KR101943862B1 - Method of concentrating killed-lactic acid bacteria using membrane filter - Google Patents
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Abstract
본원은, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시키는 것을 포함하는, 유산균 사균의 농축 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for concentrating a microbial strain of lactic acid bacteria, which comprises passing a culture broth of a lactic acid bacterium containing a medium containing microbial strains of lactic acid bacteria through a membrane filter.
Description
본원은, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시키는 것을 포함하는, 유산균 사균의 농축방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for concentrating a microbial strain of lactic acid bacteria, which comprises passing a culture broth of a lactic acid bacterium containing a medium containing microbial strains of lactic acid bacteria through a membrane filter.
국제보건기구(World Health Organization, WHO)에서 지정한 프로바이오틱스의 정의는 적절한 양으로 적용되었을 때 숙주에 건강 이익을 줄 수 있는 살아있는 미생물(A live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host)로 제한하고 있다. 그러나 최근 유산균의 프로바이오틱스의 상용화가 빠른 속도로 확대 증가하면서 프로바이오틱스 시장에서 사균체 또한 프로바이오틱스로 사용되고 있다.The definition of probiotics, as designated by the World Health Organization (WHO), refers to live microorganisms that, when applied in an appropriate amount, can provide health benefits to the host. host). However, recently, the commercialization of probiotics of lactic acid bacteria is rapidly expanding, and the bacteria are also used as probiotics in the probiotic market.
사균체로서의 프로바이오틱스는 생균제 보다 다양한 장점을 가지고 있으며 일본과 미국에서는 이미 상용화되고 있는 실정에 있다. 사균체 프로바이오틱스는 생균제 보다는 안정적(stability)으로 사용이 가능하여 산업적 적용의 범위가 넓고, 유통과정에서 다루기가 쉽고, 일반식품에도 첨가되어 식품의 기능성을 강화하면서 면역조절기능에서 생균제와 동일한 효과를 보이는 등 최근 그 시장이 크게 증가되고 있다.As probiotics, probiotics have a variety of advantages over probiotics, and they are already commercially available in Japan and the United States. The probiotics can be used more stable than probiotics, so they have a wide range of industrial applications and are easy to handle in the distribution process. They are added to the general food to enhance the functionality of the food while showing the same effect as the probiotics in the immune control function Recently, the market has increased significantly.
이러한 사균 제조방법의 종래기술로는, 회분식 배양방법이 있다. 상기 회분식 배양방법은, 통상적으로 대용량 배지에 유산균 성장용 배지와 유산균을 첨가하여 배양시킨 후에, 상기 배양된 유산균을 가열하여 사균화하는 단계를 포함한다(대한민국 공개특허 제10-2012-0047792호).As a conventional technique for producing such dead bacteria, there is a batch-type culture method. The batch-type culture method generally includes culturing a culture medium for growth of lactic acid bacteria and lactic acid bacteria in a large-capacity culture medium, and then heating and culturing the cultured lactic acid bacteria (Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2012-0047792) .
그러나, 이러한 회분식 배양에 의한 사균에는 다음과 같은 단점이 있다.However, dead cells from such batch culture have the following disadvantages.
첫 번째, 유산균의 배양 중에 발생하는 불순물을 신속하게 여과할 수 없으므로, 유산균을 세척하기 위한 별도의 공정을 필요로 하고, 유산균 배양 시간이 상대적으로 오래 걸릴 수 있다. 두 번째, 배양중인 유산균이 포함된 배지 중에서 배지 자체의 불순물 또는 배양 중인 유산균이 생성한 불순물만을 선택적으로 제거할 수 없다. First, since impurities generated during the cultivation of lactic acid bacteria can not be filtered quickly, a separate step for washing the lactic acid bacteria is required, and the lactic acid bacteria culturing time may take a relatively long time. Secondly, it is not possible to selectively remove impurities from the culture medium itself or impurities produced by the cultured lactic acid bacteria in the culture medium containing the cultured lactic acid bacteria.
따라서, 배양중인 유산균이 포함된 배지 중에서 유산균만을 선별하여 농축할 수 없으므로, 고농도 및 고품질의 유산균을 제조할 수 없다. 회분식 배양으로 제조된 유산균은 특히, 열처리 과정에서 유산균끼리 뭉치면서 입자의 크기가 증가한다. 이에 따라, 회분식 배양으로 제조한 유산균 원말이 식품 또는 음료에 첨가될 경우, 침전되어 현탁 현상을 일으킨다.Therefore, it is not possible to selectively concentrate the lactic acid bacteria in the culture medium containing the cultured lactic acid bacteria, and thus it is impossible to produce lactic acid bacteria having high concentration and high quality. Particularly, the lactic acid bacteria produced by the batch culture grows as the lactic acid bacteria accumulate in the heat treatment process. Accordingly, when the lactic acid bacteria prepared by the batch culture are added to the food or beverage, they precipitate and cause a suspension phenomenon.
상기와 같은 종래기술의 단점을 해결하기 위하여, 본원은, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시키는 것을 포함하는, 유산균 사균의 농축방법을 제공하고자 한다.In order to solve the disadvantages of the prior art as described above, the present invention provides a method for concentrating a microbial strain of lactic acid bacteria, comprising passing a culture broth of a lactic acid bacterium containing a microbial strain containing microbes of Mycobacterium tuberculosis through a membrane filter.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본원의 제 1 측면은, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시키는 것을 포함하는, 유산균 사균의 농축방법을 제공한다.According to a first aspect of the present invention, there is provided a method for concentrating a bacteria of a lactic acid bacteria, which comprises passing a culture broth of a lactic acid bacterium containing a medium containing killed bacteria of a lactic acid bacteria to a membrane filter.
본원의 제 2 측면은, 상기의 유산균 사균의 농축방법을 포함하는, 유산균 사균의 제조 방법을 제공한다.The second aspect of the present invention provides a method for producing microbes of lactic acid bacteria, which comprises the above-described method for concentrating microbes.
본원의 제 3 측면은, 상기의 제조방법으로 제조된 유산균 사균을 제공한다.The third aspect of the present invention provides a killed microbial strain of lactic acid bacteria produced by the above production method.
본원의 제 4 측면은, 상기의 사균을 포함하는 첨가제를 제공한다.A fourth aspect of the present invention provides an additive comprising the above dead cells.
본원의 구현예들에 의하면, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 사균을 농축, 분산시킬 수 있다.According to embodiments of the present application, the lactic acid bacteria bacteria can be concentrated and dispersed by passing a culture solution of the lactic acid bacteria containing the medium containing the lactic acid bacteria dead bacteria through a membrane filter.
본원의 구현예들에 의하면, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시킴으로써, 유산균의 사균화 과정에서 뭉쳐진 유산균 사균 덩어리를 분산시킬 수 있는 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 배지에 포함된 불순물이 여과됨으로써, 상기 유산균 사균을 세척할 수 있는 효과도 나타낼 수 있다.According to the embodiments of the present invention, the culture broth of lactic acid bacteria containing the culture medium containing the lactic acid bacteria dead cells is passed through the membrane filter to disperse the aggregated lumps of the lactic acid bacteria in the process of desizing the lactic acid bacteria. Further, since the impurities contained in the medium are filtered, it is also possible to wash out the dead bacteria of the above-mentioned lactic acid bacteria.
그리고, 본원의 구현예들에 의하면, 상기 막 필터를 이용하여 상기 유산균을 제외한 단백질, 탄수화물, 유산균 파쇄물 등의 불순물을 여과할 수 있으므로, 고농도의 유산균 사균을 제공할 수 있다. According to the embodiments of the present invention, impurities such as proteins, carbohydrates, and lactic acid bacterial rumble other than the lactic acid bacteria can be filtered using the membrane filter, thereby providing a strain of high concentration of lactic acid bacteria.
나아가, 본원의 구현예들에 의할 경우, 유산균의 세척 공정을 간소화 하거나 별도의 세척 공정을 필요로 하지 않을 수 있으므로, 유산균 생균 및/또는 사균의 제조 시간을 단축시킬 수 있다.Furthermore, according to the embodiments of the present invention, since the washing process of the lactic acid bacteria can be simplified or the washing process may not be required, the production time of the lactic acid bacteria and / or dead bacteria can be shortened.
또한, 본원의 구현예들에 의하면, 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 막 필터에 통과시켜, 뭉쳐진 유산균 덩어리를 분산 및 농축시킴으로써, 고품질의 유산균 사균을 제공할 수 있다. 이러한 고품질의 유산균을 포함하는 사균 원말은 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 경우, 침전 현상을 일으키지 않으므로, 우수한 유통성 및 저장성의 효과를 나타낼 수 있다.According to embodiments of the present invention, a culture medium containing lactic acid bacteria dead cells is passed through the membrane filter to disperse and concentrate the agglomerated mass of lactic acid bacteria, thereby providing a high-quality lactic acid bacteria dead bacteria. When such a high-quality lactic acid bacteria-containing dead bacteria is added to a food, a functional food or a feed, it does not cause a precipitation phenomenon, and thus can exhibit excellent flowability and storage effect.
도 1 은, 본원의 일 구현예에 따른 유산균 사균의 농축방법을 포함하는 유산균 사균 제조방법의 개략도이다.
도 2 는, 본원의 일 구현예에 따른 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기와 종래의 회분식 유산균 배양기의 구조를 비교한 개략도이다.
도 3 은, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균과 비교예 1 에 따라 배양된 유산균 생균의 생산성, 성장속도, 및 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4 는, 본원의 일 실시예에 따라 동결건조된 유산균 사균과 비교예 1 에 따라 제조된 유산균 사균을 주사형 전자형미경사진을 비교한 사진이다(SEM, X10,000).
도 5a 는, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균과 비교예 1 에 따라 배양된 유산균 생균의 크기를 비교한 사진이다(광학현미경, X1,000).
도 5b 는, 본원의 일 실시예에 따라 사균화된 유산균 사균과 비교예 1에 따라 제조된 유산균 사균의 크기를 비교한 사진이다(광학현미경, X1,000).
도 6 은, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균과 비교예 1 에 따라 배양된 유산균 생균의 크기 분포를 비교한 그래프이다.
도 7 은, 본원의 일 실시예에 따라 사균화된 유산균 사균과 비교예 1 에 따라 제조된 유산균 사균의 크기 분포를 비교한 그래프이다.
도 8 은, 본원의 일 실시예에 따른 제조방법에서, 유산균 생균의 배양 및 농축 직후, 상기 유산균 생균의 사균화 직후, 상기 유산균 사균의 농축 및 세척 직후 각각의 유산균 크기를 나타낸 사진이다(광학현미경, X1,000).
도 9 는, 본원의 일 실시예에 따라 제조된 유산균 사균을 제 2 막 필터에 통과시키기 전, 후의 크기 변화를 비교한 그래프이다.
도 10 은, 본원의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 유산균 사균의 원말의 성상, 즉 색도를 비교한 사진이다.
도 11 은, 본원의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 유산균 사균의 원말을 증류수에 현탁시킨 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 12 는, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 생균의 면역 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13 은, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 사균의 면역활성을 나타낸 그래프로서, 대식세포(macrophage)의 일종인 RAW264.7세포주를 이용하여 세포독성(LDH)과 일산화질소(Nitric oxide)의 생성정도를 측정한 그래프이다.
도 14 는, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 사균의 면역활성을 나타낸 그래프로서, 마우스 비장세포(Splenocyte)를 이용하여 세포 독성(LDH)과 TNF-α, INF-γ, IL-12, IL-4의 생성정도를 측정한 그래프이다.
도 15 는, 본원의 일 구현예에 따른 유산균 사균의 항 비만효과를 나타낸 사진 및 그래프로서, 처리된 유산균 사균의 농도증가에 반비례적으로 실험된 지방세포 내에서 지방축적이 감소되고 있음을 보이는 사진과 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a schematic view of a method for producing microbes of lactic acid bacteria comprising a method for concentrating microbes of mycobacterial strains according to one embodiment of the present invention. Fig.
FIG. 2 is a schematic diagram comparing the structures of a conventional bioreactor and a conventional batch-type lactic acid bacteria incubator according to an embodiment of the present invention. FIG.
FIG. 3 is a graph showing productivity, growth rate, and concentration of cultured and concentrated lactic acid bacteria and lactic acid bacteria in accordance with one embodiment of the present invention and lactic acid bacteria cultured according to Comparative Example 1. FIG.
FIG. 4 is a photograph (SEM, X10,000) of a microphotograph of a lyophilized lactic acid bacteria and a lactic acid bacteria prepared according to Comparative Example 1, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5A is a photograph (magnification, X1, 000) of the sizes of cultured and concentrated lactic acid bacteria and lactic acid bacteria grown in accordance with one embodiment of the present invention and lactic acid bacteria cultured according to Comparative Example 1. FIG.
FIG. 5B is a photograph (magnified with an optical microscope, X1, 000) of the size of bacteria killed in accordance with one embodiment of the present invention and the bacteria killed in accordance with Comparative Example 1. FIG.
FIG. 6 is a graph comparing the size distributions of lactic acid bacteria cultured and concentrated according to one embodiment of the present invention and lactic acid bacteria bacteria cultured according to Comparative Example 1. FIG.
FIG. 7 is a graph comparing the size distributions of dead bacteria-killed lactic acid bacteria and lactic acid bacteria produced according to Comparative Example 1 according to one embodiment of the present invention.
8 is a photograph showing the size of each lactic acid bacterium immediately after the cultivation and concentration of the lactic acid bacterium and immediately after the lysis of the lactic acid bacterium and immediately after the concentration and washing of the bacteria of the lactic acid bacteria in the production method according to one embodiment of the present invention , X1, 000).
FIG. 9 is a graph comparing changes in size before and after passage of the bacteria of the lactic acid bacteria produced according to one embodiment of the present invention into the second membrane filter.
FIG. 10 is a photograph comparing the properties, that is, the chromaticity, of the raw material of the killed microbes of the lactic acid bacteria produced according to one embodiment of the present invention and the comparative example.
Fig. 11 is a comparison of the result of suspending the raw materials of dead bacteria of the lactic acid bacteria produced according to one embodiment of the present invention and the comparative example in distilled water.
FIG. 12 is a graph showing the immunological activity of a lactic acid bacterium according to an embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a graph showing the immunological activity of killed bacteria of the lactic acid bacteria according to one embodiment of the present invention. The RAW 264.7 cell line, which is a type of macrophage, is used to generate cytotoxicity (LDH) and nitric oxide . Fig.
FIG. 14 is a graph showing the immunological activity of mycobacterium tuberculosis according to one embodiment of the present invention. FIG. 14 is a graph showing cytotoxicity (LDH) and TNF-.alpha., INF-.gamma., IL- 4 is a graph showing the degree of production.
FIG. 15 is a photograph and a graph showing the anti-obesity effect of the killed bacteria of the lactic acid bacteria according to one embodiment of the present invention, showing a decrease in fat accumulation in the fat cells inversely proportional to the increase in the concentration of treated bacteria And the graph.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. In the drawings, the same reference numbers are used throughout the specification to refer to the same or like parts.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다. Throughout this specification, when a part is referred to as being "connected" to another part, it is not limited to a case where it is "directly connected" but also includes the case where it is "electrically connected" do.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.Throughout this specification, when a member is " on " another member, it includes not only when the member is in contact with the other member, but also when there is another member between the two members.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.Throughout this specification, when an element is referred to as " including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise. The terms " about ", " substantially ", etc. used to the extent that they are used throughout the specification are intended to be taken to mean the approximation of the manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to help prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the referenced disclosure. The word " step (or step) " or " step " used to the extent that it is used throughout the specification does not mean " step for.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term " combination (s) thereof " included in the expression of the machine form means a mixture or combination of one or more elements selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the form of a marker, Quot; means at least one selected from the group consisting of the above-mentioned elements.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A or B, or A and B".
본원 명세서 전체에서, "생물반응기"의 기재는 "유산균 등의 미생물을 제조할 수 있는 통상의 시스템 전체"를 의미한다.Throughout this specification, the description of a " bioreactor " means " the entire system as a whole capable of producing microorganisms such as lactic acid bacteria ".
