KR101928036B1 - 전기방사법을 이용한 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법 - Google Patents

전기방사법을 이용한 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 생약 추출물, 폴리비닐알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체(솔루플러스)를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에서 얻은 혼합물을 전기방사법에 의해 나노 섬유 매트 제형으로 제조하는 단계;를 포함하는 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 의해 제조된 속붕해성 나노 섬유 제형은 빠른(3분 내) 붕해 특성을 보여, 구강 내에서 음료가 없이도 섭취할 수 있는 구강암 치료용 속붕해성 매트 제형으로 사용될 수 있다.

Description

전기방사법을 이용한 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법 {PROCESS FOR PREPARING FAST DISSOLVING NANOFIBER MAT FORMULATIONS FOR ORALLY ADMINISTRATING HERBAL MEDICINE EXTRACT USING ELECTROSPINNING}
본 발명은 경구 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전기방사법(electrospinning)을 이용한 생약 추출물의 경구 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법에 관한 것이다.
구강은 비강, 질, 직장 및 점안 경로와 함께 점막통과 약물 전달의 경로로 연구되어 왔다. 효소, 타액, pH 및 점막 두께와 같은 몇몇 생리적 인자는 구강 내의 약물 흡수에 영향을 미칠 수 있다. 구강 점막은 구강, 설하, 잇몸(gingival) 및 구개 조직(palatal tissue)으로 구성되며, 이들은 구조, 두께, 전환 시간(turnover time), 표면적, 투과성, 체류 시간 및 혈류가 서로 상이하다. 따라서, 이러한 생리적 문제를 극복하도록 최적화된 약물 전달 시스템이 고안되어야 한다. 전신적인 약물 전달 이외에도, 구강 내의 국소적인 약물 전달이 질병 치료에 사용되고 있다. 다양한 종류의 제형들, 예컨대 액상 제형, 반-고형 제형 및 고형 제형 [예컨대, 정제, 캔디(lozenge), 패치, 필름, 웨이퍼스, 및 입자]이 구강 내의 치료 약물 전달을 위해 개발되었다. 그 중에서, 투여 용이성 및 높은 복약 순응도(patient compliance)로 인해 속붕해성 필름 제형이 널리 사용되고 연구되었다. 다수의 제조 방법들 [예컨대, 주조, 직접 타정 및 열용융 압출(hot-melt extrusion)]이 필름 제형의 제조에 적용될 수 있다. 최근에는, 약물 전달을 위해 나노 섬유(nanofiber, NF) 제형이 개발되고 있다. 특히, NF는 구강 내의 약물 적용을 위한 속붕해성 필름으로 사용될 수 있다. NF 구조는 표면적이 넓어 신속하게 습윤되고, 제형으로부터 약물 용출이 빠르다.
구강암은 구강 내에서 발생하는 암으로, 몇몇 조직학적 종류들, 예컨대 선암종(adenocarcinoma), 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 및 기형종(teratoma)으로 분류될 수 있다. 구강암의 약 90%는 볼, 입 하부면, 잇몸, 입술, 구개, 및 혀로부터 빈번히 유래되는 편평상피세포암종(squamous cell carcinoma)이다. 구강암 치료를 위해서는 외과적 절제, 화학치료, 방사선 치료가 사용될 수 있다. 구강 및 인두(pharynx)의 암 치료에는 통상의 화학치료제 [예컨대, 블레오마이신(bleomycin), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 도세탁셀(docetaxel), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil)]가 사용된다. 최근에는, 구강암의 치료에 천연물의 사용이 시도되고 있다.
본 발명에서는, 참당귀(Angelica gigas Nakai; AGN) 추출물(ext)을 구강암 치료를 위해 이용하였다. 이의 주요 성분 [즉, 데커신(decursin, D), 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate, DA) 및 데커시놀(decursinol, DOH)], 또는 추출물은 방광암, 유방암, 대장암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 골수종, 전립선암 및 육종에 대해 이미 항암 활성을 보였다. AGN 성분들의 이러한 항암 활성에도 불구하고, 각 성분의 다양한 물리화학적 특성 (즉, log P, 분자량, pK a, 및 용해도)으로 인해 허브의 다중 성분 또는 추출물에 기반하는 제형의 개발이 방해될 수 있다. 특히, 충분한 약리 효능을 발휘하기 위해서는 제형 개발 연구에 의해 AGN의 주요 성분들 (즉, D 및 DA)의 부분적 수용성 및 지용성 특성을 극복해야 한다.
이전 연구에서 AGN 에탄올(EtOH) 추출물의 구강 전달을 위해 몇가지 제형들, 예컨대 전기분무법(electrospray)에 의한 나노복합체, 고온-용융 압출된 고형 제형, 및 마이크로에멀전이 개발된 바 있다. 본 발명에서는 구강암에 대한 항-증식 효능을 위하여 수성 매체에서의 NF의 속붕해성 특성 및 나노 입자로의 변환 특성을 이용하였다.
