derived from citrus fruit extract or chewing gum of the present invention will be described.
이하, 본 발명의 일 구현예에 따른 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, a method for producing anticancer or immunostimulatory polysaccharide according to one embodiment of the present invention will be described.
먼저, 청귤 First, 추출박Extract foil 또는 or 청피의Cheongpy 건조분말을 Dry powder 열수추출하여Hot water extraction 열수추출물을Hot water extract 제조한다(단계 a). (Step a).
상기 열수추출 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조하는 것이 바람직하다.It is preferable to prepare a suspension by mixing with water having a weight of 10 to 30 times the dry powder before the hot water extraction.
상기 열수추출은 80 내지 120℃의 열수에 의해 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 90 내지 110℃에서 수행될 수 있다.The hot water extraction is preferably carried out by hot water at 80 to 120 ° C, more preferably at 90 to 110 ° C.
이후, 상기 Then, 열수추출물에서In hot water extract 잔사를The residue 제거하고, 알코올 수용액을 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수한다(단계 b). And the precipitate is recovered by precipitating the polysaccharide by adding an alcohol aqueous solution (step b).
이때, 잔사 제거는 5000 내지 700 rpm에서 10 내지 30분 동안 원심분리함으로써 수행될 수 있다.At this time, the residue removal can be performed by centrifuging at 5000 to 700 rpm for 10 to 30 minutes.
상기 알코올 수용액은 증류수:알코올의 부피비(v/v)가 1:10 내지 1:30 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1:15 내지 1:25일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 1:17 내지 1:22 일 수 있다.The alcohol aqueous solution preferably has a volume ratio (v / v) of distilled water to alcohol of 1:10 to 1:30, more preferably 1:15 to 1:25, still more preferably 1:17 To 1:22.
또한, 침전물 회수는 500 내지 700 rpm에서 20 내지 40분간 원심분리함으로써 수행될 수 있다.The precipitate recovery can also be performed by centrifuging at 500 to 700 rpm for 20 to 40 minutes.
마지막으로, 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 투석에 의해 Finally, the precipitate was dissolved in distilled water and dialyzed 저분자Low molecule 불순물을 제거하여 청귤 Removing impurities to make citrus 추출박Extract foil 또는 or 청피의Cheongpy 열수추출Hot water extraction 조다당을Joe Daffodan 수득한다(단계 c). (Step c).
상기 투석은 40 내지 60시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 45 내지 50시간 동안 수행할 수 있다.The dialysis is preferably performed for 40 to 60 hours, more preferably 45 to 50 hours.
상기 열수추출 다당은 동결건조하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.The hot-water-extracting polysaccharide may further be freeze-dried.
상기 열수추출에 따라 수득한 조다당은 2-메틸퓨코스(2-methylfucose), 람노오스(rhamnose), 퓨코스(fucose), 2-메틸자일로스(2-methylxylose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 아피오스(apiose), 아세르산(aceric acid), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 갈락투론산(Galacturonic Acid) 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.The crude polysaccharide obtained according to the hot water extraction is selected from the group consisting of 2-methylfucose, rhamnose, fucose, 2-methylxylose, arabinose, The present invention relates to a pharmaceutical composition containing xylose, apiose, aceric acid, mannose, galactose, glucose, galacturonic acid and glucuronic acid, And the like.
바람직하게는 다당 전체 몰비 100%에 대하여, 람노오스 1 내지 5몰%, 아라비노스 14 내지 20몰%, 갈락토스 7 내지 10몰%, 및 갈락투론산 50 내지 60몰%를 포함할 수 있다.
Preferably 1 to 5 mol% of rhamnose, 14 to 20 mol% of arabinose, 7 to 10 mol% of galactose, and 50 to 60 mol% of galacturonic acid based on 100% of the total polysaccharide molar ratio.
이하, 본 발명의 다른 구현예에 따른 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, a method of producing anticancer or immunostimulatory polysaccharide according to another embodiment of the present invention will be described.
먼저, 청귤 First, 추출박Extract foil 또는 or 청피의Cheongpy 건조분말을 효소 처리하여 효소 The dried powder was subjected to enzyme treatment to remove the enzyme 처리물을The treated water 제조한다(단계 1). (Step 1).
상기 효소 처리 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조하는 것이 바람직하다.It is preferable to prepare a suspension by mixing with water having a weight of 10 to 30 times the dry powder before the enzyme treatment.
상기 효소처리는 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase) 및 마나나제(mananase) 중에서 선택된 1종 이상의 효소에 의해 수행될 수 있다.The enzyme treatment may be carried out by at least one enzyme selected from pectinase, cellulase, xylanase and mananase.
상기 효소처리는 펙티넥스(Pectinex), 에코니타제(Econitase), 라피다제(Rapidase), 비스코자임(Viscozyme), 셀루클라스트 (Celluclast), 로하멘트(Rohament), 울트라플로(Ultraflo) 및 사이토라제(Cytolase) 중에서 선택된 1종 이상의 상용효소에 의해 수행될 수 있다.The enzymatic treatment may be carried out in the following order: Pectinex, Econitase, Rapidase, Viscozyme, Celluclast, Rohament, Ultraflo, (Cytolase). ≪ / RTI >
상기 효소처리는 상기 청귤 추출박 또는 청피의 건조분말 100중량부에 대하여 0.3 내지 1.5중량부의 효소를 첨가하여 4 내지 8시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.Preferably, the enzymatic treatment is carried out for 4 to 8 hours by adding 0.3 to 1.5 parts by weight of enzyme to 100 parts by weight of the dried powder of the citrus peel or chewing gum.
이후, 상기 효소 Then, the enzyme 처리물에서In the treated water 잔사를The residue 제거하고, 알코올 용매를 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수한다(단계 2). And the precipitate is recovered by precipitating polysaccharide with an alcohol solvent (step 2).
이때, 잔사 제거는 5000 내지 700 rpm에서 10 내지 30분 동안 원심분리함으로써 수행될 수 있다.At this time, the residue removal can be performed by centrifuging at 5000 to 700 rpm for 10 to 30 minutes.
상기 알코올 수용액은 증류수:알코올의 부피비(v/v)가 1:10 내지 1:30 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1:15 내지 1:25일 수 있고, 더욱 더 바람직하게는 1:17 내지 1:22 일 수 있다.The alcohol aqueous solution preferably has a volume ratio (v / v) of distilled water to alcohol of 1:10 to 1:30, more preferably 1:15 to 1:25, still more preferably 1:17 To 1:22.
또한, 침전물 회수는 500 내지 700 rpm에서 20 내지 40분간 원심분리함으로써 수행될 수 있다.The precipitate recovery can also be performed by centrifuging at 500 to 700 rpm for 20 to 40 minutes.
다음으로, 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 투석에 의해 Next, the precipitate was dissolved in distilled water and dialyzed 저분자Low molecule 불순물을 제거하여 청귤 Removing impurities to make citrus 추출박Extract foil 또는 or 청피의Cheongpy 효소처리 Enzyme treatment 조다당을Joe Daffodan 수득한다(단계 3). (Step 3).
상기 투석은 40 내지 60시간 동안 수행하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 45 내지 50시간 동안 수행할 수 있다.The dialysis is preferably performed for 40 to 60 hours, more preferably 45 to 50 hours.
또한, 상기 효소처리 다당은 건조하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.The enzyme-treated polysaccharide may further be dried.
