KR101929293B1

KR101929293B1 - 이중 이온가교된 상호침투 네트워크형 알지네이트-셀룰로오스 비드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101929293B1
Application number: KR1020170070857A
Authority: KR
Inventors: 차채녕; 이강석; 홍지수
Original assignee: 울산과학기술원
Priority date: 2017-06-07
Filing date: 2017-06-07
Publication date: 2018-12-14

Abstract

본 발명에 따르면, 알지네이트의 1차 네트워크 내에 생체적합성 음이온성 셀룰로오스의 2차 네트워크를 형성하여 상호침투 네트워크(IPN)을 형성함으로써, 기계적 특성이 향상된 조직공학적 하이드로겔 비드를 간단하고도 효과적으로 제조할 수 있다. 상기 하이드로겔 비드는 종래보다 기계적 강도가 매우 높고 강성도를 제어가능할 뿐만 아니라 가혹한 화학적 환경에 대한 내구성이 우수하다. 또한, 상기 하이드로겔 비드에 의해 생의학적 응용을 위해 미생물종을 캡슐화하여 종래보다 생물학적 활성과 치료 효과를 극대화할 수 있다.

Description

이중 이온가교된 상호침투 네트워크형 알지네이트-셀룰로오스 비드 및 이의 제조방법{DUAL IONIC CROSSLINKED INTERPENETRATING NETWORK OF ALGINATE-CELLULOSE BEADS AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 생체적합성이 우수한 하이드로겔 비드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이중으로 이온성 가교된 상호침투 네트워크 구조를 가짐으로써 기계적 특성이 향상된 알지네이트-셀룰로오스 비드, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 생의학 관련 소재에 관한 것이다.

구형 알지네이트 하이드로겔(비드)은 현대 의공학 분야에서 가장 널리 사용되는 소재로 자리매김하고 있다. 구형 알지네이트 하이드로겔은 우수한 물리적 특성(예: 탄성, 고수분함량) 뿐만 아니라, 생체적합성, 사이즈 조절성(미크론 수준), 온화한 반응 조건, 및 간단하고도 효과적인 제법으로 인해, 약물 및 세포 전달 분야에서 주로 사용되고 있다. 알지네이트는 생체적합성이 우수한 천연 다당류로서, 각각의 당 단위에 카복실 관능기를 가지며, 양이온에 강한 친화력을 가져서 특히 칼슘 이온과 이온성 가교반응하여 하이드로겔 네트워크를 형성한다. 알지네이트 비드는 다양한 생물학적 분자(예: 저분자, 단백질 및 유전자) 및 생명체(예: 미생물, 포유류 세포)를 캡슐화하는 전달체로서 임상 치료에 사용되어 왔다. 알지네이트 비드는 안전한 캡슐화 환경을 제공하여 초기 적재 효율을 획기적으로 향상시킬 수 있는 반면, 그 외의 방법들은 대부분 정교한 화학적 반응을 이용해야 하고 종종 가혹한 조건이 필요하여 캡슐화된 개체가 손상되기 쉽다. 또한, 알지네이트 하이드로겔의 확산 특성으로 인해 캡슐화된 제제를 배지로 방출시켜 장기간의 세포 배양이 가능하면서도 면역 세포의 침투를 억제할 수 있다.

알지네이트 비드는 효과적으로 대량 생산을 할 수 있어서 대규모 산업적 활용이 가능하다. 이는 이온성 가교 반응의 특성 때문이며, 가교성 이온을 함유하는 용기에 알지네이트 용액 방울을 떨어뜨리는 순간 거의 즉각적으로 알지네이트 비드가 형성된다. 예를 들어 알지네이트 비드는 바이오연료 생산 및 환경 정화와 같은 녹색 바이오 산업을 위한 조직공학적 미생물을 캡슐화하여 고정하는데 사용된다. 알지네이트 비드는 기계적 지지체, 수성의 미세환경, 및 가혹한 외부 조건 등에 놓여진 미생물의 생물학적 활성을 연장할 수 있다. 또한, 알지네이트 비드는 농업에 사용되는 접종제와 제초제의 지속적 방출을 위한 캐리어로 사용될 수 있다.

이와 같은 다양한 활용성으로 인해 오랫동안 연구 및 개발되었음에도 불구하고, 알지네이트 비드의 장기간 안정성이 떨어지는 문제로 인해, 보다 광범위한 상업적 용도로 이용되기에는 한계가 있었다. 이온성 가교는 알지네이트 비드의 제조성을 향상시키면서도, 시간의 경과에 따라 이온이 빠져나가 기계적 특성이 저하되고 분해되는 문제를 야기하며, 특히 킬레이션이나 이온교환이 가능한 화학종의 존재 하에 이러한 문제가 더욱 커질 수 있다. 실험실 환경과는 달리, 대규모 산업 현장에서는 이온 반응성을 갖는 많은 화학 첨가제들이 사용될 수 있다. 또한, 알지네이트의 높은 점도로 인해 함량을 2%(w/v) 이상으로 할 수 없어 매우 제한적이므로, 비드의 기계적 특성을 제어하기 어려운 문제가 있다.

이러한 이유로 인해, 비드의 기계적 특성을 향상시키기 위해 다른 고분자 네트워크와의 조합이나 나노복합체 형성과 같은 많은 기법들이 개발되었다. 그러나, 이들 기법은 유독한 화합물들을 사용하여 캡슐화된 개체에 유해한 효과를 줄 수 있다. 또한, 많은 공정 단계가 추가되므로 대량 생산의 효율성이 저하된다. 따라서, 알지네이트 비드의 기계적 성능을 향상 및 조절하는 것 못지 않게, 생체적합성을 유지하고 공정성을 향상시키는 것도 응용 분야를 넓히고 품질을 향상시키는데 매우 중요하다.

한편, 셀룰로오스는 의학 제품(예: 상처 치료제 및 치료막)에서부터 식품 및 의약 첨가제에 이르기까지 다양하게 시판되는 생의학 용도로 광범위하게 사용되는 물질 중 하나이다. 셀룰로오스는 식물 및 미생물에서 유래한 천연 다당류 고분자로서 생체적합성이 매우 높아, 약물 전달 및 조직공학과 같은 분야에서도 셀룰로오스를 활용하려는 연구가 활발하다. 천연 셀룰로오스는 섬유상으로 존재하므로, 다양한 활용을 위해 물에 대한 용해도를 증대시키는 관능기가 도입되기도 한다.

예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스(CMC)는 카복실 염을 형성하여 다양한 온도 및 농도 범위에서 높은 용해도를 갖기 때문에, 널리 활용되는 수용성 셀룰로오스이다. CMC에서 음전하를 갖는 카복실기는, 점도와 생물학적 분자와의 상호작용을 통한 소재의 특성을 조절하여 약물 전달을 제어할 수 있게 해준다.

CMC의 또 다른 특징은 다가 양이온과 이온 결합을 할 수 있다는 것이다. 특히, CMC 분자는 2가 이온보다는 Al³⁺ 및 Fe³⁺와 같은 3가 이온과 즉각적으로 가교반응을 일으킨다. 이러한 특성으로 인해, CMC의 이온성 가교 네트워크를 알지네이트 하이드로겔 비드에 도입하여 기계적 특성을 향상시키는 것이 가능하다. 이에 따라 알지네이트 및 CMC와 같은 수용성 셀룰로오스의 하이브리드 네트워크에 대한 다양한 연구가 있었지만(Int. J. Biol. Macromol., 75 (2015) 409-417 참조), 이의 기계적 특성, 확산 특성 등의 면에서 아직 개선할 여지가 있다.

Int. J. Biol. Macromol., 75 (2015) 409-417

따라서, 본 발명의 목적은 알지네이트와 셀룰로오스의 하이브리드 네트워크 구조를 개선함으로써 기계적 특성 및 확산 특성의 면에서 보다 향상된 하이드로겔 비드를 제조하고, 이를 생의학 분야에 이용하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 (1) 알지네이트 및 음이온성 셀룰로오스를 함유하는 전구 용액을 제조하는 단계; (2) 상기 전구 용액을 2가 금속 양이온을 함유하는 용액에 적가하여 1차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 1차 가교된 하이드로겔 비드를 3가 금속 양이온을 함유하는 용액에 가하여 2차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계를 포함하는, 알지네이트-셀룰로오스 상호침투 네트워크 구조를 갖는 하이드로겔 비드의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 방법에 따라 제조되고, 2가 금속 양이온으로 이온 가교된 알지네이트의 네트워크와 3가 금속 양이온으로 이온 가교된 음이온성 셀룰로오스의 네트워크가 상호침투 네트워크를 형성하는 구조를 갖는, 하이드로겔 비드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 비드를 포함하는 생의학 소재를 제공한다.

