KR101920048B1 - Earthworm Animal model for Diagnosis of skin toxicity and diagnosis method using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 지렁이를 이용한 피부 독성 평가용 동물모델 및 이를 이용한 피부 독성 평가방법에 관한 것이다. 구체적으로 지렁이 피부 표면에 피검물질을 도포하고 피부를 현미경으로 관찰하여 피부 자극 여부를 관찰하는 방법에 관한 것으로써 기존 동물실험에 사용하는 피검물질 양보다 소량을 사용해 짧은 시간 내 피부 자극 가능성을 효과적으로 예비-스크리닝(pre-screening) 할 수 있으며 피부자극 동물실험에 드는 비용, 노동, 시간 및 윤리적 문제를 줄일 수 있다. The present invention relates to an animal model for evaluating skin toxicity using earthworms and a method for evaluating skin toxicity using the same. Specifically, the present invention relates to a method for observing skin irritation by applying a test substance to a surface of a skin of an earthworm and observing the skin with a microscope. Thus, it is possible to effectively prevent the possibility of skin irritation in a short period of time - can be pre-screened and reduce the cost, labor, time and ethical problems of skin-stimulated animal experiments.
Description
본 발명은 재현성과 실용성이 있으며 기존 동물실험을 대체할 수 있는 지렁이를 이용한 피부 독성 평가용 동물모델 및 피부 독성 평가방법에 관한 것이다.The present invention relates to an animal model for evaluating skin toxicity and an evaluation method of skin toxicity using an earthworm which has reproducibility and practicality and can replace an existing animal experiment.
여러 화장품이나 연고제 등의 피부용 의약품은 그 안에 포함된 화학물질들이 피부접촉에 의해 피부자극을 일으킬 수 있기 때문에 이에 대한 안정성 평가는 필수적이다. 그러나 최근 동물실험에 대한 윤리적인 개념이 강화되고 있어, 화장품 분야에서 수행되는 동물실험이 논란이 되고 있다. 특히 EU를 필두로 미국, 일본에서 동물 복지와 관련하여 동물실험 대체시험법에 관련된 법규의 제정과 동물사용 규제가 확산되고 있으며 현재 국립독성과학원에서는 화장품 등의 안정성 평가 시 국제적으로 대두되고 있는 동물대체시험법에 대한 가이드라인을 제정하였다. 따라서 화학물질의 독성 시험법에 대한 동물대체시험법의 개발이 시급한 사안으로 떠오르고 있다(Robinson et al,2002).For skin products such as cosmetics and ointments, it is essential that the chemical substances contained in them contain a risk of skin irritation due to skin contact. However, recent ethical concepts for animal experiments have been strengthened, and animal experiments conducted in the field of cosmetics have been controversial. Especially in the EU and the United States, in Japan and the United States, regulations on animal welfare substitution test laws have been enacted and animal use regulations have been spreading. The National Institute of Toxicological Research Guidelines for testing were established. Thus, the development of an alternative testing method for toxicity testing of chemicals has emerged as an urgent issue (Robinson et al, 2002).
동물대체시험법(alternative methods to animal studies)이란 개념은 미지물질의 인간에 대한 유해영향을 예측하기 위해, 시험대상으로 whole body로서 포유동물을 사용하지 않고 생물재료 또는 비생물재료를 주로 사용하는 것을 일컬으며(Hofer et al. 2004), 실험용으로 사용하는 동물의 수나 동물의 고통을 감소시키는 것도 포함하고 Russell과 Burch(1959)가 1959년 제안한 3R(replacement, reduction, refinement)개념에 기초를 두고 있다. 현재 많은 연구를 통해 몇몇 유용한 대체시험방법이 최근 OECD guideline(2010)에 등재되고 있고 피부자극 시험의 대체시험법으로 인공피부모델(RhE, Reconstituted human skin equivalent model)이 가장 많이 연구가 되고 있으며 대체시험법으로서의 가능성이 가장 높은 것으로 보고되고 있다(Fentem et al, 2001). 하지만 아직 동물실험 및 임상결과와의 상관성이 높은 시험법으로 등록되기 위해서는 허가받아야 할 과정들이 많이 남아 있다. The concept of alternative methods to animal studies is the use of biomaterials or nonbiological materials predominantly as a whole body without the use of mammals to predict the adverse effects of unknown substances on humans (Hofer et al. 2004), based on the 3R (replacement, reduction, refinement) concept proposed in 1959 by Russell and Burch (1959), including reducing the number of animals used for experimentation and animal suffering . A number of useful alternative testing methods have been recently listed in the OECD guideline (2010), and most of the studies on reconstructed human skin equivalent (RHE) (Fentem et al, 2001). In this study, However, there are still many procedures that must be approved in order to be registered as a test with high correlation with animal experiments and clinical results.
화학물질들의 인간 피부자극 평가방법 중 대표적으로 국소독성 시험법이 있다. 이 시험법은 Daize(1959)에 의해 개발되어 지금까지도 유용하게 사용되고 있으나 토끼 등의 실험동물의 큰 고통을 초래하기에 대체시험법의 연구가 시급한 시험법 중 하나이다. A local toxicity test is a representative method for evaluating human skin irritation of chemical substances. This test method was developed by Daize (1959) and has been used so far. However, it is one of the urgent test methods for the alternative test method because it causes great pain in laboratory animals such as rabbits.