상기 건조는 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등의 방법에 따라 수행될 수 있다.The drying may be carried out by a method such as vacuum distillation, freeze drying or spray drying.
상기 효소처리에 따라 수득한 조다당은 2-메틸퓨코스(2-methylfucose), 람노오스(rhamnose), 퓨코스(fucose), 2-메틸자일로스(2-methylxylose), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 아피오스(apiose), 아세르산(aceric acid), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 갈락투론산(Galacturonic Acid) 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid) 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.The crude polysaccharide obtained according to the above enzyme treatment may be selected from the group consisting of 2-methylfucose, rhamnose, fucose, 2-methylxylose, arabinose, The present invention relates to a pharmaceutical composition containing xylose, apiose, aceric acid, mannose, galactose, glucose, galacturonic acid and glucuronic acid, And the like.
바람직하게는 다당 전체 몰비 100%에 대하여, 람노오스 13 내지 20몰%, 아라비노스 12 내지 16몰%, 갈락토스 9 내지 13몰%, 및 갈락투론산 35 내지 40몰%를 포함할 수 있다.
Preferably 13 to 20 mol% of rhamnose, 12 to 16 mol% of arabinose, 9 to 13 mol% of galactose, and 35 to 40 mol% of galacturonic acid based on 100% of the total polysaccharide molar ratio.
경우에 따라 단계 (3)에서 제조된 Optionally in step (3) 조다당의Joda Party 건조분말에 에탄올 수용액을 가하여 침전물을 회수하여 청귤 An aqueous ethanol solution was added to the dried powder to recover the precipitate, 추출박Extract foil 또는 or 청피의Cheongpy 정제 다당을 회수하는 단계를 추가로 수행할 수 있다(단계 4). The step of recovering the purified polysaccharide can be further carried out (step 4).
상기 에탄올 수용액은 증류수:알코올이 1:5 내지 1:0.3의 부피비로 혼합된 것을 사용하는 것이 바람직하다.The aqueous ethanol solution is preferably a mixture of distilled water and alcohol in a volume ratio of 1: 5 to 1: 0.3.
단계 (4)는 2회 내지 5회 반복 수행하여 정제율을 높일 수 있다.
Step (4) may be repeated two to five times to increase the purification rate.
또한, 경우에 따라 단계 (3)에서 제조된 Further, in some cases, 조다당을Joe Daffodan 젤투과크로마토그래피( Gel permeation chromatography ( gelcome permeation permeation chromatographychromatography )에 의해 분자량에 따라 분리하여 정제 다당을 수득하는 단계를 추가로 수행할 수 있다(단계 4´).) According to the molecular weight to obtain purified polysaccharide (step 4 ').
단계 (4´)에서 수득된 상기 정제 다당은 농축, 투석 및 건조 공정을 순차적으로 수행하는 것이 바람직하다. Preferably, the purified polysaccharide obtained in step (4 ') is sequentially subjected to concentration, dialysis and drying processes.
상기 건조는 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등의 방법에 따라 수행될 수 있다.The drying may be carried out by a method such as vacuum distillation, freeze drying or spray drying.
이에 따라 정제된 정제다당은 50 내지 70 kDa의 고분자량 정제다당 10 내지 20 kDa의 중분자량 정제다당, 및 0.1 내지 5 kDa의 저분자량 정제다당의 3가지 타입으로 수득될 수 있다.Accordingly, the purified purified polysaccharide can be obtained in three types of high molecular weight purified polysaccharide of 50 to 70 kDa, medium molecular weight purified polysaccharide of 10 to 20 kDa, and low molecular weight purified polysaccharide of 0.1 to 5 kDa.
상기 젤투과크로마토그래피에 따라 수득한 분자량 50 내지 70kD인 정제다당의 구성당은, 람노오스(rhamnose) 100몰부에 대하여, 아라비노스(arabinose) 35 내지 45몰부; 갈락토스(galactose) 90 내지 100몰부; 및 갈락투론산(galacturonic acid) 200 내지 220몰부;를 포함할 수 있다.The constituent sugar of the purified polysaccharide having a molecular weight of 50 to 70 kD obtained by the gel permeation chromatography is 35 to 45 molar parts of arabinose to 100 molar parts of rhamnose; 90 to 100 molar parts of galactose; And 200 to 220 molar parts of galacturonic acid.
바람직하게는, 상기 람노오스 100몰부에 대하여, 퓨코스(fucose) 5 내지 10몰부; 자일로스(xylose) 14 내지 19몰부; 만노스(mannose) 2 내지 5몰부; 글루코스(glucose) 2 내지 6몰부; 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid) 3 내지 7몰부;를 추가로 포함할 수 있다.Preferably, for 100 moles of rhamnose, 5 to 10 moles of fucose;
또한, 상기 젤투과크로마토그래피에 따라 수득한 분자량 10 내지 20kD인 정제다당의 구성당은, 람노오스(rhamnose) 100몰부에 대하여, 아라비노스(arabinose) 72 내지 82몰부; 갈락토스(galactose) 50 내지 60몰부; 및 갈락투론산(galacturonic acid) 350 내지 400몰부;를 포함할 수 있다.The constituent sugar of the purified polysaccharide having a molecular weight of 10 to 20 kD obtained according to the gel permeation chromatography is 72 to 82 molar parts of arabinose to 100 molar parts of rhamnose; 50 to 60 molar parts of galactose; And 350 to 400 molar parts of galacturonic acid.
바람직하게는, 상기 람노오스 100몰부에 대하여, 2-메틸퓨코스(2-methylfucose) 15 내지 25몰부; 퓨코스(fucose) 15 내지 25몰부; 2-메틸자일로스(2-methylxylose) 7 내지 13몰부; 자일로스(xylose) 15 내지 22몰부; 아세르산(aceric acid) 10 내지 15몰부; 만노스(mannose) 0.5 내지 3몰부; 글루코스(glucose) 2 내지 6몰부; 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid) 20 내지 30몰부;를 추가로 포함할 수 있다.Preferably, 15 to 25 molar parts of 2-methylfucose are added to 100 molar parts of the above-mentioned rhamnose; 15 to 25 molar parts of fucose; 7 to 13 molar parts of 2-methylxylose;
또한, 상기 젤투과크로마토그래피에 따라 수득한 분자량 0.1 내지 5kD인 정제다당의 구성당은, 람노오스(rhamnose) 100몰부에 대하여, 아라비노스(arabinose) 5 내지 10몰부; 갈락토스(galactose) 10 내지 16몰부; 및 갈락투론산(galacturonic acid) 120 내지 160몰부;를 포함할 수 있다.The constituent sugar of the purified polysaccharide having a molecular weight of 0.1 to 5 kD obtained by gel permeation chromatography is 5 to 10 molar parts of arabinose per 100 molar parts of rhamnose; 10 to 16 molar parts of galactose; And 120 to 160 parts by mole of galacturonic acid.
바람직하게는, 상기 람노오스 100몰부에 대하여, 퓨코스(fucose) 0.2 내지 1몰부; 자일로스(xylose) 3 내지 8몰부; 만노스(mannose) 1 내지 4몰부; 글루코스(glucose) 12 내지 17몰부; 및 글루쿠론산(Glucuronic Acid) 5 내지 10몰부;를 추가로 포함할 수 있다.
Preferably, 0.2 to 1 part by mole of fucose is added to 100 parts by mole of the above-mentioned rhamnose.