본원 명세서 전체에서, "배양액"의 기재는 "유산균을 포함하는 배지"를 의미하며, "유산균 생균이 접종된 배지", "유산균 사균이 포함된 배지", "막 필터를 이용하여 배양 및 농축된 유산균이 포함된 배지", "막 필터를 이용하여 농축, 분산 및 세척된 유산균이 포함된 배지"를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Throughout the present specification, the term "culture medium" means "culture medium containing lactic acid bacteria", and the term "culture medium inoculated with lactic acid germs", "culture medium containing lactic acid bacteria", "cultured and concentrated using a membrane filter" Medium containing lactic acid bacteria, " and " medium containing concentrated, dispersed and washed lactic acid bacteria using a membrane filter ".
본원 명세서 전체에서, "유산균의 크기" 기재는 유산균 한 마리 또는 한 개체의 크기를 의미하며, 유산균의 종류 및 형태에 따라 구체적인 측정방법이 상이하다. 상기 유산균이 간균인 경우, 간균의 길이를 의미하는 것이 아니라, 간균의 두께 혹은 폭을 의미한다. 상기 유산균이 구균인 경우, 상기 "유산균의 크기" 는 구균의 직경을 의미한다. 비피도 유산균 등 기타 유산균의 경우, 통상의 기술자에게 통용되는 크기의 기준으로 측정한 크기를 의미하는 것이다.In the entire specification of the present application, the term " size of lactic acid bacteria " means the size of one or one individual of lactic acid bacteria, and the specific measuring method differs depending on the type and form of the lactic acid bacteria. When the lactic acid bacterium is a bacterium, it does not mean the length of the bacterium but means the thickness or width of the bacterium. When the lactic acid bacterium is a bacterium, the " size of the lactic acid bacterium " means the diameter of the bacterium. Bifidobacterium lactic acid bacteria and other lactic acid bacteria means the size measured on the basis of the size commonly used by ordinary technicians.
본원의 제 1 측면은, 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시키는 것을 포함하는, 유산균 사균의 농축방법을 제공한다.According to a first aspect of the present invention, there is provided a method for concentrating a bacteria of a lactic acid bacteria, which comprises passing a culture broth of a lactic acid bacterium containing a medium containing killed bacteria of a lactic acid bacteria to a membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배지에 포함된 불순물이 상기 막 필터를 통하여 여과되는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, impurities contained in the medium may be filtered through the membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 배지에 포함된 유산균 사균이 불순물로부터 세척되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria culture solution containing the culture medium containing the lactic acid bacteria dead cells may be passed through a membrane filter so that the bacteria can be washed out from the impurities.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 사균이 유산균 사균 덩어리로부터 분산 되는 것일 수 있다. 여기에서, 상기 유산균 사균 덩어리는 유산균 생균의 사균화 과정에서 유산균 사균이 뭉쳐서 형성되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria microbes may be dispersed from the lumps of the lactic acid bacteria by passing the culture broth of the lactic acid bacteria containing the medium containing the lactic acid bacteria dead bacteria through a membrane filter. Here, the mass of the dead bacteria of the lactic acid bacteria may be one in which dead bacteria of the lactic acid bacteria are formed in the process of desizing the lactic acid bacteria.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 막 필터는 0.01 ㎛ 내지 0.1㎛ 의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터를 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the membrane filter may comprise a hollow fiber membrane filter comprising a pore having a diameter of from 0.01 mu m to 0.1 mu m.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 막 필터는 50,000 달톤 내지 500,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과하는 중공사막필터를 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the membrane filter may comprise a hollow fiber membrane filter for filtering materials having a molecular weight of 50,000 daltons to 500,000 daltons.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 간균, 구균, 비피도균 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the lactic acid bacteria may include those selected from bacilli, streptococci, bifidobacteria, and combinations thereof.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum 을 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the lactic acid bacterium may comprise Lactobacillus plantarum .
본원의 제 2 측면은, 상기의 유산균 사균의 농축방법을 포함하는, 유산균 사균의 제조 방법을 제공한다.The second aspect of the present invention provides a method for producing microbes of lactic acid bacteria, which comprises the above-described method for concentrating microbes.
본원의 제 3 측면은, 상기의 제조방법으로 제조된 유산균 사균을 제공한다.The third aspect of the present invention provides a killed microbial strain of lactic acid bacteria produced by the above production method.
본원의 제 4 측면은, 상기의 사균을 포함하는 첨가제를 제공한다.A fourth aspect of the present invention provides an additive comprising the above dead cells.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 첨가제는 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 수 있는 것을 포함할 수 있다.In one embodiment of the invention, the additive may include those that may be added to food, functional food or feed.
이하, 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예에 제한되지 않을 수 있다.Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to these embodiments and examples.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 막 필터는 생물반응기에 포함되는 것일 수 있으며, 상기 생물반응기는 배양기 및 막 필터를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the membrane filter may be contained in a bioreactor, and the bioreactor may include an incubator and a membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 막 필터는 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함함으로써, 제 1 막 필터를 통과하는 유산균 생균 및 제 2 막 필터를 통과하는 유산균 사균에 전단력을 가할 수 있다. In one embodiment of the invention, the membrane filter includes a first membrane filter and a second membrane filter, so that a shearing force can be applied to the bacteria of the lactic acid bacteria passing through the first membrane filter and the bacteria of the second passage passing through the second membrane filter .
본원의 일 구현예에 따른 농축방법은 상기 유산균 생균 및 유산균 사균에 전단력을 가함으로써, 상기 유산균의 크기를 용이하게 조절할 수 있으며, 특히 상기 유산균의 크기를 작게 조절할 수 있다. 이에 따라, 본원의 일 구현예에 따른 농축방법을 이용하여 제조한 유산균은 체내에 효과적으로 흡수될 뿐만 아니라, 체내에 효과적으로 흡수되어 면역활성 및 항-비만효과를 나타낼 수 있다.The concentration method according to one embodiment of the present invention can easily adjust the size of the lactic acid bacteria by applying a shearing force to the lactic acid bacteria live bacteria and the dead bacteria of the lactic acid bacteria, and in particular, the size of the lactic acid bacteria can be controlled small. Accordingly, the lactic acid bacterium produced by the concentration method according to one embodiment of the present invention is not only effectively absorbed into the body but also effectively absorbed into the body to exhibit immunological activity and anti-obesity effect.
여기에서, 상기 막 필터를 통과하는 유체에 가해지는 전단력의 크기는 하기 식 1의 Hargen-Poiseuiller의 방정식으로 표현될 수 있다.Here, the magnitude of the shear force applied to the fluid passing through the membrane filter can be expressed by the equation of Hargen-Poiseuiller of Equation (1).
[식 1][Formula 1]
상기 식 1에서, j (관을 따라 흐르는 유체의 전단력), m (유체의 점도), Q (유체의 흐름 속도), r (관의 반경) 그리고 L (관의 길이)를 나타낸다. 또한 배양 중에 상기 유체의 흐름속도는 전단력을 조절하는 중요인자로 작용 할 수 있다. In
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기는 바람직하게는 배양기, 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 생물반응기는 상기 배양기에 첨가된 유체가 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 각각 독립적으로 통과하여 다시 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함할 수 있다. 도 2 는, 막 필터(⑥)가 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 모두 포함하는 생물반응기의 일 개략도이며, 상기 유체가 제 1 막 필터를 통과하여 상기 배양기에 전달된 후에, 상기 유체가 제 2 막 필터를 통과하여 상기 배양기에 전달될 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터와 제 2 막 필터는 도 2 에서와 달리, 상호 독립적인 공간에 존재할 수 있다. In one embodiment of the invention, the bioreactor comprising the incubator and the membrane filter may preferably comprise an incubator, a first membrane filter and a second membrane filter. Here, the bioreactor may include a structure in which the fluid added to the incubator passes through the first membrane filter and the second membrane filter independently, and is then transferred to the incubator. 2 is a schematic view of a bioreactor in which the membrane filter (6) includes both a first membrane filter and a second membrane filter, and after the fluid has passed through the first membrane filter and delivered to the incubator, May be passed through a second membrane filter and delivered to the incubator. In one embodiment of the present invention, the first membrane filter and the second membrane filter may exist in mutually independent spaces, unlike in FIG.
나아가, 상기 생물반응기는 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 추가로 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 배지 제조용 탱크에서 제조된 배지는 상기 배지 제조용 막 필터를 통과하여 다시 배지 제조용 탱크에 전달될 수 있거나 상기 배양기에 전달될 수 있다. 상기 배지 제조용 막 필터를 통과한 배지가 배양기에 전달되는 경우, 상기 배지가 배지 제조용 막 필터를 통과하여 직접 배양기에 전달되 수 있다. 또한, 도 2 에서와 같이, 상기 배지가 배양기에 전달되기 전에 저장용 탱크(③)에 저장된 후에, 상기 배양기에 전달될 수 있다. Furthermore, the bioreactor may further include a tank for preparing a culture medium and a membrane filter for preparing a culture medium. Here, the medium prepared in the tank for producing medium can be passed through the membrane filter for preparing the medium again, and then delivered to the tank for producing medium or delivered to the incubator. When the medium having passed through the membrane filter for preparing a medium is transferred to an incubator, the medium can be directly passed through the membrane filter for preparing a medium and delivered to the incubator. Also, as shown in FIG. 2, the medium may be stored in a storage tank (3) before being delivered to the incubator, and then transferred to the incubator.
상기 유산균 생균이 접종된 배지를 제 1 막 필터에 통과 시킴으로써, 상기 유산균 생균을 배양 및 농축할 수 있다. 그리고, 상기 배양 및 농축된 상기 유산균 생균을 사균화하여 제조된 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 사균을 농축, 분산시킬 수 있다.The lactic acid germ cells can be cultured and concentrated by passing the culture medium inoculated with the lactic acid germ cells in the first membrane filter. The cultured and concentrated cultured lactic acid germs can be concentrated and dispersed by passing the culture medium containing the killed microorganisms of lactic acid bacteria through the second membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터는 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 포함된 불순물을 여과시키면서 유산균 생균은 여과시키지 않는 크기의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터일 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기는, 예를 들어, 0.1 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.2 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.3 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.4 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.9 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.8 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.7 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.6 ㎛ 또는 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 일 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.1 ㎛ 미만일 경우, 상기 유산균 생균의 배양 과정에서 극심한 파울링 현상이 발생하여, 배양액의 플럭스가 감소하게 된다. 이에 따라, 상기 유산균 생균의 농축 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기가 1.0 ㎛ 초과일 경우, 상기 유산균 생균이 불순물과 함께 막을 통하여 여과되는 문제가 발생할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the first membrane filter may be a hollow fiber membrane filter including a pore having a diameter that does not allow the lactic acid germ cells to be filtered while filtering out impurities contained in the culture medium inoculated with the lactic acid germ cells. The size of the pore diameter of the first membrane filter may be, for example, 0.1 탆 to 1.0 탆, 0.2 탆 to 1.0 탆, 0.3 탆 to 1.0 탆, 0.4 탆 to 1.0 탆, 0.5 탆 to 1.0 탆, Mu m, 0.1 mu m to 0.8 mu m, 0.1 mu m to 0.7 mu m, 0.1 mu m to 0.6 mu m, or 0.1 mu m to 0.5 mu m. If the size of the pore diameter of the first membrane filter is less than 0.1 탆, extreme fouling phenomenon occurs during the cultivation of the lactic acid bacteria live bacteria, and the flux of the culture liquid is reduced. Accordingly, the concentration efficiency of the lactic acid bacteria may be reduced. If the size of the pore diameter of the first membrane filter is more than 1.0 占 퐉, there is a possibility that the lactic acid bacteria live bacteria may be filtered through the membrane together with the impurities.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터는 상기 유산균 생균의 배양 및 농축 과정 및/또는 사균화 과정에서 크기가 작아진 유산균을 농축할 수 있는 크기의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터일 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기는, 예를 들어, 0.01 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.02 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.03 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.04 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.05 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.09 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.08 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.07 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.06 ㎛ 또는 0.01 ㎛ 내지 0.05 ㎛ 일 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.01 ㎛ 미만일 경우, 상기 유산균 사균의 농축 과정에서 극심한 파울링 현상이 발생하여, 배양액의 플럭스가 감소하게 된다. 이에 따라, 상기 유산균 사균의 농축 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.1 ㎛ 초과일 경우, 상기 유산균 사균이 불순물과 함께 막을 통하여 여과되는 문제가 발생할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the second membrane filter is a hollow fiber membrane including a pore having a diameter large enough to concentrate lactic acid bacteria having a reduced size in the culture and concentration process and / Filter. Wherein the pore diameter of the second membrane filter, for example, 0.01 ㎛ to 0.1 ㎛, 0.02 ㎛ to 0.1 ㎛, 0.03 ㎛ to 0.1 ㎛, 0.04 ㎛ to 0.1 ㎛, 0.05 ㎛ to 0.1 ㎛, 0.01 ㎛ to 0.09 ㎛, it may be 0.01 ㎛ to 0.08 ㎛, 0.01 ㎛ to 0.07 ㎛, 0.01 ㎛ ㎛ to 0.06 or 0.01 to 0.05 ㎛ ㎛. If the size of the pore diameter of the second membrane filter is less than 0.01 mu m , an extreme fouling phenomenon occurs in the process of concentrating the pathogenic bacteria of the lactic acid bacteria, thereby reducing the flux of the culture liquid. Thus, there is a possibility that the concentration efficiency of the above-mentioned lactic acid bacteria dead cells may decrease. If the size of the pore diameter of the second membrane filter is more than 0.1 탆 , there is a possibility that the pathogenic bacteria of the lactic acid bacteria are filtered together with impurities through the membrane.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터는 각각 독립적으로, 6.0mm 이하의 반경을 가지는 중공사막 필터를 포함할 수 있다. 상기 중공사막 필터의 반경이 6.0mm 이하인 경우, 상기 식 1 에 따라, 유산균 생균 또는 사균에 가해지는 전단력을 증가시킬 수 있다. 이에 따라, 상기 유산균 생균 또는 사균의 크기를 작게 조절할 수 있고, 분산도를 증가시킬 수 있다.In one embodiment of the present invention, the first membrane filter and the second membrane filter may each independently include a hollow fiber membrane filter having a radius of 6.0 mm or less. When the radius of the hollow fiber membrane filter is 6.0 mm or less, the shearing force applied to the lactic acid bacteria live bacteria or dead bacteria can be increased according to the formula (1). Accordingly, the size of the lactic acid bacteria live bacteria or dead bacteria can be controlled to be small and the degree of dispersion can be increased.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터는 50,000 달톤 내지 500,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과할 수 있는 중공사막필터를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the second membrane filter may include a hollow fiber membrane filter capable of filtering a material having a molecular weight of 50,000 daltons to 500,000 daltons.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기는 압력계 및/또는 유량계를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 압력계는 막 필터의 파울링(fouling) 현상을 관리하기 위한 것이며, 상기 유량계는 유산균에 가해지는 전단력을 조절하기 위하여 막 필터를 통과하는 배양액의 흐름속도(Q)를 실시간으로 측정하기 위한 것이다.In one embodiment of the invention, the bioreactor may include a pressure gauge and / or a flow meter. Here, the pressure gauge is for managing the fouling phenomenon of the membrane filter, and the flow meter measures the flow rate ( Q ) of the culture liquid passing through the membrane filter in real time to adjust the shearing force applied to the lactic acid bacteria .