유럽 특허공개 EP 2813212 (2014.12.17)
Drug Delivery, 2016; 23(2): 489-499. School of Life and Medical Sciences Annual Research Review 2015~2016 (2016. 11.01) BioMed Research International Ⅴ 2014, Article ID 789765 (2014.01.20) Lee, et al., 2016a. Nanocomposites based on Soluplus and Angelica gigas Nakai extract fabricated by an electrohydrodynamic method for oral administration. J Colloid Interface Sci. 484, 146-154. Lee, et al., 2016b. Omega-3 fatty acids incorporated colloidal systems for the delivery of Angelica gigas Nakai extract. Colloids Surf. B Biointerfaces 140, 239-245.
본 발명자들은 전기 방사법에 의해 제조된 상기 AGN-첨가의 NF 제형은 AGN의 다수의 주요 성분들이 단일 제형 내로 통합되어 있고 투여가 간편하고, 신속히 용해되어, 나노-크기 전달체로 즉시 변환되고, 구강내 암세포로 도입되어 항-종양 효과를 나타낼 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 전기방사법을 이용하여 AGN이 첨가된 폴리비닐알코올 (PVA) 및 솔루플러스(SP)-기반의 나노섬유 매트(NF mat) 제형을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 (a) 생약 추출물, 폴리비닐알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (b) 상기 단계(a)에서 얻은 혼합물을 전기방사법에 의해 나노 섬유 매트 제형으로 제조하는 단계;를 포함하는 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법을 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 상기 생약 추출물이 당귀 추출물일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)의 상기 추출물은 에탄올 추출물일 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)에서, 생약 추출물, 폴리비닐알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체는 1:4~400:2~200의 중량비로 혼합될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)에서, 상기 생약 추출물은 증류수:에탄올:메탄올이 0.2~20:0.2~20:1의 부피비로 혼합된 용매에 용해될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계(b)의 전기방사법은 유속 0.01~5 ㎖/h로 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 단계(b)의 전기방사법은 전압 1~30 kV 인가 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형을 제공하는 것이다.
일 구현예에서, 상기 나노 섬유 매트 제형의 생약 추출물이 무정형일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노섬유 매트 제형은 직경이 100~500 nm이고, 봉입률이 50~100 %일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 AGN 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노섬유 매트 제형이, 물 없이 간편하게 복용할 수 있고, 약리 활성 성분의 국소적 또는 전신적 작용을 기대할 수 있어, 구강암 세포에서 항-종양 효과를 신속히 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 AGN 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노섬유 매트 제형은, 추후 다양한 물리화학적 특성을 갖는 생약 추출물의 전달 시스템으로 활용/개발될 수 있다.
도 1은 전기방사법(electrospinning)을 간략히 나타낸 것이다.
도 2는 제조된 NF 제형의 이미지로서, AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF의 사진 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 PVA NF, PVA/SP NF, AGN/PVA NF, 및 AGN/PVA/SP NF의 FE-SEM 이미지를 나타낸 것이다 [기준자(scale bar)의 길이는 2㎛임].
도 4는 AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF의 XRD 결과를 2θ에 의한 계수(count)에 대해 나타낸 것이다.
도 5는 NF의 붕해 시험의 결과로서, 증류수에서의 AGN/PVA NF와 AGN/PVA/SP NF의 붕해를 15분 동안 모니터링한 결과이다.
도 6은 AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF를 증류수 중에서 2분 동안 와류 교반에 의해 10 mg/㎖로 분산시킨 NF 분산체의 입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 7은 1% SDS를 포함하는 pH 6.8 완충액에서, NF로부터 D와 DA의 용출량을 측정한 (A) AGN/PVA NF 및 (B) AGN/PVA/SP NF의 시험관내 용출 시험(in vitro release test)이다 (데이터는 평균± 표준편차 (n = 3)로 나타냄).
본 발명에서는 (a) 생약 추출물, 폴리비닐알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 얻은 혼합물을 전기방사법에 의해 나노 섬유 매트 제형으로 제조하는 단계;를 포함하는 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 단계(a)의 상기 생약은 참당귀, 일당귀 및 중국당귀로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당귀; 갈근; 감초; 강황; 구기자; 겐티아나; 계피; 대황; 마황; 산수유; 센나엽; 오미자; 우황; 음양곽; 인삼; 인진호; 지실; 진피; 치자; 홍삼; 황금; 황련; 및 황백으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 당귀 추출물이며, 가장 바람직하게는 참당귀 (Angelica gigas Nakai)의 추출물이다. 참당귀의 에탄올 추출물은 구강암 세포에 대해 항-증식 활성을 나타낸다.
일 구현예에서, 단계(a)의 상기 추출은 열수; 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어진 알코올; 에테르; 에틸아세테이트; 아세톤; 및 메틸렌 클로라이드 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매에 의한 추출법, 고주파추출법, 압출용융법, 및 초임계추출법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출법으로 수행될 수 있으며, 바람직하게는 에탄올에 의한 추출이다.
상기 단계 (a)에서 친수성 중합체로서 폴리비닐알콜을 사용하였고, 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체 (polyethylene glycol-vinylcaprolactam-vinyl acetate grafted copolymer)인 솔루플러스(Soluplus, SP)를 계면활성제로서 AGN 에탄올 추출물에 첨가하였다.