본 발명의 제조방법으로 제조된 청귤 추출박 또는 청피 유래의 다당은 종래 한라봉, 귤 등의 감귤류 유래의 다당과 조성이 상이하여 항암 및 면역활성이 더욱 유용할 수 있다. 구체적으로 살펴보면, 팩틴(pectin)은 호모갈락투로난(homogalacturonan)에 공유적으로 rhamnogalacturonan(RG)-I과 RG-Ⅱ가 결합되어 있으며, 펙틴의 생리활성에 관여하는 부분은 RG-I과 RG-Ⅱ라고 알려져 있다. 한라봉 과피로부터 분리한 면역활성 및 항암활성에 주로 공헌하는 다당체는 자연계에서 잘 관찰되지 않으며, RG-Ⅱ 구조에서 관찰되는 2-메틸 퓨코스, 2-메틸자일로스, 아피오스, 아세르산, 3-디옥시-D-만노-2-옥툴로손산(KDO), 3-디옥시-D-릭소-2-헵툴로사르산(DHA)를 포함하여 14종의 단당과 23종의 당쇄결합양식으로 이루어져 있어 전형적인 RG-Ⅱ의 구조임이 확인되었다. 이에 반해, 청귤 추출박의 경우 한라봉 과피와 유사하게 펙틴 다당체에서 생리활성이 나타났으며, 이는 RG-Ⅱ가 아닌 RG-I 구조가 활성에 공헌한다고 확인되었다. 청귤 추출박 유래 면역활성 다당체는 구성당 분석을 통해 아라비노스, 갈락토스, 람노스, 갈락투론산 함량이 높고, 당쇄결합양식 분석을 통해 비교적 브랜치(branch)가 짧은 고도로 분지된 RG-I의 구조인 것으로 파악된다.
The polysaccharide derived from the citrus fruit extract or the citrus peel produced by the production method of the present invention is different in composition from polysaccharides derived from citrus fruits such as hara bong, mandarin orange and the like, so that anti-cancer and immunological activity may be more useful. Specifically, pectin has a homogalacturonan covalently bound to rhamnogalacturonan (RG) -I and RG-II, and a part involved in the physiological activity of pectin is RG-I and RG- -II. Polysaccharides, which mainly contribute to the immunological activity and anticancer activity isolated from hyalabroma, are not well observed in nature, and 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose, 14 types of monosaccharides and 23 types of sugar chains, including dioxy-D-manno-2-octulosonic acid (KDO) and 3-deoxy-D-leuco-2-heptulosaric acid And it was confirmed that it is a typical structure of RG-II. On the contrary, in the case of citrus fruit extract, physiological activity was exhibited in the pectin polysaccharide similar to that of the hirabong skin, and it was confirmed that the RG-I structure rather than RG-II contributed to the activity. Immunologically active polysaccharides derived from citrus peel extracts were analyzed by constitutional sugar analysis to determine the structure of RG-I having a high content of arabinose, galactose, rhamnose and galacturonic acid and a relatively branched branch with a sugar chain binding assay .
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the present invention. Such variations and modifications are intended to be within the scope of the appended claims.
[실시예][Example]
실시예Example 1: 청귤 1: orange juice 추출박Extract foil 열수추출Hot water extraction 조다당Group (( CCWCCW -0) 제조-0) Manufacturing
청귤 추출박 건조 분말 100 g을 DIW 2 L에 현탁하고 100℃에서 가열 처리하여 최초부피의 절반이 될 때까지 열수추출을 진행하였다. 추출액을 6,000 rpm에서 20 분간 원심 분리하여 잔사를 제거하고 여기에 4배 부피(v/v)의 95% 에탄올을 가하여 24 시간 교반하면서 다당을 침전시켰으며, 이때 발생한 침전물은 6,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 회수된 침전물을 증류수에 용해시킨 후, dialysis tubing (MW cut-off 12,400)을 이용하여 2일간 투석을 실시하였으며, 이를 동결건조 (FreeZone 12Liter, Labconco, Kansas City, Missouri. USA)하여 청귤 추출박 유래 단순 열수추출 조다당 획분(CCW-0)를 얻었다.
100 g of dried citrus fruit extract powder was suspended in 2 L of DIW and heat-treated at 100 ° C to conduct hot water extraction until the volume became half of the initial volume. The extract was centrifuged at 6,000 rpm for 20 minutes to remove the residues, and multiparticulates were precipitated by adding thereto 4 times volume (v / v) of 95% ethanol and stirring for 24 hours. The resulting precipitate was centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes The precipitate was recovered by separation. The recovered precipitate was dissolved in distilled water, dialyzed for 2 days using dialysis tubing (MW cut-off 12,400), and lyophilized (FreeZone 12Liter, Labconco, Kansas City, Missouri, USA) A simple hydrothermal extraction crude polysaccharide fraction (CCW-0) was obtained.
실시예Example 2: 청귤 2: citrus 추출박Extract foil 효소처리 Enzyme treatment 조다당Group (( CCECCE -0) 제조-0) Manufacturing
청귤 추출박 건조 분말 1 kg을 20배의 증류수에 현탁하고, 식품용 시판 상업용 효소 Pectinex ultra SP-L (from Aspergillus aculeatus, 20℃, pH 3.5)(분말의 0.5~1% 첨가)를 6시간 처리한 후, 이를 100℃에서 15분간 잔존효소 활성을 실활시켰다. 이후, 효소 단백을 제거하기 위해 청귤 추출박 효소처리물을 6,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 잔사를 제거하고 여기에 4배(v/v) 부피의 95% 에탄올을 가하여 24시간 교반하면서 다당을 침전시킨 후, 원심분리하여 상등액과 침전물을 분리하였다. 이후, 회수한 침전물은 소량의 증류수에 재용해시킨 후, dialysis tubing(MW cut-off 12,400)을 이용하여 2일간 투석을 실시하였으며 이를 동결 건조하여 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 획분 CCE-0를 얻었다.
One kilogram of dried citrus fruit extract powder was suspended in 20 times of distilled water, and the commercially available commercial commercial enzyme Pectinex ultra SP-L (from Aspergillus aculeatus , 20 ℃, pH 3.5) (added with 0.5 ~ 1% of powder) was treated for 6 hours and then the enzyme activity was inactivated at 100 ℃ for 15 minutes. Then, to remove the enzyme protein, the citrus extract-treated enzymes were centrifuged at 6,000 rpm for 20 minutes to remove the residues, followed by addition of 4-fold (v / v) 95% ethanol and stirring for 24 hours to precipitate the polysaccharide After centrifugation, the supernatant was separated from the precipitate. Thereafter, the collected precipitates were redissolved in a small amount of distilled water, dialyzed for 2 days using dialysis tubing (MW cut-off 12,400), and lyophilized to obtain an enzyme-treated polysaccharide fraction CCE-0 .