본 발명에 따르면, 알지네이트 네트워크 내에 생체적합성 음이온성 셀룰로오스의 2차 네트워크를 형성하여, 기계적 특성이 향상된 조직공학적 하이드로겔 비드를 간단하고도 효과적으로 제조할 수 있다.

특히, 카복실레이트, 설포네이트 등을 함유하는 수용성 음이온성 셀룰로오스는, 2가 이온보다는 3가 이온에 대해 더욱 가교 결합이 선호되므로, 이중의 이온성 가교 반응을 순차적으로 수행함으로써, 알지네이트와 셀룰로오스의 2가 및 3가 이온 간의 상호침투형 네트워크(interpenetrating networks, IPN)를 형성할 수 있다.

따라서, 상기 하이드로겔 비드는, 기존의 알지네이트 비드와 비교하여, 기계적 강도가 매우 높고 강성도를 제어가능할 뿐만 아니라 가혹한 화학적 환경에 대한 내구성이 우수하다. 또한, 상기 하이드로겔 비드에 의해 생의학적 응용을 위해 미생물종을 캡슐화하여 종래보다 생물학적 활성과 치료 효과를 극대화할 수 있다.

이하 첨부된 아래의 도면을 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
이하의 도면의 간단한 설명에 기재된 약어들의 의미는 구체적인 실시예에서 정의한 바와 같다.
도 1의 (a)는 이중 이온성 가교를 통한 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 제조를 나타내는 도식이고, (b)는 에테르화를 통한 음이온성 셀룰로오스의 합성 방법을 나타낸 것이다.
도 2의 (a)는 알지네이트 비드, 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드로서 Ca²⁺로만 가교되거나 Ca²⁺ 이후에 Al³⁺로 가교된 것들의 사진이고, (b) 내지 (e)는 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 탄성모듈러스(E)를 CMC 또는 SEC 농도 변화에 따라 측정한 결과로서, 이때 Ca²⁺로만 가교되거나 또는 Ca²⁺로 가교된 후에 다양한 농도(0.1, 0.2 및 0.5 M)의 Al³⁺로 가교된 비드를 사용하였다.
도 3은 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 팽윤비(Q)를 CMC 또는 SEC 농도 변화에 따라 측정한 결과로서, 이때 Ca²⁺로만 가교되거나 또는 Ca²⁺로 가교된 후에 다양한 농도(0.1, 0.2 및 0.5 M)의 Al³⁺로 가교된 비드를 사용하였다.
도 4는 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 구조적 내구성을 CMC 또는 SEC 농도 변화에 따라 측정한 결과로서, 이때 Ca²⁺로 가교된 후에 다양한 농도(0.1, 0.2 및 0.5 M)의 Al³⁺로 가교된 비드를 사용하였고, 킬레이트 용액 내에서 비드가 완전히 용해되는 시간을 분석한 것이다.
도 5은 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 팽윤비(Q)를 CMC 또는 SEC 농도 변화에 따라 측정한 결과로서, 이때 Ca²⁺로 가교된 후에 다양한 농도(0.1, 0.2 및 0.5 M)의 Al³⁺, Fr³⁺ 또는 Cr³⁺로 가교된 비드를 사용하였다.
도 6의 (a)는 Ca²⁺로 가교된 후에 Al³⁺로 가교된 알지네이트-CMC 비드로부터 얻은 약물방출 그래프이고, 이로부터 지수(exponent) 및 지연 시간(lag time)을 산출하여 (b) 및 (c)에 각각 나타내었다.
도 7의 (a)는 Ca²⁺로 가교된 후에 Al³⁺로 가교된 알지네이트-SEC 비드의 약물방출 그래프이고, 이로부터 동적상수(k)를 산출하여 (b)에 나타내었다.
도 8의 (a) 및 (b)는 각각 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드에 캡슐화된 GFP-대장균을 3일간 배양한 후 측정한 상대생존률(A' ₅₇₀ )을 나타낸 것이고, (c) 및 (d)는 각각 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드에 캡슐화된 세포로부터 얻은 GFP의 상대 형광강도(I' _F )를 나타낸 것이다.
도 9의 (a) 내지 (e)는 각각 제조예에서 합성된 CMC, SEC, MC, HEC 및 CTMAC의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10의 (a) 내지 (e)는 각각 제조예에서 합성된 CMC, SEC, MC, HEC 및 CTMAC의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11의 (a) 내지 (c)는 각각 알지네이트 비드, 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 사진으로서, Al³⁺로만 가교된 것이다.
도 12의 (a) 내지 (c)는 각각 알지네이트-HEC 비드, 알지네이트-MC 비드, 및 알지네이트-CTMAC 비드의 탄성모듈러스(E)를 다양한 셀룰로오스 농도 조건에서 측정한 결과로서, 이때 Ca²⁺로만 가교되거나 또는 Ca²⁺로 가교된 후에 Al³⁺로 가교된 비드를 사용하였다.
도 13. (a) 및 (b)는 각각 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드의 소혈청알부민(BSA) 방출 그래프이며, 이로부터 동적상수(k)를 산출하여 (c) 및 (d)에 나타내었다.
도 14의 (a) 및 (b)는 각각 알지네이트-CMC 비드와 알지네이트-SEC 비드에 캡슐화된 GFP-대장균으로부터 얻은 GFP의 형광강도(I _F )를 나타낸 것이다.

하이드로겔 비드의 제조방법

본 발명에 따르면, (1) 알지네이트 및 음이온성 셀룰로오스를 함유하는 전구 용액을 제조하는 단계; (2) 상기 전구 용액을 2가 금속 양이온을 함유하는 용액에 적가하여 1차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계; 및 (3) 상기 1차 가교된 하이드로겔 비드를 3가 금속 양이온을 함유하는 용액에 가하여 2차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계를 포함하는, 알지네이트-셀룰로오스 상호침투 네트워크(IPN) 구조를 갖는 하이드로겔 비드의 제조방법이 제공된다.

도 1의 (a)를 참조하여, 본 발명에서는 알지네이트와 음이온성 셀룰로오스가 2가 이온과 3가 이온에 대해 서로 다른 반응성을 가지는 것을 이용하여, 알지네이트 및 음이온성 셀룰로오스를 각각 2가 이온과 3가 이온에 의해 순차적으로 가교시켜, 알지네이트의 가교된 사슬과 음이온성 셀룰로오스의 가교된 사슬 간에 상호침투형 네트워크를 형성할 수 있다.

이하 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

(1) 전구 용액의 제조

상기 단계 (1)에서는 알지네이트 및 음이온성 셀룰로오스를 함유하는 전구 용액(precursor solution)을 제조한다.

이와 같이 본 발명에서 원료로 사용되는 전구 용액은 알지네이트를 함유한다. 상기 알지네이트(alginate)는 알긴(algin) 또는 알긴산(alginic acid)으로도 불리는 음이온성 다당류(polysaccharide)로 이루어진 고분자이다. 상기 알지네이트는 갈색의 해조류에서 추출한 음이온성 천연 고분자로서, 낮은 세포 독성과 풍부한 자연 저장량으로 인해 생체재료로서 적합하다.

상기 알지네이트는 100,000 g/mol 내지 300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 가질 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 알지네이트는 100,000 g/mol 내지 200,000 g/mol의 범위 또는 150,000 g/mol 내지 300,000 g/mol의 범위의 중량평균분자량(Mw)을 가질 수 있다. 알지네이트의 분자량이 너무 작을 경우 점도가 낮아져 비드 제조 시 구형 및 크기를 유지하기 어려우며, 반대로 너무 클 경우 점도가 높아져 농도 조절이 어려운 문제가 있다. 따라서, 알지네이트의 분자량이 상기 바람직한 범위 내일 때 이온성 가교 시에 비드가 구형을 유지하면서 공정성을 향상시킬 수 있다.

또한 상기 알지네이트는 상기 전구 용액에 0.1~2%(w/v)의 양으로 함유될 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 알지네이트는 0.1~1%(w/v)의 범위 또는 1~2%(w/v)의 범위로 상기 전구 용액에 함유될 수 있다. 알지네이트의 함량이 상기 바람직한 범위 내일 때, 구형 및 크기를 유지하면서 가교 밀도 조절이 가능하여, 최종 비드의 기계적 물성을 조절하기에 보다 용이하다.

또한 상기 전구 용액은 셀룰로오스를 함유한다. 섬유상 구조 성분으로서 식물에서 흔히 발견되는 천연 다당류인 셀룰로오스는, 가장 풍부한 천연 고분자이고, 산업적으로 널리 사용되고 있다.

