KR101945757B1

KR101945757B1 - 유전영동기술을 이용한 금속이온 검출방법

Info

Publication number: KR101945757B1
Application number: KR1020170028884A
Authority: KR
Inventors: 이상우; 박진성; 이규도; 최승엽; 손명구; 박인수; 김웅
Original assignee: 연세대학교 원주산학협력단; 고려대학교 세종산학협력단
Priority date: 2017-03-07
Filing date: 2017-03-07
Publication date: 2019-04-17
Also published as: KR20180102363A

Abstract

본 발명은 새로운 분광학 기술을 이용한 금속이온의 탐지와 넓은 범위의 금속이온 농도를 간단하고 정확하게 대량 측정 가능한 방법에 관한 것으로써, 보다 구체적으로 폴리뉴클레오타이드가 코팅된 기판 및 마이크로스피어를 이용해, 금속이온 농도가 증가함에 따라, 금속이온-매개 폴리뉴클레오타이드 간 상호결합력이 증가함을 이용하여, DEP힘을 가해 파열 힘(unbinding force)을 측정하고 통계적 분석방법으로 정량화함으로써 높은 민감도를 가지고 넓은 농도 범위에서 간단한 방법으로 금속이온의 존재 및 주어진 시간에 대량 측정이 가능한 방법에 관한 것이다.

Description

유전영동기술을 이용한 금속이온 검출방법{Metal ion detection method using dielectrophoretic technique}

본 발명은 유전영동기술을 이용한 금속이온 탐지 방법 및 금속이온 농도측정 방법에 관한 것이다.

산업의 급속한 발전으로 인해 발생한 중금속들은 대기, 수질 및 토양 등의 환경오염을 유발하는 인자로써 그 자체 독성뿐만 아니라 생체 내에서 분해되지 않고 축적되어 인간들에게 다양한 질병을 유발시킬 위험성이 매우 크다. 인간의 몸에 중금속이 축적되면 중추신경마비, 언어장애 등의 피해를 입을 수 있으며 골다공증 위장, 신장장애를 일으킬 수 있고 유산, 저체중 출산, 유아의 성장 장애 등을 유발할 수 있다. 따라서 중금속 오염 정도를 쉽고 정확하게 측정할 수 있는 금속이온 탐지 및 농도측정방법의 개발이 필수적이다.

통상적으로 미량의 중금속을 정량하는 방법으로 활용하고 있는 방법으로는 기체크로마토그래피(GC), 유도결합 플라즈마 분광법(ICP), 원자 흡수 분과광도법(AAS) 그리고 원자방출분광법(AES) 등의 장비를 이용하는 방법 또는 전기화학적 방법으로 크게 나눌 수 있다.

그러나 상기 원자 흡수 분광광도법은 측정시간이 많이 소요될 뿐만 아나라, 상비 장비와 같은 측정 기기들이 매우 고가에 유지비가 높으며, 기기조절 방법이 복집하고, 분석 단가가 높다는 문제점이 있다. 특히, 분광법을 이용한 측정기는 광원을 비롯하여 기기의 주요 부품들이 매우 고가이며 부품 교체 및 A/S에 있어 부가적 유지관리비가 요구될 뿐만 아니라, 기기의 구성과 원리상 현장적용이 어려워 측정값의 재현성과 정확도에 있어 많은 문제점을 갖고있다. 한편, 상기 전기화학적 측정방법은 분광법에 비해 신속, 경제적인 분석방법으로 널리 사용되고 있다. 그러나 전기화학적 측정방법 중 하나인 적하수은 전극 방식의 경우, 수은 원액을 전도매체로 사용하였을 때 수은 전극의 끊김 현상이 발생하여 안정적이고 연속적인 측정이 불가능하고, HDME(Hanging Mercury Drop Electrode), MTFE(Metal Thin Film Electrode)의 경우 수은 원액이 전도매체로 사용되기에 2차 환경오염 발생 우려가 있을 뿐 아니라, 분석 재현성 및 신뢰성이 다소 낮다는 문제점이 있다. 대표적인 중금속 분석법으로 가장 많이 사용되는 SWV(square wave stripping voltammetry)의 경우 분광학적인 방법이나 다른 전기화학적인 방법보다 높은 감도로 낮은 농도의 중금속이온을 검출할 수 있는 장점이 있으나 저농도의 중금속을 검출하기 위해서는 센서 표면에 농축시키기 위한 전처리 과정을 거칠 필요가 있으므로 수분 내지 수십 분의 측정시간이 요구된다. 또한, 장기간 사용 시 중금속 농축에 의한 센서 표면의 오염되어 측정감도 저하가 발생하는 문제점이 있다.

따라서 상기 문제점들을 극복하고 장기 사용하여도 중금속을 안정한 고감도로 검출할 수 있으며, 수초 내의 짧은 시간내 금속이온을 탐지하고 농도측정이 가능한 새로운 금속이온 검출 및 농도 측정방법의 개발이 필요하다.

은은 지난 6천년간 항균시약으로 사용되어왔다. 고대 이집트인, 그리스인 과 로마인들은 용액을 신선하게 유지하기 위해 은 용기를 사용하였으며, 상처 치료를 위해 은 패드를 사용하였다. 최근 나노기술의 발전은 은 살균성 제품에 관한 많은 연구 보고서들을 생성하면서 향상된 항균활성을 가진 은나노물질들을 생산하기에 이르렀다.

그러나 상기 향상된 은제품들로부터 방출된 은이온이 다양한 생태계로 노출될 경우, 이로 인한 환경 및 건강의 안전성 위험 문제가 발생할 수 있다는 염려가 제기되어 왔다. 다수의 연구에서는 Ag⁺가 야생동물은 물론 인간에게까지 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 점을 밝힌 바 있다. 또한, 방출된 Ag⁺는 Ag⁺-폴리뉴클레오타이드 복합체를 형성해 DNA 손상의 원인이 될 수도 있다. 따라서 환경에 존재하는 Ag⁺를 탐지하고 Ag⁺-폴리뉴클레오타이드 복합체 형성여부를 측정할 수 있는 방법을 개발하는 것은 중요하다.

기존 연구들을 통해, 금속이온과 유기 분자 간의 결합 특이성에 기초하여 원자 흡수 분광법(atomoc absorption spectrometry)과 형광 탐침(fluorescent probes)을 사용한 Ag⁺ 측정이 가능해졌다. 그러나 상기 접근법들은 Ag⁺를 측정하기 위한 전처리과정을 포함한 준비과정이 복잡하며, 낮은 농도의 Ag⁺를 측정하기 충분할 만큼 정밀하지는 않다. 상기 접근법을 대체할 수 있는 방법으로서 시토신(C)을-포함하는 폴리뉴클레오타이드를 활용한 측정 방법이 있으며, 상기 측정방법은 형광기반 검정법(fluorescence-based assays)(10 nM to 1 μM), 전기화학적 센서(electrochemical sensors)(10 nM to 10 μM), 공진 캔틸레버(resonant cantilevers)(1 nM to 10 μM), 및 켈빈 프로브 힘 현미경(Kelvin probe force microscopy)(100 pM to 100 nM)을 이용하여 시토신이 풍부한 DNA(시토신-rich DNA)에 대한 높은 선택성과 특이성을 가지고 Ag⁺를 측정할 수 있다.

그러나 상기 측정 기술들이 Ag⁺ 탐지에 있어 종래의 방법들보다는 높은 선택성을 제공하더라도, 수소(H⁺)-폴리뉴클레오타이드-복합체와 Ag⁺-폴리뉴클레오타이드 복합체 형성에 중요하게 관련되어 있는 배위(coordinate)(Ag⁺-폴리뉴클레오타이드) 결합체에 의해 중재되는 결합 상호작용을 조사함에 있어서는 여전히 제한적인 면이 존재한다. 따라서 간단하면서도 일정시간에 많은 양을 처리할 수 있는 기술을 사용해 다양한 농도 범위의 Ag⁺를 측정할 수 있을 뿐만 아니라 Ag⁺, H⁺ 및 폴리뉴클레오타이드에 의해 생성되는 결합 분자 상호간 상호작용을 측정할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있다.

결합 상호작용의 파열힘(rupture force)은 하나의 탐침(probe)으로 이러한 요구를 만족시킬 수 있는 사용가능한 후보이다. 그럼에도 불구하고, 정량분석적 접근법은 현재까지 보고된 바가 없다. 최근에 개발된 내부 미세흐름 장치를 사용하는 힘 분광법 기반 유전영동-집게(Dielectrophoretic-tweezers based force spectroscopy; DEPFS)의 경우 일정 조건에서 화학적 또는 생물학적 기능화된 수백개의 마이크로스피어(microspheres)를 탐침(probe)으로 동시 사용함으로써, 다양한 pH 조건하에서 수많은 약한 결합 상호작용들과 특이적인 리간드-리셉터 결합, 비특이적 상호작용, 그리고 DNA-DNA 상호작용같은 수많은 내부분자 상호관계의 측정이 가능하다. 따라서, 다른 힘 분광학적 접근(force spectroscopic approaches)들과는 반대로 DEPFS는 비결합분자간 상호작용의 통계적으로 신뢰성 있는 데이터를 얻는데 사용할 수 있으며, 이러한 데이터는 상호관계의 특징들을 간단하고 높은 정확성으로, 대량 분석이 가능한 방법으로써 통계적 조사에 활용할 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 DEPFS 접근법을 사용하여, 넓은 범위 농도에 걸쳐 높은 민감성을 가지고 금속(예컨대 Ag⁺)을 탐지하고 금속 폴리-C DNA 복합체(예컨데 Ag⁺/H⁺ 폴리-C DNA 복합체)간의 분자간 힘 탐지를 기반으로 금속, 수소이온 및 폴리-C DNA(예컨데, Ag⁺, H⁺와 폴리-C DNA) 사이의 상호작용을 정량적으로 측정하는 새로운 방법을 개발하였다. 또한, 이 방법으로 증류수와 식수 샘플 내 100 pM부터 100 μM의 넓은 검출 범위에 있는 DNA 복합체 상의 파열힘(F_U)을 측정하였으며, 힘 분광법(force spectroscopy)으로 Ag⁺/H⁺폴리-C DNA 복합체 내에서 Ag⁺-폴리-C DNAs 와 H⁺-폴리-C DNAs의 수소 상호작용, 배위상호작용 협동성(cooperativity)을 측정하고 통계적 평가에 사용하여 DNA 폴리뉴클레오타이드 내의 Ag⁺ 상호작용 메커니즘을 조사하였다.