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기는 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배지는 유산균 생균의 배양에 필요한 영양분을 공급하는 역할을 하며, 배지 용액을 살균하여 제조할 수 있다. 종래의 배지는 통상적으로 스팀 등으로 살균되었는데, 상기 스팀 등의 살균에 의할 경우, 탄수화물, 단백질 등이 열에 의해 탄화된 불순물이 발생하여 배지 내에 잔존함으로써, 유산균 분말의 품질이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the bioreactor may further include a tank for preparing a culture medium and a membrane filter for preparing a culture medium. The medium serves to supply nutrients necessary for the cultivation of lactic acid germ cells, and can be prepared by sterilizing the medium solution. Conventional media are usually sterilized by steam or the like. In the case of sterilization of the steam or the like, impurities carbonated by heat generated by carbohydrates, proteins, and the like are generated and remain in the medium, so that the quality of the lactic acid bacteria powder may deteriorate have.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기가 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 포함하는 경우, 상기 배지 제조용 막 필터를 이용하여 배지 용액에 포함된 불순물을 여과함으로써, 배지 용액 내에 탄화에 의한 불순물의 생성을 방지할 수 있다. 이에 따라, 본원의 일 구현예에 따른 제조 방법은 고품질의 유산균 원말을 제공할 수 있다. 여기에서, 상기 배지 제조용 막 필터는 배지 용액에 포함된 불순물을 여과할 수 있는 크기의 직경을 포함하는 중공사막 필터를 포함할 수 있다. 상기 직경은 0.1 내지 1 ㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, when the bioreactor includes a tank for preparing a medium and a membrane filter for preparing a medium, the impurities contained in the medium solution are filtered using the membrane filter for preparing the medium, Can be prevented. Accordingly, the manufacturing method according to one embodiment of the present invention can provide a high-quality lactic acid bacterial raw material. Here, the membrane filter for preparing a culture medium may include a hollow fiber membrane filter having a diameter enough to filter the impurities contained in the culture medium solution. The diameter may be 0.1 to 1 占 퐉, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 간균, 구균, 비피도균 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어서, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. reuteri , L. gasseri , L. crispatus , L, rhamnosus, L. casei, L. sakei, L. curvatus, L. shirota, L. reuteri, L. fermentum , L. brevis 등의 간균과 Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp . lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus facalis등의 구균, 그리고 Bifidobacterium longum, B. lactis, B. lactis subsp . latis, B. infantis, B.breve, B. aldolescence, 등의 비피도균을 예시할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균이 L. plantarum(LM1001, KCCM 기탁 번호 42959) 또는 L.plantarum(LM1004, KCCM 기탁 번호 43246) 를 포함하는 경우, 본원의 효과가 보다 더 현저하게 나타날 수 있다.In one embodiment of the invention, the lactic acid bacteria may be selected from the group consisting of bacilli, streptococci, bifidobacteria, and combinations thereof. For example, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. reuteri, L. gasseri, L. crispatus, L, rhamnosus, L. casei, L. sakei, L. curvatus, L. shirota, L. reuteri, L. fermentum , L. brevis Bacillus and Lactococcus lactis , Lactococcus lactis subsp . lactis , Streptococcus thermophilus , Enterococcus faecium , Enterococcus facalis , and Bifidobacterium longum , B. lactis , B. lactis subsp . latis, B. there may be mentioned a bipyridinium dogyun of infantis, B.breve, B. aldolescence, and the like. In one embodiment of the invention, if the lactic acid bacteria including L. plantarum (LM1001, Accession No. KCCM 42 959) or L.plantarum (LM1004, KCCM deposit number 43 246), may appear to the effect of the present application more pronounced than .
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배지에 접종되는 유산균 생균은, 1 단계 이상의 배양 단계를 거쳐서 배양된 것일 수 있다. 예를 들어서, 상기 유산균 생균은 종배양 및 중간배양의 단계를 거쳐서 배양된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the lactic acid germ cells inoculated into the culture medium may be cultured through one or more culture steps. For example, the lactobacillus can be cultured through a seed culture and an intermediate culture.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 종배양은 유산균 생균을 액체 배지에 접종시킨 다음에, 20 ℃ 내지 40 ℃ 의 온도에서 10 시간 내지 40 시간 동안 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기에서, 상기 유산균의 종류에 따라 비호기 조건으로 종배양 할 수도 있다. In one embodiment of the present invention, the seed culture is preferably, but not exclusively, carried out at a temperature of 20 to 40 캜 for 10 to 40 hours after inoculating the lactic acid germ cells into the liquid medium. Depending on the type of the lactic acid bacterium, seed culture may be carried out under non-exhalation conditions.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 종배양의 액체 배지는 미리 제조된 알칼리용액을 이용하여 살균전에 pH 4.0 내지 pH 8.0으로 조정될 수 있다. 상기 종배양배지의 조성(%w/v)은, 2.0~10.0 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 5.0 카제인효소분해물, 0.1 ~ 5.0 효모추출물, 0.01 ~ 3.0 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0 황산마그네슘, 0.01 ~ 1.0 염화칼슘, 0.01 ~ 0.1 황산망간, 0.01 ~ 5.0 초산나트륨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the invention, the liquid medium of the seed culture can be adjusted to pH 4.0 to pH 8.0 before sterilization using a previously prepared alkali solution. The composition (% w / v) of the seed culture medium preferably ranges from 2.0 to 10.0 glucose, 0.1 to 5.0 soybean protein hydrolyzate, 0.1 to 5.0 casein hydrolyzate, 0.1 to 5.0 yeast extract, 0.01 to 3.0 dibasic potassium phosphate, 0.1 to 5.0 magnesium sulfate, 0.01 to 1.0 calcium chloride, 0.01 to 0.1 manganese sulfate, 0.01 to 5.0 sodium acetate, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 중간배양은 상기 종배양된 유산균 생균을 양적으로 증가시키는 배양으로서, 상기 종배양과 제 1 막필터를 이용한 유산균 생균의 배양 및 농축 사이에 진행될 수 있다. 상기 중간배양은 종배양의 조건과 동일한 조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간배양은, 상기 종배양배지 0.1내지 5.0%,v/v을 중간배양배지에 접종하면서 시작될 수 있다.In one embodiment of the invention, the intermediate culture may be carried out between culturing and concentration of the lactic acid bacteria using the seed culture and the first membrane filter as a culture for quantitatively increasing the seed cultured lactic acid bacteria. The intermediate culture may be performed under the same condition as the seed culture, but is not limited thereto. The intermediate culture can be started by inoculating the intermediate culture medium with 0.1 to 5.0%, v / v of the seed culture medium.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 중간배양의 액체 배지는 미리 제조된 알칼리 용액을 이용하여 살균전에 pH 4.0 내지 pH 8.0으로 조정될 수 있다. 상기 중간배양배지의 조성(%w/v)은 2.0 ~ 10.0 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 3.0 L-시스테인, 0.1 ~ 5.0 효모추출물, 0.01 ~ 3.0 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0 황산마그네슘, 0.01 ~ 0.1 황산망간, 0.01 ~ 5.0 구연산포타슘, 0.01 ~ 2.0 염화칼슘, 0.01 ~ 5.0 계면활성제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the liquid medium of the intermediate culture may be adjusted to pH 4.0 to pH 8.0 before sterilization using a previously prepared alkali solution. The composition (% w / v) of the intermediate culture medium is in the range of 2.0 to 10.0 glucose, 0.1 to 5.0 soybean protein hydrolyzate, 0.1 to 3.0 L-cysteine, 0.1 to 5.0 yeast extract, 0.01 to 3.0 dibasic potassium phosphate, 0.1 To 5.0 manganese sulfate, 0.01 to 0.1 manganese sulfate, 0.01 to 5.0 potassium citrate, 0.01 to 2.0 calcium chloride, 0.01 to 5.0 surfactant, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 1단계 이상의 배양 단계를 거쳐서 배양된 유산균 생균 또는 상기 1단계 이상의 배양 단계를 거치지 않은 유산균 생균을 배지에 접종시킨 후에, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 배양기에 첨가한다. 이후, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 제 1 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 생균을 배양함과 동시에 농축할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the lactic acid germ cells cultured through the one or more stages of cultivation or the lactic acid germ cells not having undergone the above-mentioned one or more stages of cultivation are inoculated into the medium, and then the medium inoculated with the lactic acid germs is inoculated into the incubator . Thereafter, the lactic acid germ cells may be cultured and concentrated while passing the culture medium inoculated with the lactic acid germ cells in the first membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균이 접종되는 배지는 배지 용액으로부터 제조되는 것이며, 상기 배지는 상기 배지 용액에 포함된 불순물 또는 오염균등이 상기 배지 막 필터를 통하여 여과됨으로써 살균되어 제조되는 것일 수 있다. 종래의 배지는 통상적으로 스팀 등으로 살균되었는데, 상기 스팀 등의 살균에 의할 경우, 탄수화물, 단백질 등이 탄화된 불순물이 발생하여 배지 내에 잔존함으로써, 유산균 분말의 품질이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배지 막 필터를 통하여 배지를 살균하는 과정에서 종래의 스팀살균으로 발생하는 배지 유래 불순물, 탄화 등에 의한 불순물이 발생하지 않으므로, 고품질의 유산균 원말을 제공할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the culture medium inoculated with the lactic acid bacteria is prepared from a culture medium solution, and the culture medium is prepared by sterilizing impurities or contaminants contained in the culture medium solution through the culture medium filter . Conventional media are usually sterilized by steam or the like. When sterilization of the steam or the like occurs, carbonated impurities such as proteins or the like are generated and remain in the medium, thereby causing a problem of poor quality of the lactic acid bacteria powder. In one embodiment of the present invention, since the feedstock is sterilized through the culture medium filter, impurities due to medium-derived impurities, carbonization or the like generated by conventional steam sterilization do not occur, and thus a high-quality lactic acid bacteria raw material can be provided.
여기에서, 상기 배지 유래 불순물은 열에 의해 변성된 비 수용성 단백질, 열에 의해 파괴된 비타민 또는 영양 성분, 열에 의해 분해되거나 갈변화된 포도당 성분들일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Herein, the culture medium-derived impurities may be heat-denatured non-water-soluble proteins, heat-destroyed vitamins or nutrients, and glucose components decomposed or changed by heat.
상기 유산균 생균이 접종되는 배지는 상기 유산균 생균이 성장 및/또는 배양될 수 있는 것이면 충분한 것이고, 예를 들어서, 1.0 ~ 10.0%w/v 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0%w/v 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 5.0%w/v 효모추출물, 0.01 ~ 3.0%w/v 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0%w/v 황산마그네슘, 0.01 ~ 0.1%w/v 황산망간, 0.01 ~ 2.0%w/v 염화칼슘을 포함할 수 있거나, 0.1 ~ 10.0%, w/v 유청분말과 0.1 ~ 10.0% 치커리추출물 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 상기 배지는 추가로 0.1 ~ 5.0 %,w/v MgSO4와 0.01 ~ 0.5 %,w/v CaCl2 을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The culture medium to which the lactic acid germ cells are inoculated is sufficient if the lactic acid germ cells can be grown and / or cultured. For example, the culture medium contains 1.0 to 10.0% w / v hydrous crystalline glucose, 0.1 to 5.0% w / v soybean protein hydrolyzate , 0.1 to 5.0% w / v yeast extract, 0.01 to 3.0% w / v dibasic potassium phosphate, 0.1 to 5.0% w / v magnesium sulfate, 0.01 to 0.1% w / v manganese sulfate, 0.01 to 2.0% May contain calcium chloride, or may include, but are not limited to, 0.1 to 10.0%, w / v whey powder and 0.1 to 10.0% chicory extract. Further, the medium may further include 0.1 to 5.0%, w / v MgSO 4 and 0.01 to 0.5%, w / v CaCl 2 , but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균의 크기는, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 상기 제 1 막 필터를 통과하는 동안 상기 배지에 가해진 전단력에 의해서 조절될 수 있다. 상기 전단력은 유산균 생균이 접종된 배지의 흐름 속도에 의해서 조절되는 것일 수 있다. 상기 전단력은, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 통과하는 제 1 막 필터의 중공사막 내부의 채널크기(반경), 배지의 점도 및 흐름 속도 등으로 제어할 수 있다(상기 식 1 참조).In one embodiment of the present invention, the size of the lactic acid germs can be controlled by the shear force applied to the medium while the culture medium inoculated with the lactic acid germs is passed through the first membrane filter. The shear force may be controlled by the flow rate of the medium inoculated with the lactic acid bacteria. The shearing force can be controlled by the channel size (radius) inside the hollow fiber membrane of the first membrane filter through which the culture medium inoculated with the lactic acid bacteria live bacteria, the viscosity of the medium, and the flow rate.
종래의 회분식 유산균 배양법에 의하면, 유산균의 크기를 작게 조절하는 것이 용이하지 않는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본원은 상기 유산균이 포함된 배지에 전단력을 가하여 배양중인 유산균에 스트레스를 가함으로써, 상기 유산균의 크기를 용이하게 조절할 수 있다. According to the conventional batch-type lactic acid bacteria culture method, it is not easy to control the size of the lactic acid bacteria to be small. In order to solve such a problem, the present invention can easily control the size of the lactic acid bacteria by applying a shearing force to the culture medium containing the lactic acid bacterium to stress the cultured lactic acid bacteria.
상기 유산균의 크기는 유산균의 체내 흡수율에 직접적으로 영향을 미친다고 알려져 있으며, 특히 그 크기가 작을수록 유산균의 체내 흡수율이 높아지며 생물학적 효능이 증가한다고 알려져 있다. It is known that the size of the lactic acid bacteria directly affects the absorption rate of the lactic acid bacteria in the body. Especially, as the size of the lactic acid bacteria is smaller, the absorption efficiency of the lactic acid bacteria increases and the biological efficacy increases.
본원의 농축방법에 의할 경우, 상기 식 1에서 나타낸 바와 같이, 제1 막 필터를 통과하는 배지의 흐름속도를 통제함으로써, 상기 배지에 가해지는 전단력을 조절할 수 있다. 이에 따라, 배양되는 유산균 생균의 크기를 용이하게 조절할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유산균의 생균의 크기를 1.0 ㎛ 이하로 조절하여, 체내 흡수율을 극대화할 수 있다. 상기와 같이 크기가 상대적으로 작게 조절된 유산균 생균은, 이후 사균화 과정에서도 덜 뭉치고, 그 크기가 상대적으로 작아져서, 체내 흡수가 극대화될 수 있다.According to the enrichment method of the present invention, the shearing force applied to the medium can be controlled by controlling the flow rate of the medium passing through the first membrane filter, as shown in
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균은, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 포함된 불순물이 상기 제 1막 필터를 통하여 여과됨으로써 농축되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the lactic acid bacteria live bacteria may be concentrated by filtering the impurities contained in the medium inoculated with the lactic acid bacteria live bacteria through the first membrane filter.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균을 제 1 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 생균의 크기를 조절할 수 있다. 나아가, 상기 배지 내의 불순물을 연속적으로 제거할 수 있고, 유산균 생균을 농축할 수 있다. In one embodiment of the invention, the size of the lactic acid bacteria can be controlled by passing the lactic acid bacteria live bacteria through a first membrane filter. Further, the impurities in the culture medium can be continuously removed, and the lactic acid bacteria live bacteria can be concentrated.
통상의 회분식 유산균 배양 과정에서는, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 단백질, 탄수화물, 유기산, 균체 파쇄물 등의 불순물이 배지에 축적되어, 유산균을 공격하여 유산균의 성장을 제한함으로써, 유산균의 최종 농도를 떨어뜨리는 문제를 발생시키게 된다. In the conventional batch-type lactic acid bacteria culturing process, impurities such as proteins, carbohydrates, organic acids, and cell lysates are accumulated in the medium in which the lactic acid germs are inoculated, and the growth of the lactic acid bacteria is restricted by attacking the lactic acid bacteria, Causing a knocking problem.