실시예Example 3: 청귤 3: Blueberry 추출박Extract foil 효소처리 Enzyme treatment 조다당Group (( CCECCE -0) 알코올을 이용한 정제-0) Purification using alcohol
실시예 2에 따라 제조된 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당(CCE-0) 건조시료 일정량에 증류수와 에탄올이 일정 비율로 혼합된 농도별 알콜용액(DIW:EtOH, v/v, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1.5, 1:1, 1:0.5) 가하여 현탁하고 교반한 후, 원심분리에 의해 침전물과 상등액을 분리하였다. 이후, 회수된 침전은 동일부피의 해당 알콜용액을 가하여 3회 세척을 반복하고 각 침전물과 상등액을 회수, 동결건조를 거쳐 처리 알코올 농도별 12개의 용매 분획물을 얻었다. 구체적으로, 6개의 침전물 CCE-4P, CCE-3P, CCE-2P, CCE-1.5P, CCE-1P, CCE-0.5P 및 6개의 상등액 CCE-4S, CCE-3S, CCE-2S, CCE-1.5S, CCE-1S, CCE-0.5S을 얻었다. 이때, DIW:EtOH=1:4 비율로 혼합된 용매로 세척한 CCE-4P 획분에서 67.5%로 수율이 가장 높았으며, 알코올의 농도가 낮아질수록 수율도 함께 낮아짐을 확인할 수 있었다.
(DIW: EtOH, v / v, 1: 4, 1: 1, 1: 2, and 1: 4) mixed with a constant ratio of distilled water and ethanol was added to a predetermined amount of a dried sample of polysaccharide- 1: 3, 1: 2, 1: 1.5, 1: 1, 1: 0.5), and the precipitate and the supernatant were separated by centrifugation. Thereafter, the recovered precipitates were washed three times with the same volume of alcohol solution, and the precipitates and supernatant were recovered and lyophilized to obtain 12 solvent fractions by treatment alcohol concentration. Specifically, six precipitants CCE-4P, CCE-3P, CCE-2P, CCE-1.5P, CCE-1P, CCE- S, CCE-1S and CCE-0.5S. In this case, the yield of CCE-4P fraction washed with a solvent mixed with DIW: EtOH = 1: 4 was the highest at 67.5%, and the lower the alcohol concentration, the lower the yield.
실시예Example 4: 청귤 4: orange juice 추출박Extract foil 효소처리 Enzyme treatment 조다당Group (( CCECCE -0) 알코올 크로마토그래피를 이용한 정제-0) Purification using alcohol chromatography
실시예 2에 따라 제조된 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당(CCE-0)을 증류수에 녹여 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5)로 평형화된 Sephadex G-100 column (4×120 cm)에 전개하여 GPC (Gel permeation chromatography)를 시행하였다. 각 분획 시료는 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 분석하여 용출곡선을 작성하여 도 2에 나타내었으며, 분자량 및 구성성분이 상이한 3개의 획분, CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ로 분리한 후, 각 획분은 농축, 투석 및 동결 건조를 시행하였다.The enzyme-treated crude polysaccharide (CCE-0) prepared according to Example 2 was dissolved in distilled water and developed on a Sephadex G-100 column (4 x 120 cm) equilibrated with 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5) Gel permeation chromatography (GPC) was performed. Each fraction was analyzed for neutral sugar, acid sugar, protein, and KDO content to prepare a dissolution curve. The elution curve is shown in FIG. 2, and three fractions with different molecular weights and constituents, CCE-I, CCE-II and CCE-III After separation, each fraction was concentrated, dialyzed and lyophilized.
청귤 추출박 유래 정제획분 CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ의 수율은 각각 청귤 추출박 원물 대비 1.42%, 2.02% 및 0.51%로 확인되었다.
The yields of CCE-I, CCE-Ⅱ and CCE-Ⅲ were 1.42%, 2.02% and 0.51%, respectively.
[시험예][Test Example]
시험예Test Example 1: 다당의 성분 분석 1: Analysis of components of polysaccharide
청귤 추출박 유래 단순 열수추출 조다당 CCW-0, 효소처리 조다당 CCE-0 및 정제다당획분 CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ의 화학적 조성 및 구성당을 분석한 결과를 아래의 표 1에 나타내었으며, HPLC 분석결과를 도 3에 나타내었다.The chemical composition and constituent sugars of simple hydrothermal extraction crude polysaccharide CCW-0, enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 and purified polysaccharide fractions CCE-I, CCE-II and CCE- And the results of HPLC analysis are shown in Fig.
이에 따르면, 청귤 추출박 유래 단순 열수추출 조다당 CCW-0의 화학적 조성을 분석한 결과, 중성당 40.4%, 산성당 56.9%, 단백질과 폴리페놀은 각각 1.0%, 1.8%로 미미하게 검출되었으며, KDO는 검출되지 않았다. Alditol acetate로 유도체화한 후 구성당을 분석한 결과, galacturonic acid (GalA) (54.5%), arabinose (Ara) (17.8%) 및 galacrose(Gal)(8.6%) 순으로 확인되었으며 분자량을 확인하기 위해, HPLC를 이용하여 elution pattern을 확인한 결과 분자량이 큰 형태로 확인되었다.According to the analysis, chemical composition of CCW-0, a simple hydrothermal extraction crude polysaccharide derived from citrus peel extract, was 40.4% for neutral sugar, 56.9% for acid, and 1.0% and 1.8% for protein and polyphenol, respectively. Was not detected. (54.8%), arabinose (Ara) (17.8%) and galacrose (Gal) (8.6%) were identified in order of molecular weight after the derivatization with Alditol acetate. , And the elution pattern was confirmed by HPLC. As a result, it was confirmed that the molecular weight was large.
또한, 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0의 경우, 중성당 52.0%, 산성당 41.1%, 단백질 3.3%, 폴리페놀 1.8% 및 KDO 1.8%로 확인되었으며, 구성당을 분석한 결과, galacturonic acid (GalA) (37.6%), rhamnose (Rha) (16.7%), arabinose (Ara) (14.6%) 및 galacrose (Gal) (11.6%)로 이루어져 있었다. 또한, 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose 및 aceric acid와 같은 펙틴(pectin) 유래 rhamnogalacturonan II (RG-II)에서 발견되는 특이당도 일부 검출되었다. HPLC 분석결과는 고분자 물질과 저분자 물질이 혼재된 형태로 확인되었다.In addition, in the case of CCE-0 enzyme treated group derived from citrus peel extract, it was confirmed that 52.0% of neutral sugar, 41.1% of acid group, 3.3% of protein, 1.8% of polyphenol and 1.8% of KDO, (37.6%), rhamnose (Rha) (16.7%), arabinose (14.6%) and galacrose (Gal) (11.6%). Some of the specific sugars found in pectin-derived rhamnogalacturonan II (RG-II) such as 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose and acetic acid were also detected. The results of the HPLC analysis were confirmed as a mixture of a polymer substance and a low molecular substance.
이에 따르면, 열수추출 조다당 CCW-0와 효소처리 조다당 CCE-0는 중성당과 산성당이 주로 존재하고 있으며, 특히, 효소처리 조다당 CCE-0가 단순 열수추출 조다당 CCW-0보다 산성당 함량이 더 적게 검출되었고, 이는 pectinase 효소 처리에 의해서 pectin 유래 homogalacturonan (HG) 영역이 가수분해 후 저분자화고, 이는 이는 투석에 의해 제거된 것으로 판단된다. 또한, 효소처리 조다당 CCE-0의 경우 다양한 구성당과 함께 pectin 유래 RG-Ⅱ 구조에서만 발견되는 Kdo 및 특이당들이 검출된 사실로 미루어 보아 산성 다당체인 pectin 계열의 다당일 것으로 추정된다.According to the results, the hydrolyzate group CCW-0 and the enzyme-treated group CCE-0 mainly contain neutral sugars and acid groups. Especially, the enzyme-treated group CCE-0 is more acid The lower content of catechins was detected by the treatment with pectinase enzyme, which suggests that the homogalacturonan (HG) domain derived from pectin was hydrolyzed and reduced by low molecular weight, which was due to dialysis. In addition, in the case of the enzyme-treated polysaccharide CCE-0, Kdo and specific sugars found only in the pectin-derived RG-Ⅱ structure were detected along with various constituent sugars. Therefore, it is presumed that the polysaccharide is an acidic polysaccharide.