특히 본 발명에서는 음이온성 셀룰로오스, 즉 수용성 음이온성 셀룰로오스를 함유한다. 상기 음이온성 셀룰로오스는 셀룰로오스의 하이드록실기에 음이온을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어 카복시메틸셀룰로오스(CMC)는 소듐클로로아세테이트에 의해 셀룰로오스의 하이드록실기가 에테르화(etherification)됨으로써 합성될 수 있다(도 1의 (b) 참조).

구체적으로, 상기 음이온성 셀룰로오스는 카복시메틸셀룰로오스(CMC), 설포에틸셀룰로오스(SEC), 포스포에틸셀룰로오스(PEC) 등일 수 있다.

이들 음이온성 셀룰로오스들은 수성 조건에서 음이온기들 간의 이온 강도의 차이로 인해, 이온성 가교의 정도의 차이가 발생하는데, 이를 이용하여 최종 하이드로겔 비드의 기계적 강도를 조절할 수 있다.

바람직하게는, 상기 음이온성 셀룰로오스는 CMC 및 SEC 중에서 1종 이상인 것이, 양이온과의 결합성 차이를 이용한 비드의 기계적 물성 조절이 더 용이하다.

바람직한 일례에 따르면 상기 음이온성 셀룰로오스는 CMC일 수 있다.

바람직한 다른 예에 따르면 상기 음이온성 셀룰로오스는 SEC일 수 있다.

또한 상기 음이온성 셀룰로오스는 상기 전구 용액에 0.1~2%(w/v), 바람직하게는 0.1~1.5%(w/v) 또는 0.1~1.0%(w/v)의 양으로 함유될 수 있다. 음이온성 셀룰로오스의 함량이 상기 바람직한 범위 내일 때, 알지네이트의 이온성 가교를 거의 방해하지 않아서, 비드 형태 및 크기를 유지하면서 셀룰로오스를 이온성 가교하는데 보다 유리할 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 상기 음이온성 셀룰로오스는 0.1~0.3%(w/v)의 범위, 0.3~0.7%(w/v), 0.7~1.0%(w/v), 또는 0.7~1.5%(w/v)의 범위로 상기 전구 용액에 함유될 수 있다.

(2) 1차 가교

상기 단계 (2)에서는 상기 전구 용액을 2가 금속 양이온을 함유하는 용액에 적가하여 1차 가교된 하이드로겔 비드를 형성한다.

상기 2가 금속 양이온은 전구 용액 내의 알지네이트의 이온성 가교제로 작용하여 가교된 알지네이트 네트워크를 형성한다.

구체적으로, 상기 2가 금속 양이온은 Ca²⁺, Ba²⁺, Zn²⁺ 등에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 이 중 Ca²⁺는 생체적합성이 높아서 다양한 생물체 및 생체분자의 캡슐화 분야에 보다 유용하다.

상기 2가 금속 양이온의 농도는 0.1~1 M일 수 있다. 구체적으로, 상기 2가 금속 양이온의 농도는 0.1~0.5 M의 범위 또는 0.1~1 M의 범위일 수 있다. 2가 금속 양이온의 농도가 너무 낮을 경우 가교밀도가 낮아져 비드가 만들어지지 않거나 강도가 저하될 수 있고, 농도가 너무 높을 경우 캡슐화되는 생물체 및 생체고분자의 안정성을 저해할 수 있다. 따라서, 2가 금속 양이온의 농도가 상기 바람직한 범위 내일 때 기계적 강도를 유지하면서 생체적합성 높은 비드를 제조할 수 있다.

(3) 2차 가교

상기 단계 (3)에서는 상기 1차 가교된 하이드로겔 비드를 3가 금속 양이온을 함유하는 용액에 가하여 2차 가교된 하이드로겔 비드를 형성한다.

상기 3가 금속 양이온은 음이온성 셀룰로오스의 이온성 가교제로 작용하여 가교된 셀룰로오스 네트워크를 형성한다.

그리고, 그 결과, 상기 단계 (2)에서 가교된 알지네이트 네트워크와 상기 단계 (3)에서 가교된 셀룰로오스 네트워크 간에 상호침투 네트워크를 형성하게 된다.

특히, 음이온성 셀룰로오스는 2가 양이온보다 3가 양이온에 의해 주로 가교되는 반면, 알지네이트는 2가 양이온에 의해 가교가 더 잘 일어나므로, 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 제조하기 위해서 순차적인 가교 공정, 즉 전구 용액을 2가 금속 양이온으로 가교한 후 3가 금속 양이온과 가교하는 공정이 중요하다. 만약, 이와 같은 순차적인 공정이 아닌, 동시 가교 공정 또는 역순의 가교 공정을 수행할 경우 IPN 구조가 형성되지 않아서, 최종 하이드로겔 비드의 기계적 강도 등이 좋지 않게 된다.

상기 3가 금속 양이온은 Al³⁺, Fe³⁺, Cr³⁺, Sb³⁺, Co³⁺ 등에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 이 중 Al³⁺ 또는 Fe³⁺의 경우, 생체적합성이 다른 양이온에 비해 높아서 생명공학 분야에 적합하고, 원료가 풍부하여 보다 경제적일 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 단계 (2)에서 사용된 2가 금속 양이온이 Ca²⁺이고, 상기 단계 (3)에서 사용되는 3가 금속 양이온이 Al³⁺ 또는 Fe³⁺일 수 있다.

상기 3가 금속 양이온의 농도는 0.05~0.5 M일 수 있다. 구체적으로, 상기 3가 금속 양이온의 농도는 0.05~0.3 M의 범위 또는 0.3~0.5 M의 범위일 수 있다. 3가 금속 양이온의 농도가 상기 바람직한 범위 내일 때, 생체적합성을 유지하면서 셀룰로오스의 이온성 가교를 유도할 수 있어서, 생체적합성이 높은 상호침투형 네트워크 구조를 형성하는데 보다 유리할 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 단계 (1)에서 음이온성 셀룰로오스가 상기 전구 용액에 0.1~1%(w/v)의 양으로 함유되고, 상기 단계 (2)에서 사용된 2가 금속 양이온의 농도가 0.1~1 M이고, 상기 단계 (3)에서 사용된 3가 금속 양이온의 농도가 0.05~0.5 M일 수 있다.

그 결과 제조된 하이드로겔 비드는 2가 금속 양이온으로 이온 가교된 알지네이트의 네트워크와 3가 금속 양이온으로 이온 가교된 음이온성 셀룰로오스의 네트워크가 상호침투 네트워크를 형성하는 구조를 갖는다. 이때, 상기 하이드로겔 비드는 0.2~2 mm의 입경, 및 150~350 kPa의 모듈러스를 가질 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 방법에서 상기 음이온성 셀룰로오스가 CMC 또는 SEC이고; 상기 알지네이트가 150,000~300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 갖고; 상기 2가 금속 양이온이 Ca²⁺이고; 상기 3가 금속 양이온이 Al³⁺ 또는 Fe³⁺이고; 상기 음이온성 셀룰로오스가 상기 전구 용액에 0.1~1%(w/v)의 양으로 함유되고; 상기 2가 금속 양이온의 농도가 0.1~1 M이고, 상기 3가 금속 양이온의 농도가 0.05~0.5 M일 수 있다.

이와 같이 본 발명에서는 알지네이트와 셀룰로오스는 2가 이온과 3가 이온에 대해 서로 다른 반응성을 가지는 것을 이용하여, 알지네이트 및 CMC를 각각 2가 이온과 3가 이온에 의해 순차적으로 가교시켜, 알지네이트 및 CMC의 상호침투형 네트워크(IPN)를 형성한다. 이 경우, 가교 밀도를 개별적으로 조절함으로써 비드의 기계적 특성을 보다 넓은 범위까지 제어할 수 있다.

특히, 상기 하이드로겔 비드의 기계적 특성과 확산 특성은 음이온성 셀룰로오스의 농도 및 가교성 이온에 의해 다양하게 조절될 수 있다.

예를 들어, 상기 3가 금속 양이온의 농도가 5배 증가할 때, 상기 하이드로겔 비드의 모듈러스가 1.5~2.5배 증가할 수 있다(도 2 (d) 및 (e) 참조).

또한, 상기 전구 용액 내의 상기 음이온성 셀룰로오스의 농도가 10배 증가할 때, 상기 하이드로겔 비드의 모듈러스가 1.5~2.5배 증가할 수 있다(도 2의 (b) 참조).

또한 IPN을 형성함으로써 킬레이트 환경에 대한 비드의 구조적 내구성이 향상될 수 있다. 또한 상기 하이드로겔 비드는 약물 방출 속도와 캡슐화된 미생물 세포의 활성을 조절가능하여 생물학적 개체의 캐리어로서 유용하다.