구체적으로, 토끼를 이용한 국소독성 시험법 중 피부일차자극시험 평가방법은 다음과 같다. 토끼의 등 부위의 털을 가로세로 약 10 cm 정도의 크기로 제모한 후 척추를 중심으로 왼쪽은 시험물질 적용부위, 오른쪽은 대조물질 적용 부위로 하고, 각 적용부위에 찰과 부위와 비찰과 부위를 두어 실험을 실시한다. 시험물질은 적정한 농도로 조제하여 각 부위당 0.5 ml씩 도포하여 24시간 폐쇄첩포한다. 시험물질 적용부위는 24시간이 지난 후, 72시간이 지난 후 피부상태를 관찰하며 피부반응 평가는 [의약품등의 독성시험기준 (식품의약품안전청고시 제 2009-116호)]의 "피부반응의 평가기준"에 따라 평점으로 평가하며, 결과에 대한 자극성의 정도 판정은 일반적으로 많이 이용되는 Draize(1959)의 P.I,I(Primary Irritation Index)의 산출 방법에 따른다. 이러한 동물실험 방법은 실험 동물군을 가학적 실험방법으로 유도한 동물모델에서 평가한다는 문제가 있으며, 또한, 고비용이 소요된다는 문제점이 있다.Specifically, the evaluation method of skin primary stimulation test in the local toxicity test using rabbit is as follows. After raising the hair of the back part of the rabbit to a size of about 10 cm in length and width, the test material is applied to the left side of the vertebra, and the reference material is applied to the right side. To conduct experiments. Prepare the test substance at the appropriate concentration, apply 0.5 ml per each site, and apply closure for 24 hours. The site of the test substance is observed after 24 hours, after 72 hours, and the skin reaction is assessed according to the "Evaluation of skin reaction" of the "Toxicological Test Standard for Drugs (Food and Drug Administration Notice No. 2009-116) Criteria ", and the degree of irritation to the results is determined according to the method of calculating the PI and I (Primary Irritation Index) of Draize (1959) which is generally used. Such an animal test method has a problem in that it is evaluated in an animal model derived from a sadistic experimental method and also a high cost is required.
한편, 지렁이 종은 생활사가 짧아 부화 후 7~8주 정도 지나면 성체가 되며 이외에도 번식률이 높고 사육이 용이하며, 피검물질에 대한 감수성이 비교적 높아 독성시험 생물로 국제적으로 널리 사용되고 있다(OECD guideline, 1984). 또한, 지렁이 피부의 생체분자와 인간 피부의 생체분자(lipid extract)의 구성이 유사함이(Albro et al., 1997) 익히 알려진 사실이나 지렁이를 이용한 생태독성시험 평가방법이나 지렁이 피부 점액질 추출물을 이용한 화장품 조성물에 관한 연구만 있을 뿐, 지렁이를 피부모델로 이용하여 특정 피검물질의 피부 독성을 평가하는 방법에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다, On the other hand, earthworms are short-lived, and they become adults when they are 7 to 8 weeks after hatching. They are also widely used for toxicity test organisms (OECD guideline, 1984) because they have high reproductive rate, easy to breed and high sensitivity to test substance ). In addition, it is known that biomolecules of earthworm skin and lipid extract of human skin are similar in composition (Albro et al., 1997), but it is also known that the method of evaluating eco-toxicity using earthworms or using earthworm mucilage extract There is no known method for evaluating skin toxicity of a specific test substance by using earthworm as a skin model only in a study on a cosmetic composition,
따라서, 본 발명자들은 Skin irritation test(피부자극시험)에서 일반적으로 사용하는 동물실험의 윤리적인 문제와 경제적인 문제를 줄이고자 노력한 결과, 무척추동물인 지렁이를 피부독성 평가용 동물모델로 이용하여 소량의 피검물질을 사용해 피부 독성여부를 예민한 감도로 평가하는 방법을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to reduce the ethical problems and economical problems of animal experiments generally used in skin irritation test (skin irritation test), and as a result, they have found that the use of an invertebrate earthworm as an animal model for skin toxicity evaluation, The present inventors have completed the present invention by disclosing a method of evaluating skin toxicity with a sensitive sensitivity using a test substance.
본 발명은 윤리적으로 문제되고 있는 기존 동물실험을 대체하고 의약품 또는 화장품의 피부 독성을 예비-스크리닝(free-screening) 할 수 있는 피부 독성 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로 지렁이를 동물모델로 이용한 피부 독성 평가방법을 제공하기 위한 것이다.The present invention relates to a method for evaluating skin toxicity that can substitute for existing animal tests that are ethically problematic and free-screening the skin toxicity of pharmaceuticals or cosmetics. Specifically, the present invention relates to a skin toxicity evaluation method using an earthworm as an animal model To provide an evaluation method.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,
본 발명은 피부 독성 평가용 지렁이 동물모델을 제공한다.The present invention provides an earthworm animal model for skin toxicity evaluation.
또한, 본 발명은 In addition,
(a) 피검물질을 지렁이 피부 상에 처리하는 단계; 및(a) treating the test substance on the skin of the earthworm; And
(b) 지렁이 피부를 분석하는 단계를 포함하는, 피검물질의 피부독성의 in vivo 평가방법을 제공한다.(b) analyzing the earthworm skin to provide an in vivo evaluation method of skin toxicity of the test substance.