그러나, 본원의 농축방법에 의할 경우, 이러한 불순물은 상기 제 1 막 필터를 통하여 여과됨으로써, 유산균 생균 또는 사균의 농도를 높이는 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 이러한 불순물이 여과됨으로써, 유산균의 회수 과정에서 세척 공정을 단순화 시킬 수 있으므로, 비용 절감 및 공정 단순화의 효과도 나타낼 수 있다.However, according to the concentration method of the present invention, such impurities can be filtered through the first membrane filter, thereby enhancing the concentration of lactic acid bacteria live cells or dead bacteria. Further, since such impurities are filtered, the washing process can be simplified in the process of collecting the lactic acid bacteria, so that it is possible to reduce costs and simplify the process.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 상기 유산균 생균의 배양 동안 pH 5.5 내지 6.8 으로 유지되는 것일 수 있다. 상기 유산균 생균이 접종된 배지의 최적pH 는 유산균의 종류에 따라 상이할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 배양 중에 유산균에 의해 생산되는 유기산이 상기 배지의 pH 를 낮추는 경우, pH를 일정하게 유지하는 물질을 배지에 첨가할 수 있다. 상기 배지의 pH를 일정하게 유지하는 물질은, 예를 들어, 수산화나트륨(NaOH)용액, 수산화칼륨(KOH)용액, 암모니아수 또는 암모니아가스 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the invention, the culture medium inoculated with the lactic acid bacteria may be maintained at a pH of 5.5 to 6.8 during the culture of the lactic acid bacteria. The optimal pH of the culture medium inoculated with the lactic acid germs may vary depending on the kind of the lactic acid bacteria. In one embodiment of the invention, when the pH of the medium is lowered by the organic acid produced by the lactic acid bacteria during the culture, a substance that keeps the pH constant can be added to the medium. Examples of the substance that keeps the pH of the culture medium constant include, for example, a sodium hydroxide (NaOH) solution, a potassium hydroxide (KOH) solution, ammonia water, or ammonia gas.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기와 같이 배양 및 농축된 유산균 생균을 사균화하여 유산균 사균을 만들 수 있다. 상기 유산균 생균은 틴들 또는 열처리에 의하여 사균화 될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the cultured and concentrated lactic acid bacteria can be killed to produce lactic acid bacteria. The lactic acid bacterium may be strained by heat or a heat treatment, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 열처리는 80 ℃ 내지 121 ℃ 의 온도에서 3 분 내지 15분 동안 진행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 열처리는 1 회 내지 10 회의 초고온살균(ultra high temperature sterilization)으로 진행될 수 있다. 상기 초고온살균은 110°C 내지 130°C 의 온도에서 3.0 초 내지 10.0초 동안 진행되는 것일 수 있으며, 예를 들어서, 100˚C에서 1.0초 내지 10초 동안 2 회, 121˚C에서 1.0 내지 10.0초 동안 1 회 진행되는 것일 수 있다.In one embodiment of the invention, the heat treatment may be carried out at a temperature of 80 ° C to 121 ° C for 3 minutes to 15 minutes. In addition, the heat treatment may be conducted with one to ten times of ultra high temperature sterilization. The ultra-high temperature sterilization may be performed at a temperature of 110 to 130 ° C for 3.0 to 10.0 seconds, for example, twice at 100 ° C for 1.0 second to 10 seconds, at 1.0 to 10.0 at 121 ° C It may be one time per second.
본원의 일 구현예에 있어서, 유산균 사균의 제조방법은, 상기 유산균 생균의 배양 이후에, 분산제를 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 분산제는, 상기 유산균 생균의 사균화 과정 중에서 발생할 수 있는 뭉침 현상을 예방하는 효과를 나타낼 수 있다. In one embodiment of the present invention, the method for producing dead bacteria of a lactic acid bacteria may further include adding a dispersant to the medium inoculated with the lactic acid bacteria live bacteria after the culture of the lactic acid bacteria live bacteria. The dispersant may exhibit an effect of preventing accumulation phenomenon that may occur during the desizing step of the lactic acid germ viable bacteria.
상기 분산제는 상기 배양 및 농축된 유산균 생균의 펠렛에 대하여 10.0%(w/w) 내지 80.0%(w/w)로 첨가하는 것일 수 있다. 상기 분산제로는, 말토덱스트린 또는 트레할로스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. The dispersant may be added in an amount of 10.0% (w / w) to 80.0% (w / w) based on the pellets of the cultured and concentrated lactic acid bacteria. The dispersing agent may be maltodextrin or trehalose, but is not limited thereto.
본원의 일 구현에에 있어서, 상기와 같이 사균화된 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 사균을 농축 할 수 있다. 상기 유산균 사균이 포함된 배지가 제 2 막 필터를 통과하게 되면, 상기 배지에 가해진 전단력을 이용하여 유산균 사균, 특히, 상기 유산균의 사균화 과정에서 뭉쳐진 유산균 사균 덩어리를 분산시킬 수 있는 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 배지에 포함된 불순물이 여과됨으로써, 상기 유산균 사균을 세척할 수 있는 효과도 나타낼 수 있다.In one embodiment of the present invention, the microorganisms of the lactic acid bacteria can be concentrated while passing the culture medium containing the killed microbial bacteria of the lactic acid bacteria as described above through the second membrane filter. When the culture medium containing the killed microbes is passed through the second membrane filter, it is possible to disperse the dead microbes of the lactic acid bacteria, particularly the dead microbes of the microbes accumulated in the process of desizing the lactic acid bacteria, using the shear force applied to the medium have. Further, since the impurities contained in the medium are filtered, it is also possible to wash out the dead bacteria of the above-mentioned lactic acid bacteria.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터에 통과시키면, 상기 유산균 사균의 세척 및 농축을 극대화시킬 수 있다. 이러한 농축방법에 의할 경우, 유산균 사균의 농도를 바람직하게는 약 10 배, 9 배, 8 배, 7배, 6배 또는 5 배 농축시킬 수 있다. In one embodiment of the present invention, the culture medium containing the killed microbes may be passed through a second membrane filter to maximize washing and concentration of the killed microbes. By such a concentration method, the concentration of the pathogenic microorganism of the lactic acid bacteria can be preferably about 10 times, 9 times, 8 times, 7 times, 6 times or 5 times that of the microorganism.
이후, 상기 유산균 사균은 세척된 후에, 건조시켜서 분말화되는 것일 수 있다. 본원의 농축방법을 이용하여 제조한 유산균 사균의 분말은 용매에서 침전현상을 발생시키지 않는 효과를 나타낼 수 있다. 본원의 제조방법에 의할 경우, 상기 유산균 생균은 제 1 막 필터를 통과하면서 전단력에 의하여 크기가 조절 될 수 있다. 상기 크기가 조절된 유산균 생균은 사균화 과정에서 뭉쳐서 덩어리를 형성할 수 있지만, 상기 유산균 사균 덩어리는 제 2 막 필터를 통과하면서 전단력에 의하여 분산될 수 있다. 따라서, 상기 분산된 유산균 사균을 분말화하더라도 유산균 사균의 뭉침현상이 발생하지 않으므로, 용매에서의 침전현상을 예방할 수 있다.Then, the killed bacteria of the lactic acid bacteria may be washed and then dried and pulverized. The powder of dead bacteria of the lactic acid bacteria produced by the concentration method of the present invention can exhibit the effect of preventing the precipitation phenomenon in the solvent. According to the manufacturing method of the present invention, the size of the lactic acid bacteria can be adjusted by the shear force while passing through the first membrane filter. The size-controlled lactic acid bacteria can be aggregated to form lumps during the quenching process, but the masses of dead bacteria of the lactic acid bacteria can be dispersed by the shearing force while passing through the second membrane filter. Therefore, even if the dispersed lactic acid bacteria are pulverized, the aggregation of the dead bacteria of the lactic acid bacteria does not occur, so that the precipitation phenomenon in the solvent can be prevented.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 배양액은 유산균을 제외한 단백질, 탄수화물, 유산균 파쇄물 등의 불순물을 여과하기 위하여 세척될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the culture broth of the lactic acid bacteria may be washed to remove impurities such as proteins, carbohydrates, and lactobacilli except for lactic acid bacteria.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터에 의한 유산균 세척의 효과를 극대화 하기 위하여, 세척액을 배양기에 첨가 한 후에 상기 사균을 제 2 막 필터에 통과시킬 수 있다. 여기에서, 상기 세척액은, 예를 들어, 멸균된 증류수와 0.1내지 1.0%,w/v염화나트륨(NaCl)를 포함하는 증류수 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세척액은 상기 농축된 유산균 사균이 포함된 배지 부피의 1.0 내지10 배로 첨가될 수 있다.In an embodiment of the present invention, in order to maximize the effect of washing the lactic acid bacteria with the second membrane filter, the washing solution may be added to an incubator, and then passed through the second membrane filter. Here, the washing solution includes, for example, sterilized distilled water and distilled water containing 0.1 to 1.0% w / v sodium chloride (NaCl), but the present invention is not limited thereto. The washing solution may be added at 1.0 to 10 times the volume of the culture medium containing the concentrated microbial cells of the lactic acid bacteria.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조, 유동층건조 또는 분무건조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the invention, the drying may be, but not limited to, lyophilization, fluid bed drying or spray drying.
본원의 일 실시예에 있어서, 상기 분말화된 유산균 사균은 0.01 ㎛ 내지 3.0㎛, 0.1 ㎛ 내지 3.0㎛, 0.5 ㎛ 내지 3.0㎛ 의 크기를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 분말화된 유산균 사균의 40% 내지 100% 의 크기가 1.0 ㎛ 이하인 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pulverized lactic acid bacteria dead bacteria may include a size of 0.01 mu m to 3.0 mu m, 0.1 mu m to 3.0 mu m, and 0.5 mu m to 3.0 mu m. Here, 40% to 100% of the powdery lactic acid bacteria dead cells may have a size of 1.0 mu m or less.
본원의 농축방법을 이용하여 제조한 유산균 사균 원말은 유산균 사균의 입자 크기가 작을 뿐만 아니라, 유산균 사균이 고르게 분산되어 분포하게 된다. 나아가, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터에 의한 불순물 여과 단계를 거쳐서 불순물이 상대적으로 미량 존재하므로, 본원에 따른 농축방법을 이용하여 유산균 사균을 제조하면, 고품질의 유산균 사균 원말을 제공할 수 있다.In the starter of lactic acid bacteria produced by the concentrating method of the present invention, not only the particle size of the dead bacteria of the lactic acid bacteria is small but also the dead bacteria of the lactic acid bacteria are dispersed evenly. Further, since a relatively small amount of impurities are present through the impurity filtration step by the first membrane filter and the second membrane filter, when the pathogenic bacteria of the lactic acid bacteria are prepared using the concentration method according to the present invention, it is possible to provide a high- have.
이러한 고품질의 유산균 사균 원말은 상기 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 경우, 침전현상을 일으키지 않으므로, 우수한 유통성 및 저장성의 효과를 나타낼 수 있다.When such a high quality Lactobacillus acidophilus strain is added to the food, the functional food or the feed, it does not cause the precipitation phenomenon, so that it can exhibit the excellent flowability and storage effect.
이하, 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited thereto.
[[ 실시예Example ] ]
1. 유산균의 기원(Origin)Origin of lactic acid bacteria
본원에서 사용된 L. plantarum(LM1001) 과 L. plantarum(LM1004)는 한국국제대학교 제약공학과[주소: 660-759, 경남 진주시 문산읍 동부로 965]에서 한국의 전통발효 식품인 김치로부터 분리되었다. 상기 L. plantarum(LM1001) 및 L.plantarum(LM1004) 는 한국미생물보존센터(Korean culture center of microorganisms)에 일반 기탁하였으며, 각각 신규의 KCCM 42959(기탁일: 2010년 11월 12일) 및 KCCM 43246(기탁일: 2016년 10월 28일)로 명명되었다. L. plantarum (LM1001) and L. plantarum (LM1004) used in this study were isolated from kimchi, a traditional fermented food in Korea, at Korea International University, Department of Pharmaceutical Engineering [Address: 660-759, 965 Dongburo, Munsan-eup, Jinju, Gyeongsangnam-do. The L. plantarum (LM1001) and L.plantarum (LM1004) was deposited with the General Korea Culture Center of Microorganisms (Korean culture center of microorganisms), each new KCCM 42959 (date of deposit: November 12, 2010) and KCCM 43246 (Date of deposit: October 28, 2016).
이하의 실시예 또는 실험예에서 사용된 모든 유산균은 별도의 언급이 없는 한 L.plantarum(LM1001)과 L.plantarum(LM1004)이다.All lactic acid bacteria used in the following Examples or Experiments are L. plantarum (LM1001) and L. plantarum (LM1004), unless otherwise noted.
2. 분석 방법2. Analysis method
2-1. 생균수 분석2-1. Live cell number analysis
배양중에 증가하는 유산균의 생균수는 콜로니카운팅(Colony counting) 방법으로 분석하였다. 이때 L. plantarum의 콜로니를 분석하기 위해 사용된 배지는 MRS(Difco, USA) 고형배지였으며, 배양은 37˚C에서 48시간 비호기적으로 실시한 후 생성된 콜로니의 숫자를 측정함으로써 분석하였다. 배양기는 앞서 사용한 JRS-150C모델을 사용하였다.The number of viable cells of lactic acid bacteria increased during the culture was analyzed by the colony counting method. At this time, the medium used for the analysis of colonies of L. plantarum was MRS (Difco, USA) solid medium, and cultivation was performed by measuring the number of colonies generated after 48 hours of non-occasional incubation at 37 ° C. The incubator used the JRS-150C model previously used.
배양액은 107, 108, 109 배수까지 펩톤수를 이용하여 희석 한 후, 페트리디쉬(Petri-dish)당 1.0ml씩 사용하면서 푸어링(Pouring) 방법을 사용하면서 분석되었다.The culture was diluted to 10 7 , 10 8 , and 10 9 with a number of peptones and analyzed using a pouring method using 1.0 ml per petri dish.
이때 배지희석을 위해 사용된 펩톤수의 조성(%,w/v)은 다음과 같다: 0.01 ~ 1.0 염화나트륨, 0.1 ~ 5.0 카제인효소분해물, 0.01 ~ 5.0 제2인산나트륨, 0.01 ~ 1.0 제1인산칼륨을 제조 후 살균(121˚C, 15분)하여 사용하였다.The composition (%, w / v) of the peptone water used for the dilution of the medium was as follows: 0.01 to 1.0 sodium chloride, 0.1 to 5.0 casein enzyme hydrolyzate, 0.01 to 5.0 sodium phosphate, 0.01 to 1.0 potassium phosphate (121 ° C, 15 minutes) after sterilization.
2-2. 총균수 분석2-2. Total bacterial count analysis
배양액의 살균 후, 배양액 중의 사균체 수는 혈구계 Hemocytometer[Marienfeld, Germany]를 사용하여 분석하였다. 1,000 배율의 광학현미경[BX 53F, Olympus, Japan] 을 통해 혈구계의 총 20개의 방에 있는 사균수를 측정하여 평균치 Navg 를 구한 후 [식 2]를 통하여 총균수[No/g 원말 또는 ml]를 분석하였다.After sterilization of the culture medium, the number of dead cells in the culture solution was analyzed using a hemocytometer [Marienfeld, Germany]. The average number N avg was determined by measuring the number of bacteria in 20 rooms of the hemocyte through a 1,000 magnification optical microscope [BX 53F, Olympus, Japan] ] Were analyzed.
[식 2][Formula 2]
여기에서, R 은 희석배수이다.Here, R is a dilution factor.
사균 원말에 존재하는 총균수 분석을 위하여, 1.0g 건조원말을 10ml의 증류수에 녹인 후, 잘 현탁하여 108, 109, 1010 배수로 멸균된 증류수에 희석하여 측정하였다.For the analysis of the total number of bacteria present in dead leaves, 1.0 g of dried starch was dissolved in 10 ml of distilled water, and the suspension was well suspended and diluted in sterilized distilled water at 10 8 , 10 9 and 10 10 .
2-3. 포도당, 젖산의 HPLC 분석2-3. HPLC Analysis of Glucose and Lactic Acid
배양 동안 포도당과 젖산 등의 유기산 분석을 위해 HPLC(Agilent Technology 1200, Agilent, USA)을 사용하였다. 정지상(Stationery phase) 와 운동상(Mobile phase) 를 위해 각각 아민-컬럼(NH2, 300mmX7.8mm, 9.0mm particle size, Bio-Rad, USA)과 5mM H2SO4용액(0.5ml flow rate)을 사용하였다. 분석 동안 컬럼의 온도는 35˚C로 유지하였으며, 샘플은 오토샘플러(5.0mL)를 통해 자동으로 주사(Inject)하였다. 분석은 R.I detector를 사용하면서 Agilent Chemstation 1200 분석 프로그램을 이용하여 실시하였다.HPLC (Agilent Technology 1200, Agilent, USA) was used for the analysis of organic acids such as glucose and lactic acid during the culture. (
2-4. 면역활성 분석방법2-4. Immuno-active assay method
유산균 사균(Heat-killed probiotics, HK-probiotics)의 면역활성과 세포독성은 대식세포(RAW 264.7)와 마우스비장(spleen)내의 면역세포(Splenocytes)들을 이용한 in-vitro 분석에서 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-4(IL-4), 인터페론-감마(INF-γ), TNF-알파(TNF-α), NO-(Nitric oxide)생산량의 변화와 면역세포의 생존능(viability) 과 증식성을 분석함으로써 평가하였다.Immunoreactivity and cytotoxicity of heat-killed probiotics (HK-probiotics) were measured by in-vitro analysis using immunocytes (RAW 264.7) and mouse spleen (splenocytes) 12), interleukin -4 (IL-4), interferon-gamma (INF-γ), TNF- alpha (TNF-α), NO - (Nitric oxide), viability (viability) and proliferative changes in the immune cells and the production .