일 구현예에서, 단계 (a)에서, 생약 추출물, 폴리비닐알콜, 및 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체가 1:4~400:2~200의 중량비로 혼합될 수 있고, 바람직하게는 1:10~100:5~50의 중량비로 혼합될 수 있고, 가장 바람직하게는 1:40:25의 중량비로 혼합될 수 있다.
일 구현예에서, 단계 (a)에서, 생약 추출물은 증류수: 에탄올: 메탄올이 0.2~20:0.2~20:1의 부피비로 혼합된 용매에 용해될 수 있고, 바람직하게는 1~5: 1~5:1의 부피비로 혼합된 용매에 용해될 수 있고, 가장 바람직하게는 2:2:1의 부피비로 혼합된 용매에 용해될 수 있다.
상기 단계 (b)에서는 상기 단계 (a)에서 얻은 혼합물을 전기방사법에 의해 나노섬유 매트 제형으로 제조하였다.
전기방사법(electrospinning)은 최근 나노섬유를 제조할 수 있어 각광받고 있는 기술로서, 그 원리는 원료인 고분자물질에 고전압 전기장을 걸면, 원료물질 내부에서 전기적 반발력이 생겨 분자들이 뭉치고 나노 크기의 실 형태로 갈라지면서 공기를 통해 채찍처럼 움직이는 불안정한 분출(즉 용액과 나노입자들의 좁은 흐름)이 만들어진다. 용매가 증발하는 동안 나노 입자들이 이러한 채찍질 운동으로 분출되면서 20nm-1㎛의 직경을 갖는 나노섬유를 제조할 수 있는 방법이다(도 1 참조). 나노섬유는 기존 섬유에 비해 큰 표면적을 갖기 때문에 필터로 사용할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 전기방사법은 유속 0.01~5 ㎖/h로 수행될 수 있으며, 바람직하게는 유속 0.1~3 ㎖/h, 더욱 바람직하게는 유속 0.5~2 ㎖/h, 가장 바람직하게는 1 ㎖/h로 수행될 수 있다.
상기 단계(b)의 전기방사법은 전압 1~30 kV, 바람직하게는 25 kV 인가 하에서 수행된다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 제조방법에 의해 제조된 생약 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형을 얻는 것이다.
일 구현예에서, 상기 나노섬유 매트 제형은 직경이 100~500 nm이고, 봉입률이 50~100 %일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 나노섬유 매트 제형 내의 생약 추출물, 바람직하게는 AGN 에탄올 추출물은 전기 방사 공정 동안 결정형에서 무정형으로 그 고체 상태가 변환된다. 이러한 무정형 상태는 AGN 에탄올 추출물의 유효 성분인 D 및 DA가 상기 제형으로부터 신속히 용출되도록 한다.
상기 제조방법에 의해 수득된 속붕해성 나노섬유 매트 제형은 물 없이 간편하게 복용할 수 있고, 구강내 투여함으로써 약리 활성 성분의 국소적 또는 전신적 작용을 기대할 수 있으므로, 구강암 세포에서 항-종양 효과를 증진시킬 수 있다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
1.1. 재료
신선한 AGN는 평창(한국)의 지역 시장에서 입수하였다. D와 DA의 표준 시료는 한국한방산업진흥원(Korean Traditional Medicine Industry, 경산, 한국)에서 입수하였다. PVA (분자량: 30-70 kDa)는 시그마 알드리치 사(Sigma Aldrich, 세인트 루이스, 미주리주, 미국)에서 구입하였다. SP는 바스프(BASF SE 사, 루트비히스하펜, 독일)에서 입수하였다. 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS)는 도쿄 케미컬 인더스트리 사(Tokyo Chemical Industry Co. Ltd., 도쿄, 일본)로부터 구입하였다. RPMI1640 [로스웰 파크 기념협회(Roswell Park Memorial Institute)에서 개발됨], 페니실린, 스트렙토마이신, 및 열-불활성화 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 기브코 라이프 테크놀로지 사(Gibco Life Technologies, Inc., 그랜드 아일랜드, 뉴욕, 미국)로부터 입수하였다. 모든 용매는 고성능 액상 크로마토그래피 (HPLC) 등급을 사용했고, 모든 다른 화학물질들은 분석 등급으로 추가 정제 없이 사용하였다.
1.2. NF의 제조 및 특성 확인
AGN 에탄올 추출물을 보고된 방법(Lee, et al., 2016a, J Colloid Interface Sci. 484, 146-154; Lee, et al., 2016b, Colloids Surf. B Biointerfaces 140, 239-245)에 따라, AGN을 55℃에서 24 시간 동안 건조시킨 후 실온으로 냉각하여 제조하였다. 건조된 AGN에 에탄올을 첨가하고 80℃에서 2시간 동안 가열하여, AGN로부터 약리 활성 성분을 추출하였다. 이후 건조시켜 에탄올을 완전히 제거하고, AGN 에탄올 추출물을 수득하였다.