본 발명의 지렁이를 포함하는 피부 독성 평가용 동물모델 및 이를 이용한 피부 독성 평가방법은 인간 피부와 유사한 지질 특성을 가지면서 인간 피부보다 예민한 지렁이를 동물모델로 사용해 소량의 피검물질의 사용만으로 인간 피부에 미치는 피검물질의 독성을 효과적으로 예비-스크리닝(pre-screening)할 수 있고 일반적인 피부자극 동물실험에 드는 비용, 노동, 시간 및 윤리적 문제를 줄일 수 있다.The animal model for skin toxicity evaluation including the earthworm according to the present invention and the skin toxicity evaluation method using the animal worm include earthworms similar to human skin, Can effectively pre-screen the toxicity of the test substance and reduce the cost, labor, time, and ethical problems associated with general skin irritating animal experiments.
도 1은 지렁이 피부자극 평가 정의 및 관찰 예시를 나타낸다.
도 2는 지렁이 피부에 1.5 w/v% 트리클로산(Triclosan)을 처리하고 2시간, 24시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 3은 지렁이 피부에 8 w/v% 아세트산(Acetic acid)을 처리하고 2시간, 24시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 4는 지렁이 피부에 0.5 w/v% 황산(Sulfuric acid)을 처리하고 2시간, 24시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 5는 지렁이 피부에 2 w/v% 질산(Nitric acid)을 처리하고 2시간, 24시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 6은 지렁이 피부에 2 w/v% 소듐카보네이트(Sodium carbonate)를 처리하고 2시간, 24시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 7은 지렁이 피부에 80 w/v% 이소프로판올(Isopropanol)을 처리하고 2시간이 지난 후 지렁이 피부자극 관찰 결과를 나타낸다.
도 8은 상기 여섯 가지 시험물질 각각의 지렁이 피부자극 실험결과와 GHS 피부자극을 비교한 결과를 나타낸다.Figure 1 shows an earthworm skin irritation assessment definition and observation example.
Fig. 2 shows earthworm skin irritation observation results after treating earthworm skin with 1.5 w / v% triclosan for 2 hours and 24 hours.
FIG. 3 shows the result of observation of earthworm skin irritation after 2 hours and 24 hours after 8 w / v% acetic acid treatment of earthworm skin.
FIG. 4 shows observation results of earthworm skin irritation after treating earthworm skin with 0.5 w / v% sulfuric acid for 2 hours and 24 hours.
FIG. 5 shows the result of observing earthworm skin irritation after treating earthworm skin with 2 w / v% nitric acid for 2 hours and 24 hours.
FIG. 6 shows the result of observing earthworm skin irritation after 2 hours and 24 hours of treatment with earthworm skin 2 w / v% sodium carbonate.
FIG. 7 shows the observation result of earthworm skin irritation after 2 hours of treatment with earthworm skin with 80 w / v% isopropanol.
FIG. 8 shows the results of comparing the results of the earthworm skin irritation test and the GHS skin irritation of each of the six test substances.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 피부 독성 평가용 지렁이 동물모델을 제공한다.The present invention provides an earthworm animal model for skin toxicity evaluation.
상기 지렁이는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei), 줄지렁이(eisenia fetida) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정하지 않으며 붉은줄지렁이를 사용하는 것이 바람직하다.The earthworms are classified as red worms ( Eisenia andrei , eisenia fetida ) may be used, but it is not limited thereto and it is preferable to use red line earthworm.
상기 피부는 동물의 피부를 의미하며 동물의 종류를 특별히 한정하지 않으나, 인간 피부인 것이 바람직하다.The skin refers to the skin of an animal, and the kind of animal is not particularly limited, but human skin is preferred.
상기 피부 독성 평가란 피부에 필요적 또는 불가피하게 접촉하는 화학물질이 피부에 미치는 악영향을 미리 평가하는 방법을 말한다. 상기 피부에 미치는 악영향이란 피부조직의 괴사, 궤양, 출혈, 부종, 변색, 탈모, 건선 등의 피부질환 및 알레르기 반응 등을 말하며 화장품, 의약품 등에 다수 포함되어있는 화학물질의 위험성을 미리 평가하지 않고 무작위로 사용할 경우 예상치 못한 부작용의 발생 또는 피부상태가 악화될 위험이 있기 때문에, 이러한 제품의 시판 또는 사용 전에 피부 독성 평가를 수행하는 것이 바람직하다.The skin toxicity evaluation refers to a method of evaluating in advance the adverse effects of chemical substances which are necessary or inevitably brought into contact with the skin on the skin. The adverse effect on the skin refers to necrosis of skin tissue, ulcer, hemorrhage, swelling, discoloration, hair loss, skin diseases such as psoriasis, and allergic reaction, and it does not evaluate the risk of chemicals included in many cosmetics, medicines, It is desirable to perform a skin toxicity assessment prior to marketing or use of such products, since there is a risk of unexpected side effects or deterioration of the skin condition.
상기 동물모델은 지렁이를 이용한 동물모델로써, 보다 구체적으로 지렁이 피부를 의약품 또는 화장품의 피부 독성 평가용으로 사용한다. 독성 평가가 가능한 피검물질로는 피부에 도포되는 것이면 특별히 그 범위를 한정하지 않는다. The animal model is an animal model using earthworms, and more specifically, earthworm skin is used for skin toxicity evaluation of medicines or cosmetics. The test substance which can be evaluated for toxicity is not particularly limited as long as it is applied to the skin.