2-4-1. 시료확보 2-4-1. Sample collection
L. plantarum(LM1001)를 이용하여 본원의 제조방법으로 제조한 유산균 생균과 유산균 사균 시료를 제조하였다. Lactic acid bacteria and lactic acid bacteria samples prepared by the method of the present invention were prepared using L. plantarum (LM1001).
유산균 생균 시료는 희석한 생균을 일정 농도로 구강 투여 하여 마우스 혈중에서 사이토카인들의 변화를 측정하는 in-vivo 테스트로 분석하였으며, 사균의 면역활성은 마우스 비장세포(splenocytes)와 대식세포주(RAW264.7)를 이용하여 사균을 농도별로 처리 후 사이토카인의 변화를 분석하는 in-vitro 실험을 통하여 실시하였다. Lactic acid bacteria were analyzed by an in-vivo test in which the diluted live cells were orally administered at a fixed concentration to measure changes in cytokines in the mouse blood. Immunoglobulin activity of the killed cells was determined by measuring the splenocytes and macrophages (RAW264.7 ) Were used to analyze the changes of cytokines after in vitro treatment of dead cells.
2-4-2. 실험동물 및 처리2-4-2. Experimental animals and treatment
6 주령의 웅성 Balb/c 마우스를 ㈜샘타코코리아(한국)에서 분양 받아 사용하였다. 사육환경은 온도 22±2℃ , 습도 50±20%, 12시간 조명하에 사육하였으며, 사료는 마우스용 고형사료를, 음수는 상수도수를 제한 없이 섭취시켰다. 동물은 1주일 동안 실험 동물실에서 적응시킨 후 실험을 수행하였다. Six-week-old male Balb / c mice were purchased from Samtaco Korea (Korea). The feeding environment was maintained at a temperature of 22 ± 2 ° C and a humidity of 50 ± 20% for 12 hours. Feeds were fed with solid feed for mouse and water for drinking water without restriction. The animals were adapted for one week in an experimental animal room and then subjected to experiments.
본원의 제조방법으로 제조한 L. plantarum (LM1001)의 유산균 생균을 농도별로 10일간 매일 1회 구강 투여를 수행하였다. 마지막 구강 투여 후 24 시간에 실험동물로부터 혈액시료를 확보 한 후 -80℃ 에 보관하면서 실험에 사용하였다. 양성 대조군으로 Con A 25 mg/kg으로 정맥투여 하였다.Lactic acid bacteria of L. plantarum (LM1001) prepared by the method of the present invention was orally administered once a day for 10 days for each concentration. Blood samples were collected from the experimental animals 24 hours after the last oral administration and stored at -80 ° C. Con A was intravenously administered at 25 mg / kg as a positive control.
2-4-3. 마우스 비장세포 분리 및 배양2-4-3. Isolation and culture of mouse splenocytes
마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하며, RPMI 1640 용액으로 세척한 다음 분쇄하여 세포를 유리하였다. 분리된 세포 현탁액을 200 메쉬 스태인리스 스틸 체 에 통과시킨 후 4℃, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 세포 펠릿을 ACK 버퍼에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 유출된 비장세포는 10% 소태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1×106 cell/㎖이 되도록 현탁하여 48 웰 플레이트에 각각 500 ㎕을 분주하였으며, 본원의 제조방법으로 제조된 L. plantarum의 유산균 사균을 농도별로 처리하였다. 리포폴리사카라이드 및 Con A 을 양성대조군으로 시료를 구분하여 세포에 처리하였다. The spleen was aseptically removed from the mouse, washed with RPMI 1640 solution, and then pulverized to obtain cells. The separated cell suspension was passed through 200 mesh stainless steel, centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes at 4 ° C, and the cell pellet was suspended in ACK buffer for 5 minutes to remove red blood cells. The spleen cells were suspended in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin at a concentration of 1 × 10 6 cells / ml, and 500 μl of each was dispensed into a 48-well plate. Lactobacillus acidophilus L. plantarum produced by the present method was treated by concentration. Lipopolysaccharide and Con A were treated with cells as a positive control.
위와 같이 처리된 세포군들을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3~72시간 배양하였고, 상기 배양액의 상층액을 -20℃ 에 보관하여 사이토카인 생성량 측정을 위해 사용하였다.Cells treated as above were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 3 to 72 hours. The supernatant of the culture was stored at -20 ° C and used for cytokine production.
2-4-4. 세포 배양2-4-4. Cell culture
비장세포 및 RAW 264.7 세포를 10% 소태아혈청과, 100 유닛/mL의 스트렙토마이신과 페니실린이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하고 NO 및 세포 증식률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사용하였다.Spleen cells and RAW 264.7 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 100 units / mL of streptomycin and penicillin at 37 ° C and 5% CO 2 to determine the effect on NO and cell proliferation Respectively.
2-4-5. 사이토카인(2-4-5. Cytokine ( IFNIFN -γ, -γ, TNFTNF -α, IL-12) -α, IL-12) 분비능Secretory function 측정 Measure
비장세포을 배양시킨 다음 배양 상층액으로 부터 분비되는 사이토카인 (TNF-α, IFN-γ, IL-12) 분비량을 측정하였다. 본원의 제조방법으로 제조된 L.plantarum(LM1001) 사균 시료를 양성대조군인 LPS 및 Con A와 함께 일정 시간 처리 한 후 배양액에 유리된 사토카인의 농도를 효소결합면역흡착검사 (Enzyme linked immumosorbent assay, ELISA)법을 이용하여 측정하였다 (ELISA kit, R&D system, USA).After splenocytes were cultured, secretion of cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-12) secreted from the culture supernatant was measured. After L. plantarum (LM1001) prepared by the method of the present invention was treated with positive control LPS and Con A for a certain period of time, the concentration of free cytokine in the culture solution was measured by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) method (ELISA kit, R & D system, USA).
즉, 사이토카인의 항체가 코팅되어 있는 96웰 플레이트에 상층액 시료 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 상층용액을 제거하고 인산염환충용액와 트윈-20 (Sigma)을 섞어 만든 세척액으로 3회 이상 세척하였다. That is, 100 μl of the supernatant sample was added to a 96-well plate coated with an antibody of cytokine, allowed to react at room temperature for 2 hours, and then the supernatant solution was removed. The supernatant was washed three times with a phosphate buffer solution and Tween-20 (Sigma) Lt; / RTI >
다시 2차 항체를 포함하는 용액을 넣어 1차 항체와 반응시킨 후, 아비딘(Avidin) 과 결합된 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase, HRP) 효소를 넣어 상온에서 15분 반응시켰다. 이후, HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 확인하였다.Then, a solution containing the secondary antibody was added to react with the primary antibody, and Horseradish peroxidase (HRP) enzyme conjugated with avidin was added thereto, followed by reaction at room temperature for 15 minutes. After that, TMB solution was added as a substrate for the HRP enzyme, and the reaction was confirmed by color change.
시료에 존재하는 사이토카인의 농도에 따라 색상의 변화가 나타나므로, 이 변화를 통해 시료 중에 사이토카인의 생성 유무를 알 수 있었다. 상기 HRP 효소와 TMB 기질의 반응을 황산(1.0M)을 넣어 종결시킨 후, 마이크로플레이트 리더기 (Thermo)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.The change in color was observed depending on the concentration of cytokine present in the sample. Thus, the presence or absence of cytokine production in the sample was confirmed by this change. The reaction between the HRP enzyme and the TMB substrate was terminated by adding sulfuric acid (1.0 M), and the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Thermo).
2-4-6. NO 측정 2-4-6. NO measurement
대식세포주 RAW 264.7 세포를 5×105 cell/㎖의 농도로 96웰 플레이트에 분주하여 24시간 배양 시킨 후 양성대조군으로 LPS를 1 mg/㎖로 처리하고, 음성대조군으로 인산염완충용액을 처리하였다. 본원의 제조방법으로 제조된 L. plantarum (LM1001) 사균 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. The macrophage RAW 264.7 cells were seeded in a 96 well plate at a concentration of 5 × 10 5 cells / ml, cultured for 24 hours, treated with 1 mg / ml of LPS as a positive control, and treated with phosphate buffer solution as a negative control. A sample of L. plantarum (LM1001) prepared by the method of the present invention was treated and then re-cultured for 24 hours.
상기 NO의 농도는 그리스 리에이전트 시스템(Griess reagent system , Sigma, USA) 을 사용하여 측정하였다. 96웰 플레이트에 50 ㎕ 배양액을 넣고 그리스 리에이전트 I(NED 용액)과 그리스 리에이전트 II (술파닐아미드 용액)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10분간 반응하고 30분 이내에 마이크로플레이트 리더기(Tecan, Austria) 를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. 상기 NO의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선(0~100 마이크로몰)을 이용하여 계산하였다.The NO concentration was measured using a Griess reagent system (Sigma, USA). 50 μL of the culture was added to 96-well plate, and the same amount of Glycine Agent I (NED solution) and Glycyrrhizin II (sulfanilamide solution) were mixed in a dark room. After 10 min of incubation in a dark room, microplate reader (Tecan, Austria) at 540 nm. The NO concentration was calculated using a standard curve of sodium nitrite (0 to 100 micromolar).
2-4-7. 세포 증식률 측정2-4-7. Measurement of cell proliferation rate
비장세포 및 RAW 264.7 세포의 증식률은 WST-1 분석법으로 측정하였다. 비장세포 및 RAW 264.7 세포를 5×105 세포/웰의 농도로 조정하여 96웰 플레이트에 분주 후 시료와 대조군을 처리하여 48시간 배양하였다. WST-1 키트 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 1시간 동안 배양하여 ELISA 판독기(Thermo, Germany)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식 3으로 나타내었다.The proliferation rate of splenocytes and RAW 264.7 cells was determined by WST-1 assay. The splenocytes and RAW 264.7 cells were adjusted to a concentration of 5 × 10 5 cells / well and dispensed in a 96-well plate, followed by treatment with a sample and a control group and culturing for 48 hours. 100 ㎕ of WST-1 kit solution was added and incubated for 1 hour. Absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader (Thermo, Germany).
[식 3][Formula 3]
여기에서, N(%)는 세포증식 비, Cp는 사균처리 후 흡광도, Cs는 무처리 후의 흡광도를 나타낸다.Here, N (%) is the cell proliferation ratio, C p is the absorbance after the fungus treatment, and C s is the absorbance after the untreated treatment.
2-4-8. 통계처리 2-4-8. Statistical processing
이상의 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 21 매뉴얼(Statistical Package for Social Sciences, IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석 테스트(one way ANOVA test)로 분석하였으며, 시료 간의 유의성은 스튜던트 투 테일드 T테스트로 P<0.05 수준에서 비교하였다.The results were analyzed by one way ANOVA test using the SPSS 21 manual (Statistical Package for Social Sciences, IBM, Armonk, NY, USA) T test at the P < 0.05 level.
2-5. 유산균 항 비만효과 분석2-5. Analysis of lactobacillus anti-obesity effect
지방전구세포 (3T3-L1 cell)에서 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하면서 구현예에 따라 제조된 유산균 사균 샘플을 농도별로 처리한 후, 지방 세포 내 지방축적 억제 효과 확인을 위해 오일 레드 오(Oil red O) 염색 및 세포내 중성지방 함량(TG kit)을 측정하여 세포내 지방 축적 정도를 확인하였다.In order to confirm the effect of inhibiting the accumulation of fat in the adipocyte, a sample of Lactobacillus koreanum prepared according to the embodiment was induced to differentiate into a mature fat cell in the lipocortical cell (3T3-L1 cell) O) staining and intracellular triglyceride content (TG kit).
2-5-1. 지방전구세포 성장저해 효과2-5-1. Inhibition effect of fat precursor cell growth
유산균의 항 비만효과를 분석하기 위하여 지방전구세포 3T3-L1(Mouse Embryonic Fibroblast-Adipose like cell line) 배양액에 유산균 사균체의 세포독성을 분석하기 위하여 MTT 분석법(Methylthiazolinyldiphenyl tetrazolium bromide assay)을 실시하였다. MTT assay (Methylthiazolinyldiphenyl tetrazolium bromide assay) was performed to analyze the cytotoxicity of lactic acid bacteria in the culture medium of 3T3-L1 (mouse embryonic fibroblast-adipose like cell line) to analyze the anti-obesity effect of lactic acid bacteria.
3T3-L1 지방세포를 96-웰 플레이트 (96-웰 플레이트)에 4×104 세포/ml로 분주하여 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 DMEM 배지와 유산균 사균체 분말을 농도별로(0, 100, 250, 500 ㎍/ml) 24시간 동안 처리하였다. 이후 용매 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 5 ㎎/㎖로 용해한 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 용액을 각 웰 (well) 마다 120 ㎕씩 처리하여 4시간 동안 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 3T3-L1 adipocytes were plated at 4 × 10 4 cells / ml in 96-well plates (96-well plate) and cultured in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator for 24 hours. After the culture, the culture medium was removed and DMEM medium and lactic acid bacteria powder were treated for 24 hours at concentrations of 0, 100, 250 and 500 ㎍ / ml. Then, a solution of MTT (3- [4,5-dimethyl-thiazole] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) dissolved in 5 mg / ml of DBS in a solvent DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, And incubated for 4 hours in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
배양 이후 배양액을 제거한 뒤 각 웰마다 디메틸설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide)를 200 ㎕/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 섞어주었다. 그 후 ELISA reader로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. After the culture, the culture solution was removed, and dimethyl sulfoxide (DMSO) was added to each well at a rate of 200 μl / well and mixed well using a pipette. The absorbance was then measured at 570 nm with an ELISA reader.
2-5-2. 지방세포 지질축적 저해활성 측정 (Oil Red O staining analysis)2-5-2. Measurement of adipocyte lipid accumulation inhibitory activity (Oil Red O staining analysis)
3T3-L1 지방세포를 6-웰 플레이트(6-웰 플레이트)에 7×104 세포/ml 밀도로 분주하고 8일 동안 지방세포를 분화시키면서 동시에 유산균 사균 분말을 농도별로(100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였다. 8일 후 세포의 배양액을 버리고 인산완충식염수(PBS; phosphate buffered saline)로 씻어주었다. 이후 각 웰에 10% 포름알데하이드(formaldehyde)를 500 ㎕씩 각 웰에 넣고 4℃ 에서 1 시간 동안 고정 시키고, 포름알데하이드를 제거한 후에 인산완충식염수로 3 번 씻어낸 후 CO2 인큐베이터에서 건조하였다. 3T3-L1 adipocytes were fed to a 6-well plate (6-well plate) at a density of 7 × 10 4 cells / ml and differentiated into adipocytes for 8 days, / ml). After 8 days, the cell culture was discarded and washed with phosphate buffered saline (PBS). Then, 500 μl of 10% formaldehyde was added to each well, fixed at 4 ° C for 1 hour, washed with phosphate-buffered saline three times, and dried in a CO 2 incubator after removal of formaldehyde.
이후 플레이트(plate)가 다 마르면 오일 레드 오 염색약을 500 ㎕씩 넣고 상온에서 어두운 상태로 30분간 염색한 후 인산완충식염수로 3번 씻어내었다. 염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하였으며, 관찰 후 웰당 300 ㎕의 이소-프로판올로 지방세포 내 염색된 염색약을 추출하여 ELISA 리더기로 500 ㎚에서 광학밀도값(OD값; optical density)을 측정하였다. After the plates were dried, 500 μl of Oil Red Dye was added, and the mixture was stained for 30 minutes at room temperature in a dark state, and washed three times with phosphate-buffered saline. The stained cells were observed under a microscope. After observation, the stained dye in the adipocyte was extracted with 300 μl of iso-propanol per well and the optical density value (OD value) was measured at 500 nm with an ELISA reader.
오일 레드 오 염색약은 오일 레드 오 염색약 500 mg을 이소-프로판올(iso-propanol) 100 ml에 녹인 용액을 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.45 ㎛ 필터(filter)로 여과한 후 사용하였다.The oil red dyes were obtained by mixing 500 mg of Oil Red dyestuff with 100 ml of iso-propanol in distilled water at a ratio of 6: 4 and filtering with 0.45 ㎛ filter.