따라서 본 발명에 따라 간단하고도 효과적인 방식으로 이중 이온 가교된 IPN 구조의 하이드로겔 비드를 제조하여 생의학 분야의 다양한 형태의 소재로 활용될 수 있다.

하이드로겔 비드

따라서 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 하이드로겔 비드를 제공한다. 즉 상기 하이드로겔 비드는 2가 금속 양이온으로 이온 가교된 알지네이트의 네트워크와 3가 금속 양이온으로 이온 가교된 음이온성 셀룰로오스의 네트워크가 상호침투 네트워크를 형성하는 구조를 갖는다.

상기 하이드로겔 비드는 50~350 kPa의 모듈러스를 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 하이드로겔 비드는 100~350 kPa의 범위, 150~350 kPa의 범위, 200~350 kPa의 범위, 또는 250~350 kPa의 범위의 모듈러스를 가질 수 있다. 하이드로겔 비드의 모듈러스가 상기 범위 내일 때, 외부 충격에 견디는 지지체로서의 역할과 내부에 함유된 생명체를 보호하는 보호막으로서의 역할을 보다 성공적으로 수행할 수 있다.

또한 상기 하이드로겔 비드는 0.2~2 mm의 입경을 가질 수 있다. 구체적인 예로서, 상기 하이드로겔 비드는 0.2~1 mm의 범위, 또는 0.5~2 mm의 범위의 입경을 가질 수 있다. 하이드로겔 비드의 입경이 상기 범위 내일 때, 많은 양의 생명체 및 생체고분자를 캡슐화하고 많은 양의 비드를 이동, 운반 및 주입하는데 용이하여 효율적인 캡슐화 및 생명공학적 응용 면에서 보다 유리하다.

바람직한 일례로서, 상기 하이드로겔 비드는 0.2~2 mm의 입경, 및 150~350 kPa의 모듈러스를 가질 수 있다.

또한, 이때 상기 음이온성 셀룰로오스가 CMC 또는 SEC이고; 상기 알지네이트가 100,000~300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 갖고; 상기 2가 금속 양이온이 Ca²⁺이고; 상기 3가 금속 양이온이 Al³⁺ 또는 Fe³⁺인, 하이드로겔 비드일 수 있다.

생의학 소재

본 발명은 또한 상기 하이드로겔 비드를 포함하는 생의학 소재를 제공한다.

상기 생의학 소재는 상처 치료제(wound dressing) 또는 조직공학적 지지체(engineered tissue scaffold)일 수 있다.

하이드로겔 비드를 약물 분자와 세포와 같은 생물학적 개체의 캐리어로서 활용하기 위해서는, 비드가 다양한 약물을 원하는 속도로 방출하고 캡슐화된 세포에 영양을 공급하기에 충분한 확산성을 반드시 가져야 한다. 고무-탄성 이론에 따르면, 가교 밀도는 재료의 기계적 특성 및 확산 특성에 역행하는 효과를 나타내며, 가교 밀도가 증가할수록 기계적 특성이 향상됨에도 확산 특성은 감소하는데 이는 가교된 네트워크가 유체의 혼입을 더욱 억제하기 때문이다. 본 발명에 따르면, 이중 이온성 가교에 의해 IPN 비드의 가교밀도를 다양하게 조절함으로써, 확산 특성을 다양하게 변화시킬 수 있다. 즉, 셀룰로오스 네트워크의 농도와 가교 밀도를 조절함으로써 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 기계적 특성과 팽윤 특성을 넓은 범위로 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하이드로겔 비드는 조절된 약물 전달 시스템에 유용하게 활용될 수 있다.

한편, 이온성 가교로 제조된 하이드로겔 비드는 공유성 가교된 하이드로겔에 비해 분해에 대해 더욱 민감하다. 이러한 분해는 수성 환경에서 킬레이트 화합물의 존재에 의해 종종 발생하여 비드에서 이온이 빠져나올 수 있다. 잘 제어된 실험실 환경과는 달리, 많은 생물학적 또는 산업적 분야에서는 킬레이트에 의해 비드의 구조를 약화시킬 수 있는 화합물들, 예를 들어 시트레이트, 포스페이트, 금속 효소, 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 등이 존재할 수 있다. 이에 대해 본 발명의 하이드로겔 비드는 이중 가교된 IPN 구조를 가지므로 킬레이트제에 대한 구조적 내구성이 우수하여 다양한 생물학적 또는 산업적 분야에 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 하이드로겔 비드는 산업용 화학 제품과 연료를 지속가능하고 친환경적으로 생산하기 위한 유전공학적 미생물종을 고정시키는데 사용될 수 있다. 이와 같이 하이드로겔 비드에 의한 캡슐화 기술을 발효 공정에 도입함으로써 다양한 이점을 얻을 수 있다. 첫째, 가혹한 공정 조건(예: 높은 전단응력 및 독성 화학 첨가제)으로부터 미생물종을 보호할 수 있다. 둘째, 원심분리 없이도 발효된 혼합물을 쉽게 회수할 수 있어서, 반복적인 발효 공정에 매우 유용하다. 셋째, 세포를 전구 용액과 혼합하는 간단한 공정에 의해 세포를 캡슐화한 비드를 대량 생산할 수 있다.

[실시예]

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 이하의 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 이들 범위로 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에서 함량을 나타내는 단위 중 "%"는 특별한 언급이 없으면 부피에 대한 질량을 백분율로 환산한 단위(즉 w/v)를 의미한다. 예를 들어 어떠한 용질 1 g이 용매 100 mL 내에 용해된 용액에서 상기 용액 중의 상기 용질의 함량은 1%(w/v)에 해당한다.

이하의 실시예 및 도면에서, 알지네이트는 "Alg"로 약칭될 수 있고, 카복시셀룰로오스 및 설포에틸셀룰로오스는 "CMC" 및 "SEC"로 약칭될 수 있으며, 알지네이트-카복시셀룰로오스의 비드는 "Alg-CMC"로 약칭될 수 있고, 예를 들어 알지네이트 및 0.1% 카복시셀룰로오스의 전구 용액으로부터 합성된 비드는 "Alg-CMC0.1"로 약칭될 수 있다.

이하에서는 하이드로겔 비드의 원료로 사용되는 셀룰로오스들을, 종래에 잘 알려진 합성법(Ramos LA et al., Carbohydrate Polym 2005;60:259-67 등 참조)에 따라, 셀룰로오스의 하이드록실기에 관능기를 접합하여 제조하였다.

제조예 1: 카복시메틸셀룰로오스(CMC)의 합성

셀룰로오스(1 g, 시그마알드리치)를 다이메틸설폭사이드(30 mL)에 용해하고 60℃에서 테트라부틸암모늄플루오라이드(9 중량%)를 가하였다. 소듐하이드록사이드 분말(3.7 g, 시그마알드리치)을 반응 혼합물에 분산시키고, 실온에서 2시간 교반하여 머서화(mercerization)하였다. 수득한 혼합물에 소듐클로로아세테이트(7.2 g, 시그마알드리치)를 천천히 가하고 60℃에서 24시간 교반하였다. 전체적인 공정은 질소 가스 하에서 수행되었다. 수득한 혼합물을 아세트산(10%)로 중화시키고, 과량의 다이에틸에테르로 침전을 수행하였다. 침전물을 탈이온수로 투석한 뒤, 감압 하에 동결 건조하여 카복시메틸셀룰로오스를 얻었다.

제조예 2: 설포에틸셀룰로오스(SEC)의 합성

소듐브로모에탄설포네이트(Alfa Aesar)를 반응물로 이용하여 상기 제조예 1과 동일한 방식으로 설포에틸셀룰로오스를 합성하였다.

비교제조예 1: 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC)의 합성

테트라부틸암모늄플루오라이드가 9 중량%로 첨가된 다이메틸설폭사이드(30 mL)에 셀룰로오스(1 g, 시그마알드리치)를 가하고 60℃에서 용해하였다. 반응 혼합물에 소듐하이드록사이드 분말(3.7 g, 시그마알드리치)을 분산시키고, 실온에서 2시간 교반하여 머서화(mercerization)하였다. 이후 1-클로로에탄올(4.96 g, 시그마알드리치)을 반응 혼합물에 천천히 가하고 60℃에서 24시간 교반하였다. 이때 셀룰로오스의 글루코산(anhydroglucose) 단위의 1-클로로에탄올에 대한 몰 분율은 1~10의 범위로 하였고, 전체적인 공정은 질소 가스 하에서 수행되었다. 반응 혼합물을 아세트산(10%)으로 중화시키고, 탈이온수로 투석한 뒤, 감압 하에 동결 건조하여 하이드록시에틸셀룰로오스를 얻었다.