NF는 전기방사법에 의해 제조하였다. PVA NF의 경우, PVA (0.4g)를 가열하여 증류수(DW, 2㎖)에 녹이고, 이를 에탄올 (2㎖)과 혼합하여 제조하였다. PVA/SP NF를 제조하기 위해서, PVA (0.4g)를 가열하여 증류수 (2㎖)에 용해시키고, 이를 에탄올 (2㎖)와 혼합하였다. SP (250mg)는 PVA 용액과 에탄올의 상기 혼합물 중에 용해시켰다. AGN/PVA NF를 제조하기 위하여, PVA (0.4g)를 가열하여 증류수 (2㎖)에 용해시키고, 에탄올 (2㎖)와 혼합하였다. 이후 상기 혼합물을 메탄올(MeOH, 1㎖)에 용해된 AGN 에탄올 추출물 (10mg)과 혼합하였다. AGN/PVA/SP NF의 경우, PVA (0.4g)를 가열에 의해 증류수 (2㎖)에 용해시키고, 이를 에탄올 (2㎖)과 혼합하였다. 이후 SP (250mg)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 메탄올 (1㎖) 중의 AGN 에탄올 추출물 (10mg)과 혼합하였다. AGN/PVA NF와 AGN/PVA/SP NF의 혼합물의 전도도(conductivity)를 제조사의 프로토콜(ELS-Z1000; Otsuka Electronics, 도쿄, 일본)에 따라 레이저 도플러법(Laser Doppler method)에 의해 측정하였다.
전기 방사 공정을 위하여, 각 샘플을 스테인리스 스틸 니들(25G)이 장착된 시린지(10㎖ 부피)에 넣었다. 시린지의 끝부터 밑면까지의 거리는 15cm였다. 상기 용액을 25kV에서 시린지 펌프(NanoNC, 서울, 한국)에 의해 1㎖/h 유속(flow rate)으로 스테인리스 스틸 시트에 분무하였다. NF를 상기 스테인리스 스틸 시트로부터 수집하여, 이를 -20℃에서 보관하였다.
가변 압력장 주사전자현미경 (variable pressure-field emission-scanning electron microscope, VP-FE-SEM; SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Oberkochen, 독일)을 사용하여, NF의 형태를 관찰하고 NF의 직경을 측정하였다. 이를 위하여, NF를 스터브(stub) 상에 올려놓고, 진공 하에서 금으로 코팅하였다.
NF 제형 중의 D와 DA의 봉입률(entrapment efficiency)은 HPLC 분석에 의해 결정하였다. 각 NF 제형을 증류수에 분산시키고, 메탄올로 1 mg/㎖의 농도가 되도록 희석하여 D와 DA의 함량을 측정하였다. AGN 에탄올 추출물 중의 D와 DA 함량과 비교하여, 각 NF 제형 중의 D와 DA 함량을 정량적으로 결정하였다. 펌프(PU-2089 Plus; Jasco, 도쿄, 일본), UV/Vis 검출기(UV-1575), 및 자동 주입기 (AS-2050 Plus)가 장착된 HPLC 시스템을 사용하여 이들을 정량 분석하였다. 이동상은 0.2% 포름산을 포함하는 증류수 (A)과, 0.2% 포름산을 포함하는 아세토니트릴 (B)의 혼합물이었다. 유속은 1㎖/분으로 유지하였고, 이동상의 구배 조건(ingredient condition)은 다음과 같이 설정하였다: (1) 0분, A:B = 70:30 (v/v), (2) 15분, A:B = 60:40, (3) 30분, A:B = 50:50, (4) 40분, A:B = 25:75, (5) 45분, A:B = 70:30, (6) 50분, A:B = 70:30, 및 (7) 55분, 정지. D와 DA의 분석을 위하여, 역상 C18 컬럼 (Kinetex, 250×4.6 mm, 5㎛; Phenomenex, 토렌스, 캘리포리아, 미국)를 사용하였다. 주입 부피는 10㎕였고, 흡광도를 329nm 파장에서 모니터링하였다. D와 DA 분석시 직선성(linearity)은 1~500 ㎍/㎖ 농도의 AGN 에탄올 추출물에서 나타났다. 이 분석에서 일간 오차 및 하루 중의 편차(inter-intra-day variances)는 허용가능한 범위 내에 있다.
1.3. X-선회절 (XRD) 분석
AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF의 XRD 분석은 LYNXEYE 검출기가 장착된 D8 ADVANCE 시스템 (Bruker AXS GmbH, 칼스루에, 독일)을 사용하여 실시하였다. CuKα-조사(1.5418 Å 파장)를 40mA 및 40kV 발생기(generator) 조건에서 5-50°의 2θ 범위에서 사용하였다. 스텝 크기 및 스캔 속도는 각각 0.02° 및 0.5 초/스텝이었다.
1.4. 붕해 시험
먼저, 증류수 (100㎖)를 페트리 디쉬 (150mm 직경)에 넣었다. 동량의 NF 제형들 (AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF)을 상기 페트리 디쉬의 증류수에 첨가하였다. 지정된 시간 (0, 1, 3, 5, 10 및 15 분)에 사진 이미지를 얻었다.