2-5-3. 지방세포 내 중성지방(Tri-glycerides) 함량 분석 2-5-3. Analysis of triglyceride contents in adipocytes
3T3-L1 지방세포를 6-웰 플레이트(6-웰 플레이트)에 7×104 세포/ml 밀도로 분주하고 8일 동안 지방세포를 분화시키면서 동시에, 유산균 사균분말을 농도별로(100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였다. To 7 × 10 4 cells / ml density and a frequency divider, while differentiation of fat cells for 8 days at the same time, the lactic acid bacteria powder, dead cells at different concentrations (100, 250, 500 3T3-L1 (6-well plate), the fat cells 6-well plates Mu] g / ml).
8일 후 각 웰을 인산완충식염수로 세척한 후 스크라퍼(cell scraper, SPL)를 이용하여 세포를 모은 후 초음파 분쇄기(SONIFIER 450, BRANSON)를 이용하여 세포 내 중성지방을 추출하여 트리글리세리드 키트(TG-S, 아산제약)를 이용하여 중성지방의 함량을 측정하였다.After 8 days, each well was washed with phosphate-buffered saline, cells were collected using a cell scraper (SPL), and the intracellular triglyceride was extracted using an ultrasonic pulverizer (SONIFIER 450, BRANSON) -S, ASAN PHARMACEUTICAL Co., Ltd.) was used to measure the content of triglycerides.
실시예 1. 유산균 생균의 배양 및 농축Example 1 Culture and Concentration of Lactic Acid Bacteria
1-1. 유산균 생균의 보관1-1. Storage of lactic acid bacteria
본원의 실시예에서 사용할 유산균은 먼저 37℃ 에서 MRS (Difco. USA) 고형배지를 이용하여 48 시간 동안 혐기적 조건에서 배양하였다. 48 시간 후, 배지에 나타난 유산균 군집은 무균밴치에서 수확되어 인산염완충용액(Phosphate buffered saline; PBS, pH 6.8)을 이용하여 3번 세척한 후, 적절한 동결보호제(25% 글리세린 + 10% 탈지분유)를 첨가 현탁하여 -70℃ 초저온냉동고에서 동결하기에 앞서 크리오-바이알(Cryo-vial, 1.2ml, Simport, Canada)에 0.2ml씩 분주하였다. The lactic acid bacteria used in the examples of the present application were first cultured at 37 ° C. for 48 hours under anaerobic conditions using MRS (Difco, USA) solid medium. After 48 hours, the lactic acid bacteria collected on the medium were harvested in sterile vats and washed 3 times with phosphate buffered saline (PBS, pH 6.8), followed by addition of appropriate cryoprotectant (25% glycerin + 10% (0.2 ml) was dispensed into a cryo-vial (1.2 ml, Simport, Canada) prior to freezing in a -70 ° C cryogenic freezer.
상기 동결된 바이알(Defreezed vial, DF vial)들은 최대 6개월 동안 보관하면서, 필요할 때 마다 꺼내 녹여서 사용하였다. 모든 실험은 오염을 최소한으로 줄이기 위하여 무균상태에서 진행하였다.The defreezed vials (DF vials) were stored for a maximum of 6 months, taken out and melted as needed. All experiments were conducted in aseptic conditions to minimize contamination.
1-2. 유산균 생균의 1-2. Lactobacillus 종배양Seed culture
초저온 냉동고에서 상기 바이알을 꺼내 녹인 후에 유산균 생균의 종배양을 실시하였다. The vial was taken out from a cryogenic freezer and dissolved, followed by seed culture of lactic acid germ.
1차적으로, DF-바이알(0.2ml)들을 살균된 15ml MRS(Difco, USA) 액체배지(18f, 실험관) 에 접종하였으며, 37℃에서 12시간 동안 배양기[JSBI-150C, JSR Korea]에서 비호기적으로 배양하였다. First, DF-vials (0.2 ml) were inoculated into sterile 15 ml MRS (Difco, USA) liquid medium (18f, laboratory) and incubated at 37 ° C for 12 hours in an incubator [JSBI-150C, JSR Korea] .
2차적으로, 12시간 동안 배양된 15ml 유산균액을 다시 1.0L 종배양 배지 LTMS-PR-SM (2.0L 삼각플라스크, 4개)로 접종하였으며, 37˚C에서 10시간 동안 비호기적인 조건으로 배양기[JSRB-150C, JSR Korea]에서 정체배양 하였다. Secondly, 15 ml of the lactic acid bacteria cultured for 12 hours was inoculated again with 1.0 L seed culture medium LTMS-PR-SM (2.0 L Erlenmeyer flask, 4) and incubated at 37 ° C for 10 hours in an aseptic condition [JSRB-150C, JSR Korea].
이때 사용된 종 배양 배지 LTMS-PR-SM 조성(%,w/v)은 아래와 같다: 2.0~10.0 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 5.0 카제인효소분해물, 0.1 ~ 5.0 효모추출물, 0.01 ~ 3.0 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0 황산마그네슘, 0.01 ~ 1.0% 염화칼슘 , 0.01 ~ 0.1 황산망간, 0.01 ~ 5.0 초산나트륨 등이 포함하며, 살균전에 NaOH(10.0M)를 이용하여 pH6.8로 조정되었다. The composition (%, w / v) of the seed medium LTMS-PR-SM used at this time is as follows: 2.0-10.0 hydrolyzed glucose, 0.1-5.0 soybean protein hydrolyzate, 0.1-5.0 casein hydrolyzate, 0.1-5.0 yeast extract , 0.01 to 3.0 divalent potassium phosphate, 0.1 to 5.0 magnesium sulfate, 0.01 to 1.0% calcium chloride, 0.01 to 0.1 manganese sulfate, 0.01 to 5.0 sodium acetate and the like. Respectively.
1-3. 유산균 생균의 중간배양1-3. Medium culture of lactic acid bacteria live cells
상기 종 배양에서 배양된 1.5L 종배양액을 80L 중간배양 배지 LTMS-PR-MM (100L발효기, 코바이오택)에 접종하기 위해 사용하였다. 이러한, 중간배양은 32℃에서 약간의 교반과 함께 12시간 동안 실시하였으며, 배양액의 pH를 pH 5.0내지 pH 7.0로 조정하기 위해 필요할 때마다 암모니아가스를 주기적으로 첨가하였다.The 1.5 L seed culture cultivated in the seed culture was used to inoculate the 80 L intermediate culture medium LTMS-PR-MM (100 L fermenter, Kobioctak). This intermediate culture was carried out for 12 hours with slight agitation at 32 DEG C and ammonia gas was added periodically whenever necessary to adjust the pH of the culture medium from pH 5.0 to pH 7.0.
이 때 사용된 상기 중간배양 배지의 조성(%,w/v)은 아래와 같다: 2.0 ~ 10.0 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 3.0 L-시스테인, 0.1 ~ 5.0 효모추출물, 0.01 ~ 3.0 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0 황산마그네슘, 0.01 ~ 0.1 황산망간, 0.01 ~ 5.0구연산포타슘, 0.01 ~ 2.0 염화칼슘, 0.01 ~ 5.0 트윈-80 을 포함하며, 살균전에 NaOH(10.0M)를 이용하여 pH6.8로 조정되었다.The composition (%, w / v) of the intermediate culture medium used in this case is as follows: 2.0-10.0 hydrolyzed glucose, 0.1-5.0 soybean protein hydrolyzate, 0.1-3.0 L-cysteine, 0.1-5.0 yeast extract, 0.01 , Sodium hydroxide (10.0M) prior to sterilization, sodium hydroxide (0.01M), sodium hydroxide (0.01M), potassium hydroxide (0.01M NaCl) and adjusted to pH 6.8.
1-4. 유산균 생균의 제 1 막 필터를 이용한 배양 및 농축1-4. Cultivation and concentration of lactic acid bacteria using first membrane filter
본원의 농축방법에서 사용되는 생물반응기는 제 1 막 필터(0.5㎛ 직경의 포어 사이즈 및 6mm 채널반경을 가지는 중공사막 필터, Al-Al 세라믹 중공사막 필터) 와 배양기를 포함하는 것으로서, 상기 막 필터가 배양기의 외부에 위치하며, 배양액은 배양기에 먼저 접종된 후에 강제무균순환펌프(Q=9.0 m3/h, Hmax=41 m, 5.0 bar, 120℃)에 의하여 상기 막 필터와 상기 배양기를 순환하게 된다.The bioreactor used in the concentrating method of the present invention includes a first membrane filter (hollow-sieve filter having a pore size of 0.5 mu m diameter and a 6 mm channel radius, Al-Al ceramic hollow fiber membrane filter) and an incubator, The culture solution was circulated through the membrane filter and the incubator by a forced aseptic circulation pump (Q = 9.0 m 3 / h, H max = 41 m, 5.0 bar, 120 ° C) .
먼저, 상기 종배양 및 중간배양을 거쳐서 배양된 유산균 생균이 접종된 배지 20L를 배양기에 접종시켰다. 이후, 상기 유산균 생균이 포함된 배지를 강제무균순환펌프를 이용하여 상기 제 1 막 필터에 통과시킴으로써 농축 및 여과하면서 배양하였다.First, the culture medium was inoculated with 20 L of the culture medium inoculated with the cultured lactic acid bacterium via the seed culture and the intermediate culture. Thereafter, the culture medium containing the lactic acid germ cells was passed through the first membrane filter using a forced aseptic circulation pump, followed by concentration and filtration.
상기의 농축 및 여과 과정을 통하여, 중간배양 배지를 여과함과 동시에, 새로운 배지를 배양기에 첨가하였다. 상기 새로이 접종된 배지의 조성(%,w/v)은 다음과 같다: 2.0 ~ 10.0 함수결정포도당, 0.1 ~ 5.0 대두단백효소분해물, 0.1 ~ 5.0 효모추출물, 0.01 ~ 3.0 제2인산칼륨, 0.1 ~ 5.0 황산마그네슘, 0.01 ~ 0.1 황산망간, 0.01 ~ 2.0염화칼슘. 상기 새로이 접종된 배지는 배양기로 첨가되기 전에 배지필터(0.2㎛ 직경의 포어 사이즈 및 6mm 채널반경을 가지는 Al-Al 세라믹 중공사막 필터)를 통해 미리 살균하였다.Through the above-described concentration and filtration, the intermediate culture medium was filtered, and the new medium was added to the incubator. The composition (%, w / v) of the freshly inoculated medium is as follows: 2.0-10.0 hydrolyzed glucose, 0.1-5.0 soybean protein hydrolyzate, 0.1-5.0 yeast extract, 0.01-3.0 potassium phosphate, 5.0 Magnesium sulfate, 0.01 to 0.1 manganese sulfate, 0.01 to 2.0 calcium chloride. The freshly inoculated medium was pre-sterilized through a media filter (Al-Al ceramic hollow fiber filter with a pore size of 0.2 탆 diameter and a 6 mm channel radius) before being added to the incubator.
상기 중간배양 배지를 새로이 첨가한 배지로 전량 교체한 후에, 배양기를 18℃ 이하로 냉각하였으며, 상기 제1막 필터를 따라 흐르는 배양액의 흐름을 최소한으로 유지하였다. 상기 유산균 생균의 배양 및 농축을 시작하기 전까지 5시간 동안 배지의 pH 를 5.0내지 6.8(1:1=20%,w/v 암모니아수:증류수)으로 유지하였다.After the whole medium was replaced with freshly added medium, the incubator was cooled to 18 캜 or lower, and the flow of the culture fluid flowing along the first membrane filter was kept to a minimum. The pH of the culture medium was maintained at 5.0 to 6.8 (1: 1 = 20%, w / v ammonia water: distilled water) for 5 hours until the culture and concentration of the lactic acid bacteria viable.
이 후, 상기 유산균 생균의 배양 및 농축을 시작하기 전 생물반응기의 온도를 32℃ 로 높여, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 포함하는 배양액을 제 1 막 필터에 통과시키면서, 상기 유산균 생균을 배양 및 농축하는 실질적인 배양을 개시하였다. 이 때, 제 1 막 필터를 통과하면서 배양액의 부피가 일정한 속도로 감소하게 되는데, 상기 새로이 접종된 배지를 펌프(YZ15, Leadfluid, China, Max=20.0L/h)를 이용하여 배양기에 무균적으로 계속하여 공급하였다.Thereafter, the temperature of the bioreactor is raised to 32 캜 before starting the cultivation and concentration of the lactic acid germ viable bacteria, and the culture solution containing the medium inoculated with the lactic acid germ viable bacteria is passed through the first membrane filter, ≪ / RTI > At this time, the volume of the culture liquid decreases at a constant rate as it passes through the first membrane filter. The freshly inoculated medium is sterilized by a pump (YZ15, Leadfluid, China, Max = 20.0 L / h) Followed by feeding.
그리고, 상기 제 1 막 필터를 따라 순환하는 배지의 흐름속도는 상기 강제무균순환펌프를 이용하여 50.0 L/h 내지 300.0 L/h로 조절하였으며, 생물반응기 내부를 암모니아수 (1:1=20%, w/v 암모니아수: 증류수)를 이용하여 pH 5.0 내지 pH 7.0상태로 유지하였으며, 비호기적인 상태를 유지하기 위하여 질소가스를 이용하여 발효기의 내압을 0.1 ~ 0.5 kg/cm2상태로 유지하였다.The flow rate of the culture medium circulating along the first membrane filter was adjusted to 50.0 L / h to 300.0 L / h using the forced aseptic circulation pump. Ammonia water (1: 1 = 20% w / v ammonia water: distilled water). The internal pressure of the fermenter was maintained at 0.1 to 0.5 kg / cm 2 using nitrogen gas to maintain the aseptic state.
실시예 2. 유산균 생균의 사균화Example 2: Strains of lactobacillus < RTI ID = 0.0 >
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1 에서 수득한 유산균 생균의 사균화에 앞서 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 분산제를 첨가하지 않은 그룹 1 과 분산제로서 0.1 내지 80.0 중량% 의 말토덱스트린 및 0.1 내지 80.0 중량% 의 트레할로스를 각각 첨가한 그룹 2 및 그룹 3 을 제조하였다.In one embodiment of the present invention, prior to saccharification of the lactic acid germ viable cells obtained in Example 1, the medium inoculated with the lactic acid germs inoculated is divided into
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1 에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 121℃ 에서 3초간 3회 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-1).In one embodiment of the present invention, lactic acid bacteria obtained in Example 1 were circulated for 3 seconds at 121 DEG C for 3 seconds using an ultrahigh-temperature continuous sterilizer to prepare lactic acid bacteria dead bacteria (Example 2-1).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1 에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 110℃ 에서 5분간 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-2, 도 5b).In one embodiment of the present invention, lactic acid bacteria obtained in Example 1 were circulated at 110 DEG C for 5 minutes using an ultra-high temperature continuous sterilizer to produce lactic acid bacteria (Example 2-2, FIG. 5B).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1 에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 65℃, 85℃ 및 120℃ 에서 3분간 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-3, 도 7).In one embodiment of the present invention, lactic acid bacteria obtained in Example 1 were circulated for 3 minutes at 65 DEG C, 85 DEG C, and 120 DEG C using an ultra-high temperature continuous sterilizer to produce lactic acid bacteria dead cells (Examples 2-3, 7).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1 에서 수득한 유산균 생균을 80℃ 에서 각각 0분, 30분, 60분, 90분, 120분 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-4, 도 9).In one embodiment of the present invention, the lactic acid germs obtained in Example 1 were circulated at 80 ° C for 0 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 90 minutes, and 120 minutes, respectively, to produce lactic acid bacteria. , Fig. 9).
실시예Example 3. 유산균 3. Lactic acid bacteria 사균의Dead bacteria 제 2 막Second membrane 필터를 이용한 농축, 세척 및 분산 Concentration, washing and dispersion using filters
상기 실시예 2-1 에서 수득한 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터(0.01㎛ 내지 0.1㎛ 직경의 포어 사이즈 및 3 mm 채널반경을 가지며, 50,000 달톤 내지 500,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과하여 배출할 수 있는, 폴리술폰 중공사막 필터)에 통과시켜 유산균 사균을 2 내지 10 배로 농축하였다. 상기 제 2 막 필터를 사용하면서, 실시예 2 의 사균화 과정에서 뭉친 유산균 배양액에 전단력을 가하여 유산균 사균을 분산시켰다. The culture medium containing the lactic acid bacteria obtained in Example 2-1 was filtered through a second membrane filter (having a pore size of 0.01 mu m to 0.1 mu m in diameter and a channel radius of 3 mm and having a molecular weight of 50,000 daltons to 500,000 daltons And passed through a polysulfone hollow fiber membrane filter capable of discharging it, to concentrate the dead bacteria of the lactic acid bacteria 2 to 10 times. While using the second membrane filter, a shearing force was applied to the cultured liquid of the lactic acid bacteria, which was collected in the desizing step of Example 2, to disperse the dead bacteria of the lactic acid bacteria.