따라서, 본 발명자들은 DEPFS를 사용해, 용액 내 존재하는 금속이온의 검출 및 금속이온의농도를 정량적으로 측정하고 DNA 폴리뉴클레오타이드 내의 금속이온 상호작용 메커니즘을 측정할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제1,599,606호 한국등록특허 제1,380,716호

Measurement of the Interaction Between Hemicytosinium Duplexed Using Dielectrophoretic Tweezers(2015 The 6th Asian Particle Technology Symposium 15-18th Sept. / Seungyeop Choi, Min Hyung Kim, 외 7명) Direct measurement of the interaction force between hemicytosinium duplexes using dielectrophoreticforce spectroscopy(2015 대한의용생체공학회 추계학술대회(12-14th_Nov.) Detection of Silver Ions Using Dielectrophoretic Tweezers-Based Force Spectroscopy(2016 Analytical Chemistry(20th_July) / Seungyeop Choi, Sang Woo Lee 외 10명)

본 발명은 용액 내 금속이온의 존재와 농도를 간단하고 정밀하게 측정하고 대량 분석이 가능한 새로운 DEP 힘 기반 힘 분광법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 전극이 형성된 기판의 일면 이상을 폴리뉴클레오타이드로 기능화시키는 단계;

(b) 단계(a)의 기판과 폴리뉴클레오타이드로 기능화된 비즈를 챔버(chamber)에 넣는 단계;

(c) 챔버에 금속을 포함 또는 미포함하는 피검용액을 넣고 기판에 전압을 인가하는 단계;

(d) 비즈의 움직임을 측정하여 영상신호 정보를 수득하는 단계;

(e) 단계(d)에서 수득한 영상신호 정보로부터 그레이스케일 값을 구하는 단계;

(f) 단계 (e)에서 얻은 그레이스케일 값을 이용하여 파열 순간을 검출하는 단계; 및

(g) 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 단계를 포함하는, 금속이온 검출 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(f) 단계 (e)에서 얻은 그레이스케일 값을 이용하여 파열 순간을 검출하는 단계;

(g) 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 단계; 및

(h) 단계 (g)에서 구한 파열힘 값과 포아송 통계분석방법(Poisson statistics)을 이용한 분자간 결합력 측정 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

폴리뉴클레오타이드로 기능화된 기판 및 폴리뉴클레오타이드로 기능화된 비즈(beads)가 들어 있는 챔버;

상기 챔버 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;

상기 챔버 위 또는 일측에 위치되어, 상기 챔버 내를 촬상하는 카메라;

상기 카메라로부터 수신된 영상신호로부터 그레이스케일 값을 측정하고, 그레이스케일 값을 이용해 파열 순간을 검출하는 측정부; 및

상기 측정부에서 측정한 파열 지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 분석부를 포함하는, 금속이온 측정장치를 제공한다.

본 발명은 DEP 기반 힘 분광법을 이용해 정밀하며 간단한 금속이온 탐지, 금속이온 농도측정 및 금속이온과 폴리뉴클레오타이드 간의 상호작용을 측정하고 통계적 분석을 통해 정량화하는 방법을 제공한다.

도 1은 Ag⁺가 들어있는 용액 내에서 폴리-C DNA가 고정된 마이크로스피어와 DEP 칩간의 Ag⁺-폴리 C-DNA 상호결합 형태를 나타냈으며, DEP 힘을 증가시킬 경우 마이크로스피어가 부양하게 되고 이에 따라 Ag⁺를 매개해 결합되어 있던 폴리-C DNA간 결합이 파괴되며, 그 순간의 파열힘(Unbinding force)을 측정하여 Ag⁺의 농도가 증가함에 따라 파열힘이 증가하는 결과를 요약해 나타낸 것이다.
도 2는 측정 시스템의 개략도를 나타낸다. Ag⁺에 의해 매개되는, parallel 폴리-C DNA 사이의 상호관계를 측정하는 DEPFS를 도식으로 나타낸 개략도(스케일을 나타내지 않은)이다. 수소 결합 및 배위결합의 조합과 함께, H⁺/Ag⁺-폴리-C 복합체 안의 내재 힘(inherent forces)은 DEP 힘에 의한 마이크로스피어의 상향 이동으로 측정된다.
도 3은 실험 구성을 도식적으로 나타낸 것으로 측정 방법은 세 단계로 구성된다. (A) 첫 번째 단계는 전극의 중심에 고정된 폴리-C DNA를 가진 마이크로스피어를 붙잡기 위해 네거티브 DEP 힘(48Vp-p, 1 MHz)을 인가하는 것이다. (B) 다음 단계는 마이크로스피어 탐침과 실리콘 다이옥사이드(SiO₂) 표면 사이의 C-Ag⁺-C 결합을 유도하는 것이다. (C) 그 다음으로 파열힘을 수직 DEP 힘(122Vp-p, 1 MHz)을 사용해 측정한다. (D-F) 100 pM(100 μm scale bar) Ag⁺ 농도가 들어있는 서로 맞물린 전극(interdigitated electrodes)이 존재하는 DEP chip 안에서 (A-C) 단계로부터 획득된 시각적 이미지를 나타낸다. 삽도는 각각의 인가전압에 따른 단일 마이크로스피어 이동을 나타낸다(10 μm scale bar).
도 4는 폴리-C DNA의 표면 고정화와 특징을 나타낸다. (A) SiO₂ 표면상에 폴리-C DNA 공유결합과 EDC/NHS를 가진 마이크로스피어를 도식적으로 설명하였다.
도 5는 6-FAM(여기(excitation)/ 방출(emission) 파장은 495 nm / 520 nm)으로 표지된 DEP 칩 표면(A)과 폴리-C DNA가 고정된 마이크로스피어(B)의 형광이미지를 나타낸다.((A) scale bar 100 ㎛, (B) scale bar 200 ㎛)
도 6의 (A)는 고정화된 폴리-C DNA를 가지는 마이크로스피어의 SEM 이미지를 나타내며, (B)는 폴리-C DNA가 있는 D 박스 지역의 이미지를 분명하게 보기 위해 나타낸 것이다. 삽도는 카르복실화된 폴리스티렌 마이크로스피어의 AFM 이미지를 나타낸다((A) scale bar 10 ㎛ (B) scale bar 100 nm).
도 7은 AFM 이미지로부터 얻은 형태학적 높이 분배를 나타낸다. 삽도는 카르복실화된 DEP 칩 표면(왼쪽)의 AFM 이미지와 폴리-C DNA 고정화된 DEP 칩 표면(오른쪽)을 나타낸다. 각각의 사이즈는 5 × 5 ㎛²이다.
도 8은 6-염기에서 36-염기 범위의 서로 다른 길이(L)를 가지는 폴리-C DNA와 Ag⁺, H⁺사이의 분자간 힘을 정량화한 결과를 나타낸다. (A,B) 파열힘(Unbinding for (F_U))히스토그램 및 각각의 L 값들에서 Ag⁺가 존재/ 비존재시 가우스 핏(Gaussian fits)을 나타낸다. (C) A와 B로부터 얻어지는 평균 파열 힘(<F_U>)과 표준편차를 나타냈으며, 삽도는 DNA 분자의 짝풀림 상태(unzipping of DNA molecules)를 나타내었다. (D) 이동 힘(Shift force, S_F)은 Ag⁺가 존재 또는 부존재하는 상태에서 얻어지는 <F_U> 값의 차이를 나타내며, 이는 폴리-C₆ DNA의 S_F값들을 정규화(normalization)하여 얻는다.
도 9는 DEPFS를 사용한 Ag⁺의 탐지 능력의 정량적 특징을 나타낸다. (A) 세미로그 스케일(semilogarithm scale) 상에서 DEPFS를 사용한 Ag⁺ assay로부터 얻은 평균 파열 힘(<F_U>) 및 표준편차를 나타낸다. student's t test (two-tailed) 는 통계적 분석을 위해 사용하였다(*P < 0.0001). 점선은 하기 로그 함수에 들어맞는다. <F_U>= 3.65×10^-9×log[Ag⁺] + 48.91 ×10^-9. (B) 이온 선택성 테스트 및 (C) Ag⁺센서로 DEPFS의 실제적 적용결과를 나타낸다(**P < 0.0001).
도 10은 Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 상호작용의 통계적 분석결과를 나타낸다. (A) 세미로그 스케일 상에서 [Ag⁺]대비 Ag⁺-폴리-C 복합체 상호작용의 단일 파열 힘(Single rupture force) 및 Ag⁺-폴리-C 복합체 내 Ag⁺와 H⁺의 상호관계를 도식적으로 나타낸다. (B) [Ag⁺](오각형, 검은색) 대비 정규화된 F_Usingle(즉, F_Usingle*)의 세미로그 도표(Semilogarithmic plot)가 Hill 공식(점선, 초록색)에 부합함을 나타낸다. F_Usingle* 은 하기 공식으로부터 얻어진다. F_Usinle* =F_Usingle - MIN[F_Usingle])/(MAX[F_Usingle] - MIN[F_Usingle]). 삽도는 파트 B의 연산도표를 나타낸다.
도 11은 그레이스케일 분석법을 사용하여 C-Ag⁺-C/C-H⁺-C 복합체 사이의 파열힘(unbinding force)을 결정하는 방법을 나타낸다. 보다 구체적으로 그레이스케일 변분법(grayscale variation method)을 사용하여 파열 전압(unbinding voltage)을 결정하는 것이다. Ⅰ) 표준 정규 분포(normal Gaussian distribution)에서 평균값(μ)으로부터 2배 이상 표준편차(2σ)로 결정되는 노이즈 레벨. Ⅱ) 노이즈 레벨을 넘어서 지속적인 그레이스케일 값으로 나타나는 파열 전압(unbinding voltage)을 나타낸다. 내부 마이크로스피어 지역의 밝기(그레이스케일 값)를 나타내는 삽도는 인가되는 전압의 함수에 따라 증가한다. 막대는 그레이스케일 레벨을 나타낸다(0 에서 255까지).
도 12는 파열 전압(unbinding voltage)을 반영한 파열 힘(F_U)을 결정하는 방법을 나타낸다. I) DEP 힘의 계산법을 설명하기 위한 도이다. DEP 힘의 이론적 모델은 세개의 파라피터(ε_p*; 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity), ε_m*; 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity), r; 마이크로스피어 지름(microsphere radius), 파열 전압(unbinding voltage), 유한 요소 시뮬레이션(finite element simulation)(COMSOL Multiphysics 3.5a)으로 풀리는 전기장 프로파일(electric field profile, E)에 도입된다. Ⅱ) DEP 힘과 인가된 전압 함수로부터 파열 사건(unbinding event)의 히스토그램(histogram) 그래프를 나타낸다.
도 13은 DEP 칩의 유한-요소 시뮬레이션(finite-element simulation)을 나타낸다. (A)는 유전영동 트위저(Dielectrophoretic tweezers)에 대한 다중선형전극(interdigiated electrode)의 개략도를 나타낸다. (B)는 DEP 칩 구조의 측면도를 나타낸다. (C)는 제한 요소 시뮬레이션 상에서 구현된 다중선형전극 에서의 전기장의 표면 기울기(그레이스케일 레벨)와 유전영동 힘의 방향(보라색 화살표)을 나타낸다.
도 14는 DEP 칩 표면과 폴리스티렌 마이크로스피어에 폴리-C DNA를 고정화하는 방법을 나타낸다. (Ⅰ내지 Ⅲ)는 두 표면(DEP 칩, 폴리스티렌 마이크로스피어) 모두에 폴리-C DNA를 고정화시키는 과정을 나타낸다. EDC/NHS는 아마이드를 형성하기 위해 카르복실산을 활성화시키고 폴리-C DNA는 각각의 표면에 안정한 아마이드 결합을 포함한다.
도 15는 폴리스티렌 마이크로스피어 표면 상에 폴리-C DNA가 고정화 됨을 증명하는 도이다. SEM 이미지와 표면 거칠기는 카르복실화 마이크로스피어(bare)와 고정화된 폴리-C DNA를 가진 마이크로스피어(DNA)를 나타낸다. 스케일 바는 100 nm이다. 바닥 이미지는 1,280 x 960 pixels을 아우르는 지역을 거쳐 그레이스케일 값(0 부터 255)으로 구성된 ImageJ 소프트웨어를 사용해 얻은 3D 이미지를 나타낸다.
도 16은 DEP 칩 표면상의 고정화된 폴리-C DNA의 거칠기를 나타낸다. AFM은 카르복실 기능기와 폴리-C DNA의 고정화된 SiO₂ 표면의 루트-평균-제곱 높이(root-mean-squared height)(Rq)를 이미지화한것이다. 이미지의 크기는 5 × 5 μm² 이다. 폴리-C DNA가 고정화된 SiO₂ 표면의 거칠기는 반응하지 않은 카르복실 기능기와 활성화된 시약(EDC, NHS)과 같은 잔여 분자들에 의해 증가한다.
도 17은 DEPFS 안에서 칩 세척 과정 이후의 파열전압(unbinding voltage)(Vp-p) 반복테스트 결과를 나타낸다.
도 18은 폴리-C DNA 안의 짝풀림 상태와 늘림상태의 일련순서 개략도를 나타낸다. (A) 폴리-C DNA의 3' 말단이 있는 곳에서 폴리-C DNA의 짝풀림 모델(unzipping model)이 각각의 표면(마이크로스피어 및 DEP 칩)에 고정화된다. (B) 각각의 3' 말단 및 5' 말단이 있는 곳에서 폴리-C DNA의 전단모델(shear model)이 서로 다른 표면상(마이크로스피어 및 DEP 칩)에 고정화된다.
도 19는 서로 다른 Ag⁺ 농도(100 pM에서 1 pM까지)에서 C-H⁺-C 결합의 강도와 배지 전도성(medium conductivity) 사이의 관계를 나타낸다. Ag⁺의 농도를 반영하는 DEP 힘의 변화를 검사하기 위해, 증류수 내에서 카르복실화된 마이크로스피어와 카르복실화된 SiO₂ 표면 사이의 평균 파열 힘을 관찰하였다. <F_U>값은 Ag⁺가 100 μM보다 낮을 경우 배지 전도성에 의해 영향받지 않았다. 그러나, Ag⁺가 1 mM일 때의 <F_U>는 극적으로 증가하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 100 pM 부터 100 μM 까지의 Ag⁺의 이온의 측정 범위를 선택할 수 있다.
도 20은 파열 힘(Unbinding force)(Fu) 히스토그램과 서로 다른 Ag⁺농도의 가우스 핏(Gaussian fits)를 나타낸다. 히스토그램이 F_U와 표준편차가 증가함에 따라 오른쪽으로 이동함을 알 수 있다.
도 21은 본 발명의 DEPFS 시스템의 측정한계점(또는 측정의 한계; LOD)의 평가치를 나타낸다. (A) Ag⁺가 없을 때의 파열힘(F_U) 히스토그램 및 가우스 핏(Gaussian fit)을 나타낸다. (B) 세미-로그 스케일(semi-logarithm scale)로 DEPFS의 Ag⁺ 검사법으로부터 구한 평균 파열 힘(<F_U>) 및 표준편차를 나타낸다. Ag⁺ 가 존재하지 않는 상태에서 <F_U>의 빈칸(blank)의 표준편차(standard deviation,σ) 의 3배로 정의되는 LOD(μ _blank +3σ _blank )에 따르면, 본 발명의 시스템하에서 Ag⁺ 측정을 위한 LOD는 ~300 pM까지로 정의된다.
도 22는 100 nM 금속이온 용액상에서 미디움 전도성(Medium conductivity)을 나타낸다. 각종 금속이온 용매 내 미디움 전도도를 증류수에서 얻은 값(3.1μS/cm)과 비교하였으며, <F_U>값은 100 μM까지는 미디움 전도성에 영향을 받지 않았다. 따라서, <F_U>는 100 nM 금속이온 용액에서는 미디움 전도성에 의한 영향을 받지 않음을 알 수 있다.
도 23은 원편광 이색성 분광법(circular dichroism; CD)를 사용해 증류수에서 free 폴리-C DNA간의 C-H⁺-C 상호작용 확인결과를 나타낸다. 각각의 파란색 선은 266 nm 및 288 nm를 나타낸다. 266 nm와 288 nm에서 각각의 피크는 수소화된 염기(C⁺)의 신호와 DNA 인터베이스 안에서 C-H⁺-C의 형성 신호를 나타낸다. 이것은 이전의 연구결과와 동일하게 증류수에서 수소화된 시토신과 시토신사이에 결합을 형성하고 있음을 의미한다. 그러나 이러한 접근법에서 매체 내 수소화된 시토신의 특이적 양을 정량화하는 것은 어렵다.
도 24는 DEP 칩 상에서 서로 다른 폴리-C DNA 농도 상태에서 C-H⁺-C 결합 강도를 나타낸다. (A) DEP 칩 표면에 고정화된 폴리-C DNA 농도 함수로부터 얻은 파열 평균 힘(<F_U>)을 나타낸다. <F_U>는 DNA 몰 농도와 선형관계를 나타낸다. (B) 폴리-C DNA 코팅된 마이크로스피어와 폴리-C DNA 코팅된 칩 표면 사이의 수소 상호작용을 확인하기 위해 단일 파열 힘(F_Usingle)을 계산하는데 Poisson statistics 이론 모델에 따른 편차(Variation) vs. <F_U> 그래프를 사용하였다. F_Usingle을 계산하기 위해서, DNA 분자 밀도를 서로 다른 <F_U> 측정으로 규제하였다. 붉은 선은 선형 핏(linear fit)(128.1×10-12×[<F_U>])을 나타내고 선형 핏의 기울기는 폴리-C/폴리-C 사이의 F_Usingle을 의미한다.
도 25는 도 9A를 프로브와 칩표면 간에 상호작용하는 모든 폴리-C DNA 사이에서의 상호작용 특성(벌키(bulky)한 분자들 사이의 협동성 특성)을 폴리-C DNA 단일 분자 사이의 상호작용 특성과 비교하기 위하여, 정규화 과정을 수행한 <F_U>의 그래프를 나타낸 것이다. 이 때, Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 결합된 협동성 특성을 알아보기 위하여 적용한 Hill 공식에 부합하는지를 확인하였다. 그 결과, R-square이 0.95로 높은 신뢰성을 나타내었다.
도 26은 벌키(bulky)한 분자와 단일 분자 사이의 협동성 특성(cooperativity property)의 차이점을 나타낸다. 단일 파열 힘(single unbinding force)(F_Usingle _*; 검은색 오각형 및 초록색 점선)과 평균 파열 힘(<F_U ^*>; 붉은색 육각형 및 붉은색 점선) vs Hill 공식에 부합하는 [Ag⁺]를 나타낸다.
도 27은 칩 표면에 분주된 폴리-시토신 DNA 농도에 따른 수소결합력 측정 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 단계(a)의 기판은 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나 미세유체 칩(microfluidic chip)을 사용하는 것이 적절하며, 미세유체 칩은 절연기판을 추가로 포함할 수 있으며 상기 절연기판은 그 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나, 이산화규소(SiO₂, 실리카)가 증착된 실리콘일 수 있다. 한편, 상기 기판의 일면 이상을 폴리뉴클레오타이드로 기능화할 수 있으며, 보다 적절하게는 단일면을 폴리뉴클레오타이드로 기능화하는 것이 적절하다. 한편, 상기 단계(b)의 챔버는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)으로 제조할 수 있다.