한편, 청귤 추출박 유래 효소처리 정제 다당 CCE-I의 경우, 중성당 52.1%, 산성당 42.0%, 단백질 2.6%, Kdo 2.2% 및 phenolic compounds는 1.0%로 이루어져 있고, 구성당으로는 GalA (41.0%), Rha (19.5%), Gal (18.5%) 및 Ara (8.1%) 순으로 나타났으며, 분자량을 확인한 결과, 62 kDa 정도의 분자량을 가진 다당이 주로 존재하는 것으로 확인되었다. CCE-I은 GalA, Rha, Gal 및 Ara가 주로 존재하는 것으로 보아 rhamnose 및 galacturonic acid를 주쇄로 한 pectin 유래 rhamnogalacturonan I (RG-I) 구조일 것으로 추정되며, 특히 arabinose와 galactose의 높은 조성을 고려할 때, RG-I 구조내의 arabinogalactan이 높은 비율로 존재할 것이라고 추정된다.On the other hand, the enzyme-treated purified polysaccharide CCE-I derived from citrus peel extract was composed of 52.1% of neutral sugar, 42.0% of acid, 2.6% of protein, 2.2% of Kdo and 1.0% of phenolic compounds. ), Rha (19.5%), Gal (18.5%) and Ara (8.1%), respectively. As a result of molecular weight determination, it was confirmed that polysaccharide having molecular weight of about 62 kDa was mainly present. It is suggested that CCE-I is a rhamnogalacturonan I (RG-I) structure derived from pectin mainly composed of rhamnose and galacturonic acid, considering that GalA, Rha, Gal and Ara are mainly present. Especially considering the high composition of arabinose and galactose, It is estimated that a high proportion of arabinogalactan in the RG-I structure will be present.
비교적 저분자 다당체 CCE-II는 중성당 40.8%, 산성당 51.6%, 단백질 1.4%, Kdo 5.5% 및 phenolic compounds는 0.7%로 이루어져 있고, 구성당 분석 결과, GalA (48.5%), Rha (12.8%) 및 Ara (9.9%) 순으로 나타났으며, 자연계에서 거의 관찰되지 않으며, RG-II 구조에서만 주로 존재하는 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose 및 aceric acid와 같은 특이당들이 다량 검출되었다. 또한, HPLC를 이용하여 순도 및 분자량을 측정한 결과, 16 kDa 의 정제도가 우수한 단일 획분을 나타내어, CCE-II는 pectin의 HG 부분에 공유적으로 결합되어있는 RG-Ⅱ 구조인 것으로 추정된다.As a result of the constitutional analysis, GalA (48.5%) and Rha (12.8%) were found to be relatively low-molecular polysaccharide CCE-II, which consisted of 40.8% neutral sugar, 51.6% acidity, 1.4% protein, , And ara (9.9%). In the RG-II structure, 2-methyl fucose, 2-methyl xylose, apiose and acic acid were detected in large amounts. Purity and molecular weight were measured by HPLC. As a result, a purified fraction of 16 kDa showed excellent single fraction. It is estimated that CCE-II is an RG-II structure covalently bonded to the HG portion of pectin.
저분자 획분 CCE-Ⅲ는 중성당 47.6%, 산성당 48.0%, 단백질 0.7%, Kdo 2.5% 및 phenolic compounds 1.2%로 이루어져 있었으며, 이중 GalA 45.7% 및 Rha 32.5%로 주로 구성되어 있었으며, 190-4,500 Da의 넓은 범위의 분자량으로 이루어져 있는 것으로 보아 효소 가수분해로 인해 분해된 저분자들과 RG-Ⅱ의 monomer 형태가 혼재되어있을 것으로 추정된다.
The low-molecular fraction, CCE-Ⅲ, consisted of 47.6% neutral sugar, 48.0% acid, 0.7% protein, 2.5% Kdo and 1.2% phenolic compounds and was composed mainly of GalA 45.7% and Rha 32.5% , It is presumed that the monomeric form of RG-Ⅱ is mixed with the low-molecular-weight decomposed by enzymatic hydrolysis.
시험예Test Example 2: 2: 열수추출Hot water extraction 조다당Group CCWCCW -0와 효소처리 -0 and enzyme treatment 조다당Group CCECCE -0의 대식세포(-0 macrophages ( macrophagemacrophage )에 대한 세포독성 및 사이토카인() And cytokines (< RTI ID = 0.0 > cytokionecytokione ) 생산에 미치는 영향) Impact on production
시험예 2에 따른 시험결과를 도 4에 나타내었다. 여기서, NC는 음성 대조군(medium) 이고, PC (LPS, 1 ㎍/mL)는 음성대조군이다. The results of the test according to Test Example 2 are shown in Fig. Where NC is the negative control and PC (LPS, 1 ug / mL) is the negative control.
마우스의 복강으로부터 분리한 정상세포인 대식세포(macrophage)를 이용하여 청귤 추출박 유래 단순 열수추출 조다당 CCW-0와 효소처리 조다당 CCE-0에 의한 세포 독성여부를 측정하여 그 결과를 도 4의 (a)에 나타내었다. The cytotoxicity of simple hydrothermally extracted crude polysaccharide CCW-0 and enzyme-treated polysaccharide CCE-0 derived from citrus peel extracts was measured using macrophages, which are normal cells isolated from the abdominal cavity of mice, (A) of FIG.
1×106 cells/mL로 조정된 정상세포주에 CCW-0와 CCE-0를 각각 1㎍에서 1000 ㎍까지의 다양한 농도로 가하여 배양한 후 세포의 생존 여부를 확인한 결과, 복강에서 분리한 대식세포에 대해 두 시료 모두 세포독성은 나타나지 않았으며, 오히려 정상세포에 대한 증식능을 보여주었다.CCW-0 and CCE-0 were added to normal cell lines adjusted to 1 × 10 6 cells / mL at various concentrations ranging from 1 μg to 1000 μg respectively, and then viability of the cells was examined. As a result, , Neither cytotoxicity was observed in both samples, but rather the ability to proliferate to normal cells.
도 4의 (b)~(c)를 참조하면, 청귤 추출박 유래 단순 열수추출 조다당 CCW-0와 효소처리 조다당 CCE-0에 대하여 복강 유래 대식세포의 사이토카인 생산을 in vitro 에서 측정한 결과, CCE-0의 경우 1,000㎍/mL의 농도에서만 IL-6, IL-12 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산을 촉진함을 확인하였으며, CCW-0은 모든 농도에서 IL-6, IL-12 및 TNF-α와 같은 사이토카인 생산능이 전혀 나타나지 않았다.4 (b) to 4 (c), the production of cytokines of abdominal-derived macrophages was measured in vitro in a simple hydrothermal extraction crude polysaccharide CCW-0 derived from citrus peel extracts and an enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 As a result, it was confirmed that CCE-0 promotes the production of cytokines such as IL-6, IL-12 and TNF-α only at a concentration of 1,000 μg / mL. -12, and TNF- [alpha].