비교제조예 2: 메틸셀룰로오스(MC)의 합성

아이오도메탄을 반응물로 이용하여 상기 비교제조예 1과 동일한 방식으로 메틸셀룰로오스를 합성하였다. 이때 셀룰로오스의 글루코산 단위의 아이오도메탄에 대한 몰 분율은 1~10의 범위로 하였다.

비교제조예 3: 셀룰로오스 트라이메틸암모늄클로라이드(CTMAC)의 합성

(2-클로로에틸)트라이메틸암모늄클로라이드(Alfa Aesar)를 반응물로 이용하여 상기 비교제조예 1과 동일한 방식으로 셀룰로오스 트라이메틸암모늄클로라이드를 합성하였다. 이때 셀룰로오스의 글루코산 단위의 (2-클로로에틸)트라이메틸암모늄클로라이드에 대한 몰 분율은 1~10의 범위로 하였다.

이상 제조된 셀룰로오스들을 FT-IR 분광법(도 9 참조) 및 ¹H-NMR(도 10 참조)에 의해 분석하였다. 분석 결과, FT-IR 스펙트럼 및 ¹H-NMR 스펙트럼에 나타난 피크들은 셀룰로오스의 특징적인 피크들에 대응하였다.

실시예 1: 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 제조 (CMC 이용)

고분자량의 알지네이트(220,000 g mol^-1, Junsei Chemical, 일본) 및 CMC를 증류수에 각각 2%로 용해시켜 원료 용액으로 사용하였다. 알지네이트 및 CMC 용액을 다양한 비율로 혼합하여 전구 용액을 제조하고(전구 용액 중 알지네이트 함량 0.1~1%, CMC 함량 0.1~1%로 다양하게 변화), 18G 바늘(BD Biosciences)이 연결된 주사기에 넣었다. 전기 주사 펌프(Legato 100, KD Scientific)를 이용하여 용액을 천천히 배출한 결과, 0.1 M 염화칼슘 용액의 용기 내에서 즉각적으로 방울이 형성되었다. 완전히 가교되도록 1시간 동안 비드를 용기에 방치하고, 증류수에 보관하였다. 비드를 염화알루미늄 용액의 용기로 옮기고 1시간 반응을 통해 추가적인 이온성 가교를 형성시켰다. 그 결과, 알지네이트 네트워크의 비드 내에 음이온성 셀룰로오스의 네트워크가 상호침투 네트워크(IPN)를 형성한, 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 수득하였다.

실시예 2: 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 제조 (SEC 이용)

셀룰로오스로서 SEC를 이용하여 실시예 1과 동일한 경로로 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 수득하였다.

이상 실시예에서 Ca²⁺로 가교된 비드와 Ca²⁺ 이후에 Al³⁺로 가교된 비드의 사진을 도 2에 나타내었다. 이들 사진에서 Ca²⁺로만 가교된 비드와 비교하여, Ca²⁺ 이후에 Al³⁺로 가교된 비드가 좀 더 불투명하였으므로 Al³⁺에 의해 추가 가교되었음을 알 수 있었다.

이상 제조된 비드들 및 이와 유사한 방식으로 제조된 대조군의 비드들에 대해 아래와 같이 평가하였다.

실험예 1: Al ³⁺ 에 의해 형성된 IPN의 강성도(rigidity) 평가

다양한 비드의 탄성모듈러스를 측정하여, 다양한 가교 조건에 대한 기계적 특성을 평가하였다.

그 결과, CMC 농도를 0.5%까지 증가시킴에 따라 Ca-알지네이트-CMC 비드의 모듈러스가 약간 증가되었으나(1.8배 증가), CMC 농도를 그 이상 1%까지 증가시킴에 따라서는 모듈러스가 개선되지 않았다(도 2의 (b) 참조). 이러한 결과는 알지네이트 비드 내의 CMC가 Ca²⁺과 일부 이온성 가교를 한다는 것을 의미한다.

이들 비드를 Al³⁺로 추가 가교시켜 알지네이트-CMC IPN 비드로 제조한 결과, Ca-알지네이트-CMC 비드와 비교하여 모든 경우에 모듈러스가 더욱 증가하였으며, 이와 같은 증가는 CMC의 농도에 비례하였고(0.1% CMC의 경우 2.9배 증가, 0.5% CMC의 경우 3.4배 증가, 1% CMC의 경우 5.2배 증가), 이는 CMC가 Al³⁺에 의해 우선적으로 가교됨을 의미한다.

한편, CMC 없이 제조된 알지네이트 비드의 경우에도, 비록 CMC-알지네이트 비드와 같이 현저한 수준은 아니더라도, Al³⁺로 추가 가교되어 모듈러스 향상을 나타내었다. 이러한 결과는 Al³⁺가 알지네이트 분자도 가교시킴을 의미한다.

Al³⁺에 의한 알지네이트의 가교 특성을 좀 더 Ca²⁺와 비교하기 위해, 알지네이트 전구 용액을 Al³⁺ 용액에 적가하는 대조 실험을 수행하였다.

그 결과, 생성된 비드는 납작한 원반 형상이었고(도 11 참조), 이는 적가되는 방울이 Al³⁺ 용액의 표면에 떨어질 때의 충격에 의한 것으로 추측되며, 또한 비드가 구조적으로 약하여 시간의 경과에 따라 결국 분해되는 등 비드가 제대로 형성되지 않았다. 이러한 결과는 Ca²⁺가 Al³⁺보다 양전하는 낮지만 알지네이트 비드의 형성에 좀 더 효과적임을 분명히 보여준다.

알루미늄 이온은 물 분자와 하이드록사이드 이온을 리간드로 갖는 착화합물(예: Al(H₂O)₆ ³⁺, Al(OH)²⁺, Al(OH)₂ ⁺)을 형성하므로, 알지네이트가 이와 같은 리간드를 대신하여 Al³⁺와 상호작용하는 데에는 시간이 필요한 반면, Ca²⁺은 이미 완전히 이온화된 형태로 존재하므로 알지네이트와 즉각적으로 상호작용하는 것으로 보인다.

또한 앞서와 같은 방식으로 알지네이트-SEC 비드를 제조한 뒤 모듈러스를 측정하였다.

그 결과, CMC와는 달리 Ca-알지네이트-SEC 비드의 모듈러스는 SEC의 농도가 증가함에 따라 점진적으로 감소하였다(도 2의 (c) 참조). 이러한 결과는 SEC의 존재로 인해 Ca²⁺에 의한 알지네이트의 가교에 의한 기계적 특성이 저해된 것으로 보인다. 설포네이트는 카복실레이트보다 약한 염기이므로, CMC의 카복실레이트기와 비교하여 SEC 내의 설포네이트기와 Ca²⁺의 상호작용 강도가 적을 것이다.

한편 Al³⁺와 추가로 가교하여 알지네이트-SEC IPN 비드를 생성할 때, SEC의 농도 증가에 따라 Ca-알지네이트-SEC 비드와 비교하여 모듈러스가 현저히 증가하였다(0.1% SEC의 경우 6.9배 증가, 0.5% SEC의 경우 13.5배 증가, 1% SEC의 경우 22배 증가)(도 2의 (c) 참조). 이러한 결과는, 알지네이트-CMC IPN 비드에서와 같이, 알지네이트 네트워크 내에서 SEC가 Al³⁺로 가교되어 IPN 네트워크 비드를 형성하였음을 보여준다. Al³⁺가 Ca²⁺에 비해 높은 양전하를 가지므로, SEC의 설포네이트기는 Al³⁺와 좀 더 정전기적 상호작용을 하게 된다.

또한, 알지네이트-SEC 비드에 비해 알지네이트-CMC 비드가 Ca²⁺에 의한 빠른 초기 가교로 인해 전반적으로 높은 모듈러스를 나타내었으나, 알지네이트-SEC 비드의 경우 Al³⁺ 가교에 의한 모듈러스 향상이 더욱 높았다.

실험예 2: Al ³⁺ 농도에 따른 강성도(rigidity) 평가

Al³⁺의 농도를 변화시켜가며 음이온성 셀룰로오스의 2차 가교밀도를 조절하여 강성도를 평가하였다.

그 결과 알지네이트-CMC IPN 비드에서, Al³⁺ 농도가 0.1 M 에서 0.2 M까지 증가시킴에 따라 모듈러스의 증가를 나타내었다(도 2의 (d) 참조).