한편, 상기 금속이온 검출방법에서 금속은 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 은(Ag), 수은(Hg), 리튬(Li), 나트륨(Na), 철(Fe) 및 아연(Zn)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 보다 적절하게는 은이온 및 수은 이온을 검출하는데 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명을 피검용액 속 은이온 검출을 위해 사용할 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리-시토신 DNA을 사용하는 것이 적절하다. 상기 폴리-시토신 DNA는 시토신 염기 15 내지 32개로 구성됨이 바람직하며, 적절하게는 20 내지 28개, 보다 바람직하게는 22 내지 26개. 가장 바람직하게는 24개인 것이 바람직하다.

본 발명을 피검용액 속 수은이온 검출을 위해 사용할 경우, 상기 폴리뉴클레오타이드는 폴리-시토신티민 DNA를 사용하는 것이 적절하다. 상기 폴리-시토신티민 DNA는 5'-(CT)_n-3'이고, 여기에서 n은 3 내지 9의 정수인 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 5'-CTCTCTCTCTCT-3'인 것이 바람직하다.

한편, 상기 단계 (f)의 파열 순간을 검출하는 단계는 전압을 인가함으로써 발생하는 비즈의 부양 변위(levitation displacement)와 그레이스케일 값 강도의 변화를 매칭하고, 기준치를 넘어서 변동(fluctuation)이 발생하는 순간을 파열 순간으로 정의함을 특징으로 한다(도 11 참고). 그리고 상기 기준치는 하기 [식 1]의 가우스 분포를 따르는 그레이스케일 값의 변동(fluctuation)을 측정하되, 변동 레벨(fluctuation level)은 μ± 2σ로 나타내어지고,

[식 1]

상기 식에서,

χ는 그레이스케일 값이고,

μ는 그레이스케일 값의 평균이며,

σ는 그레이스케일 값의 표준 편차인 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 단계(g)의 변환과정은 하기 [식 2]를 이용하여 수행되고,

[식 2]

변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U : unbinding force)을 구하며, 상기 식에서, ε_m은 매질의 유전율(permittivity)이며, Re는

분수 계산값의 실수부만 취한 값을 의미하며, ε_p ^*은 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity)이며, ε_m ^*은 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity)이고, r은 마이크로스피어 지름(microsphere radius)이며, E _rms 는 유한요소 시뮬레이션(finite element simulation, COMSOL Multiphysics 3.5a)으로부터 얻은 전기장 프로파일(electric field profile)인 것을 특징으로 하며, 상기 (g)단계의 평균 파열힘(<Fu>)값과 금속이온 농도가 비례하는 것을 이용하여, 금속이온의 존재 및 농도를 측정한다.

또한, 본 발명은

(g) 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(Fu; unbinding force)을 구하는 단계; 및

아울러, 본 발명은

상기 측정부에서 측정한 파열 지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(Fu; unbinding force)을 구하는 분석부를 포함하는, 금속이온 측정장치를 제공한다.