이하 실시예 및 실험예에서 지렁이를 동물모델로 사용하여 6가지 피검물질(트리클로산, 아세트산, 벤질알코올, 황산, 질산, 소듐카보네이트, 이소프로판올)의 인간 피부 독성 여부를 평가하였다.In the following Examples and Experiments, earthworms were used as an animal model to assess human skin toxicity of six test substances (triclosan, acetic acid, benzyl alcohol, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate, isopropanol).
그 결과 6가지 물질 모두에서 지렁이 피부자극(Earthworm irritation)이 확인되었으며 일반적인 동물실험보다 더 낮은 농도의 피검물질을 사용해 짧은 시간 동안 피부독성 여부를 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다. As a result, it was confirmed that earthworm irritation was confirmed in all of the six substances and screening of skin toxicity for a short time using a lower concentration of test substance than the general animal test was confirmed.
또한, 본 발명은 (a) 피검물질을 지렁이 피부 상에 처리하는 단계; 및 (b)지렁이 피부를 분석하는 단계를 포함하는 피검물질의 피부독성의 in vivo 평가방법을 제공한다.(A) treating the test substance on the skin of the earthworm; And (b) analyzing the skin of the test substance, including the step of analyzing the earthworm skin, in vivo Evaluation method.
상기 단계 (a)의 피검물질은 인간 피부에 도포되는 화학물질이면 특별히 그 범위를 한정하지 않으며, 피검물질의 형상에 특별한 제한은 없으나 액상, 고체, 과립, 분말, 에멀젼, 페이스트, 크림 또는 겔-타입 등의 상태일 수 있다. 사용가능한 피검물질로는 계면활성제, 화장품, 헤어염색제, 태닝제, 클렌져, 비누, 섬유유연제, 주방세제, 세탁세제, 탈취제 및 방향제 등을 사용할 수 있으며 적절하게는 유기에테르(organic ether), 카르복실산(Carboxylic acid), 무기산(Inorganic acid), 무기염(Inorganic salts) 및 알코올 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 트리클로산(Triclosan), 아세트산(Acetic acid), 황산(Sulfuric acid), 질산(Nitric acid), 소듐카보네이트(Sodium carbonate) 및 이소프로판올(Isopropanol)로 이루어진 군에서 선택되는 피검물질을 지렁이 피부에 도포해 피부 독성평가하는 것이 바람직하다. The test substance of step (a) is not particularly limited as long as it is a chemical substance applied to human skin, and the shape of the test substance is not particularly limited, but may be a liquid, a solid, a granule, a powder, an emulsion, a paste, Type or the like. Examples of the test substance that can be used include surfactants, cosmetics, hair dyes, tanning agents, cleansers, soaps, fabric softeners, kitchen detergents, laundry detergents, deodorants and fragrances, and suitably organic ethers, May be selected from the group consisting of carboxylic acids, inorganic acids, inorganic salts and alcohols or mixtures thereof. Preferably, a test substance selected from the group consisting of Triclosan, Acetic acid, Sulfuric acid, Nitric acid, Sodium carbonate and Isopropanol is applied to the skin of the earthworm It is desirable to evaluate skin toxicity.
지렁이 피부의 지질성분에는 광학적 활성을 가진 화합물로 5,7,9(11),22-ergostatetraen-3bT-ol (9-DHE) 및 5,7,9(11)-cholestatrien-3bT-ol (9-DDHC)가 포함되어 있다. 이 중 9-DHE는 인간 피부의 지질성분 중 하나로써 지렁이 피부와 인간 피부의 일부 지질성분이 유사함은 알려져있는 사실이다. 하지만 지렁이 피부와 인간 피부는 일부 성분만 유사할 뿐, 피부로 호흡하는 환형동물인 지렁이의 피부와 인간 피부의 기본적인 형태 및 구조는 매우 상이하다. 따라서 지렁이 피부를 이용해 인간 피부 독성 평가 스크리닝 방법을 고안하고, 지렁이 피부로 독성평가 가능한 특정 화합물을 찾아내는 것은 별도의 실험을 통하지 않고서는 쉽게 유추 가능한 것이 아니다.The lipid component of earthworm skin has optically
한편, 도포하는 피검물질의 적정농도 범위는 상기 트리클로산은 0.05 w/v% 내지 2.0 w/v%, 상기 아세트산은 1 w/v% 내지 20 w/v%, 상기 황산은 0.05 w/v% 내지 4 w/v%, 상기 질산은 0.2 w/v% 내지 5 w/v%, 상기 소듐카보네이트는 0.2 w/v% 내지 6 w/v%, 상기 이소프로판올은 10 w/v% 내지 90 w/v% 농도인 것이 적절하다. 바람직하게는 트리클로산 0.05 w/v% 내지 1.5 w/v% , 아세트산 2 w/v% 내지 15 w/v%, 황산 0.1 w/v% 내지 2 w/v%, 질산 0.5 w/v% 내지 2 w/v%, 소듐카보네이트 0.5 w/v% 내지 4 w/v%, 이소프로판올 60 w/v% 내지 80 w/v% 인 것이 바람직하다.On the other hand, a suitable concentration range of the test substance to be coated is 0.05 w / v% to 2.0 w / v% of the triclosan, 1 w / v% to 20 w / v% of the acetic acid, 0.05 w / % W / v% to 5 w / v% of sodium nitrate, 0.2 w / v% to 6 w / v% sodium carbonate, 10 w / v% to 90 w / v% isopropanol, Concentration. Preferably from 0.05 w / v% to 1.5 w / v% triclosan, from 2 w / v% to 15 w / v% acetic acid, from 0.1 w / v% to 2 w / v% sulfuric acid, from 0.5 w / v% w / v% of sodium carbonate, 0.5 w / v% to 4 w / v% of sodium carbonate, and 60 w / v% to 80 w / v% of isopropanol.