1.5. NF 분산체의 특성 확인
입자 크기와 제타 전위(zeta potential) 분석에 의해 NF의 분산체의 특성을 확인하였다. AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF의 각 10 mg/㎖를 2분간 와류 교반하여 증류수 중에 분산시켰다. NF 분산체의 입자 크기, 다분산성(polydispersity), 및 제타 전위값을 제조사의 프로토콜(ELS-Z1000; Otsuka Electronics, 도쿄, 일본)에 따라 동적 광산란법(dynamic light scattering; DLS) 및 레이저 도플러법에 의해 측정하였다.
1.6. 시험관내 용출 시험
NF 제형으로부터의 D와 DA의 용출 프로파일은 pH 6.8 완충액-기반의 타액-유사 매체(saliva-mimicked media)에서 평가하였다. 용출 시험 동안 싱크 상태(sink condition)를 유지하기 위하여, 계면 활성제로서 1% (w/v) SDS를 상기 완충액에 첨가하였다. AGN/PVA NF 또는 AGN/PVA/SP NF (1.5mg AGN 에탄올 추출물에 상응하는 양)을 1% (w/v) SDS를 포함하는 15㎖ 인산염 완충 생리식염수(PBS, pH 6.8)에 넣었다. 그리고, 이들을 37℃의 진탕 수조에서 50 rpm으로 교반하였다. 지정된 시간(1, 3, 5, 10 및 15분)에, 용출 매체의 일정량(0.5 ㎖)을 취하고, 동일 부피의 새로운 용출 매체를 보충하였다. 각 시료는 HPLC 시스템을 사용하는 정량 분석을 위해 시린지 필터 (0.2㎛ 기공 크기)로 여과하였다. 각 그룹으로부터 용출된 D와 DA의 양은 상기 기술한 HPLC 분석법을 사용하여 결정하였다.
1.7. 세포독성 시험
YD-9 (인간 구강 측면 유래의 편평상피세포암종) 세포를 한국세포주은행 (Korean Cell Line Culture, KCLB; 서울, 한국)으로부터 입수하였다. YD-9 세포는 10% (v/v) FBS 및 1% (v/v) 페니실린 (100 U/㎖) 및 스트렙토마이신 (0.1 mg/㎖)이 포함된 RPMI 1640에서 37℃, 습윤한 5% CO2 분위기에서 배양하였다. 세포 배양 디쉬에서 70-80% 밀집도(confluency)에 도달한 후, YD-9 세포를 1웰 당 2×103 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고, 이들을 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. AGN 에탄올 추출물, AGN/PVA NF 또는 AGN/PVA/SP NF (10, 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ AGN 에탄올 추출물 농도에 상응함)를 YD-9 세포에 첨가하고, 이들을 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. NF 제형들은 와류 교반으로 세포 배양 배지 중에 분산시키고, 이들을 세포에 첨가하였다. 이들 샘플을 48시간 배양한 후 제거하고, 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 37℃에서 CellTiter 96　 AQueous 단일 용액 세포 증식 실험 시약 (One Solution Cell Proliferation Assay Reagent, PromegaCorp., 피츠버그, 위스콘신주, 미국)으로 처리하였다. 흡광도는 EMax 정밀 마이크로플레이트 판독기 (EMax Precision Microplate Reader, Molecular Devices, 서니베일, 캘리포니아주 미국)를 사용하여 490nm에서 측정하고, 세포 생존률을 대조군 그룹(무처리)의 생존률과 비교하여 계산하였다.
1.8. 통계 분석
모든 실험은 3번 이상 실시하였고, 데이터는 평균±표준 편차(SD)로 표시하였다. 통계 분석은 양방향 t-검증(two-tailed t-test) 및 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 실시하였다.
2. 결과 및 논의
2.1. NF의 제조 및 특성 분석
D, DA, 및 DOH는 AGN 에탄올 추출물의 구강용 제형 개발을 위한 대표 마커로서 사용되었다. AGN 에탄올 추출물 중의 D, DA, 및 DOH의 함량은 각각 61.00±12.63 mg/g, 49.30±12.13 mg/g, 및 2.19±0.04 mg/g로 보고된 바 있고(Piao, et al., 2015. PLoS One 10, e0124447) 특히 D와 DA는 AGN 에탄올 추출물 중에 높은 함량으로 포함되므로 마커로서 사용되어 왔다(Lee, et al., 2016a. Colloid Interface Sci. 484, 146-154; Lee, et al., 2016b. Colloids Surf. B Biointerfaces 140, 239-245) D와 DA는 수용해성이 낮으며, 이들의 경구 투여를 위한 몇몇 제형[예를 들어, 고온 용융 압출법에 의해 제조된 고형 입자, 마이크로에멀전, 및 전기수력학적 방법 (electrohydrodynamic method)에 의해 제조된 나노복합체]이 개발되었다. 본 발명에서는, AGN EtOH 추출물의 전달을 위하여 PVA 및 SP-기반의 NF를 전기 방사 공정에 의해 제조하였다. PVA는 속붕해성 필름의 구성성분으로서 사용되었고, SP를 계면활성제로 첨가하였다.