그러나, Al³⁺ 농도를 0.5 M까지 더 증가시켰을 경우에는 약간의 모듈러스 감소를 나타내었고, 이는 비드 내의 CMC가 가교 반응에 모두 참여하여, 과량의 Al³⁺가 이온성 가교를 오히려 방해하기 때문이다.

알지네이트-SEC IPN 비드에서도, Al³⁺ 농도의 증가에 따른 모듈러스의 변화가 앞서와 유사하였다(도 2의 (e) 참조).

그러나, 알지네이트-CMC IPN 비드가 모든 경우에서 0.5 M Al³⁺ 농도에 모듈러스가 감소하는 것과는 달리, SEC 농도가 증가함에 따라 0.5 M Al³⁺에서의 모듈러스 증가가 관찰되었으며, 이는 높은 Al³⁺ 농도에서도 가교를 일으키는 자유 설포네이트기의 갯수가 충분함을 의미한다.

이러한 결과는, Al³⁺에 의한 모듈러스의 증가가 알지네이트-CMC 비드보다 알지네이트-SEC 비드에서 더욱 현저한 것으로 나타난 도 2의 (c)의 결과에 대응한다. 이는 또한 SEC가 CMC와 같이 Ca²⁺에 의한 알지네이트의 초기 가교에 참여하지 않기 때문에, 설포네이트기가 Al³⁺에 의해 더 가교될 수 있는 우수한 반응성을 가짐을 의미한다.

이를 고려할 때, Al³⁺에 의한 2차 셀룰로오스 네트워크의 가교밀도를 조절함으로써, IPN 비드의 기계적 특성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: 셀룰로오스의 관능기의 IPN 형성 평가

알지네이트와 음이온성 셀룰로오스의 이중 이온성 가교에 의한 IPN 네트워크 형성에 대해 좀 더 알아보기 위해서, 비음이온성 셀룰로오스들을 이용하여 IPN 비드를 제조하였다.

구체적으로, 양이온성 종들과 정전기적 상호작용을 하지 않는 관능기를 갖는 메틸셀룰로오스(MC), 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC), 및 셀룰로오스트리메틸암모늄클로라이드(CTMAC)를 이용하였다.

그 결과, HEC의 경우, HEC의 농도를 0.5 %까지 증가시킴에 따라 Ca-알지네이트-HEC 비드의 모듈러스가 감소하였으나(17 kPa에서 9 kPa까지), 1% HEC 농도에서는 증가하였다(15.5 kPa)(도 12의 (a) 참조). 이온성 가교 능력이 없는 HEC는 알지네이트와 Ca²⁺ 간의 가교를 저해하는 것으로 보이며, 다만 높은 농도에서는 HEC가 알지네이트-HEC 비드에서 필러로서 작용하기 때문에 모듈러스의 증가를 나타낸 것으로 보인다. 알지네이트-HEC 비드의 모듈러스는 모든 경우에서 알지네이트 비드에 비해 낮았으며, 이는 Al³⁺에 의한 가교가 2차 가교가 거의 없음을 의미한다.

한편, MC의 경우, MC의 농도가 0.5%까지 증가함에 따라 Ca-알지네이트-MC 비드의 모듈러스도 증가하였으나(17 kPa에서 27 kPa까지), 1% MC에서는 감소하였다(16 kPa)(도 12의 (b) 참조). MC 분자에서 메틸기는 소수성 상호작용을 하나, 국부적으로 소수성이 증가할 경우에는 이온성 가교를 오히려 방해할 수 있다. 알지네이트-HEC 비드와 같이, 알지네이트-MC IPN 비드의 모듈러스는 알지네이트 비드의 모듈러스보다 낮거나(0.5% MC 미만에서) 또는 유사한 수준이다(1% MC에서).

CTMA의 경우, 양전하로 하전된 트리메틸암모늄클로라이드 그룹을 갖는 수용성 셀룰로오스가 알지네이트 비드로 도입되었기 때문에, 강성도 면에서 다른 양상을 나타내었다. 즉, CTMAC의 농도가 1%까지 증가함에 따라 Ca-알지네이트-CTMAC 비드의 모듈러스가 17 kPa에서 30 kPa까지 증가하였다. Ca²⁺ 및 CTMAC는 모두 알지네이트 가교에 관여하여, 모듈러스를 증가시킬 수 있었다(도 12의 (c) 참조). 그러나, 알지네이트-CTMAC IPN 비드의 모듈러스는 알지네이트-HEC 비드 또는 알지네이트-MC 비드의 모듈러스보다 매우 낮았고, 그 결과 Ca-알지네이트-CTMAC 비드의 모듈러스는 0.5% 및 1%의 CTMAC 농도에서 유사하였다. 이는 알지네이트와 이미 이온성 상호작용을 형성한 CTMAC 분자와 Al³⁺가 경쟁하여 교체하기 때문인 것으로 보인다.

이를 고려할 때, 음이온성 관능기를 갖지 않는 수용성 셀룰로오스는 Al³⁺이온성 가교에 의한 2차 네트워크를 형성할 수 없어서, 알지네이트-CMC 및 알지네이트-SEC 비드와 같이 이중 이온성 가교에 의한 IPN 형성을 못하였음을 알 수 있다.

실험예 4: Al ³⁺ 에 의해 형성된 IPN의 팽윤(swelling) 평가

알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 팽윤비를 측정하여 비드의 확산 특성에 미치는 다양한 이중 가교 조건을 평가하였다.

그 결과, CMC의 농도가 증가함에 따라 Ca-알지네이트-CMC 비드의 팽윤비(Q)가 점진적으로 감소하였고, CMC의 최대 농도(1%)에서는 Ca-알지네이트 비드와 비교하여 45%까지 높아졌다(도 3의 (a) 참조). 이러한 결과는 CMC가 Ca²⁺에 의한 알지네이트와의 광범위한 가교 반응에 참여하였음을 의미한다.

한편, 알지네이트-CMC IPN 비드의 팽윤비는 CMC가 증가함에 따라 현저히 감소하지는 않았고, 1% CMC에서 단지 14%가 감소하였는데, 이와 같은 결과는 Ca²⁺과 다른 Al³⁺의 화학적 가교 특성에 기인한 것으로 보인다.

한편, 도 2에 나타난 알지네이트-CMC IPN 비드의 기계적 특성은, Al³⁺에 의해 형성된 고분자 네트워크가 기존 네트워크의 기계적 특성을 향상시키는데 큰 영향을 주지만, 도 11에서 보듯이, 용액 상태의 고분자를 가교시키는데는 효과적이지 않다는 것을 보여준다.

이는 3가의 Al³⁺가 2가의 Ca²⁺에 비해 더 가까운 거리에 고분자 사슬들이 모여있을 때만 이온성 가교가 효율적으로 이루어진다는 것을 의미하여, 그 결과, 3가 양이온에 의한 셀룰로오스의 가교밀도 증가가 비드의 전체적인 팽윤 저하에 영향을 크게 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.

또한, 높은 전하의 이온은 고분자 전해질과 상호작용하여 국부적으로 짝이온 농도를 증가시킴이 알려져 있다. 따라서, Ca²⁺에 비해 Al³⁺에 의해 가교된 비드 내의 이온성 강도는 고분자 네트워크 주변의 짝이온의 농도가 높아짐에 따라 더 커질 수 있고, 이는 오히려 친수성의 증가를 가져올 수 있다. 여기에 더불어 음이온성 셀룰로오스 자체가 가지는 친수성으로 인해 비드 전체적인 친수성 증가에 기여한다고 볼 수 있다.

한편, Ca-알지네이트-SEC 비드 및 알지네이트-SEC IPN 비드의 팽윤비(Q)도 SEC 농도와 관계없이 유사하였다(도 3의 (b) 참조). 그러나 알지네이트-CMC 비드와는 달리, SEC 농도에 따라 팽윤비가 점차 증가하였다. 도 2의 (c)에 나타난 모듈러스의 감소를 함께 고려할 때, 알지네이트-SEC 비드는 알지네이트-CMC 비드에 비해 가교 밀도가 낮고, 알지네이트 내에 존재하는 SEC는 Ca²⁺에 의한 광범위하고도 효과적인 가교를 억제함을 알 수 있었다.

또한, Al³⁺의 농도를 다양하게 변화시켜가며 IPN 비드를 제조한 뒤 팽윤비를 측정하여, 셀룰로오스 네트워크의 가교 밀도가 비드의 팽윤 특성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과, Al³⁺ 농도가 0.1 M에서 0.2 M로 증가함에 따라 알지네이트-CMC 비드 및 알지네이트-SEC 비드 모두 팽윤비가 크게 감소하였다(도 3의 (c) 및 (d) 참조). 또한 Al³⁺ 농도가 0.5 M까지 증가할 경우 IPN 비드의 팽윤비는 별로 달라지지 않았다. 이러한 팽윤비의 변화는 도 2의 (d) 및 (e)에 나타난 비드의 강성도 변화와는 역비례 관계를 갖는 것이다.