각각의 피검물질의 농도를 상기 적정 농도범위보다 낮은 농도를 지렁이에 도포할 경우, 화학물질이 지렁이 피부에 미치는 영향이 미미해 실험군 지렁이의 피부상태와 대조군 지렁이의 피부상태 비교시 특별한 차이가 나타나지 않아 부적절하며, 상기 적정 농도범위보다 높은 농도의 피검물질을 지렁이 피부에 도포해 스크리닝한 결과는 적정 농도범위로 피부독성을 스크리닝한 결과와 큰 차이가 없다. 따라서 상기 피검물질의 적정 농도범위로 피검물질의 독성여부를 판단하기 충분하므로 더 높은 농도의 피검물질을 사용하는 것은 비경제적이다.When the concentration of each test substance is applied to the earthworm at a concentration lower than the appropriate concentration range, the effect of the chemical substance on the earthworm skin is insignificant. Therefore, there is no particular difference in comparing the skin condition of the earthworm test earth with that of the control earthworm, The result of screening the earthworm with the test substance at a concentration higher than the appropriate concentration range is not significantly different from the result of screening for skin toxicity in an appropriate concentration range. Therefore, it is sufficient to judge whether the test substance is toxic to the appropriate concentration range of the test substance, so it is uneconomical to use the test substance at a higher concentration.
예를 들어, 도 8의 Hazard statement (GHS) 열에 나와있는 % 수치는 일반적인 동물실험(토끼 등)에서 피부독성을 야기하는 농도 범위를 나타낸다. 따라서, 트리클로산의 경우 GHS 결과 H315(Causes skin irritation)정도의 자극이 관찰되었으나 지렁이 피부의 경우 1.5% 농도에서 H315보다 심한 회복 불가능한 피부자극인 H314(Caues severe skin burns and eye damage)가 관찰되어 일반적인 동물실험에서 보다 민감한 피부자극을 나타내었다. 아세트산의 경우 GHS시험에서는 25% 이상의 농도에서 회복불가능한 피부 상태(H314)를 나타내었으나, 지렁이 피부에서는 10% 이상의 농도에서부터 회복 불가능한 피부자극(H314)이 관찰되었다. 황산의 경우 GHS시험에서는 15% 이상의 농도에서부터 회복 불가능한 피부자극(H314)이 관찰되었으나, 지렁이 피부독성 실험결과 0.5% 이상의 농도에서부터 동일한 피부자극이 관찰되었다. 질산의 경우 GHS시험에서는 20% 이상의 농도에서부터 회복 불가능한 피부자극(H314)이 관찰되었으나, 지렁이 피부의 경우 2% 이상의 농도에서부터 회복 불가능한 피부자극(H314)이 관찰되었다. 탄산나트륨 및 이소프로판올의 경우 GHS시험에서는 피부독성이 나타나지 않았으나, 지렁이 피부독성 실험결과 2% 농도이상의 탄산나트륨에서 H314가 나타났으며, 이소프로판올은 80%이상의 농도에서 H315 피부자극이 나타났다. 따라서, 피부자극 평가에서 일반적인 동물실험이 아닌 본 발명의 독성평가용 지렁이 동물모델을 사용할 경우, 더 적은 농도의 화학물질을 사용해 인간 피부자극 가능성을 프리 스크리닝할 수 있는 바, 보다 효율적인 독성평가 모델로 사용가능하다.For example, the% values in the Hazard Statement (GHS) column of Figure 8 indicate concentration ranges that cause skin toxicity in general animal experiments (such as rabbits). Therefore, in the case of triclosan, a stimulus of about H315 (Causes skin irritation) was observed in GHS result, but in case of earthworm skin, H314 (Caes severe skin burns and eye damage) The experiment showed more sensitive skin irritation. Acetic acid showed irreversible skin condition (H314) at a concentration of 25% or more in the GHS test, but irreversible skin irritation (H314) was observed in an earthworm skin at a concentration of 10% or more. In the case of sulfuric acid, irreversible skin irritation (H314) was observed from the concentration of 15% or more in the GHS test, but the same skin irritation was observed from the concentration of 0.5% or more in the earthworm skin toxicity test. In the case of nitric acid, irreversible skin irritation (H314) was observed from the concentration of 20% or more in the GHS test, but irreversible skin irritation (H314) was observed from the concentration of 2% or more in the case of the earthworm skin. Sodium carbonate and isopropanol did not show skin toxicity in the GHS test, but earthworm skin toxicity test showed H314 in sodium carbonate of 2% concentration and H315 skin irritation in isopropanol in 80% or more concentration. Thus, when using the animal model of toxicity assessment of earthworms according to the present invention, rather than a general animal experiment in the assessment of skin irritation, it is possible to pre-screen the possibility of human skin irritation using a lower concentration of chemicals, Available.