본 시험예에서 대식세포를 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0에 의해 24시간 자극한 결과, 염증부위에 면역세포의 귀소와 직접 관련이 있는 염증성 사이토카인으로 분류되는 IL-6과 TNF-α의 생산 및 세포성 면역능의 활성화와 직접 관련이 있는 IL-12를 유의하게 생산하는 활성이 있음이 확인되었으므로 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0은 생체방어에 작용하는 대식세포 수용체에 결합한 다음 세포 내 신호전달을 유도하여 핵 내에서 사이토카인을 유도시켜 면역기구를 활성화하는 기능에 일부 관여하고 있다고 판단된다.In this test, stimulation of macrophages with CCE-0 enzyme-treated polysaccharide-derived polysaccharide-derived polysaccharide for 24 hours revealed that IL-6 and TNF-α, which are classified as inflammatory cytokines, α production and IL-12 activity, which is directly related to the activation of cellular immunity, was found to be significant. Therefore, the enzyme-treated polysaccharide-derived CCE-0 derived from citrus peel extracts was found to bind to the macrophage receptor It is thought to be involved in the function of activating the immune system by inducing cytokine in the nucleus by inducing intracellular signal transduction.
특히, IL-12는 암세포 존재 시, 암세포 치사작용을 하는 NK cell 활성화에 직접 관여하므로 항암 활성 유도에 필수적인 사이토카인으로 인정되고 있으므로, 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0에는 NK cell 활성화 기능도 있을 것으로 추측된다.
In particular, IL-12 is recognized as a cytokine essential for the induction of anticancer activity since it is directly involved in the activation of NK cells that are involved in cancer cell death in the presence of cancer cells. Therefore, the enzyme-treated group CK- .
시험예Test Example 3: 청귤 3: Blueberry 추출박Extract foil 유래 효소처리 정제 다당 획분의 대식세포에 대한 세포독성 및 사이토카인 생산에 미치는 영향 Effect of Enzyme-Treated Purified Polysaccharide Fraction on Cytotoxicity and Production of Cytokines to Macrophages
시험예 3의 결과를 도 5에 나타내었다.The results of Test Example 3 are shown in Fig.
위의 시험예에서 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0가 단순 열수추출 조다당 CCW-0보다 높은 cytokine 생산능을 보여주긴 했지만, 고농도에서만 생산능을 나타내었으므로 활성에 더 관여하는 영역을 찾고자 정제를 통해 세 개의 획분 CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ를 얻었으며, 이에 대한 사이토카인 생산능을 확인하였다.In the above test example, the enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 derived from citrus peel extract showed higher cytokine production ability than the simple hydrothermal extraction crude polysaccharide CCW-0. However, since it produced only at a high concentration, Three fractions CCE-I, CCE-Ⅱ and CCE-Ⅲ were obtained through the screening, and their cytokine production ability was confirmed.
먼저 마우스의 복강으로부터 분리한 정상세포인 대식세포를 이용하여 청귤 추출박 유래 효소처리 정제 획분 CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ에 의한 세포 독성여부를 측정한 결과를 도 5의 (a)에 나타내었다. First, the cytotoxicity of CCE-I, CCE-II, and CCE-III was examined using macrophages, normal cells isolated from the abdominal cavity of mice, Respectively.
1×106 cells/mL로 조정된 종양 및 일반세포주에 정제 획분 CCE-I, CCE-Ⅱ 및 CCE-Ⅲ를 각각 1㎍에서 1000㎍까지의 다양한 농도로 가하여 배양한 후 세포의 생존여부를 확인한 결과, 복강에서 분리한 대식세포에 대해 정제획분 시료 모두 세포독성을 나타나지 않았다.
The cells were cultured in the presence of various concentrations ranging from 1 μg to 1000 μg of the purified fractions CCE-I, CCE-II and CCE-III in tumor and normal cell lines adjusted to 1 × 10 6 cells / mL, As a result, no cytotoxicity was observed in the purified fraction samples of the macrophages isolated from the peritoneal cavity.
시험예Test Example 4: 청귤 4: orange juice 추출박Extract foil 유래 정제 다당 Derived tablets polysaccharide CCECCE -I의 자연 살해 세포에 의한 살해 활성능(Performance of killing action by natural killer cells of -I NKNK cellcell activityactivity ) 분석) analysis
시험예 4에 따른 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I의 NK cell 자극활성 결과를 도 6에 나타내었다.The results of the NK cell stimulation activity of the enzyme-treated purified fraction CCE-I derived from the citrus peel extract-like peptide according to Test Example 4 are shown in FIG.
CCE-I을 각 125, 250, 500㎍/mouse로 정맥 주사하여 얻어진 비장 유래 세포 (splenocytes, NK-cells)는 target cell인 암세포주 (YAC-1)에 대한 effect cell (splenocytes)의 비율(E/T ratio)이 E/T ratio=100:1에서 가장 높은 살해능을 보여주었으며, 특히 250 ㎍/mouse에서 normal control (NC) 대비 약 3배의 높은 NK cell 활성을 나타내었다. 이는 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I이 NK cell을 활성화시켜 청귤 추출박의 항암활성에 주로 작용하는 것으로 확인된다.
(Splenocytes, NK-cells) obtained by intravenous injection of CCE-I at 125, 250 and 500 μg / mouse, respectively, showed the ratio of effect cell (splenocytes) to target cell (YAC-1) / T ratio) showed the highest killability at E / T ratio of 100: 1, and especially at 250 ㎍ / mouse, NK cell activity was about 3 times higher than that of normal control (NC). It is confirmed that CCE-I, an enzyme-treated purified fraction derived from citrus peel extract, activates NK cells and acts mainly on the anticancer activity of citrus fruit extract.
시험예Test Example 5: 청귤 5: orange juice 추출박Extract foil 유래 정제 다당 Derived tablets polysaccharide CCECCE -I의 정맥투여를 통한 항전이 활성Of intravenous administration of -I
앞선 실험결과 강력한 NK cell 활성자극능이 확인되어 이들의 항전이 활성을 측정하고자 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I을 농도별로 정맥 주사한 후, Colon 26-M3.1 carcinoma cell을 정맥으로 투여하여 항전이 활성을 평가하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.The results of the previous experiment showed that the strong NK cell activating ability was confirmed, and to measure the antitumor activity of these NK cells, the Colon 26-M3.1 carcinoma cell was intravenously injected with the CCE-I enzyme-treated fraction- The antitumor activity was evaluated and the results are shown in Fig.
시료를 투여하지 않은 대조군의 종양의 수를 100% 전이된 것으로 하여 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I의 항전이 활성을 확인한 결과, 125㎍과 250 ㎍의 CCE-I을 투여한 군에서 전이가 각각 73.8%과 72.8%가 저해되는 항전이 효과가 확인되었자. 그러나, 500 ㎍ 농도 투여군에서는 암전이가 28.2% 정도 억제되는 것으로 보아 오히려 낮은 농도에서 암전이 억제효과가 더 우수한 것으로 확인되었다. The antitumor activity of the enzyme-treated purified fraction CCE-I derived from the citrus fruit extract-treated leaves was examined by counting the number of tumors in the control group to which no sample was administered as 100%. As a result, the group treated with 125 μg and 250 μg of CCE- 73.8% and 72.8% of the metastatic lesions were inhibited, respectively. However, the inhibition of cancer metastasis by 28.2% was observed at 500 ㎍ concentration.