추가적으로, 상기 제 2 막 필터에 의한 유산균 분산의 효과를 극대화하기 위하여, 분산제를 배지에 첨가하여 실시하였으며, 모든 결과를 하기의 표 2 및 도 8, 도 9 에 나타내었다.In addition, in order to maximize the effect of the lactic acid bacteria dispersion by the second membrane filter, a dispersant was added to the culture medium, and all results are shown in Table 2, FIG. 8, and FIG.
도 8 에 나타낸 바와 같이, 유산균 사균을 제 2 막 필터를 이용하여 농축, 세척 할 경우, 열처리 단계에서 뭉쳐진 유산균 사균이 분산 및 농축되어 회수됨을 알 수 있었다. 나아가, 상기 제2 막 필터를 이용하는 경우에도, 제 1 막 필터에서와 같이 불순물들이 배양액으로부터 여과 및 제거되는 것은 통상의 기술자에게 자명한 사실이다. As shown in Fig. 8, when the bacteria of the lactic acid bacteria are concentrated and washed using the second membrane filter, It was found that the accumulated strains of lactic acid bacteria were dispersed and concentrated and recovered in the heat treatment step. Further, even when the second membrane filter is used, it is a matter of course to those skilled in the art that the impurities are filtered and removed from the culture liquid as in the first membrane filter.
전술한 바와 같이, 유산균은 사균화 과정에서 여러 마리가 뭉쳐서 유산균 사균 덩어리를 형성하게 된다. 본 실시예에서 유산균의 사균화 직후 형성된 유산균 사균 덩어리의 크기는 20㎛ 내지 200 ㎛ 으로 측정되었다(도 9). 상기 사균화된 직후의 유산균 사균 또는 유산균 사균 덩어리를 상기 제 2 막 필터를 통과시킴으로써, 뭉친 유산균 사균 덩어리를 분산시켰다. 이렇게 분산된 유산균 사균의 크기는 0.5 ㎛ 내지 3.0 ㎛ 이하로 측정되었다(도 9).As described above, lactic acid bacteria are clustered in the process of saccharification to form aggregates of lactic acid bacteria dead cells. In the present example, the size of the mass of dead bacteria of the lactic acid bacteria formed immediately after the quenching of the lactic acid bacteria was 20 占 퐉 To 200 mu m (Fig. 9). The mass of dead bacteria of the lactic acid bacteria or the dead bacteria of the lactic acid bacteria immediately after the quenching was passed through the second membrane filter to disperse the agglomerated mass of the dead bacteria of the lactic acid bacteria. The size of the dispersed lactic acid bacteria dead cells was measured to be 0.5 탆 to 3.0 탆 or less (Fig. 9).
실시예Example 4. 유산균 4. Lactic acid bacteria 사균의Dead bacteria 세척, 건조 및 Washing, drying and 분말화Powdered
상기 실시예 3 에 따른 유산균 사균의 농축 후에, 세척액으로서 살균된 증류수를 배양기에 첨가하였고, 제 2 막 필터에 통과시킴으로써 상기 유산균 사균액을 세척하였다.After the concentration of the dead bacteria of the lactic acid bacteria according to the above Example 3, distilled water sterilized as a washing solution was added to the incubator, and the lactic acid bacterial strain was washed by passing it through the second membrane filter.
살균된 증류수를 농축된 유산균 사균이 포함된 배지의 2배 부피로 첨가한 후에, 다시 제 2 막 필터를 통과시키면서 희석된 배지를 희석전의 부피로 농축하는 과정을 3회 반복하였다. 그 결과, 상기 농축된 사균이 포함된 배지의 총 6배 부피의 살균된 증류수로 농축된 사균을 세척하는 효과를 나타내었다. The sterilized distilled water was added twice as much as the culture medium containing the concentrated Mycobacterium tuberculosis bacteria, and then the diluted culture medium was again passed through the second membrane filter to concentrate the diluted medium to a volume before dilution. As a result, it showed the effect of washing germs concentrated with sterilized distilled water of a total volume of 6 times the volume of the medium containing the concentrated dead cells.
상기의 방법으로 세척된 유산균 사균을 동결건조기에서 총 96시간 동안 건조시켜 분말화하였다.The killed bacteria of the lactic acid bacteria washed by the above method were dried in a freeze dryer for a total of 96 hours to be powdered.
위와 같이 세척, 건조 및 분말화된 유산균 사균의 크기 분포를 측정하여 도 9 에 나타내었다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 분말화된 사균의 크기가 0.5 ㎛ 내지 3.0㎛ 의 크기 분포를 나타내었고, 나아가 상기 분말화된 사균의 60% 내지 100% 의 크기가 1.0 ㎛ 이하로 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는, 상기 열처리 과정에서 40 ~ 200 ㎛까지 증가하였던 유산균이 제 2 막 필터에 의하여 배양액에 가해진 전단력으로 분산 되었기 때문이다.The size distribution of washed, dried and powdered lactic acid bacteria dead cells was measured and shown in FIG. As shown in FIG. 9, it was found that the size of the powdered dead cells showed a size distribution of 0.5 μm to 3.0 μm, and further, the size of 60% to 100% of the powdered dead cells appeared to be 1.0 μm or less . This is because the lactic acid bacteria which had increased to 40 ~ 200 쨉 m in the heat treatment process were dispersed by the shearing force applied to the culture liquid by the second membrane filter.
비교예 1. 회분식 배양을 이용한 유산균 사균의 제조Comparative Example 1. Preparation of lactic acid bacteria dead cells using batch culture
유산균의 회분식 배양은 100L 발효조(코바이오택)에서 배양액의 총량 80L로 실시 하였다. 먼저, 상기 발효조에 상기 종배양 거쳐서 배양된 유산균 생균을 포함하는 배양액 4.0L(5.0%,v/v)를 100L 발효조에 접종하였다. Batch cultivation of lactic acid bacteria was carried out in a total volume of 80 L in a 100 L fermenter (Kobioctak). First, 4.0 L (5.0%, v / v) of the culture liquid containing the lactic acid germ cells cultured through the seed culture was inoculated into the fermentation tank into the 100 L fermenter.
회분식 배양기에서 배양 중에 교반속도는 30rpm, 온도는 32℃를 유지하였다. 또한, 질소가스를 이용하여 비호기적인 상태를 유지하였으며, 배양중에 pH는 암모니아 가스를 이용하면서 pH 5.0 내지 pH 7.0으로 유지하였다. 이러한 회분식 배양 동안 일정간격으로 상기 유산균의 생균을 샘플링하여 특성을 분석하였다.During the culture in the batch incubator, the stirring speed was 30 rpm and the temperature was maintained at 32 캜. In addition, nitrogen gas was used to maintain the ash state. During the culture, the pH was maintained at pH 5.0 to pH 7.0 using ammonia gas. During the batch culture, the live bacteria of the lactic acid bacteria were sampled and analyzed at regular intervals.
이후에, 본원의 일 실시예에서, 상기 유산균의 생균을 110℃ 에서 5 분 동안 열처리 하여 사균화 하였다(비교예 1-1, 도 5). 도 5 에 나타낸 바와 같이, 종래의 회분식 배양을 이용하여 제조된 유산균 사균은, 본 발명에 따른 유산균 사균에 비하여 크기가 크고 덜 농축되었음을 알 수 있었다. Thereafter, in one embodiment of the present invention, the live bacteria of the above-mentioned lactic acid bacteria were heat-treated at 110 DEG C for 5 minutes and sacrificed (Comparative Example 1-1, Fig. 5). As shown in FIG. 5, the dead bacteria of the lactic acid bacteria produced using the conventional batch culture was larger and less concentrated than the dead bacteria of the present invention.
이후에, 본원의 일 실시예에서, 상기 유산균의 생균을 120℃ 에서 3 초 동안 3 번 순환처리 하여 사균화 하였다(비교예 1-2, 도 7). 도 7 에 나타낸 바와 같이, 종래의 회분식 배양을 이용하여 제조된 유산균 사균은, 본 발명에 따른 유산균 사균에 비하여 크기가 큰 것으로 관찰되었다.Thereafter, in one embodiment of the present invention, the live bacteria of the above-mentioned lactic acid bacteria were circulated for three times at 120 DEG C for 3 seconds to be sacrificed (Comparative Example 1-2, FIG. 7). As shown in Fig. 7, the dead bacteria of the lactic acid bacteria produced using the conventional batch culture method was observed to be larger than the bacteria of the lactic acid bacteria according to the present invention.
추가적으로, 실시예 4 와 동일한 방법으로 유산균 사균을 건조 및 분말화 하였다.In addition, the dead bacteria of the lactic acid bacteria was dried and pulverized in the same manner as in Example 4.
[실험예][Experimental Example]
실험예 1. 유산균 생균의 생산성 및 성장속도 평가Experimental Example 1. Evaluation of Productivity and Growth Rate of Lactic Acid Bacteria
실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 생산성 및 성장속도를 비교하여 아래의 표 1 에 나타내었다. 상기 유산균 생균의 생산성은 펠렛의 양으로 나타내었으며, 상기 유산균 생균의 성장속도(Specific growth rate, m)는 하기의 식 4 로 나타내었다.The productivity and growth rate of the lactic acid germ cells according to Example 1 and Comparative Example 1 are shown in Table 1 below. The productivity of the lactic acid bacterium was expressed by the amount of pellet, and the specific growth rate (m) of the lactic acid bacterium was expressed by the following equation (4).
[식 4][Formula 4]
여기에서, LN은 로그함수식이며 t1은 특정 시간 t1에서의 유산균 생균의 농도, t2는 특정시간 t2에서의 유산균 생균의 농도를 나타내며, t는 경과된 시간을 나타내는 것이다. Here, LN is the logarithmic function formula, t 1 is the concentration of the lactic acid bacteria at the specific time t 1 , t 2 is the concentration of the lactic acid bacteria at the specific time t 2 , and t is the elapsed time.
[표 1][Table 1]
여기서 피딩속도(feeding rate, h-1)는, 실시예 1 에서 상기 중간배양 이후 상기 제 1 막 필터에 의한 유산균 생균의 배양 및 농축 전에, 상기 새로이 접종된 배지가 배양기에 공급되는 속도를 의미하며, 아래의 식 5에 따라 분석되었다. Here, feeding rate (h -1 ) means a rate at which the freshly inoculated medium is fed to the incubator before culturing and concentration of the lactic acid bacteria live bacteria by the first membrane filter after the intermediate culture in Example 1 , And analyzed according to
[식 5][Formula 5]
여기에서, Qh는 1시간에 소비되는 배지의 양(L)였으며, V는 생물반응기의 전체부피(L)이다.Where Q h is the amount of medium consumed in one hour (L), and V is the total volume (L) of the bioreactor.
상기 표 1 에서 살펴본 바와 같이, 비교예 1 에 따른 유산균 생균은 펠렛 양이 각각 18.3g/L(LM1001) 및 15.2g/L(LM1004) 인데 반하여, 실시예 1 에 따른 유산균 생균은 펠렛의 양이 각각 205.8g/L(LM1001) 및 170.0g/L(LM1004) 으로 뛰어난 생산성을 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 1, the amount of pellets of the lactic acid bacterium according to Comparative Example 1 was 18.3 g / L (LM1001) and 15.2 g / L (LM1004), respectively, (LM1001) and 170.0 g / L (LM1004), respectively.
또한, 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 배양액은 젖산의 농도가 각각 478.1mM(LM1001) 및 534.1mM(LM1004) 인데 반하여, 실시예 1 에 따른 유산균 생균의 배양액은 젖산의 농도가 각각 324.3mM(LM1001) 및 369.2mM(LM1004) 을 나타내었다. The culture broth of the lactic acid bacterium according to Comparative Example 1 had a lactic acid concentration of 478.1 mM (LM1001) and 534.1 mM (LM1004), respectively, whereas the culture solution of the lactic acid bacterium according to Example 1 had a lactic acid concentration of 324.3 mM ) And 369.2 mM (LM1004).
이를 통하여, 실시예 1 에 따른 제조방법에 의할 경우, 젖산 등의 불순물이 제 1 막 필터를 통하여 계속 여과 및 제거되어 배양 동안 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 이에 따라, 상기 불순물이 일정농도로 유지됨으로써 비교예 1에 비하여 유산균의 최종 생산양을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다. As a result, it was found that impurities such as lactic acid were continuously filtered and removed through the first membrane filter and kept constant during the culture in the manufacturing method according to Example 1. Thus, it was found that the impurities were maintained at a constant concentration, thereby increasing the amount of the final production of the lactic acid bacteria as compared with Comparative Example 1.
실험예 2. 유산균 생균의 크기 조절 평가Experimental Example 2. Evaluation of Size Control of Lactic Acid Gonococci
실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균을 회수하여 건조 분말화시킨 후에, 분말에 존재하는 유산균 생균을 주사형전자현미경(Scanning ElectroMicroscope, SEM, X10,000)로 찍은 사진을 도 4 에 나타내었으며, 광학현미경(X1,000) 으로 찍은 사진을 도 5 에 나타내었다.FIG. 4 shows a photograph of the lactic acid germ cells present in the powder after the recovery of the lactic acid germs according to Example 1 and Comparative Example 1 by drying and pulverization and scanning with a scanning electron microscope (SEM, X10,000) , And a photograph taken with an optical microscope (X1, 000) are shown in Fig.
그리고, 상기 실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 크기 분포를 측정하여 도 6 에 나타내었다.The size distribution of the lactic acid germ cells according to Example 1 and Comparative Example 1 was measured and shown in FIG.
도 4 및 도 5 에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 에 따른 유산균 생균은 비교예 1 에 비하여, 유산균 생균의 크기가 작을 뿐만 아니라, 더욱 농축되어 있음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 4 and FIG. 5, it was found that the lactic acid germ viable bacteria according to Example 1 were not only small in size but also more concentrated than those in Comparative Example 1.
나아가, 도 6에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 크기는 최대 6.3㎛ 의 크기를 갖는 분포를 보인 반면에, 실시예 1 에 따른 유산균 생균의 크기는 최대 4.0㎛ 의 더 작은 크기의 분포를 나타내었다. 또한, 실시예 1 에 따른 유산균 생균을 열처리 사균화 하게 되면 그 크기가 3.0 ㎛까지 감소하였으며, 이는 비교예 1 의 4.0 ㎛ 보다 현저히 작은 수치임을 나타내는 것이다.Further, as shown in Fig. 6, the size of the lactic acid germs according to Comparative Example 1 was 6.3 mu m maximum, while the size of the lactic acid germs according to Example 1 was smaller than 4.0 mu m Respectively. In addition, when the lactic acid germ cells according to Example 1 were heat-treated and homogenized, the size decreased to 3.0 μm, which is significantly smaller than 4.0 μm in Comparative Example 1.
실험예 3. 유산균 사균의 크기 조절 평가Experimental Example 3. Evaluation of Size Control of Lactic Acid Bacteria
상기 실시예 2-1 에 따른 유산균 사균의 회수 과정에서, 실시예 3 에 따른 제 2 막 필터를 이용한 특성 및 비교예로서 원심분리를 이용한 특성을 비교하여 아래의 표 2 에 나타내었다.The characteristics using the second membrane filter according to Example 3 and the characteristics using centrifugation as a comparative example are shown in Table 2 below in the process of recovering bacteria from the lactic acid bacteria according to Example 2-1.