한편, 트리클로산(Triclosan), 아세트산(Acetic acid), 황산(Sulfuric acid), 질산(Nitric acid), 소듐카보네이트(Sodium carbonate) 및 이소프로판올(Isopropanol)은 식품의약품안전처의 독성정보제공시스템에 등록된 독성물질로써 사람에게 투여 시 또는 피부에 도포한 후의 증상 등이 익히 알려져 있으며 피부독성이 보고된 물질들이다. 본 발명자들은 하기 실시예 및 실험예에서 나타낸 바와 같이 상기 6개의 화학물질을 지렁이 피부에 도포해 피부 독성 여부를 예비-스크리닝하였으며 그 결과, 지렁이 피부를 이용해서도 상기 6개의 화합물의 피부 독성을 확인할 수 있었다.Triclosan, acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate and isopropanol are toxic substances registered in the toxicological information system of the Food and Drug Administration The substance is known to be toxic to the skin and is well known for its use in humans or after application to the skin. As shown in the following Examples and Experimental Examples, the present inventors applied the six chemical substances to earthworm skin to preliminarily screen skin toxicity, and as a result, they confirmed skin toxicity of the six compounds using earthworm skin I could.
한편, 상기 단계(a)의 피검물질을 지렁이 피부 상에 처리하는 단계에서 도포하는 방법은 붓으로 피검물질을 도포하는 방법, 스프레이로 피검물질을 분사해 도포하는 방법, 액체상태의 피검물질에 지렁이를 침수시키는 방법 등 다양한 방법으로 도포할 수 있으며 특정 방법으로 한정되는 것은 아니지만 시험물질을 붓을 담근 후 적당량을 취해 지렁이 피부표면에 피검물질을 도포하는 것이 바람직하다. 이 때 시험물질의 호흡, 섭취 등에 지렁이가 영향을 받는 것을 방지하기 위하여 지렁이 환대를 기준으로 환대 하단부터 꼬리까지만 시험물질을 노출시킨다. 한편, 피검물질 도포시 환경 조건은 20℃ 내지 30℃ 온도인 것이 적절하며 암조건에서 시험물질을 노출시키는 것이 바람직하다. On the other hand, the method of applying the test substance of step (a) in the step of treating earthworms on the skin includes a method of applying a test substance with a brush, a method of spraying a test substance by spraying, A method of immersing the test substance in water, and the method is not limited to a specific method. However, it is preferable to immerse a test substance in a brush, and then take an appropriate amount of the test substance and apply the test substance to the surface of the earthworm. In order to prevent the earthworm from being affected by respiration and ingestion of the test substance, the test substance is exposed only from the bottom to the tail of the earth based on earthworm hospitality. On the other hand, it is preferable that the environmental condition at the time of applying the test substance is a temperature of 20 to 30 캜, and it is preferable to expose the test substance under the dark condition.
한편, (a)단계 처리 이후, 1시간 내지 26시간 후 지렁이 피부의 상태를 관찰한다. 적절하게는 1 내지 3시간 이내 1차 관찰, 22시간 내지 26시간 이내 2차 관찰하는 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 피검물질 노출 후 2시간 후 1차 관찰, 24시간 후 2차 관찰하는 것이 바람직하다. 기존 실험동물을 이용한 피부자극 실험에서는 관찰시점을 4시간과 14일로 정하고 자극에 의한 피부의 변화 등을 관찰한 후 피검물질의 피부자극 여부를 결정하지만, 본 발명의 지렁이를 이용할 경우 일반 동물실험보다 더 민감한 반응이 관찰되므로 노출시간을 2시간과 24시간으로 단축해 시험하는 것이 적절하다. 피검물질 노출 후 1시간 미만의 시간이 지난 후 지렁이 피부를 관찰할 경우, 지렁이 피부에 흡수된 피검물질이 피부변화를 충분히 일으키기에 짧은 시간으로 부적절하며, 피검물질 노출 후 26시간 이후 관찰할 경우, 24시간이 지난 후의 피부상태를 관찰한 후 피검물질의 독성수준을 파악하는 것과 비교해 큰 차이가 없고 불필요하게 실험시간이 길어져 비효율적이다. On the other hand, after the step (a), the condition of the earthworm skin is observed after 1 to 26 hours. It is preferable to carry out the first observation within 1 to 3 hours and the second observation within 22 to 26 hours, more preferably the first observation after 2 hours from the exposure of the test substance and the second observation after 24 hours . In the skin irritation experiment using the existing experimental animals, the observation time is set to 4 hours and 14 days, and skin irritation is determined after the observation of the skin change by stimulation. However, when the earthworm of the present invention is used, Since more sensitive reactions are observed, it is appropriate to test the exposure time to 2 hours and 24 hours. When earthworm skin is observed after less than 1 hour from the exposure of the test substance, the test substance absorbed by the earthworm skin is inadequate for a short period of time to sufficiently cause skin changes. If the test substance is observed after 26 hours from the exposure of the test substance, There is no significant difference compared to the determination of the toxicity level of the test substance after observing the skin condition after 24 hours, and the test time is unnecessarily long and is inefficient.
상기 (b)단계는 피검물질 도포 후 피부에 발생한 피부자극을 관찰하며, 피부의 괴사, 궤양, 출혈, 부종, 변색 및 탈모로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 관찰 및 분석하는 것을 특징으로 한다. 피부의 변화를 관찰하는 방법으로는 육안 관찰도 가능하나 현미경을 사용해 관찰하는 것이 적절하며, 현미경의 배율은 지렁이의 크기, 피부에 발생한 상처의 형태, 피부상태 등에 따라 적절한 범위에서 조정할 수 있고 특정 배율에 한정되는 것은 아니다. 상기 단계 (a) 및 (b)의 피부독성 평가 방법은 8회 내지 30회 반복 수행하는 것이 적절하다. In the step (b), skin irritation occurring on the skin after application of the test substance is observed, and at least one selected from the group consisting of skin necrosis, ulcer, bleeding, edema, discoloration and hair loss is observed and analyzed . The method of observing changes of the skin can be visual observation but it is appropriate to observe using a microscope. The magnification of the microscope can be adjusted in an appropriate range according to the size of the earthworm, the shape of the wound on the skin, the skin condition, . It is appropriate that the skin toxicity evaluation method of steps (a) and (b) is repeated 8 to 30 times.