이는 앞선 결과와 상응하게 CCE-I의 항전이 활성은 앞선 NK cell 활성을 나타내었던 시료농도와 비교하였을 때 동일한 결과를 나타냄으로써 CCE-I에 의한 종양전이 억제효과는 NK cell의 활성화에 기인한 효과일 수 있는 것으로 예측되었다.These results indicate that the antitumor effect of CCE-I is similar to that of the previous NK cell activity, and thus the inhibitory effect of CCE-I on tumor metastasis is due to the activation of NK cell .
NK cell은 대식세포에 의해 생산되는 IL-12에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있으므로 CCE-I에 의해 대식세포의 IL-12 생산이 유도되고 이들의 자극에 의해 활성화된 NK cell에 의해 강력한 항전이 효과를 유도한 것으로 사료된다.
Since NK cells are known to be activated by IL-12 produced by macrophages, the production of IL-12 by macrophages is induced by CCE-I and the strong antitumor effect by NK cells activated by these stimuli .
시험예Test Example 6: 6: NKNK cellcell 기능이 제어된 Function controlled mousemouse 에서의 청귤 In oranges 추출박Extract foil 유래 효소처리 다당 획분의 항전이 활성 Enzyme-Treated Polysaccharide Fraction Having Antioxidant Activity
실험전이 모델에서의 BRM (biological response modifier) 물질의 투여에 의한 항종양 활성은 주로 대식세포나 NK cell의 활성화가 주로 작용한다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I의 항전이 활성이 NK cell 자극에 의한 효과인지 여부를 확인하기 위하여 rabbit anti-asialo GM1 항체를 이용하여 mouse의 NK cell 기능을 블록(block)한 후 Colon 26-M3.1 lung carcinoma cell을 이용한 항전이 활성측정 실험을 수행하여 그 결과를 투여 시료의 농도별로 도 8 내지 도 10에 나타내었다.It is well known that antitumor activity by the administration of biological response modifier (BRM) in the experimental metastasis model is mainly activated by macrophage or NK cell activation. Therefore, in order to determine whether the antitumor activity of the enzyme-treated purified fraction CUE-I derived from the citrus peel extract-derived fraction was effected by NK cell stimulation, the NK cell function of the mouse was blocked using rabbit anti-asialo GM1 antibody Colon 26-M3.1 lung carcinoma cells. The results are shown in FIG. 8 to FIG. 10 according to the concentrations of the administered samples.
마우스에 125 ㎍, 250 ㎍과 500 ㎍의 CCE-I 시료를 각각 투여한 결과, 500 ㎍도 항전이 효과를 나타내었지만, 특히 125 ㎍와 250 ㎍ 농도에서 우수한 항전이 효과를 보여주었음. 반면, NK cell 기능을 block한 mouse에 CCE-I을 125, 250 및 500 ㎍ 투여한 경우 모두 anti-asialo GM1만을 처리한 군보다 적은 수의 colony가 관찰되었으며, colony의 수는 농도마다 차이가 나타났다. As a result of administration of 125 ㎍, 250 ㎍ and 500 ㎍ of CCE-I to mice, 500 ㎍ of antiretroviral effect was observed, but especially, the antagonistic effect was observed at 125 ㎍ and 250 ㎍ concentrations. On the other hand, when CCE-I was administered at 125, 250, and 500 μg to the mice blocked with NK cell function, fewer colonies were observed than those treated with anti-asialo GM1 alone, .
위의 결과를 종합해보면, 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I의 항전이 효과는 주로 NK cell의 활성에 기인하지만 일부 NK cell 이외의 다른 면역세포(예를 들어, CTL, 대식세포)가 항전이 효과에 작용할 것으로 사료된다.
These results suggest that the antitumor effect of enzyme-treated purified fraction CCE-I derived from citrus peel-derived starch is mainly due to the activity of NK cells, but other immune cells (for example, CTL, macrophages) It is believed that the antitumor will work on the effect.
시험예Test Example 7: 청귤 7: Orange 추출박Extract foil 유래 origin 조다당Group CCECCE -0의 경구투여에 의한 자연살해세포의 종양살해능(-0 on the tumor killing ability of natural killer cells by oral administration ( NKNK cellcell activityactivity ))
앞서 정맥투여에 의한 NK cell 활성화 및 항전이 활성실험에서 우수한 결과를 보였던 청귤 추출박 유래 효소처리 정제획분 CCE-I이 청귤 추출박 다당의 활성본체로 작용한다는 사실을 앞선 동물실험을 통해 확인하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.Previous animal studies have confirmed the fact that CCE-I, an enzyme-treated purified fraction derived from a citrus fruit extract, has been shown to exert an excellent effect on NK cell activation and antitumor activity by intravenous administration, The results are shown in Fig.
경구투여를 통한 NK cell 활성 및 항전이 효과를 보고자 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0를 이용하여 실험을 진행하였다. 건강기능성 식품 소재로 사용하고자 할 때는 비용 및 시간절감을 위해 정제시료보다는 조다당 시료 형태로 소재를 만들어 사용하게 되므로 이에 맞게 조다당 시료를 선택하여 산업적으로 응용가능하도록 실험을 진행하였다.To investigate NK cell activity and antitumor effect by oral administration, the experiment was conducted using enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 derived from citrus peel extract. In order to reduce the cost and time, it is necessary to use the raw material as the raw material for the functional functional food.
청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0 시료를 농도별(100, 500 및 1,000 ㎍/mouse)로 14일간 1일 1회 마우스에 경구투여하고 NK cell 자극활성을 측정한 결과 (Fig. 17(A)), 종양세포에 대하여 E/T ratio가 높아질수록 우수한 살해능이 나타남을 확인할 수 있었으며 특히 100과 500 ㎍/mouse에서 우수한 살해능을 보여주었다.
The results of the oral administration of the enzyme-treated crude polysaccharide-derived CCE-0 sample (100, 500, and 1,000 ㎍ / mouse) to the mouse once a day for 14 days and the NK cell stimulating activity were measured A) and tumor cells, the higher the E / T ratio, the better the killing ability. In particular, 100 and 500 ㎍ / mouse showed excellent killability.
시험예Test Example 8: 청귤 8: Blueberry 추출박Extract foil 유래 효소처리 Derived enzyme treatment 조다당Group CCECCE -0의 경구투여에 의한 항전이 활성-0 < / RTI >
청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0는 정맥투여를 통해 우수한 항전이 활성을 나타내었다고 확인한 바, 이를 경구투여를 통하여 항전이 활성을 재차 측정한 결과, 종양전이주 접종하기 14일 전부터 1일 1회로 경구투여한 후 Colon26-M3.1 cell을 접종하고 14일 후에 실험동물 모델에서 폐를 적출하여 항전이 활성을 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.The enzyme-treated crude polysaccharide-derived CCE-0 from citrus fruit extracts was found to exhibit excellent antitumor activity through intravenous administration. The antitumor activity of the antitumor activity was measured again by oral administration, After one round of oral administration, Colon26-M3.1 cells were inoculated and 14 days later, the lungs were removed from the experimental animal model, and the antitumor activity was measured. The results are shown in FIG.