이하 실시예 및 실험예에서 미세유체칩, 뉴클레오타이드의 제작 및 뉴클레오타이드를 칩과 마이크로스피어에 기능화하는 방법, 금속이온과 폴리뉴클레오타이 드 복합체 사이의 화학적 상호작용을 측정하는 DEPFS의 원리 및 상호작용 측정, 포아송 통계분석을 이용한 결합-파열 힘 측정, 통계적 방법으로 단일 결합력 분석, Hill 공식을 이용한 금속과 폴리뉴클레오타이드 사이의 결합 협동성을 측정하는 방법을 설명하였다.

결과적으로, 본 발명은 피검물질 내 금속이온을 측정하는 새로운 접근방법을 제시하였으며, 본 발명의 유전영동기술을 이용한 금속이온 탐지 방법 및 금속이온 농도측정 방법은 폴리뉴클레오티드와 특정 금속이온의 결합력 및 DEP 힘을 이용하여 파열힘(<Fu>)을 측정하고 본 발명자들이 개발한 통계적분석방법을 사용하여, 피검용액 내 금속이온의 존재 및 농도를 간단하고 정확하며, 높은 민감성을 가지고 정밀하게 측정할 수 있다.

이하 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 이는 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 미세유체칩 ( microfludic chip) 제작

포토리소그래피(photolithography)기술을 사용해 산화된 실리콘 기판(i-Nexus, Seongnam, Republic of Korea)상에 다중 선형 전극 패턴(interdigitated electrode array pattern)(40 μm 폭 및 10 μm 간격)을 제작하였다. 구체적으로 1000Å 두께의 두꺼운 크롬 맞물림 전극 배열 패턴을 열 증착 기술과 표준 리프트-오프(lift-off) 공정을 이용하여 기판(wafer)상에 증착한 후 금속 전극을 7000Å 두께의 두꺼운 PECVD(plasma-enhanced chemical vapor deposited) 실리콘 다이옥사이드로 씌웠다. 구조의 평면도는 도3의 D 내지 F에 도식화하였으며, 칩의 개략적인 단면도는 도 13에 나타내었다.

< 실시예 2> 올리고 뉴클레오타이드의 제조

폴리-C DNA는 상업적으로 입수하였다(Cosmogentech, Seoul, Rupublic of Korea). 상기 폴리-C DNA는 다음과 같은 서열을 가지고 있다: 24-염기 폴리-C DNA(5′-CCC CCCCCC CCC CCC CCC CCC CCC-3′-(CH₂)₆-NH₂ 및 6-FAM-5′-CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC CCC-3′-(CH₂)₆-NH₂); 12-염기 폴리-C DNA (5′-CCC CCC CCCCCC-3′-(CH₂)₆-NH₂); 6-염기 폴리-C DNA (5′-CCC CCC-3′-(CH₂)₆-NH₂). 고압 액체 크로마토그래피 순도에서 모든 올리고 뉴클레오타이드를 합성하였으며 DEP 칩 표면 및 마이크로스피어를 기능화(Functionalized)하는데 사용하였다.

< 실시예 3> 폴리 -C DNA를 이용한 미세유체 장치( Microfluidic Device)의 기능화(Functionalization)

상기 <실시예 1>에서 제조한 미세유체 장치의 표면을 다음과 같이 기능화하였다: 3-트리에톡시실릴프로필 석신산 무수물(3-triethoxysilylpropyl succinic anhydride; TESPSA)을 처리해 카르복실-말단 산화 표면층을 가진 장치 표면에 폴리-C DNA를 고정화하였다. 실리콘 다이옥사이드 칩(Silicon dioxide chip)을 우선 H₂SO₄-H₂O₂(1 : 2) 비율로 구성된 용액으로 이동시켜 하이드록실 기능화된 기판(hydroxyl functionalized substrate)(SiO₂-OH)을 제조하였다. 그 후 하이드록실 기능화된 기판을 100 mM TEPSA(Gelest, Morrisville, PA)가 들어있는 유기용매(톨루엔, 99.8%)에 하룻밤동안 침지시켰다(SiO₂-COOH). 카르복실화한 기판을 세 종류의 서로 다른 용매(톨루엔, N,N-다이메틸포름아마이드 (DMF, Sigma-Aldrich, St, Louis, MO; 99.9% HPLC grade 및 증류수)로 세척하고 질소로 건조시킨 후 카르복실화된 기판을 65 mM N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(EDC; Sigma-Aldrich,99%) 및 108 mM N-하이드록시숙신이미드(NHS; Sigma-Aldrich, 98%)를 포함한 0.01 M PBS(phosphate buffered saline) (Gibco, Gaithersburg, MD) 용액에 pH 7.2 조건에서 1시간 동안 침지시켰다. 그 후 칩 표면에 아마이드 결합(amide bond)을 형성하기 위해서 상기 용액에 200, 400 및 800 nM 폴리-C DNA 용액을 각각 첨가한 후 하룻밤 동안 두었다(SiO₂-폴리-C DNA). 폴리-C DNA를 고정화한 후, DEP 칩 기판을 과량의 PBS 버퍼 용액과 증류수로 헹구고 질소 가스로 건조시켰다. 상기 모든 샘플의 준비는 22 ℃에서 수행하였다.

< 실시예 4> 고정화된(Immobilized) 폴리 -C DNA를 갖는 마이크로스피어 제작

폴리-C DNA로 고정화된 마이크로스피어를 제조하기 위해, 카르복실화된 폴리스티렌 마이크로스피어 3 mg/mL(Kisker, Steinfurt, Germany; 15 μm)을 6.25 mg 99% EDC와 6.25 mg 98% NHS가 포함되어 있는 PBS(Gibco; 0.01 M, pH 7.2) 용액에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음으로 상기 반응시킨 혼합물은 하룻밤동안 1 μM 폴리-C DNA와 함께 반응시켜 폴리-C DNA가 고정화된 마이크로스피어를 제조한 후 볼텍스시키고 원심분리기로 PBS 안에서 5회 세척하였다. 상기 마이크로스피어를 증류수(Gibco, Gaithersburg,MD) 또는 식수(Jeju Samdasoo, JPDC, and Republic of Korea)로 희석하고 사용 전에 원심분리하였다. 상기 모든 샘플의 준비는 22℃에서 수행하였다.

< 실시예 5> 형광 현미경(Fluorescence Microscopy), 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscopy; SEM ) 및 원자력 현미경(Atomic Force Microscopy; AFM)으로 기능화된 칩과 마이크로스피어 특정화 방법

폴리-C DNA 고정화된 마이크로스피어와 DEP 칩을 분석 이전에 PBS와 증류수로 세척하였다. 마이크로스피어의 표면과 PECVD(plasma enhanced chemical vapor deposition) 산화물을 WB 필터를 사용해 형광 현미경(BX60, Olympus, Tokyo, Japan)으로 검사하였다. FE SEM(Field emmission SEM)(JSM-7001F, JEOL, Tokyo, Japan)을 폴리-C DNA와 카르복실 기능기가 고정되어 있는 폴리스티렌 마이크로스피어 표면의 형태와 구성 관찰을 위해 사용하였다.

폴리-C DNA 고정화된 마이크로스피어와 카르복실화 폴리스티렌 마이크로스피어는 비전도성 물질이기 때문에, 전자 손상으로부터 보호하기 위해, 샘플을 백금 이온 증착으로 전처리하였다. SEM 이미지 상면도 간의 차이점은 Image J를 이용해 분석하였다(도 15). AFM 측정은 공기중에서 멀티모드 V (Veeco, Santa Barbara, CA)를 사용해 수행하였으며 그로부터 얻은 이미지들은(5 × 5 μm²) 나노스코프 소프트웨어(Nanoscope software)(Bruker)를 사용해 추가 분석하였다. 또한, 폴리-C DNA를 가지거나 가지지 않는 DEP 칩 기판의 AFM 높이 이미지는 제곱 평균 제곱근 값(root mean square)으로 정의한 표면 거칠기와 대조해 정량화하였다.

상기 R_q는 Root mean square 이며, 구체적으로 AFM을 이용하여 표면의 높이(height)를 개별적으로 측정하고 측정된 높이의 평균값을 구한 후 평균값과와 측정값과의 편차를 측정하고 편차를 제곱한 값들을 모두 더하여 총 측정갯수로 나눈 값의 평균값을 의미한다.

n은 측정한 sample(=height)의 총 갯수이고,

y_i는 i^th sample 측정치 - sample 측정치 평균값이다.

< 실시예 6> C- Ag ⁺ -C/C-H ⁺ -C 복합체의 파열 힘(unbinding force) 측정방법

폴리-C DNA가 고정되어 기능화된 DEP 칩 표면 중간 지점에 3 mm 지름의 구멍을 가지고 있는 6 × 6 × 1.2 mm³ 크기의 폴리디메틸실록산(PDMS)챔버에 접촉시켜 넣었다. 구체적으로, 금속이온과 고정화된 폴리-C DNA를 갖는 마이크로스피어 혼합물(폴리-C DNA : 금속이온 = 9 : 1 ; 10 μL)을 상기 PDMS 챔버에 넣었다. 모든 금속이온 용액은 금속 질산염(AgNO₃, LiNO₃, NaNO₃, Hg(NO₃)₂, Zn(NO₃)₂, 및 Fe(NO₃)₃; Sigma-Aldrich) 형태로 사용하였다. 전압은 33250 함수 발생기(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)와 연결된 WMA300 증폭기(Falco Systems, Amsterdam, The Netherlands)를 사용해 미세유동 칩의 전극에 인가하였고, 인가전압을 검사하기 위해 오실로스코프(WaveRunner 6050, LeCroy, New York, NY)로 재확인하였다. 그 후, 비드(bead)의 움직임을 평면도 전하 결합 소자 카메라(top-view charge coupled camera)(Motionscope M3, Redlake, San Diego, CA)를 이용해 기록하였다. 분자간 상호작용 파열 힘(F_U)을 그레이스케일 변화 방법 및 유한 요소 시뮬레이션(Finite elements simulation; FES)으로부터 얻은 DEP 힘 지도(DEP force map)를 조합해 사용함으로써 정량화하였다. 요약하자면, 칩 기판 표면으로부터의 마이크로스피어(탐침)의 파열 지점을 결정하기 위해서, 본 발명자들은 인가된 전압의 함수값으로써 평면도 시각 이미지의 각각의 마이크로스피어의 내부 영역의 그레이스케일 값을 사용하였다.

더욱 상세한 DEPFS에서 파열힘(unbinding force) 측정 과정은 다음과 같다. DEPFS 시스템을 이용하여 은 이온들과 올리고뉴클레오타이드 사이의 파열 힘을 측정하기 위해서, DEP에 의한 부양 힘(leviation force)의 대상인 마이크로스피어의 파열 이동(rupture displacement)을 결정하는 것이 중요하다.