상기 단계 (a), (b)의 피부독성 평가방법으로 관찰한 지렁이 피부상태에 대한 실험 데이터를 기반으로 피검물질의 피부 독성 여부를 평가한다. 피검물질의 분류 표시에 대한 세계조화시스템(GHS, Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals)에 근거하여 노출 2시간 후 지렁이 개체수 절반 이상에서 피부 자극이 발현되고 24시간 후 자극부위가 더 악화된 경우 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가하고, 완화된 경우 Earthworm-H315(Earthworm irritation)으로 평가한다(도1 참조).The skin toxicity of the test substance is evaluated based on the experimental data on the earthworm skin condition observed by the skin toxicity evaluation method of steps (a) and (b) above. Based on the Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS) for the classification of the test substance, skin irritation is expressed in more than half of the earthworm population after 2 hours of exposure and the irritation site becomes worse after 24 hours Earthworm-H314 (Earthworm corrosion), and if mitigated, Earthworm-H315 (Earthworm irritation) (see FIG. 1).
이하 실시예 및 실험예에서 6가지 피검물질(트리클로산, 아세트산, 벤질알코올, 황산, 질산, 소듐카보네이트, 이소프로판올)에 대해 무척추동물인 지렁이피부를 이용한 피부자극성 평가 및 그 결과를 나타내었다.In the following Examples and Experimental Examples, skin irritation evaluation using earthworm, which is an invertebrate for six test substances (triclosan, acetic acid, benzyl alcohol, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate and isopropanol), and the results are shown.
그 결과 6가지 물질 모두 지렁이피부에서 일반적인 동물실험보다 더 낮은 농도를 사용해 짧은 시간 동안 실험한 결과 피부자극이 관찰되었으며 상기 6가지 물질의 피부독성을 확인하였기에, 피부자극 동물실험보다 더 민감한 대체시험법으로 활용할 수 있다.As a result, all of the six substances were tested for a short period of time using lower concentrations than those of animal experiments in earthworm skin. Skin irritation was observed and skin toxicity of the six substances was confirmed. Therefore, .
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 피부자극 시험을 위한 지렁이의 준비 1> Preparation of earthworm for skin irritation test
피부자극 시험을 수행하기 위하여, 시험종은 국내외에서 쉽게 찾아볼 수 있고 흔히 배양되고 있는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei)를 이용하였다, 붉은줄지렁이는 OECD 인공토양에 스파그넘 피트모스(Sphagnum Peatmoss)를 추가한 배양토를 처리하고 20℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 제작된 배양토는 2주에 한 번 갈아주었으며 충분한 수분공급을 하며 관리하였다. 시험 3시간 전에 시험에 사용할 지렁이 300 - 600 mg을 골라내 세척 후 여과지(Filter paper)에서 내장 내용물(Gut)을 제거하고 사용하였다.In order to carry out the skin irritation test, the test species used Eisenia andrei , which is easily cultivated at home and abroad, and the red line earthworm was added to the OECD artificial soil by adding Sphagnum Peatmoss One cultured soil was treated and cultured in a 20 ° C incubator. The cultivated soil was changed once every 2 weeks and was administered with sufficient water supply. Three to eight hours prior to the test, 300 - 600 mg of earthworms for use in the test were selected and washed, and the gut was removed from the filter paper.
<< 실시예Example 2> 시험물질의 준비 2> Preparation of Test Article
시험물질로 트리클로산(Triclosan), 아세트산(Acetic acid), 황산(Sulfuric acid), 질산(Nitric acid), 소듐카보네이트(Sodium carbonate), 이소프로판올(Isopropanol)을 선정하여 피부자극 실험을 수행하였다. 각 물질은 Signa-Aldrich 및 DUCKSAN에서 공급받았다. 하기 표 1에 사용한 시험물질과 시험농도를 표기하였으며 트리클로산은 50% 에탄올을 용매로 사용하였고, 그 외 아세트산, 황산, 질산, 소듐카보네이트 및 이소프로판올은 증류수를 용매로 사용하여 시험용액을 제조하였다.Triclosan, acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate, and isopropanol were selected as test substances and skin irritation experiments were conducted. Each material was supplied by Signa-Aldrich and DUCKSAN. Test substances and test concentrations used in the following Table 1 were used. Triclosan was used as a solvent in 50% ethanol. In addition, acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate and isopropanol were prepared by using distilled water as a solvent.
<< 실시예Example 3> 지렁이를 이용한 피부자극 평가방법 3> Evaluation method of skin irritation using earthworm
피검물질의 피부자극 정도는 피검물질의 분류 표시에 대한 세계조화시스템(GHS, Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals)에 근거하여 Category 1: Corrosive(H314)한 물질과, Category 2: Irritant(H315)(표 2)로 구분되며 이를 기준으로 지렁이 피부자극 실험에 적용하였다.The degree of skin irritation of the test substance is classified into Category 1: Corrosive (H314) and Category 2: Irritant (H315) based on the Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS) ) (Table 2), and applied to earthworm skin irritation test.