시료를 투여하지 않은 control군의 종양 수를 100% 전이된 것으로 하여 CCE-0의 항전이 활성을 확인한 결과, 1,000 ㎍의 투여군에서 약 12.0%, 500 ㎍의 투여군에서 약 18.8% 그리고 100 ㎍의 투여군에서 약 22.0%의 항전이 활성을 확인되어 수치상으로는 농도의존적인 경향을 보여주었으나, 500 ㎍과 1,000 ㎍ 농도에서는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.The number of tumor cells in the control group, which was not administered with the sample, was 100% transferred. As a result, CCE-0 showed the antitumor activity of about 12.0% in the group administered with 1,000 μg, about 18.8% in the group administered with 500 μg, And 22.0% of the antioxidant activity was observed in the culture media.
위의 결과를 바탕으로 청귤 추출박 유래 효소처리 조다당 CCE-0는 정맥투여뿐만 아니라 경구투여에서도 우수한 항전이 활성이 나타나는 것을 재차 확인할 수 있었다.Based on the above results, it was confirmed that the enzyme-treated crude polysaccharide CCE-0 derived from the citrus peel-derived starch showed excellent antioxidant activity not only by intravenous administration but also by oral administration.
또한, 위 결과를 토대로 동물과 사람 간 상대적 약효평가 공식(daily dosage of oral administration)을 이용하여 일일섭취량을 추정하게 된다면, 성인 남성(60 kg) 기준 하루에 243.3 mg을 약 2주간 섭취하게 된다면, 약 22.0%의 종양 전이 억제효과를 나타낼 수 있다고 추정할 수 있다.
Based on the above results, if the daily dosage of oral administration of animals and humans is used to estimate the daily intake, if an adult male (60 kg) receives 243.3 mg per day for about 2 weeks, It can be estimated that it can exhibit a tumor metastasis suppressing effect of about 22.0%.
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, many modifications and changes may be made by those skilled in the art without departing from the spirit and scope of the invention as defined in the appended claims. The present invention can be variously modified and changed by those skilled in the art, and it is also within the scope of the present invention.
Claims (14)
(b) 상기 열수추출물을 원심분리하여 잔사를 제거하고, 알코올 수용액을 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수하는 단계; 및
(c) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 40 내지 60시간 동안 투석에 의해 저분자 불순물을 제거하여 청귤 추출박 또는 청피의 열수추출 다당을 수득하는 단계;를 포함하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.(a) preparing a hot-water extract by hot water extraction of a dried powder of a citrus peel or a chewing gum;
(b) centrifuging the hot-water extract to remove residues, and adding an aqueous alcohol solution to precipitate the polysaccharide, thereby recovering the precipitate; And
(c) dissolving the precipitate in distilled water to remove low molecular impurities by dialysis for 40 to 60 hours to obtain a hydrothermally extracted polysaccharide of citrus peel or chewing gum.
단계 (a)는 상기 열수추출 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the step (a) is mixed with water having a weight of 10 to 30 times the weight of the dry powder before the hot water extraction to prepare a suspension.
단계 (b)의 상기 알코올 수용액은 증류수:알코올의 부피비(v/v)가 1:10 내지 1:30인 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the alcohol aqueous solution of step (b) has a volume ratio (v / v) of distilled water: alcohol of 1:10 to 1:30.
단계 (c)의 상기 열수추출 다당은 동결건조, 분무건조 및 감압증류 중에서 선택된 어느 하나의 과정을 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the hydrolyzed polysaccharide of step (c) is further subjected to any one of the steps selected from lyophilization, spray drying and vacuum distillation.
(2) 상기 효소 처리물을 원심분리하여 잔사를 제거하고, 알코올 수용액을 가하여 다당을 침전시킴으로써 침전물을 회수하는 단계; 및
(3) 상기 침전물을 증류수에 용해시킨 후 40 내지 60시간 동안 투석에 의해 저분자 불순물을 제거하여 청귤 추출박 또는 청피의 효소처리 조다당을 수득하는 단계;를 포함하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.(1) preparing an enzyme-treated product by enzymatically treating a dried powder of a citrus peel extract or a chewing gum;
(2) removing the residue by centrifuging the enzyme-treated product, and precipitating polysaccharide by adding an aqueous alcohol solution to recover the precipitate; And
(3) dissolving the precipitate in distilled water and removing low molecular impurities by dialysis for 40 to 60 hours to obtain an enzyme-treated polysaccharide of a citrus extract or chewing gum; and .
단계 (1)은 효소 처리 전 상기 건조분말의 10 내지 30배 중량의 물과 혼합하여 현탁액을 제조하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
Wherein the step (1) comprises mixing the dried powder with water in an amount of 10 to 30 times the weight of the dried powder before the enzyme treatment to prepare a suspension.
단계 (1)의 상기 효소처리는 펙티나제(pectinase), 셀룰라제(cellulase), 자일라나제(xylanase) 및 마나나제(mananase) 중에서 선택된 1종 이상의 효소에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
Wherein the enzyme treatment of step (1) is carried out by at least one enzyme selected from the group consisting of pectinase, cellulase, xylanase and mananase. A method for producing immunostimulatory polysaccharides.
단계 (1)의 상기 효소처리는 펙티넥스(Pectinex), 에코니타제(Econitase), 라피다제(Rapidase), 비스코자임(Viscozyme), 셀루클라스트 (Celluclast), 로하멘트(Rohament), 울트라플로(Ultraflo) 및 사이토라제(Cytolase) 중에서 선택된 1종 이상의 상용효소에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
The enzymatic treatment of step (1) can be carried out in the following order: Pectinex, Econitase, Rapidase, Viscozyme, Celluclast, Rohament, Wherein the enzyme is carried out by one or more enzymes selected from the group consisting of enzymes, enzymes, enzymes, ultrafloes and cytolases.
단계 (1)의 상기 효소처리는 상기 청귤 추출박 또는 청피의 건조분말 100중량부에 대하여 0.3 내지 1.5중량부의 효소를 첨가하여 4 내지 8시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
Wherein the enzymatic treatment of step (1) is carried out for 4 to 8 hours by adding 0.3 to 1.5 parts by weight of enzyme to 100 parts by weight of the dried powder of the citrus peel or chewing gum. Way.
단계 (3) 이후,
(4) 상기 조다당의 건조분말에 에탄올 수용액을 가하여 침전물을 회수하여 청귤 추출박 또는 청피의 정제 다당을 회수하는 단계;를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
After step (3)
(4) A method for producing antitumor or immunostimulatory polysaccharide, which comprises the step of recovering the purified polysaccharide of a citrus fruit extract or a chewy gum by adding an aqueous ethanol solution to the dried powder of the above-mentioned saccharide, and recovering the precipitate.
단계 (4)는 2회 내지 5회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.12. The method of claim 11,
Wherein step (4) is repeated two to five times.
단계 (3) 이후,
(4´) 상기 조다당을 젤투과크로마토그래피(gel permeation chromatography)에 의해 분자량에 따라 분리하여 정제 다당을 수득하는 단계;를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.The method according to claim 6,
After step (3)
(4 ') separating the crude polysaccharide according to molecular weight by gel permeation chromatography to obtain a purified polysaccharide, wherein the purified polysaccharide is further subjected to gel permeation chromatography.
단계 (4´)에서 수득된 상기 정제 다당은 농축, 투석 및 건조 공정을 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암 또는 면역활성 다당의 제조방법.
14. The method of claim 13,
Wherein the purified polysaccharide obtained in step (4 ') is sequentially subjected to concentration, dialysis and drying steps.
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