그레이스케일 변이 방법은(grayscale variation method)은 부양 변위(leviation displacement)와 그레이스케일 값 강도의 변화를 매칭함으로써 마이크로스피어의 부양 순간을 예측가능하게 한다. 칩 전극내 인가된 전압이 증가할 때, 즉 마이크로스피어에 영향을 미치는 DEP 힘들이 증가할 때 비즈(beads)의 부양변이(leviation displacement)가 일어난다. 상면 이미지의 저속 촬영 분석결과, 각 마이크로스피어에서 내부 영역의 그레이스케일 값 강도가 DEP 힘에 의해 부양함에 따라 증가됨을 나타낸다. 이러한 방법들을 통해, 칩 기판 상에 고정화된 다른 생체분자들과 화학 물리학적으로 상호작용하는 생체분자들로 고정화된 마이크로스피어의 파열 변이를 구할 수 있다. 이전 연구에서 내부 마이크로스피어 지역의 그레이스케일 값의 변동(fluctuation)을 60초간 측정하였으며, 변동은 하기 식과 같이, 가우스 분포를 따른다.

x는 그레이스케일 값을 나타내며, μ는 그레이스케일 값의 평균을 σ는 그레이스케일 값의 표준 편차를 의미한다. 도11의 I은 μ = 109.15, σ = 0.45 에서 가우스 분포 경향이 있는 마이크로스피어의 전형적 예시를 나타낸다. 이러한 마이크로스피어의 변동은 열역학 이론에 따르면 입자들의 열적 변동에 의해 영향을 받으며, 칩 표면의 몇몇 분자들과의 분자간 상호관계에 의해 발생한다(즉, 비공유 결합). 결론적으로, 본 발명자들은 마이크로스피어의 그레이스케일 레벨이 변동 지역(fluctuated region)을 초과하지 않는 곳에서 μ± 2σ(μ,σ는 Gaussican 분포 파라미터)로 나타내는 변동 레벨(fluctuation level)을 경계선으로 정의하였다. 만약 마이크로스피어의 변동 정도가 외부 힘에 의해 변한다면, 그 힘을 특정 실험 조건에서의 파열 힘(rupture force)으로 정의할 수 있다(도 11의 Ⅱ).

칩 표면에서 마이크로스피어가 위쪽으로 이동할 때, 상면도(도 11 A-Ⅱ 삽도)에서 마이크로스피어의 그레이스케일 값이 증가하는 것과 일치되게 각각의 마이크로스피어는 초점 밖(즉, 칩 표면 접지)을 나가면서 흐릿해지기 시작하였다. 따라서 본 발명자들은 변동 레벨을 넘어서면서 인가된 전압이 증가됨에 따라 그레이스케일 값을 비교함으로써 파열 지점(이동점)을 찾을 수 있다. 이러한 파열은 칩 내에서 모든 비즈들에서 동시에 일어나고, 본 발명자들은 세 개의 독립적 측정법으로 CCD 카메라 시스템 안에서 ~400 비즈까지 추적할 수 있었다.

본 발명자들은 각각의 마이크로스피어에서 파열을 일으키는 각각의 인가된 전압을 측정하고 DEP 파열 힘(unbinding force)으로 전환시켰다(도 12). 변환 과정에서, 본 발명자들은 COMSOL Multiphysics로 FEA(finite element analysis)를 수행하면서 얻은 몇몇 파라미터(e.g., ε_p ^*, ε_m ^*, r 및 E ) 값들의 측정값으로 부호화된 custombuilt Matlab을 사용하였다. 상기 모든 과정들 각각은 본 발명자들이 개발한 것이며, 보다 자세한 과정은 하기에서 설명한다. 확실한 은 이온 농도를 얻기 위해, 정규화 분포를 보여주는 ~400 서로 다른 F_U값을 구하였다(도 12, Ⅱ). 가우스 곡선(Gaussian curve)에 맞춰봄으로써, 평균 파열 힘(unbinding force, <F_U>)을 구할 수 있었다.

DEP힘은 다음과 같이 제시된다.

여기서 n은 힘의 순서(force order), K_n은 n^th-order Clausis-Mossotti factor이며, φ는 외부 전기장의 정전기 포텐셜(electrostatic potential), ε_p : particle 유전율, ε_m: medium 유전율, r : particle의 반지름을 나타낸다. 1V_peak _-to-peak, 1 MHz인 AC signal이 전극에 인가되었을 때, 10 ㎛ 분리되어있는 40 ㎛ 넓이의 IDT 전극 구조 상에서 전기장 프로파일(profile)을 발생시키는 유한 요소 프로그램(finite element program)인 COMSOL Multiphysics과 상기 공식을 이용해 전체 DEP 힘을 측정용으로 Matlab(R12, Mathworks)을 개발하였으며, Matlab을 사용한 인가된 전압의 함수를 이용해 전기영동 힘(dielectrophoretic force)을 계산하였다(도 13). FEM(finite element method) 분석의 품질은 상대적으로 메쉬의 질(quality of mesh)과 같은 유한 요소 컨버젼스(finite element convergence)의 해상도에 영향을 받을 수 있기 때문에, 본 발명자들은 미리 메쉬의 질(mesh quality)과 샘플링 비(sampling ratio)의 함수로써 FEM 분석의 품질을 특정화하였다. 상기 기술에 기초하여, 수직 네거티브 DEP 힘 프로파일(vertical negative DEP force profile)을 서로 다른 전압에서 평가하였다.

< 실시예 7> DEP 칩의 교정(Calibration of DNA chip)

동일한 MEMS 제작 과정으로 DEP 칩을 생산하더라도, 칩들은 종종 성능상 차이를 나타낸다. 따라서 본 발명자들은 DEP 칩을 사용하기 전에 DEP칩의 품질체크를 하였다. 칩 성능 품질체크 결과를 도 17에 나타내었다. 여기서는 카르복실화된 마이크로스피어의 파열 전압 측정결과 비슷한 성능을 나타내는 잘 세척된 칩을 선택해 사용하였으며, 1.002 Vp-p, 평균 파열 전압(unbinding voltage)은 반데르발스 상호작용 범위내인 46.51 pN, DEP 힘과 일치하였다(cf., 마이크로스피어의 중력(∼0.1 pN)).

< 실험예 1> Ag ⁺ /H ⁺ 폴리 -C DNA 복합체의 상호작용을 측정하는 DEPFS의 원리

본 발명자의 목표는 기능화된 폴리-C DNA를 포함하는 마이크로스피어(프로브)에 네거티브 DEP(nDEP)힘을 이용해 Ag⁺의 농도함수로 C-Ag⁺-C/C-H⁺-C 힘을 직접적이고 대규모로 측정하는 것이다(도 2 및 도 3). Ag⁺/H⁺폴리-C DNA 복합체의 분자 간 상호작용을 측정하기 위해, 본 발명자들은 수백개의 폴리스티렌 마이크로스피어와 DEP 칩 기판(SiO₂)을 폴리-C DNA로 기능화 시켰다(도 2 및 도 14). 마이크로스피어는 Ag⁺가 존재 또는 존재하지 않는 상태에서 폴리-C DNA 기능화된 칩 표면과 상호작용한다. 그 결과 두 표면(즉 마이크로스피어 및 칩 기판) 간에 분자 간 상호작용이 발생한다. 또한, 본 발명자는 3' 아민(amine) 그룹을 사용해 두 개의 서로 다른 표면에(즉, 마이크로스피어 및 DEP 칩) 폴리-C DNA를 고정화하기 때문에 도 18에 나타낸 바와 같이 짝풀림 형태(unzipping mode)가 전단형태(shear mode)보다 일반적인 것으로 확인하였다.

DEP 힘이 증가할수록, 상기 상호작용은 칩 기판으로부터 고정화된 폴리-C DNA를 가지는 마이크로스피어의 상향 이동에 의해 깨지게 된다. 이것은 Ag⁺와 H⁺에 의해 매개되는 폴리-C DNA사이의 분자간 힘(파열)을 직접적으로 측정하는 것을 가능하게 한다. 특히, 마이크로스피어는 무작위로 미세 유동 챔버(microfluidic chamber)내의 IDT(interdigitated) 전극 위의 실리콘 다이옥사이드(silicon dioxide) 필름 상에 분산된다. 교류전압(48 V_p _-p, 1 MHz)이 IDP(Interdigitated) 전극에 인가되면, 마이크로스피어는 nDEP 힘에 의해 전극의 가운데를 따라 가지런해지고(도 3B), 그런 다음 Ag⁺와 함께 상호작용하고, C-Ag⁺-C 및 C-H⁺-C 복합체를 형성한다(도 3C). 또한, 더 높은 전압(∼122 V_p _-p, 1 MHz)이 인가된 IDP 전극은 마이크로스피어가 전극 가운데에서 수직으로 부양될 때 복합체를 깨뜨릴 수 있다. 마이크로스피어의 움직임과 이동은 광학 현미경 이미지를 사용해 평가하였으며, 마이크로스피어의 밝기는 그레이스케일(grayscale) 방법을 사용하여 복합체의 파열 힘(rupture force)을 결정하기 위해 정량분석되는 초점이탈 깊이(defocusing depth)에 기인한 트랩(trap) 높이의 변화로 측정하였다(도 3D-F).

< 실험예 2> 고정화된 폴리 -C DNA를 가지는 DEP 칩 기판과 마이크로스피어 특징확인

<실시예 3> 및 <실시예 4>에 개시한 바와 같이 폴리-C DNA 고정화된 마이크로스피어와 DNA코팅된 칩을 얻기 위해서, 아미노-표지화된(amino-labeled) 폴리-C DNA를 카르복실 그룹으로 기능화된 폴리스티렌 마이크로스피어와 역시 카르복실 그룹으로 기능화된 DEP 칩의 실리콘 다이옥사이드 기질표면을 펩타이드 결합을 통해 고정화하였다(도 4 및 도 14). 마이크로스피어와 DEP 칩 기판의 제작은 형광 현미경(fluorescent microscopy)으로 확인하였다(도 5A,B). 한편, 형광-표식된 올리고뉴클레오타이드를 사용해 기능화 프로토콜이 잘 진행되었는지 여부를 확인하였다. 또한 탐침 비드뿐만 아니라 DEP 칩 표면 상에 올리고뉴클레오타이드의 기능화를 확인하기 위해 형광(6-FAM)으로 표시된 폴리-C DNA를 사용하였다(도 14).

다만, 실제로 DEPFS를 사용해 은 이온 탐지 수행시 형광-표식된 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고 그 대신에 순수한 올리고뉴클레이타이드 서열을 사용하였다. 이는 힘 측정에서 염색 분자(즉, 6-FAM)에 의해 유도되는 실험적 오류를 피하기 위해서이다. 추가적인 실험(SEM, AFM)으로 형광 염료가 없는 고정된 폴리-C DNA의 분포를 관찰하였다. 또한 SEM과 AFM을 사용하여 고정화된 폴리-C DNA를 가지는 마이크로스피어와 DNA 코팅된 칩들을 각각 검사하였다(도 6 및 도 7). 마이크로스피어 표면의 AFM 분석은 마이크로스피어의 곡률과 흔들림(wobbling)(즉, 요동(rocking) 운동)에 의해 변화하기 때문에, SEM을 이용하여 폴리-C DNA가 고정되어있는 마이크로스피어의 형태뿐만 아니라, 폴리-C DNA가 수 많은 작은 알갱이로 관찰되는 폴리-C DNA 표면을 관찰하였다. 상기 결과는 폴리-C DNA가 존재할 때 입상도(granularity)의 경향이 증가함이 보고된 이전 결과와 일관되었다. 이와 대조적으로 대조샘플(카르복실화된 폴리스티렌 마이크로스피어)는 상대적으로 평평한 표면을 나타냄을 확인하였다(도 6B, 도 15).