실험예 5: 킬레이트 환경에 대한 구조적 내구성 평가

킬레이트제에 대한 이중 가교된 IPN 비드의 구조적 내구성을 측정하여 평가하였다. 구체적으로, 생화학 분야에서 잘 알려진 킬레이트제인 EDTA를 함유하는 완충 용액에, 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 첨가하고, 비드 구조가 완전히 분해되는데 걸리는 시간을 측정하였다(도 4 참조).

알지네이트-CMC IPN 비드의 경우, CMC 농도가 0.1%에서 1%로 증가함에 따라 분해 시간이 증가하였고, 이는 Al³⁺ 농도가 0.5M까지 증가하였을 때 최대가 되었다(즉 0.5 M Al³⁺에서 CMC 농도가 0.1%에서 1%로 증가함에 따라 분해 시간이 270% 증가)(도 4의 (a) 참조). 이는 CMC 네트워크의 가교 밀도가 증가함에 따라 비드 내부로 EDTA가 확산되는 것이 지연되는 것으로 보인다.

알지네이트-SEC IPN 비드의 경우에도 SEC 농도의 증가에 따라 분해 시간이 증가하였다(즉 0.1 M Al³⁺에서 SEC 농도가 0.1%에서 1%로 증가함에 따라 분해 시간이 32% 증가)(도 4의 (b) 참조). 그러나, 알지네이트-CMC 비드와는 달리, Al³⁺의 농도가 분해 시간에 주는 영향은 크지 않았으며, 이는 알지네이트-CMC 비드와 비교하여 가교 밀도가 낮기 때문인 것으로 추측된다.

실험예 6: 3가 이온의 종류에 따른 IPN 형성 평가

IPN 형성 시에 3가 이온의 종류에 따른 차이를 알아보기 위해, 서로 다른 3가 이온인 Fe³⁺ 또는 Cr³⁺를 사용하여 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 제조하고, 이들의 기계적 특성을 측정하여 Al³⁺를 사용하여 얻은 비드와 비교하였다(도 5 참조). 이들 3가 이온의 농도는 0.1 M 에서 0.5 M까지 변화시켰다.

그 결과, Fe³⁺를 이용하는 경우에 알지네이트-CMC 비드와 알지네이트-SEC 비드 모두에서 모든 농도에 대해 모듈러스가 가장 높았다. 상기 3종의 이온 중 Fe³⁺는 가장 크고 무거운 이온이기 때문에(Al, Cr 및 Fe의 원자번호는 각각 13, 24 및 26), 음이온성 관능기와 가장 쉽게 상호작용하는 것으로 보인다. 이는 0.1 M에서 Cr³⁺로 가교된 비드의 모듈러스가 Al³⁺로 가교된 비드보다는 높으나 Fe³⁺로 가교된 비드보다는 낮은 것에서도 알 수 있다.

이와 같은 가교성 이온의 질량과 크기가 기계적 특성에 미치는 영향은 알지네이트 비드에서도 유사하게 관찰되는데, Ba²⁺, Sr²⁺ 및 Cd²⁺과 같은 크고 무거운 2가 이온에 의해 가교된 알지네이트 비드는 Ca²⁺에 의해 가교된 비드보다 강하다.

그러나, 높은 이온 농도에서는, Al³⁺로 가교된 비드의 모듈러스가 Cr³⁺로 가교된 비드의 모듈러스보다 모든 CMC 및 SEC 농도에서 현저히 높았다. 이는 비드에 의한 이온 확산이 더 크게 작용했기 때문이며, 그에 따라 좀 더 작은 Al³⁺가 Cr³⁺보다 비드 내로 잘 확산될 수 있었기 때문이다.

한편, 3가 이온의 종류에 관계 없이, 알지네이트-CMC IPN 비드의 모듈러스는 높은 셀룰로오스 농도에서 알지네이트-SEC IPN 비드의 모듈러스보다 일반적으로 컸으며, 이는 CMC가 SEC보다 좀 더 효과적으로 이온성 가교를 할 수 있음을 의미한다.

또한, Ca²⁺을 이용하지 않고, Al³⁺와 유사한 방식으로 Cr³⁺ 또는 Fe³⁺ 용액에 비드 전구 용액을 적가하여 비드를 제조하고 가교 특성을 비교하였다. 그 결과 Al³⁺만으로 가교된 비드와 유사하게, Cr³⁺만으로 가교된 비드는 약하여 제대로 형성되지 않았다.

한편, Fe³⁺만으로 제조된 비드는 기계적 강도가 좀 더 높았고 구형을 잘 유지하여 Cr³⁺에 비해 Fe³⁺의 가교 성능이 우수함을 알 수 있었으나, 이들의 강성도는 Ca²⁺로 가교된 비드에 비해 훨씬 낮았다.

또한, 알지네이트는 어떠한 종류의 3가 이온보다도 2가의 Ca²⁺이온과 더욱 효과적으로 가교될 수 있었다.

실험예 7: 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 약물 방출 평가

다양한 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 약물 방출 시험을 수행하여 방출 경향을 분석하였다. 이때 소혈청알부민(BSA)을 단백질 약물로 이용하였다.

그 결과, 알지네이트-CMC IPN 비드의 경우, 본격적인 방출이 진행되기 이전에 초기 방출되어 S자 형상(sigmoidal pattern)의 방출 그래프를 나타내었다(도 6의 (a) 참조). 이와 같은 방출 동향은 IPN 네트워크에서 일반적으로 발견되는 것으로, 본격적인 방출을 위해서는 1차 및 2차 네트워크에서 모두 사슬 이완이 필요하다. 그러므로, 이들 그래프는 S자 형상의 방출 패턴을 보이는 와이블(Weibull) 식에 대응할 수 있다.

알지네이트-CMC IPN 비드의 방출 동향을 보여주는 지수 값(b)의 경우에는 더욱 근접하였다(도 6의 (b) 참조). 그러나 알지네이트 비드의 지수 값은 크게 달라져서, 알지네이트와 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드 간의 서로 다른 약물 방출 동향을 확인할 수 있었다.

지연 반응을 알 수 있는 지연 시간 상수(T)는 예상대로 CMC 농도 증가에 따라 CMC의 가교 밀도가 커져 증가하였다(도 6의 (c) 참조). 이러한 결과로부터 CMC 네트워크의 가교 정도를 통해 알지네이트-CMC IPN 비드로부터의 약물 방출을 조절할 수 있음을 알 수 있다.

한편, 알지네이트-SEC IPN 비드의 방출 그래프는 S자 형상을 나타내지 않았고, 따라서 와이블 모델에 맞지 않았다. 이들은 그보다는 시간에 따른 힘의 법칙인 리트거-페파스(Ritger-Peppas) 모델에 잘 맞았으며(도 7의 (a) 참조), 이를 통해 약물 방출이 2차 SEC 네트워크에 의해 크게 영향받지는 않음을 알 수 있었다. 알지네이트-SEC IPN 비드의 동적속도상수(k)는 비드 내의 SEC 네트워크의 존재에도 불구하고 알지네이트 비드보다 더 컸다(도 7의 (b) 참조). 이러한 경향은, 도 2 및 도 3에서 보듯이, 높은 SEC 농도에서 알지네이트-SEC IPN 비드의 강성도가 낮아지고 팽윤이 증가하기 때문이다.

또한, 대조군으로서, Ca-알지네이트-CMC 비드의 약물 방출 경향을 측정하여, CMC의 2차 가교가 방출 메커니즘에 미치는 영향을 확인하였다(도 13 참조). 이의 방출 그래프는 알지네이트-CMC IPN 비드와 달리 S자 형상이 아니었으나, 팽윤이 조절된 통상적인 리트거-페파스 모델에 근접하였다. 또한, CMC 농도에 따라 동적속도상수가 증가하였고, 이는 알지네이트-CMC IPN 비드에서 방출이 지연되는 것과 반대되는 결과이다.

이와 유사한 방식으로, Ca-알지네이트-SEC 비드의 약물 방출 경향도 측정하였다(도 13 참조). 그 결과 알지네이트-SEC IPN 비드와 같이 리트거-페파스 모델에 잘 맞았다. 그러나, SEC 농도에 따라 동적속도상수가 증가하는 점은 Ca-알지네이트-CMC 비드의 경우와 유사하였다.