AGN EtOH 추출물을 포함하는 NF-기반의 매트 제형을 전기방사법에 의해 제조하였다. AGN EtOH 추출물(다중 성분을 포함함)의 용해를 위하여, 증류수/에탄올/메탄올 (2:2:1, v/v/v)에 기초하는 용매 시스템을 확립하였다. 상기 조성의 용매 시스템에서, 투입한 물질의 침전물은 발생하지 않았다. 전기 방사 공정 이후, 흰색의 얇은 매트가 AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF 그룹 모두에서 수득되었다(도 2). 그러나, AGN/PVA/SP NF이 촘촘한 질감을 갖는데 반해, AGN/PVA NF는 느슨한 엮임 구조를 보였다. AGN/PVA NF에 비해 AGN/PVA/SP NF의 더욱 촘촘한 구조는, 이송과 보관 동안 견고성을 제공할 수 있다. NF의 형태 및 직경을 FE-SEM에 의해 관찰하였다 (도 3). 확립된 제조 조건에서, PVA NF 그룹은 뚜렷한 섬유상을 나타내지는 않았지만, SP가 첨가되자 NF의 그물망-유사 구조가 생성되었다.
비드가 포함된 NF 구조는 구형과 섬유상의 중간 단계이다. 비드는 AGN/PVA NF 구조의 일부에서 관찰되었으나, 비드가 없는 NF 구조는 본 발명의 제조 조건 중 AGN/PVA/SP NF 그룹에서 나타났다. AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF 그룹에서, FE-SEM에 의해 직접 측정된 섬유의 평균 직경은 각각 75nm 및 170nm였다(도 3 및 표 1). AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF의 혼합물의 전도성은 각각 337±1μS/cm 및 281±6 μS/cm였다. 전도성이 높은 용액일수록 전기 방사시 직경이 더 작은 NF를 생성한다고 알려졌다. 따라서, AGN/PVA NF 그룹에 비해 AGN/PVA/SP NF 그룹 용액의 낮은 전도성은 직경이 더 큰 NF 구조의 생성에 기여할 것이다. D와 DA의 평균 봉입률은, AGN 에탄올 추출물에 비해, AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF 그룹에서 각각 84.6% 및 81.0%였다(표 1). 이는 AGN 에탄올 추출물이 전기 방사 공정에 의해 NF 제형으로 성공적으로 도입되었음을 시사하였다.
NF 제형의 특성 확인
구성 평균 직경 (nm) 봉입률 (%)
AGN/PVA NF 75 ± 26 84.6 ± 18.6
AGN/PVA/SP NF 170 ± 35 81.0 ± 10.1
데이터는 평균 ± 표준편차 (n ≥ 3)로 나타냄.
평균 직경은 SEM 이미지에서의 NF의 직접 측정값을 나타냄.
봉입률(%) = [NF 중의 D 및 DA의 실제량 / NF 중의 D 및 DA의 첨가량]×100
2.2. XRD 분석
전기 방사 공정 동안 AGN 에탄올 추출물의 고형 상태의 변경 (결정형과 무정형 사이)은 XRD 분석으로 조사하였다 (도 4). AGN 에탄올 추출물의 XRD 프로파일은 본 발명자들의 이전 보고(Lee, et al., 2016a. J Colloid Interface Sci. 484, 146-154)에서 이미 제시되어, 본 연구에는 포함하지 않았다. 보고된 바와 같이, AGN 에탄올 추출물 그룹은 11.72°, 12.80°, 13.17°, 18.87°, 19.63°, 24.82°, 및 31.05°에서 뚜렷한 피크를 나타내었다. 그러나 이러한 피크들은 AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF 그룹의 프로파일에서는 나타나지 않았다 (도 4). 이것은 AGN 에탄올 추출물의 구성 성분들이 전기 방사 공정 동안 결정형에서 무정형 상태로 전환된다는 것을 암시한다. 또한, 이러한 전기수력학적 공정 동안의 AGN 에탄올 추출물의 무정형화는 본 발명자들의 이전 연구에서도 관찰되었다. AGN 에탄올 추출물의 성분과 PVA 및 SP와의 상호작용은 AGN 에탄올 추출물 성분의 무정형화와 관련될 수 있다. 또한 전기방사 단계 동안에 유기 용매를 신속하게 제거하는 것도 AGN 에탄올 추출물의 구성 성분의 무정형화에 기여할 수도 있다. 또한 전기수력학적 공정 동안의 결정형 약물의 무정형화가 보고된 바 있다. AGN 에탄올 추출물이 결정형에서 무정형으로 변환되는 것은 이들이 구강으로 투여된 후 수용해도 및 용해도의 개선에 기여할 수 있다.