또한, 생체분자들(폴리-C DNA)이 기능화된 칩 표면의 정밀 지형적 변화를 탐지하기 위해 AFM을 사용하였다. 이러한 지형학적 윤곽의 변화를 정량화하기 위해, 표면 거칠기 히스토그램(histogram)을 이용하여 폴리-C DNA 고정화단계를 거치기 전과 거친 후를 비교하여 확인하였다. 올리고뉴클레오타이드(크기)가 카르복실 기능기보다 크기 때문에, DNA가 고정화된 표면의 높이 분포는 더 높아진다. 이러한 히스토그램 상에서 높이 차이는 동등한 AFM 이미지 조건에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로의 큰 이동을 나타냄을 보여준다(도 7). 일반적으로, DNA가 없을 경우보다 DNA-고정화 된 경우 표면 거칠기가 높아지며, 지형 높이(topographic height)의 히스토그램(histogram)이 더 넓은 폭을 나타낸다(도 16). 이러한 다양한 현미경 관찰 분석을 통하여, 본 발명자들은 제작 방법을 확인하였다. 그러나 상기 분석은 시스템상 고정화된 폴리-C DNA를 가지는 마이크로스피어의 안정성을 보장하지는 못한다. 또한, DNAs 사이의 인장력 또는 분자간 상호작용은 DNA 길이에 의존 할 뿐만 아니라 온도 또는 pH, 수소 및 Ag⁺, H⁺와 폴리-C DNA 사이의 상호작용에 의해 발생되는 배위 상호작용(coorinate interactions)과 같은 미세환경에 의존함은 익히 알려져 있다. 따라서 본 발명자들은 하기 <실험예 3>과 같이 최적화된 방법을 확립하였다.

< 실험예 3> Ag ⁺ /H ⁺ 폴리 -C DNA 복합체간 상호작용을 위한 마이크로스피어 최적화

약한 산성 조건(pH 5)에서 시토신과 헤미프로톤화된 시토신(C-H⁺-C) 사이에서 수소결합이 일어남은 익히 알려져있다. 또한, Ag⁺가 수용액 안에 존재할 때, C-H⁺-C 수소 결합은 각각의 시토신 내 헤테로 질소원자들 사이의 가교를 거쳐 Ag⁺의 배위결합으로 대체될 수 있다(즉, C-Ag⁺-C가 됨). 이러한 이유로 Ag⁺/H⁺ 폴리-C DNA 복합체들 간 상호작용을 보다 정확히 측정하기 위해 폴리-C DNA가 고정화된 최적의 마이크로스피어를 만들어야하며, 따라서 폴리-C DNA의 길이를(L) 최적화하는 것이 필요하다.

구체적으로 고정화된 폴리-C DNA를 가진 마이크로스피어의 최적화를 위해, 본 발명자들은 DEPFS를 사용해 증류수(pH 5.4) 안에 Ag⁺가 존재 또는 부존재하는 조건에서 폴리-C DNA의 다른 길이(L)로 기능화된 칩 표면과 마이크로스피어 사이의 F_U를 측정하였다. 그 결과, L이 증가함에 따라 더 큰 F_U를 얻을 수 있었다. 이는 L이 증가할수록 Ag⁺가 없는 상태에서 마이크로스피어와 칩의 각 표면의 폴리-C DNA 사이에서 C-H⁺-C를 형성할 수 있는 시토신염기의 수가 증가하고, 이에따라 C-H⁺-C 이중체의 결합수가 증가하기 때문이다(도 8A, B). Ag⁺ 가 존재하는 상태에서 F_U 값은 Ag⁺가 존재하지 않을 때보다 커지는데, 이는 배위 상호작용이 수소 상호작용보다 결합강도가 높기 때문이다. 이는 폴리-C₆ DNA가 결과적으로 매우 작은 F_U 값을 야기함을 나타낸다. 이것은 아마 상온에서 짧은 이중-가닥 DNA의 경우, DNA 혼성화의 열역학적 안전성 때문으로 이러한 불안전성은 Ag⁺의 도입으로 인한 배위결합형성으로 안정화될 수 있다(도 8B).

측정된 Fu값은 가우스 핏에 근거한 평균 파열힘(unbinding force)(<F_U>)은 F_U으로 요약될 수 있으며, 도 8C에 도시하였다. Ag⁺가 존재할 때와 부존재할 때의 <F_U> 사이의 차이(S_F)가 C₂₄에서 가장 강하게 나타났다(도 8D). 따라서 24-염기 폴리-C DNA가 10 μM Ag⁺를 탐지할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 폴리-C₂₄ DNA로 하기 실험을 수행하였다.

< 실험예 4> Ag ⁺ /H ⁺ 폴리 -C DNA 복합체 간 상호작용 측정

DEPFS를 사용해 수소(C-H⁺-C) 및 배위(C-Ag⁺-C)상호작용에 의해 매개되는 Ag⁺/H⁺ 폴리-C DNA 복합체간 상호작용을 측정하기 위해, 본 발명자들은 고정화된 폴리-C DNA를 가지는 마이크로스피어와 칩 표면 사이의 미세유동칩 내로 Ag⁺를 도입하였다. 상기 상호작용 측정 전에, 다양한 Ag⁺ 농도(100 pM - 1 mM)를 포함하는 매체의 전도도를 측정하였고, 이는 미디엄(medium)의 전도도가 유전영동힘을 결정하는데 있어 중요한 파라미터이기 때문이다. 한편, 최고값(1 mM)을 제외하고는, 테스트된 Ag⁺ 농도가 매체 전도도에 중요하게 영향받지 않음을 전도도값, 유전영동힘값(F_MU)을 통하여 확인하였다(도 19). 구체적으로, 카르복실화된 마이크로스피어와 음 전하를 띄는 표면을 사용해 서로 다른 Ag⁺농도에서 <F_U>를 측정함으로써 매체 전도도에 있어 Ag⁺농도의 효과 유효성을 검증하였다. 결론적으로, 폴리-C DNA가 표면에 고정된 마이크로스피어와 칩을 사용하여, Ag⁺ 100 pM 부터 100 μM의 범위에서 DNA 복합체의 Ag⁺/H⁺ 폴리-C의 상호작용을 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타냈다. 아울러 상호작용의 <F_U>는 12.51 ± 1.33 nN부터 35.75 ± 3.20 nN까지 Ag⁺ 농도가 증가함을 확인하였다(도 20).

< 실험예 5> DEPFS를 사용시 Ag ⁺ 의 탐지 능력 확인

DEPFS를 이용한 Ag⁺의 검출력 분석하기 위해서, F_U 데이터를 이용하여 표준 편차와 평균 파열 힘(<F_U>)을 표시하였다(도 9A). 도 9A에 나타난 바와 같이, 세미로그 스케일(semi-logarithm scale) 상에서 Ag⁺농도가 증가할수록 <F_U>가 그에 비례해 증가함을 확인하였다. 다수의 DEP 칩들 상에서 폴리-C DNA가 고정화된 마이크로스피어 400개 이상을 상기 분석을 위해 사용하였으며, 이 분석법은 높은 신뢰도(P <0.0001)와 매우 짧은 검출 시간(< 3분)을 가짐을 증명하였다. 농도 검출의 한계는 ∼300 pM까지이며(도 21), 이는 기존 화학 변성 전극상의 스트리핑 전압전류법(tripping voltammetry at a chemically modified electrode)(∼2 pM) 및 유도결합 플라즈마 질량 분석기(inductively coupled plasma-mass spectrometry)(∼6 pM)와 같은 전통적인 방식과 비교해 우수한 값을 나타냄을 확인하였다.

또한 Zn² ⁺, Li⁺, Na⁺, Hg² ⁺ 및 Fe³ ⁺를 포함하는 다양한 금속이온들(100 nM)을 사용해 이온 선택성을 평가하였다(도 9B). 본 발명의 DEPES의 측정 능력을 정량화하기 위해서, 폴리-C DNA와 Ag⁺또는 다른 양이온들(X) 중 어느 하나 사이의 두 개의 평형상수비로 정의되는 선택계수(Selectivity coefficient)(ξ)를 계산하였다. (즉, ξ = K_DNA,X/K_DNA,Ag⁺)

상기 선택계수(ξ)를 계산하기 위해, 본 발명자들은 본 발명의 DEPFS 시스템 내 평형상수(K)를 다음과 같이 정의하였다.

평형상수(K_DNA, _X )가 폴리 C-DNA와 복합체 형태(금속이온을 갖는 폴리-C DNA,X)들 사이의 힘의 비율로 정의되는 곳에서 이들은 각각 F _DNA 및 F _DNA _-X 를 나타낸다. 금속이온의 종류(즉, Ag⁺, Li⁺, Na⁺, Fe³ ⁺, Hg² ⁺, Zn² ⁺등)에 불구하고 금속이온(X)의 동일한 농도의 존재 내 bare beads와 DEP 칩 표면 사이의 결합 힘 평균은 동등한 것으로 간주한다. 따라서 상기 공식은 본 발명의 시스템 내 F _DNA 가 동일한 곳(~11.22 pN)에서는 K _DNA,X ∝ F _DNA _-X /F _DNA 로 간단히 할 수 있다(도 8B). 따라서 K _DNAX 가 F _DNA _-X 에 정비례한다 말할 수 있으며, 두 개의 서로 다른 금속이온 사이의 선택계수는 두 평형 상수(K _DNA,X1 및 K _DNA,X2 )의 비율로 정의한다.

예를 들어, 상기에서 언급한 바와 같은 정의에 기초로, 은 이온과 리튬 이온사이의 선택계수는 대략 0.6으로 측정할 수 있으며(~14pN / 23 pN), 표 1은 데이터 내 선택 계수를 계산한 것을 요약하였다. 따라서, Ag⁺가 본 발명의 DEPFS 시스템상에서 다른 양이온들보다 적어도 25 %이상 선택성이 우수함을 확인하였다.

X1	Ag⁺
X2	Ag⁺	Li⁺	Na⁺	Hg⁺	Zn² ⁺	Fe³ ⁺
ξ	1.000	0.637	0.516	0.557	0.741	0.673

따라서, 본 발명의 DEPFS 시스템 상에서 다른 양이온들과 비교해 적어도 25%정도, Ag⁺가 우수한 선택성을 나타냄을 확인하였다. 이는 다른 금속이온들과 비교해 보았을 때 Ag⁺포획이 좋은 선택성을 가짐을 입증하였다.