[표 2][Table 2]
상기 표 2 에서 나타낸 바와 같이, 실시예 3 에 의할 경우, 누적수율이 115.2%(그룹 1), 148.5%(그룹 2) 그리고 168.7%(그룹 3)까지 증가함을 알 수 있었다. 그러나, 비교예에 의한 원심분리로 유산균 사균을 회수할 경우, 균의 뭉침현상이 더욱 심해져서, 누적수율이 26.4%로 급격히 감소함을 알 수 있었다. As shown in Table 2, it was found that the cumulative yield was increased to 115.2% (Group 1), 148.5% (Group 2), and 168.7% (Group 3) in Example 3. However, when the dead bacteria of the lactic acid bacteria were recovered by centrifugation according to the comparative example, the accumulation of bacteria became more severe, and the cumulative yield was rapidly decreased to 26.4%.
실험예Experimental Example 4. 유산균 4. Lactic acid bacteria 사균의Dead bacteria 현탁성Suspension 평가 evaluation
실시예 4 및 비교예 1-1 에 따른 유산균 사균 원말의 수용 현탁상태 안정성을 관찰하기 위하여 본 실험을 진행하였다. The present experiment was carried out to observe the stability of the host suspension of lactic acid bacteria according to Example 4 and Comparative Example 1-1.
실험은 Lactobacillus plantarum (LM1001) 유산균을 이용하여 실시예 4 및 비교예 1-1 에 따른 유산균 사균 원말을 1.0E+12/g 원말로 제조하였다. 이후, 실시예 4 의 사균 유래 사균 원말은 1.0E+8/ml 농도 및 비교예 1-1의 사균 유래 사균 원말은 1.0E+7/ml의 농도로 멸균된 증류수에 현탁하여 실온에서 4일동안 침전 상태를 관찰하였다(도 11).Experiments were carried out on Lactobacillus plantarum (LM1001) lactic acid bacteria using 1.0E + 12 / g native horse according to Example 4 and Comparative Example 1-1. Thereafter, the dead organism-derived dead organism seeds of Example 4 were suspended in distilled water sterilized at a concentration of 1.0E + 8 / ml and the dead organism-derived dead organism seeds of Comparative Example 1-1 at a concentration of 1.0E + 7 / ml, And the precipitated state was observed (Fig. 11).
상기 본원의 농축방법을 이용하여 배양을 실시하여 제조된 유산균 사균 원말의 총균밀도는 5.2E+12/g 원말이었으며, 상기 회분식 배양을 통해 제조된 유산균 사균 원말의 총균밀도는 2.9E+12/g 원말이었다.The density of germ cells of the lactic acid bacteria prepared by the above enrichment method was 5.2E + 12 / g, and the density of germs of the lactic acid bacteria prepared through the batch culture was 2.9E + 12 / g was the original.
도 11 에 나타낸 바와 같이, 회분식 배양에 의할 경우 현탁 1시간 만에 현탁의 일부분이 침전되는 현상은 나타낸 반면에, 본원의 제조방법에 의할 경우 현탁 후 4일 동안에도 안정적으로 현탁상태를 유지하고 나타냄을 알 수 있다. As shown in Fig. 11, in the case of batch culture, a part of the suspension was precipitated within one hour of suspension, whereas in the case of the manufacturing method of the present invention, the suspension was stably maintained for 4 days after suspension And the like.
실험예Experimental Example 5. 유산균 생균의 면역활성 분석 5. Immunological activity analysis of lactic acid bacteria
본원의 농축방법을 이용하여 제조한 두 종의 L. plantarum 의 생균 및 사균 각각에 대하여 면역활성을 분석하였다.Immunoreactivity of two strains of L. plantarum prepared by the enrichment method of the present invention was analyzed for each of live cells and dead cells.
상기 유산균 생균의 면역활성은 다음과 같이 분석하였다: 유산균 생균이 포함된 사료를 마우스에 공급한 후에, 상기 마우스 혈액 내의 사이토카인(TNF-α, INF-γ, IL-12) 농도변화를 측정하는 in-vivo 테스트를 실시하여 도 12에 나타내었다.The immunoactivity of the lactic acid bacteria was assayed as follows: After feeding the feed containing the lactic acid bacteria live cells, changes in cytokine (TNF-α, INF-γ, IL-12) The in-vivo test was carried out and is shown in Fig.
구체적으로, 6주령 웅성 Balb/c 마우스에 유산균 생균 2종을 농도별 (10, 100 mg/kg)로 10일간 매일 1회 구강 투여하였다. 마지막 구강 투여 24 시간 후에 실험동물로부터 혈액시료를 확보 한 후 -80 ℃ 에 보관 후 실험에 사용하였다. 양성 대조군으로 Con A 25 mg/kg 으로 정맥투여 하였다.Specifically, two 6-week-old male Balb / c mice were orally administered with two kinds of lactobacillus live bacteria per concentration (10, 100 mg / kg) every day for 10 days. Blood samples were collected from the experimental animals 24 hours after the last oral administration and stored at -80 ° C before use in the experiment. Con A was intravenously administered at 25 mg / kg as a positive control.
도 12 에 나타낸 바와 같이, 10 일간 유산균을 처리 후 혈청 사이토카인의 양을 ELISA assay를 이용하여 측정하였다. 양성 Con A (25 mg/kg)에 비하여 사이토카인 TNF-α, IFN-γ, 및 IL-12 가 모두 유의적으로 증가하였다. As shown in Fig. 12, the amount of serum cytokine after the lactobacillus treatment for 10 days was measured by ELISA assay. TNF-α, IFN-γ, and IL-12 were significantly increased compared to the positive Con A (25 mg / kg).
실험예 6. 유산균 사균의 면역활성 분석Experimental Example 6. Analysis of Immunological Activity of Mycobacterium tuberculosis
본원의 농축방법을 이용하여 제조한 두 종의 L. plantarum 의 사균에 대하여 면역활성을 분석하였다.The immune activities of two species of L. plantarum prepared by the enrichment method of the present invention were analyzed.
상기 유산균 사균의 면역활성은 다음과 같이 분석하였다: RAW264.7 대식세포를 이용한 세포독성 실험과 NO-(Nitric oxide) 생성, 그리고 마우스 비장세포(splenocytes)에 의한 사이토카인((TNF-α, INF-γ, IL-12, IL-6) 생성을 측정하는 in-vitro 테스트를 실시하여 도 13에 나타내었다.The immunological activity of the lactic acid bacteria was analyzed as follows: RAW264.7 cytotoxicity experiment using macrophages, production of NO - (nitric oxide), and cytokine (TNF-α, INF -γ, IL-12, and IL-6) was performed and shown in FIG.
앞서 분석방법에서 기술한 절차에 따라 RAW264.7 대식세포를 이용하여 유산균 사균의 세포독성과 Nitric oxide 생산유도 기능이 탐색되었다. The cytotoxicity and inducibility of Nitric oxide production of lactic acid bacteria using RAW264.7 macrophages were investigated according to the procedure described in the previous method.
도13(A) 는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 유산균의 세포 처리 농도를 설정하기 위하여 유산균 시료를 48 시간 까지 처리 한 후 세포독성을 실험한 결과를 나타낸 것이며, 10 ㎍/ml의 농도 이하 에서 세포독성이 나타나지 않음을 나타내고 있다. 따라서 세포 독성이 나타나지 않는 농도 (0.1-10 ㎍/㎖ 이하)에서 유산균 시료의 면역 활성 효능을 측정하였다. 세포 독성은 유리된 락테이트 디하이드로게네이스(Lactate dehydrogenase) 의 활성도로 측정하였다.Fig. 13 (A) shows the results of an experiment of cytotoxicity after treating a lactic acid bacterium sample for 48 hours in order to set the cell treatment concentration of lactic acid bacteria in RAW 264.7 cells, which is a mouse macrophage cell line. Indicating no cytotoxicity. Therefore, the immunoactivity of lactic acid bacteria was measured at a concentration (0.1-10 ㎍ / ㎖ or less) at which no cytotoxicity was observed. Cytotoxicity was measured by the activity of the liberated lactate dehydrogenase.
도 13(B)는 유산균 사균분말 처리가 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에서 NO 생성능에 미치는 영향에 관하여 평가하기 위하여, 상기 RAW 264.7 세포에 유산균 시료를 0.1, 1, 10 ug/ml 농도로 48 시간까지 처리 한 후 배양배지로 유리된 NO의 활성을 그리즈 리에이전트 시스템(Griess reagent system) 방법을 사용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.Fig. 13 (B) is a graph showing the effect of Lactobacillusthus koreanum powder treatment on the NO production ability of mouse macrophage cell line Raw 264.7 cells. To the RAW 264.7 cells, lactobacillus samples were treated at 0.1, 1 and 10 ug / ml for 48 hours , And the activity of NO released in the culture medium was measured using a Griess reagent system.
도 13에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 LPS에 의해서 NO의 생성능이 6배 정도 증가 하였으며, 처리한 유산균 시료 모두에서 농도 의존적으로 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다.As shown in Fig. 13, the ability of NO to be increased by the positive control group LPS was increased about 6 times, and it was confirmed that the concentration of NO was significantly increased in all of the lactic acid bacteria treated.
도 14는 마우스 비장세포를 이용하여 사이토카인 생산에서 유산균 사균 분말의 효과를 나타낸 것이다. 도 14(A)는 전술된 유산균 사균 분말 0.1 ~ 10mg/ml 처리 농도 이하에서 비장세포 세포독성이 나타나지 않음을 나타내는 것이다. 그리고, 도 14(B), (C), (D) 및 (E)는 각각 유산균 사균 분말의 처리가 농도 유의적으로 사이토카인의 생산량을 높이고 있음을 나타내는 것이다.Fig. 14 shows the effect of microbial cells of lactic acid bacteria in the production of cytokines using mouse spleen cells. Fig. 14 (A) shows that splenocyte cytotoxicity does not appear at a concentration of 0.1 to 10 mg / ml of the above-mentioned lactic acid bacteria dead powder. 14 (B), 14 (C), 14 (D) and 14 (E) show that treatment of the lactic acid bacteria dead bacteria powder increases the production of cytokines with a significant concentration.
도 12 내지 도 14에서 나타낸 바와 같이, 두 종의 유산균 모두 생균과 사균에서 면역강화기능이 발견되었으며, 면역활성을 나타냄을 알 수 있었다. As shown in Figs. 12 to 14, both of the lactic acid bacteria of the two species were found to be immunopotentiating in both live bacteria and dead bacteria, indicating that they exhibited immunological activity.
실험예 7. 유산균 사균의 항 비만효과Experimental Example 7. Anti-obesity effect of strains of lactic acid bacteria
유산균 사균의 항 비만효과를 관찰하기 위하여, 지방세포 내 지방축적 억제 실험을 수행하였다. 구체적으로, 지방세포에 지방축적 유도물질인 25mg/ml con A 를 첨가한 후에, L. planatrum(LM1004)의 유산균 사균 분말을 농도별로 (0, 100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였으며, 감소된 지방축적 양을 측정하였다. 대조군으로서 상기 지방축적 유도물질을 처리하지 않은 군과, 상기 지방축적 유도물질을 처리한 후에 유산균 사균 분말을 처리하지 않은 군을 사용하였다.도15에 나타낸 바와 같이, 유산균 사균 분말의 처리농도(0, 100, 250, 500 ㎍/ml)에 따라, 지방세포에 축적된 지질의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 현미경으로 관찰할 수 있었다(도15A).In order to observe the anti - obesity effect of Lactobacillus koreanum, fat accumulation inhibition experiment was performed. Specifically, 25 mg / ml con A, a fat accumulation inducer, was added to the adipocytes, and the powder of L. planatrum (LM1004) lactic acid bacteria was treated at different concentrations (0, 100, 250, 500 ㎍ / ml) The amount of fat accumulation was measured. As a control group, the group in which the fat accumulation inducer was not treated and the group in which the fat accumulation inducing substance was treated and then the lactobacillus microorganism powder was not treated were used. As shown in FIG. 15, , 100, 250, 500 占 퐂 / ml), it was observed microscopically that the amount of lipid accumulated in adipocytes was decreased in a concentration-dependent manner (Fig. 15A).
특히 500 ㎍/ml 농도에서, 양성대조군(Con A)과 비교하였을 때 지방세포 내 지질이 약 46% 정도 감소하는 것을 오일레드 오 염색방법을 통하여 확인할 수 있었다(도15C). Especially, at the concentration of 500 / / ml, it was confirmed that the lipid in the adipocyte was reduced by about 46% when compared with the positive control (Con A) (Fig. 15C).
또한 처리농도(0, 250, 500 ㎍/ml)에 따라, 지방세포에 축적된 중성지방의 양이 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 500 ㎍/ml 농도에서, 양성대조군(Con A)과 비교하였을 때 지방세포 내 중성지방(TG)의 양이 약 81% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도15D).In addition, the amount of triglyceride accumulated in the adipocytes was decreased according to the treatment concentration (0, 250, 500 ㎍ / ml), especially when compared with the positive control (Con A) at 500 ㎍ / It was confirmed that the amount of triglyceride (TG) in fat cells was reduced by about 81% (FIG. 15D).
실험예 7 을 통하여, LM1004 는 지방 세포내에 지질축적을 억제하는 효과까지 나타냄을 알 수 있었다. Experimental Example 7 showed that LM1004 also exhibited lipid accumulation inhibition in adipocytes.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.It will be understood by those of ordinary skill in the art that the foregoing description of the embodiments is for illustrative purposes and that those skilled in the art can easily modify the invention without departing from the spirit or essential characteristics thereof. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be construed as being included within the scope of the present invention.
Claims (11)
유산균 생균을 준비하고;
상기 유산균 생균을 틴들 또는 열처리에 의해 사균화하고;
상기 유산균 사균화 과정에서 상기 유산균 사균이 뭉쳐서 형성된 유산균 사균 덩어리가 포함된 배지를 포함하는 유산균 배양액을 준비하고; 및
상기 유산균 배양액을 0.01 ㎛ 내지 0.1 ㎛의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터를 포함하는 막 필터에 통과시킴으로써 상기 유산균 사균 덩어리를 분산시키고,
상기 배지에 포함된, 유산균을 제외한 불순물이 상기 막 필터를 통하여 여과되는 것
을 포함하는, 유산균 사균의 농축방법.
As a method for concentrating microorganisms of lactic acid bacteria,
Preparing lactic acid bacteria live bacteria;
Homogenizing the lactic acid germ cells by tin or heat treatment;
Preparing a lactic acid bacterium culture liquid comprising a medium containing a mass of killed microbial bacteria formed by clustering of the microbial strains of the lactic acid bacteria in the step of homogenizing the lactic acid bacteria; And
The above-mentioned lactic acid bacteria culture solution is passed through a membrane filter including a hollow fiber membrane filter containing pores having a diameter of 0.01 mu m to 0.1 mu m to disperse the above-
Impurities other than lactic acid bacteria contained in the culture medium are filtered through the membrane filter
And a method of concentrating the pathogenic bacteria of lactic acid bacteria.
상기 배지에 포함된 유산균 사균이 불순물로부터 세척되는 것인,
유산균 사균의 농축방법.
The method according to claim 1,
Wherein the microorganism of the present invention is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
A method for concentrating lactic acid bacteria dead bacteria.
상기 막 필터는 50,000 달톤 내지 500,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과하는 중공사막필터를 포함하는 것인,
유산균 사균의 농축방법.
The method according to claim 1,
Wherein the membrane filter comprises a hollow fiber membrane filter for filtering a material having a molecular weight of 50,000 daltons to 500,000 daltons.
A method for concentrating lactic acid bacteria dead bacteria.
상기 유산균은 간균, 구균, 비피도균 및 이들의 조합에서 선택되는 것을 포함하는 것인,
유산균 사균의 농축방법.
The method according to claim 1,
Wherein the lactic acid bacterium comprises a bacterium, a bacterium, a non-bacteriophage, and a combination thereof.
A method for concentrating lactic acid bacteria dead bacteria.
상기 유산균은 Lactobacillus plantarum 을 포함하는 것인,
유산균 사균의 농축방법.
The method according to claim 1,
Wherein the lactic acid bacterium comprises Lactobacillus plantarum .
A method for concentrating lactic acid bacteria dead bacteria.
유산균 사균의 제조방법.
9. A method for concentrating a microorganism of the genus Escherichia coli according to any one of claims 1, 3 and 6 to 8,
A method for producing lactic acid bacteria dead cells.
The lactic acid bacteria killed by the method according to claim 9.
상기 첨가제는 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 수 있는 것인,
첨가제.
An additive comprising the Mycobacterium tuber of claim 10,
Wherein the additive can be added to food, functional food or feed,
additive.
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