2.3. 붕해 시험
제조된 NF의 붕해 시간을 증류수 중에서 측정하였다(도 5). 증류수 중에서 15분 경과 후, 두 그룹 모두에서 NF 매트는 존재하지 않았다. 특히, AGN/PVA/SP NF 그룹은 3분 내에 완전 붕해되는 것으로 나타났다. SP의 양친매성 특성이 AGN/PVA NF보다 AGN/PVA/SP NF의 더 신속한 붕해에 기여하는 것으로 보인다. 이러한 결과는 구강 내에서 AGN/PVA/SP NF가 AGN/PVA NF보다 더 빨리 붕해된다는 것을 나타낸다.
2.4. NF 분산체의 특성 확인
본 발명에서는 AGN 에탄올 추출물을 고형 제형 내로 봉입하기 위해서, 전기방사법에 의해 NF 매트를 제조하였다. 먼저, 수성 매체 중의 NF의 분산은 나노 입자를 형성할 것이라는 가설을 세웠다. 이를 확인하기 위해, 각 NF 그룹을 2분 동안 와류 교반으로 증류수에 분산시키고, 이의 입자 특성을 평가하였다(도 6 및 표 2).
NF 제형의 분산체의 특성 확인
구성 평균 직경(nm) 다분산성 지수 제타 전위(mV)
AGN/PVA NF 419 ± 16 0.27 ± 0.01 -3.5 ± 2.6
AGN/PVA/SP NF 79 ± 2# 0.10 ± 0.01 -1.7 ± 5.3
각 제형은 2 분 동안 와류 교반에 의해 증류수 중에 10 mg/mL으로 분산됨.
데이터는 평균± 표준편차 (n = 3)으로 나타냄.
# p < 0.05, AGN/PVA NF 그룹에 비교함.
AGN/PVA NF 분산체 및 AGN/PVA/SP NF 분산체 그룹의 평균 직경은 각각 419nm 및 79nm였다. 이들은 또한 도 6 및 표 2에서 나타난 바와 같이 좁은 크기 분포를 보였다. 이들 두 개의 NF 분산체 그룹의 제타 전위값은 각각 -3.5mV 및 -1.7 mV였다. AGN/PVA/SP NF 분산체 그룹의 평균 직경은 AGN/PVA NF 분산체 그룹의 평균 직경보다 상당히 작았다(p < 0.05). SP (계면활성제)를 NF 제형에 첨가함으로써, NF 제형이 수성 매체 중에 분산될 때에 표면 장력을 감소시킬 수 있다. 수성 매체 중의 나노 입자의 표면 장력의 감소는 AGN/PVA/SP NF 분산체의 평균 직경의 감소와 관련된 것으로 보인다. AGN/PVA/SP NF 분산체 그룹은 AGN/PVA NF 그룹에 비해 붕해 속도가 더 빠르고 입자 크기가 더 크며, 이는 구강 투여 후 AGN 에탄올 추출물 성분들의 세포 흡수 및/또는 점막 흡수의 개선에 기여할 것이다.
2.5. 시험관내 시험
구강중 타액과 유사한 pH 6.8 완충액 중에서, AGN/PVA NF 및 AGN/PVA/SP NF로부터의 D 및 DA의 용출량을 측정하였다(도 7). 이전의 연구에서 기술된 바와 같이(Lee, et al., 2016a. J Colloid Interface Sci. 484, 146-154), pH 6.8 버퍼 중의 AGN 에탄올 추출물로부터 용출된 D 및 DA의 농도는 확립된 HPLC 에세이의 정량값 하한 한계 미만이었다. 따라서, AGN 에탄올 추출물로부터의 D 및 DA의 용출 프로파일은 기재되지 않았다. SDS (1%, w/v)를 계면활성제로서 용출 매체에 첨가하여, 용출 시험 동안의 싱크 상태를 유지하였다. 제조된 NF 제형의 속붕해성 특성을 고려하여, 총 용출 시간은 15분으로 하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, AGN/PVA NF로부터 D 및 DA의 용출량은 1분 및 15분에 각각 22.4~24.1% 및 61.5~67.0%였다. 또한 AGN/PVA/SP NF로부터 D 및 DA의 용출량은 1분 및 15분에 각각 19.6~20.2% 및 63.8~68.4%였다. SP가 AGN/PVA NF에 첨가되면 NF 분산체의 입자 크기가 감소되기는 하지만, 이로 인해 NF 제형으로부터의 D 및 DA의 총 용출에는 유의한 영향을 미치지 않았다. 본 발명에서는 NF 제형으로부터 D 및 DA의 즉시 용출 프로파일이 관찰되었고, 이것은 AGN 에탄올 추출물 성분들의 무정형화 및 빠른 습윤 및 속붕해 특성에 의해 설명될 수 있다. 개발된 NF 제형에서 관찰된 즉시 용출 특성에 의해 이들 제형을 구강에 성공적으로 적용할 수 있을 것이다.