< 실험예 6> 식수 내에서 Ag ⁺ 농도 측정 여부확인

본 발명의 방법을 이용하여, 일반적 식수(제주 삼다수, JPDC,한국) 내 Ag⁺농도 측정 가능여부를 확인하였으며, 구체적으로 식수내 AgNO₃(1-100 ㎛)의 다양한 농도를 분석하였다. 도 9C에 나타난 바와 같이, 식수 내 <F_U>값이 증류수에서보다 약 20 nN 정도 낮게 나타났다. 그럼에도 불구하고 식수에서 [Ag⁺]에 따른 <F_U>의 직선적 증가는, DEPFS가 U.S. 환경 보호 협약에 규정된 표준 식수 기준의 민감한 요구사항(46 μM)에 근거한 환경 용수 내 Ag⁺를 측정하기 위한 실용적 적용에 적합함을 뒷받침한다. 아울러 도 9A의 <F_U>의 선형성은 Ag⁺, H⁺와 폴리-C 사이의 상호작용이 Ag⁺/H⁺ 폴리-C DNA 복합체 내 수소(C-H⁺-C) 와 배위(C-Ag⁺-C) 상호작용 간의 간단한 기계적 모델로 설명 가능함을 보여준다.

< 실험예 7> 포아송 통계분석을 이용한 Ag ⁺ /H ⁺ 폴리 -C DNA 복합체 형성에 있어 각각의 결합-파열 힘(bond-rupture force) 측정

본 발명자들은 동일한 <F_U>측정 데이터를 활용하고 포아송 통계분석(Poisson statistics)으로 Ag⁺/H⁺ 폴리-C DNA 복합체에 있어 각각의 결합-파열 힘(bond-rupture force)(즉, 폴리-C DNA의 파열 힘)을 계산하였다.

포아송 통계방법을 사용해 각각의 결합을 계산하는 방법은 다음과 같다.

포아송 통계적 분석을 위해 각각의 결합은 독립(independent), 이산 확률(discrete random)변수이고, 프로브와 표면 사이의 파열 힘은 각각의 개별 결합의 합이라 정의한다(Williams, J. M.; Han, T.; Beebe, T. P. Langmuir 1996, 12, 1291-1295/ Williams, D. H.; Stephens, E.; Zhou, M. Journal of Molecular Biology 2003, 329, 389-399.). 이러한 가정은 이전의 연구들을 고려하였을 때 합리적이다. 이러한 통계적 방법은 통계적으로 신뢰할 수 있는 측정 데이터로부터 유도된 평균힘과 표준편차를 사용해 각각의 결합들을 계산하는데 사용한다. 포아송 통계분석법에 따르면, 분산(distribution)은 n 이산 사건(events)(즉, 발생하는 각각의 결합의 파열을 위한 n 사건)의 무작위 샘플을 관찰한 것의 비율을 말하며, 파열힘(unbinding force)은 하기 평균(mean; m) 및 편차(variance, σ²)의 포아송 분산으로써 달라진다.

m = nF,

σ= nF² ^,

고정된 접촉 지역 내에서 F 및 n은 각각 개별적으로 각각의 결합 힘 및 결합들의 수를 나타낸다. 개별 결합 힘은 다음과 같이 나타낼 수 있다.

F = σ ² / m .

본 발명에서는 높은 통계적 신뢰도(P < 0.0001)를 얻기 위해 동일한 환경하에서 동시에 400개 이상의 마이크로스피어 프로브를 측정한 결과로부터 도출해 낸 평균힘과 표준편차를 사용하여 각각의 Ag⁺-폴리-C DNA 복합체들을 계산하는데 사용하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 추가적으로, Ag⁺가 부존재하는 상태에서 폴리-C DNA 복합체의 측정 데이터 및 각각의 결합-파열을 이용하여 계산한 평균 힘 및 표준편차를 도 24에 나타내었다.

마이크로스피어와 전극 표면 사이의 접촉지역이 접촉지역 중심점에서 대칭적 기하구조를 가지기 때문에, 통계적 관점으로 접촉 지역의 로딩(loading)된 힘은 모든 가능한 내부분자들과 동등화 될 것이라 추측할 수 있다. 비록 접촉지역의 분자긴 로딩된 힘이 다양할지라도, 평균 로딩된 힘은 일정한 로딩 값에서 유지된다.

< 실험예 8> 통계적 방법으로 단일 결합력 분석

또한, 본 발명자들은 각각의 결합 합계 값으로 제시되는 평균 힘을 측정하고 평균힘으로부터 통계적 방법을 사용해 단일 결합력을 분석하였다. 비록 개별의 분자간에 수소와 킬레이트 결합(chelate bond)의 다양한 혼합성분이 있었음에 불구하고, 포아송 방법으로 단일결합을 분석하였다. 분석한 단일결합은 가능한 모든 결합 구성요소로부터 금속이온에 의해 매개되는 폴리-C DNA 복합체의 평균 결합 확률(average bond probability)로 나타내었다. 포아송 통계 모델을 반영하면, 단일 파열 힘은 단일 분자(즉, DNA 한쌍)를 의미한다. 도 10A에 나타낸 바와 같이 각각의 결합-파열 힘, F_Usingle은 Ag⁺ 농도가 증가함에 따라 139 부터 296 pN 까지 증가하였다. 이 S자형 곡선은 DNA-Ag⁺의 상호 작용을 이용한 이전 연구 결과와 일치하는 결과이며(C-Ag⁺-C), 상기 결과는 각각의 내부 분자간 결합이 동일한 한 종류로 구성될 때는 나타나지 않았다.

또한, 약한 산 조건(pH 5)하에서 헤미수소화 시토신(C-H⁺-C) 수소 결합이 존재할 때 Ag⁺가 없는 상태에서 폴리-C-DNA 복합체의 각각의 결합-파열 힘은 비록 폴리-C-DNA 복합체의 농도가 다양하더라도 128 pN에서 일정하게 나타났다(도 24). 따라서, 도 10A에 나타낸 바와 같이 F_Usingle 의 증가는 Ag⁺, 폴리-C-DNA 복합체 상에서 C-H⁺-C 와 C-Ag⁺-C 이중체로 구성된 잡종(heterogeneity) 정도에 영향을 받음을 확인하였으며, 약한 산성 조건에서, 폴리-C DNA는 수소결합을 통해 다른 폴리-C DNA와 함께 평행-가닥 이중체를 구성함을 확인하였다.

한편, 상기 잡종(heterogeneity) 정도에 따른 결합-파열 힘에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인으로 염기간 스태킹(base stacking) 상호작용이 있으나, 최근 AFM 힘 분광학 연구 결과에 따르면 단일 염기 스태킹의 힘은 ∼2 pN로 결합-파열 힘에서는 미미한 영향력을 끼치는 것이 확인되었는바, 위와 같은 연구결과와 본 발명자들은 이번 실험결과를 종합해 볼때, 상기 실험에서 측정한 결합-파열 힘은 염기 스태킹보다 수소결합의 기여도가 더 일반적인 현상임을 확인하였다.

구체적으로, 단일 폴리-C DNA 사이의 상호결합 측면에서, 낮은 Ag⁺농도 범위(0.1, 1 및 10 nM)에서는 폴리-C DNA에서는 C-Ag⁺-C 결합이 거의 생성되지 않아 Ag⁺이온이 폴리-C DNA와 활발히 상호작용하지 않음을 알 수 있었다. 반면, 높은 Ag⁺ 농도 범위에(e.g., 1, 10, 및 100 μM)에서는 Ag⁺/H⁺-폴리-C-DNA 복합체 안에서 C-Ag⁺-C 형성됨을 확인할 수 있었다. 예를 들어 1 nM Ag⁺에서 F_Usingle 값은 약 139 pN이었으며 이는 수소 결합의 각각의 파열힘과 매우 유사하다(∼128 pN). 한편 100 μM Ag⁺에서 F_Usingle은 낮은 Ag⁺ 농도에서 얻어지는 값보다 약 2.1 배 정도 더 크다. 또한, 높은 Ag⁺ 농도 범위에서, F_Usingle 값이 포화되는 것으로 나타났다.

< 실험예 9> Hill 공식(Hill equation)을 이용한 Ag ⁺ 와 폴리 -C DNA 사이의 결합된 협동성(binding cooperativity ) 계산

계산 결과를 좀 더 분석하기 위해서, 두 개의 서로 다른 결합 구성요소들보다 많은 협동성을 조사하는데 사용하는 Hill 공식(Hill equation)을 이용해 Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 결합된 협동성(binding cooperativity)을 확인하였다.

그 결과, 측정 계산후 얻은 상대적인 정규화 값과 Hill 공식이 일치함을 알 수 있었으며(도 10B), Hill 공식을 정규화된 F_Usingle에 적용하였다(즉, F_Usingle ^*)(도 10A). 생체분자들 사이의 협동성에 대한 기존 이론들에 따르면, 결합관련성은 Hill 공식(R² = 0.99)에서 분리상수(K_d)와 Hill협동성 계수(coefficients)(n)로 특정된다. 실험결과 K_d 값과 n은 각각 87.6 nM과 0.962이였으며, C-Ag⁺-C 상호작용은 다른 선행연구에서 밝혀진 비특이적 금속-리간드 상호관계보다 더 높은 특이성을 가짐을 확인하였다. 또한, Hill 협동성 계수(coefficients; n)가 1에 근접하게 나타났으며, 이로부터 폴리-C DNA 내에 C-Ag⁺-C 결합이 형성되더라도 결합부위 주위에서 또 다른 C-Ag⁺-C 결합이 형성될 확률에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(no cooperativity). 상기 결과는 등온 적정 열량 측정법(isothermal titration calorimetry)을 사용하여 Ag⁺가 특히 1 : 1의 몰비의 C : C 염기쌍과 결합함을 분석하였던 이전 연구결과와 일치하는 결과이다.

한편, S자 곡선(도 10A)은 Ag⁺, H⁺ 와 폴리-C DNA 사이에서 상호작용 동안 수소결합(C-H⁺-C)과 배위 결합(coordinate bonds; C-Ag⁺-C)들의 혼합 비율에 영향을 받음을 확인하였다. 즉, 낮은 Ag⁺ 농도에서는 수소 결합(즉, C-H⁺-C 형성)형성이 지배적이며, Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 상호작용은 거의 발생하지 않으나 Ag⁺ 농도가 증가함에 따라 임계 농도 지점(즉,K_d ¹ ^/n = 46.1 nM)이 존재하기 때문에 Ag⁺-연계 배위 결합( Ag+-mediated coordinate bonds)에 의해 관리되는 강한 결합형태로 변함을 알 수 있었다. 비록 폴리-C DNA와 Ag⁺ 결합특징이 협동성에 기초하지 않더라도(no cooperativity), 이러한 형태변화가 (C-H⁺-C → C-Ag⁺-C) Ag⁺농도 뿐만 아니라 측정 미디움(medium) 내의 산성 정도에 따른 수소 결합의 총량에 의해서 결정될 수 있음을 확인하였다. 한편, Ag⁺ 농도에 따른 프로브와 chip 표면 간에 상호작용하는 모든 폴리-C DNA 사이에서의 상호작용 특성 (벌키(bulky)한 분자들 사이의 협동성 특성)은 폴리-C DNA 단일 분자 사이의 상호작용 특성과 차이(도9A 의 <F_U>, 선형모양 vs 도10B 의 F_Usingle, S자 모양)가 있는 것으로 확인하였다. 따라서 벌키(bulky)한 분자들 사이의 협동성 특성을 확인하기 위하여, Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 결합된 협동성 특성을 관측하는 용도로 적용한 Hill공식(Hill equation)에 부합하는지 확인하였다. 도 10B 보다는 다소 떨어지지만, R-square 이 0.95 로 비교적 높은 신뢰성을 나타내었다. 하지만, Ag⁺-폴리-C 복합체의 단일 및 평균 비결합 힘은 다른 협동 상수(n)를 갖는다 (F_Usingle ^*, 0.962; <F_U ^*>, 0.367). 이는 특정 입자(본 연구에서는 Ag⁺)와 단일 입자 (본 연구에서는 폴리-C DNA 해당) 사이의 상호작용과 벌키한 분자들 사이의 상호작용 특성이 다르게 확인된다는 종전연구 결과와 유사하다. 따라서 결합 협동성(binding cooperativity)은 결합력이 감소함에 따라 감소함을 확인하였다.