이상의 결과를 통해, 알지네이트 비드 내에서 비가교된 셀룰로오스가 약물 방출을 억제하지 않고 촉진시키며, 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 2차 가교가 약물 방출에 영향을 미침을 알 수 있었다.

실험예 8: 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드 내의 미생물 활성

또한, 녹색 형광 단백질을 생산할 수 있는 대장균(GFP-대장균)을 알지네이트-셀룰로오스 비드 내로 캡슐화하고, GFP-대장균으로부터 발현된 GFP를 측정하여 평가하였다.

그 결과, 모든 경우에서, 배양 1일만에 GFP-대장균의 생존률이 크게 증가하였으며(도 8 참조), 이는 세포들이 비드 내로 빠르게 확산되었음을 의미한다.

먼저, 알지네이트-CMC IPN 비드의 경우, CMC 농도의 증가에 따라 1일차의 생존률이 대체로 증가하였다(도 8의 (a) 참조). 또한, 높은 CMC 농도(1%)에서는 배양 3일 동안 생존률이 잘 유지된 반면, 그 외 다른 농도에서는 생존률이 다소 감소하였다.

알지네이트-SEC IPN 비드의 경우, 1일차에는 SEC 농도에 따라 생존률이 증가하였으나, 알지네이트-CMC IPN 비드에서 나타난 것과 같이 현저한 수준은 아니었다(도 8의 (b) 참조). 또한, 알지네이트-CMC IPN 비드와 달리, 높은 SEC 농도에서의 알지네이트-SEC IPN 비드의 생존률은 시간의 경과에 따라 감소하였고 이는 다른 농도에서도 마찬가지였다.

이와 같은 결과로부터, 비드의 기계적 특성이 캡슐화된 세포에 큰 영향을 미친다는 것과, 비드의 강성도가 증가함에 따라 생존률과 확산도가 높아진다는 것과, 구조적 내구성이 큰 비드 내에서 장기간 생존률이 높아진다는 것을 알 수 있었다.

생존률에 대해 더 알아보기 위해서, 캡슐화된 GFP-대장균에서 발현된 GFP를 측정하여, 비드의 기계적 특성이 유전자 발현 성능에 미치는 영향을 분석하여 보았다. 구체적으로, 제어된 형광 강도(즉 야생형 대장균의 형광으로 정규화된 GFP-대장균의 형광)(도 14 참조)를, 도 8의 (a) 및 (b)에서 나타난 생존률(A' ₅₇₀ )로 정규화하여, 비드 내에 살아있는 각 세포에서 발현된 GFP의 수준(I' _F )을 나타내었다.

그 결과, 알지네이트-CMC IPN 비드의 경우, 모든 경우에서 시간의 경과에 따라 I' _F 가 증가하였으나, 이의 I' _F 값들은 알지네이트 비드의 I' _F 값들보다 낮았다(도 8의 (c) 참조). 한편, 알지네이트-SEC IPN 비드의 I' _F 는, 높은 SEC 농도 조건을 제외하고는, 알지네이트 비드의 I' _F 보다 컸다(도 8의 (d) 참조).

이러한 결과로부터, 단백질 발현에 큰 영향을 주는 비드의 확산 특성이 달라짐을 알 수 있었다. 이는 도 3에서 알지네이트-CMC IPN 비드의 팽윤비가 알지네이트 비드보다 작고 CMC 농도에 따라 감소한 반면, 알지네이트-SEC IPN 비드의 팽윤비는 SEC 농도에 따라 증가한 것에 대응한다.

비드의 가교 밀도 증가에 의한 확산 억제는 캡슐화된 세포에 의한 대사 속도를 감소시킬 것으로 보인다. 또한, 캡슐화된 GFP-대장균으로부터 발현된 단백질은 모든 비드 구성에서 시간에 따라 증가하였으며, 이는 이들의 생체적합성과 세포를 캡슐화하는 운송체로서의 유용성을 보여준다.

이상의 실시예 및 실험예들을 통해, 이중으로 이온 가교하는 방식으로 제조된 알지네이트-셀룰로오스 상호침투형 네트워크(IPN) 구조의 비드에 대해 다양하게 시험한 결과, 수용성 음이온성 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 설포에틸셀룰로오스(SEC)는 양이온과 이온성 가교 반응을 하는 것을 확인할 수 있었다.

특히, 셀룰로오스는 2가 양이온인 Ca²⁺보다 3가 양이온(예: Al³⁺, Cr³⁺ 및 Fe³⁺)에 의해 주로 가교된 반면, 알지네이트는 Ca²⁺과 같은 2가 양이온에 의해 가교가 더 잘 일어났다. 이는 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드를 제조하기 위해서 순차적인 가교 공정, 즉 셀룰로오스를 2가 이온과 가교한 후 3가 이온과 가교하는 공정이 필요함을 보여준다.

또한, 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드의 기계적 특성과 확산 특성은 셀룰로오스의 농도 및 가교성 이온에 의해 다양하게 조절될 수 있었다. 또한 IPN을 형성함으로써 킬레이트 환경에 대한 비드의 구조적 내구성이 향상될 수 있었다. 또한 알지네이트-셀룰로오스 IPN 비드는 약물 방출 속도와 캡슐화된 미생물 세포의 활성을 조절가능하여 생물학적 개체의 캐리어로서 유용하였다.

따라서 본 발명에 따라 간단하고도 효과적인 방식으로 이중 이온 가교된 IPN을 제조하여 생의학 분야의 다양한 형태의 소재로 활용될 수 있다.

Claims

(1) 알지네이트 및 음이온성 셀룰로오스를 함유하는 전구 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 전구 용액을 2가 금속 양이온을 함유하는 용액에 적가하여 1차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계; 및
(3) 상기 1차 가교된 하이드로겔 비드를 3가 금속 양이온을 함유하는 용액에 가하여 2차 가교된 하이드로겔 비드를 형성하는 단계를 포함하고,
상기 음이온성 셀룰로오스가 설포에틸셀룰로오스(SEC)이고,
상기 3가 금속 양이온이 Al³⁺이고,
상기 2차 가교된 하이드로겔 비드가 알지네이트-셀룰로오스 상호침투 네트워크 구조를 갖고, 50~350 kPa의 모듈러스 및 0.2~2 mm의 입경을 갖는, 하이드로겔 비드의 제조방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 알지네이트가 100,000~300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 갖는, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 2가 금속 양이온이 Ca²⁺인, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 음이온성 셀룰로오스가 상기 전구 용액에 0.1~1%(w/v)의 양으로 함유되고,
상기 2가 금속 양이온의 농도가 0.1~1 M이고,
상기 3가 금속 양이온의 농도가 0.05~0.5 M인, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 2차 가교된 하이드로겔 비드가 2가 금속 양이온으로 이온 가교된 알지네이트의 네트워크와 3가 금속 양이온으로 이온 가교된 음이온성 셀룰로오스의 네트워크가 상호침투 네트워크를 형성하는 구조를 갖는, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 2차 가교된 하이드로겔 비드가 150~350 kPa의 모듈러스를 갖는, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 알지네이트가 150,000~300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 갖고;
상기 2가 금속 양이온이 Ca²⁺이고;
상기 음이온성 셀룰로오스가 상기 전구 용액에 0.1~1%(w/v)의 양으로 함유되고;
상기 2가 금속 양이온의 농도가 0.1~1 M이고,
상기 3가 금속 양이온의 농도가 0.05~0.5 M인, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 8 항에 있어서,
상기 3가 금속 양이온의 농도가 5배 증가할 때,
상기 2차 가교된 하이드로겔 비드의 모듈러스가 1.5~2.5배 증가하는, 하이드로겔 비드의 제조방법.
제 1 항의 방법에 따라 제조되고, 2가 금속 양이온으로 이온 가교된 알지네이트의 네트워크와 3가 금속 양이온인 Al³⁺로 이온 가교된 설포에틸셀룰로오스(SEC)의 네트워크가 상호침투 네트워크를 형성하는 구조를 갖고, 50~350 kPa의 모듈러스 및 0.2~2 mm의 입경을 갖는, 하이드로겔 비드.
제 11 항에 있어서,
상기 하이드로겔 비드가 150~350 kPa의 모듈러스를 갖는, 하이드로겔 비드.
제 12 항에 있어서,
상기 알지네이트가 100,000~300,000 g/mol의 중량평균분자량(Mw)을 갖고;
상기 2가 금속 양이온이 Ca²⁺인, 하이드로겔 비드.
제 11 항의 하이드로겔 비드를 포함하는 생의학 소재.
제 14 항에 있어서,
상기 생의학 소재가 상처 치료제 또는 조직공학적 지지체인, 생의학 소재.