2.6. 세포 독성 시험
상기 제조된 NF 제형의 항-증식 효능을 구강 편평상피세포암종 세포에서 평가하였다. NF의 농도는 AGN 에탄올 추출물의 농도에 따라 계산하였다 (데이터는 평균± 표준편차 (n = 5)로 계산함). AGN 추출물 또는 이들의 주요 성분(즉, D, DA 및 DOH)은 몇몇 종류의 암, 예컨대 방광암, 유방암, 대장암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 골수종, 전립선암, 및 육종에서 항-종양 효능을 갖는다고 보고되었다. 본 발명에서는, AGN 에탄올 추출물의 항-증식 특성을 YD-9 세포 (인간 구강 측면 유래의 편평상피세포암종)에서 비색법(colorimetric assay)으로 평가하였다. 특히, 50 ㎍/㎖의 AGN 에탄올 추출물 농도에서, 세포 생존률의 순서는 이하와 같았다: AGN 에탄올 추출 현탁액 > AGN/PVA NF > AGN/PVA/SP NF (p < 0.05). 48 시간 배양 후 YD-9 세포에서 AGN 에탄올 추출 현탁액, AGN/PVA NF, 및 AGN/PVA/SP NF 그룹의 IC50 값은 각각 163.3±12.8, 147.4±0.7, 및 138.3±5.3 ㎍/㎖였다 (p < 0.05). AGN 에탄올 추출 현탁액 그룹의 경우, 세포독성은 다른 그룹에 비해 낮았으며, 이는 수용액 환경 중의 AGN의 주요 성분들(D 및 DA)의 난용성에 기인한 것으로 보인다.
AGN/PVA NF 그룹에 비해 AGN/PVA/SP NF 그룹의 IC50 값이 더 낮은 것은, 부분적으로는 AGN/PVA/SP NF 분산체의 평균 직경(79nm)과 AGN/PVA NF 분산체의 평균 직경(419nm)의 차이에 의해 설명될 수 있다. AGN/PVA NF 분산체 그룹에 비해 AGN/PVA/SP NF 분산체 그룹은 입자 크기가 더 작고, 이는 YD-9 세포에 대한 개선된 세포 독성에 기여하는 것으로 보인다. AGN/PVA/SP NF는 구강에 생체내 적용된 후, 에탄올 추출물 및 AGN/PVA NF에 비해 속붕해성 및 속용성을 나타내었고 항-증식 활성이 더 높았으며, 이로 인해 항암 활성이 개선된 것이다.
3. 결론
AGN-첨가된 NF 구조를 속붕해성 매트로 제조하여, 구강 편평상피세포암종 세포에 대한 항 증식 특성을 평가하였다. 전기방사법에 의해, 170nm 평균 직경 및 80% 이상의 봉입률을 갖는 AGN/PVA/SP NF를 제조하였다. 전기 방사 공정에 의해, NF 구조내 AGN 에탄올 추출물의 고형 상태가 결정형에서 무정형 상태로 변환되었다. 이는 수용액 매체 내에서 수용해성 개선 및 속용성에 기여할 수 있다. AGN/PVA/SP NF는 AGN/PVA NF에 비해 속붕해성 특성을 보였으며, 이는 AGN/PVA/SP NF 중에 포함되는 SP의 양친매성 특성에 기인할 수 있다. AGN/PVA NF와 AGN/PVA/SP NF 구조는 모두 수용액 환경 중에 분산되면 나노-크기의 입자들로 변환되었다. D와 DA는 AGN/PVA/SP NF로부터 즉시 용출되었고, 이로써 AGN/PVA/SP NF의 구강 내에서 속붕해성 매트로서의 가능성을 보였다. AGN/PVA/SP NF 그룹은 YD-9 세포에서의 AGN 에탄올 추출 현탁액 및 AGN/PVA NF 그룹에 비해서 더 높은 항-증식 활성을 나타내었다. 제조된 AGN/PVA/SP NF은 구강암 치료를 위한 속붕해성 매트 제형의 개발 가능한 후보일 수 있다.

Claims (10)

  1. (a) 폴리비닐알콜 0.4 중량부(g)를 물 2 부피부(ml)에 용해시키고 에탄올 2 부피부(ml)를 첨가한 후 폴리에틸렌 글리콜-비닐카프로락탐-비닐아세테이트 그래프트화된 공중합체 0.25 중량부(g)를 첨가하고, 메탄올 1 부피부(ml)에 포함된 당귀의 에탄올 추출물 0.01 중량부(g)를 혼합한 혼합물을 얻는 단계; 및
    (b) 단계(a)에서 얻은 혼합물을 전기방사법에 의해 나노 섬유 매트 제형으로 제조하는 단계;를 포함하는 당귀의 에탄올 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)의 전기방사법이 유속 0.01~5 ㎖/h로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계(b)의 전기방사법이 전압 1~30 kV 인가 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 하나의 항에 의해 제조된 당귀의 에탄올 추출물의 구강내 투여용 속붕해성 나노 섬유 매트 제형.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 나노 섬유 매트 제형의 당귀의 에탄올 추출물이 무정형인 것을 특징으로 하는 나노 섬유 매트 제형.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 나노섬유 매트 제형은 직경이 100~500 nm이고, 봉입률이 50~100 %인 것을 특징으로 하는 나노 섬유 매트 제형.
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