< 실험예 10> 폴리 -CT DNA와 DEP 힘을 이용해 Hg ⁺ 이온 검출 가능성 확인

DEPFS(Dielectrophoretic-tweezers based force spectroscopy) system 내에서 핵염기(nucleobase)와 수은이온(Hg²⁺)간의 특이적 결합력 측정가능 여부를 확인하기 위하여, 티민(thymine) 핵염기와 수은이온간의 특이적 배위결합(T-Hg² ⁺-T) 특성을 이용하여, 폴리뉴클레오타이드로 5’-CTCTCTCTCTCT-3’를 사용하고, 해당 폴리-CT DNA를 마이크로스피어 및 DEP chip에 분주시켜 약산성 용액(증류수) 내에서 핵염기와 수은이온 간의 특이적 결합력을 확인하였다. 보다 구체적으로, 비즈(beads)로 10 μm Spherotech 제품을 사용해 Hg² ⁺ 이온농도가 0 M, 1 μM 일 때의 각각의 unbinding voltage을 확인하였으며, 상기 <실시예 6>와 동일한 방법으로 DEP 파열힘(DEP rupture force)을 측정하였다(도 27).

그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, 폴리-CT DNA 사이의 결합력은 같은 핵염기수(12)의 폴리-C DNA에 비해서 50% 정도 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 기존 연구에서의 사용한 시토신 수보다 50% 감소한 시토신을 사용에 따른 결과로써 폴리-CT DNA 사이에서의 C-H⁺-C 결합수가 약 50% 정도 감소해 결합력이 형성되는 것을 확인하였으며, Hg² ⁺ 이 첨가됨으로 인해, Hg² ⁺ 이온과 선택적 배위결합을 형성하는 티민 핵염기가 증가함에 따라, 결합력이 증가하였음을 알 수 있었다. 결과적으로, 폴리-CT DNA를 이용하여 Ag⁺ 이온과의 결합력 검출뿐만 아니라 Hg² ⁺ 이온과의 결합력 검출 및 해당 분석 모델 구현의 가능성을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명자들은 DEP 기반 힘 분광법을 이용해 간단하고, 견고하고, 대량 분석이 가능한 방법으로써 넓은 농도 범위를 거쳐 Ag⁺ 검출 및 높은 민감도를 가질 뿐만 아니라 분자간 상호작용에 의해 Ag⁺, H⁺와 폴리-C DNA 이중체간의 상호작용의 통계적 분석의 새로운 접근법을 증명하였다. 이 접근법을 사용해, Ag⁺-폴리-C 복합체에서 수소와 배위 결합 사이에서 결합 상호작용의 파열 힘(F_U)를 정량화하였으며, 증류수와 식수 내 Ag⁺ 를 감지하기 위해 폴리-C DNA의 최적 길이를 특정하였다. 또한, 본 발명자들은 동등한 F_U측정 데이터를 사용해 C-H⁺-C 와 C-Ag⁺-C 이중체로 구성된 Ag⁺/H⁺-폴리-C DNA 복합체의 상호작용을 밝혔으며, Hill의 결합모델과 결합하여 포아송 통계법에 의한 단일 결합 힘과 Ag⁺와 폴리-C DNA의 결합협동성을 측정하였다. 본 발명자들은 Ag⁺가 존재하지 않을 경우 폴리-C DNA 상호작용은 C-H⁺-C에 의존함을 밝혔으며, 이와 반대로 Ag⁺ 농도가 증가함에 따라 C-H⁺-C 형성이 Ag⁺와 폴리-C DNA 사이의 C-Ag⁺-C으로 대체됨을 증명하였다. 본 발명자들은 일회용 미세유동칩 안의 폴리뉴클레오타이드와 Ag⁺의 약한 킬레이션(chelation)을 정량화해 독특한 힘 분광학 기술로써 DEPFS의 유용성 및 타당성을 입증하였다.

Claims

(a) 전극이 형성된 기판의 일면 이상을 시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화시키는 단계;
(b) 단계(a)의 기판과 시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화된 비즈를 챔버(chamber)에 넣는 단계;
(c) 챔버에 금속을 포함 또는 미포함하는 피검용액을 넣고 기판에 전압을 인가하는 단계;
(d) 비즈의 움직임을 측정하여 영상신호 정보를 수득하는 단계;
(e) 단계(d)에서 수득한 영상신호 정보로부터 그레이스케일 값을 구하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 얻은 그레이스케일 값을 이용하여 파열 순간을 검출하는 단계; 및
(g) 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 단계를 포함하는, 은이온 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(a)의 기판은 미세유체 칩(microfluidic chip)인 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제2항에 있어서,
미세유체 칩은 절연기판을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제3항에 있어서,
절연기판은 이산화규소(SiO₂, 실리카)가 증착된 실리콘인 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 단계(b)의 챔버는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)로 제조되는 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
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제1항에 있어서,
상기 단계 (f)는 전압을 인가함으로써 발생하는 비즈의 부양 변위(levitation displacement)와 그레이스케일 값 강도의 변화를 매칭하고, 기준치를 넘어서 변동(fluctuation)이 발생하는 순간을 파열 순간으로 정의함을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제12항에 있어서, 상기 기준치는.
하기 [식 1]의 가우스 분포를 따르는 그레이스케일 값의 변동(fluctuation)을 측정하되,
변동 레벨(fluctuation level)은 μ± 2σ로 나타내어지고,
[식 1]

상기 식에서,
χ는 그레이스케일 값이고,
μ는 그레이스케일 값의 평균이며,
σ는 그레이스케일 값의 표준 편차인 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (g)의 변환과정은 하기 [식 2]를 이용하여 수행되고,
[식 2]

변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U : unbinding force)을 구하며,
상기 식에서,
ε_m은 매질의 유전율(permittivity)이며,
Re는 파열 전압(unbinding force)이고,
ε_p ^*은 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity)이며,
ε_m ^*은 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity)이고,
r은 마이크로스피어 지름(microsphere radius)이며,
E_rms 는 유한요소 시뮬레이션(finite element simulation, COMSOL Multiphysics 3.5a)으로부터 얻은 전기장 프로파일(electric field profile)인 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 (g)단계의 평균 파열힘(<F_U>) 값과 은이온 농도가 비례하는 것을 특징으로 하는, 은이온 검출방법.
(a) 전극이 형성된 기판의 일면 이상을 시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화시키는 단계;
(b) 단계(a)의 기판과 시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화된 비즈를 챔버(chamber)에 넣는 단계;
(c) 챔버에 금속을 포함 또는 미포함하는 피검용액을 넣고 기판에 전압을 인가하는 단계;
(d) 비즈의 움직임을 측정하여 영상신호 정보를 수득하는 단계;
(e) 단계(d)에서 수득한 영상신호 정보로부터 그레이스케일 값을 구하는 단계;
(f) 단계 (e)에서 얻은 그레이스케일 값을 이용하여 파열 순간을 검출하는 단계;
(g) 파열지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 단계; 및
(h) 단계 (g)에서 구한 파열힘 값과 포아송 통계분석방법(Poisson statistics)을 이용한 분자간 결합력 측정 방법.
제16항에 있어서, 상기 단계 (h)의 포아송 통계분석방법은 하기 <식 2>를 이용하여 수행되고,
[식 2]
m = nF, σ= nF²
F = σ ² / m
상기 식에서 F는 분자간 결합력이고,
m 은 파열 힘(F_U)의 평균이며,
σ ² 은 편차(variance)임을 특징으로 하는 분자간 결합력 측정 방법.
시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화된 기판 및 시토신-염기가 15 내지 32개로 구성된 폴리-시토신 DNA로 기능화된 비즈(beads)가 들어 있는 챔버;
상기 챔버 밑에 위치하되, 전극부를 구비하며, 상기 전극부에 전압을 인가하여 전기장을 형성하는 전계생성부;
상기 챔버 위 또는 일측에 위치되어, 상기 챔버 내를 촬상하는 카메라;
상기 카메라로부터 수신된 영상신호로부터 그레이스케일 값을 측정하고, 그레이스케일 값을 이용해 파열 순간을 검출하는 측정부; 및
상기 측정부에서 측정한 파열 지점의 전압(unbinding voltage)을 측정하고 변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U; unbinding force)을 구하는 분석부를 포함하는, 은이온 측정장치.
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제18항에 있어서, 상기 측정부는 전압을 인가함으로써 발생하는 비즈의 부양 변위(leviation displacement)와 그레이스케일 값 강도의 변화를 매칭하고, 기준치를 넘어서 변동(fluctuation)이 발생하는 순간을 파열순간으로 정의함을 특징으로 하는, 은이온 측정장치.
제25항에 있어서, 상기 기준치는
하기 [식 1]의 가우스 분포를 따르는 그레이스케일 값의 변동(fluctuation)을 측정하되,
변동 레벨(fluctuation level)은 μ± 2σ로 나타내어지고,
[식 1]

상기 식에서,
χ는 그레이스케일 값이고,
μ는 그레이스케일 값의 평균이며,
σ는 그레이스케일 값의 표준 편차인 것을 특징으로 하는, 은이온 측정장치.
제18항에 있어서, 변환과정은 하기 [식 2]를 이용하여 수행되고,
[식 2]

변환과정을 거쳐 파열 힘(F_U : unbinding force)을 구하며,
상기 식에서,
ε_m은 배지의 유전율(medium permittivity)이며_,
Re는 파열 전압(unbinding force)이고,
ε_p ^*은 복합체 소분자 유전율(complex particle permittivity)이며,
ε_m ^*은 복합체 배지 유전율(complex medium permittivity)이고,
r은 마이크로스피어 지름(microsphere radius)이며,
E는 유한요소 시뮬레이션(finite element simulation, COMSOL Multiphysics 3.5a)으로부터 얻은 전기장 프로파일(electric field profile)인 것을 특징으로 하는, 은이온 측정장치.
제18항에 있어서,
상기 분석부는 평균 파열힘(<F_U>) 값과 은이온 농도가 비례하는 것을 이용해 은이온을 검출하는 것을 특징으로 하는, 은이온 측정장치.