* 물질에 최대 4시간 이내로 노출시키고 최대 14일까지 관찰했을 때 실험동물 중 1/3에서 표피에 회복불능의 괴사, 궤양, 출혈 딱지, 변색, 탈모가 일어나는 물질을 Category 1로 구분함. Category 1은 Subcategory로 1A, 1B, 1C로 구분함.
* Labelling은 H314 정의를 활용해 Earthworm-H314로 표기함.
H314-Causes severe skin burns and eye damage
*
* Labeling refers to Earthworm-H314 using the H314 definition.
H314-Causes severe skin burns and eye damage
* 물질에 최대 4시간 이내로 노출시켰을 때, 시험동물 중 2/3에 회복가능한 손상을 주는 물질을 Category 2로 분류함.
*Labelling은 H315 정의를 활용해 Earthworm-H315로 표기함.
H315-Causes skin irritation
Classify substances that give recoverable damage to 2/3 of the test animals when exposed to the substance for up to 4 hours.
* Labeling is defined as Earthworm-H315 using the H315 definition.
H315-Causes skin irritation
구체적으로 기존 실험동물을 이용한 피부자극 실험에서는 관찰시점을 4시간과 14일로 정하고 자극 정도에 따라 피검물질의 피부자극을 결정하지만 지렁이를 이용할 경우 일반 동물실험보다 더 민감한 반응이 관찰되므로 노출시간을 2시간과 24시간으로 단축시켜 피부자극 실험을 실시하였다. 노출 2시간 후 지렁이 개체수 절반 이상에서 피부 자극이 발현되고 24시간 후 자극부위가 더 악화된 경우 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가하였으며, 완화된 경우 Earthworm-H315(Earthworm irritation)으로 평가하였다(도 1).Specifically, in the skin irritation experiment using existing experimental animals, the observation time is set to 4 hours and 14 days, and the skin irritation of the test substance is determined according to the degree of stimulation. However, when the earthworm is used, a more sensitive reaction is observed than the general animal test. Time and 24 hours, respectively. After 2 hours of exposure, skin irritation was observed at more than half of the earthworm population, and when the irritation site became worse after 24 hours, it was evaluated as Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) and when mitigated, it was evaluated as Earthworm-H315 One).
<< 실시예Example 4> 지렁이4> Earthworm 피부에 시험물질 노출 및 현미경을 이용한 피부자극 정도 관찰 방법 Exposure of test material to skin and observation of skin irritation using microscope
페트리 디쉬(petri dish) 90×15 mm를 실험용기로 이용하였으며, 100×100 mm의 필터페이퍼에 증류수 2350 ㎕를 적셔 수분을 고정시키고 준비된 지렁이를 필터 페이퍼 위에 위치시켰다. 상기 <실시예 2>에서 제조한 시험물질에 세필붓을 담근 후 3회 정도 털어내어 적당량을 취한 후 지렁이 피부표면에 1회 접촉시켜 피검물질을 노출시켰다. 이 때 시험물질의 호흡, 섭취 등에 지렁이가 영향을 받는 것을 방지하기 위하여 지렁이 환대를 기준으로 환대 하단부터 꼬리까지만 시험물질을 노출시켰다. 25℃ 암조건에서 시험물질 노출 후 2시간, 24시간이 지난 후 개체별로 현미경관찰(x30)을 진행하여 피부자극 정도를 관찰해 지렁이 피부자극성을 평가하였다.A petri dish (90 × 15 mm) was used as a test vessel, and 2300 μl of distilled water was immersed in 100 × 100 mm filter paper to immerse the water, and the prepared earthworm was placed on the filter paper. A specimen brush was immersed in the test material prepared in the above <Example 2>, and then shaken for about 3 times to take an appropriate amount. Then, the test article was exposed by contacting the surface of the earthworm once with the earthworm. In order to prevent the earthworm from being affected by respiration and ingestion of the test substance, the test substance was exposed only from the bottom to the tail according to earthworm hospitality. After 2 hours and 24 hours after exposure to the test substance at 25 캜 in dark condition, the skin irritation was evaluated by observing the degree of skin irritation by subjecting each individual to a microscopic observation (x30).
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 트리클로산을Triclosan 이용한 피부 자극 실험 Used skin irritation experiment
<실시예 2>에서 제조한 트리클로산을 시험용액으로 준비한 후 상기 <실시예 4>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다. 0 w/v% 트리클로산은 50 w/v% 에탄올만 포함되어 있는 시험용액으로 평가한 것이다. The triclosan prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and an earthworm skin irritation evaluation was conducted according to the method described in Example 4 above. 0 w / v% Triclosan was evaluated with a test solution containing only 50 w / v% ethanol.
그 결과, 하기 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이 0 w/v% 트리클로산을 처리한 그룹의 지렁이 8개체 중 6개체의 피부에 아무런 변화가 나타나지 않았으며 0.05 - 1 w/v% 트리클로산 노출군에서는 8개체 중 4개체의 피부에 아무런 변화가 나타나지 않았다. 반면 1.5 w/v%의 트리클로산의 경우 노출시킨 지렁이 20개체 중 7개체의 피부에는 아무런 변화가 나타나지 않았으나 4개체에서는 24시간 이후 회복가능한 또는 회복되는 피부자극(irritation)이 관찰되었으며, 9개체에서는 24시간 이후 피부자극이 더욱 악화되는 것을 확인하였다. 따라서 <실시예 3>에 기재한 평가방법에 따라 1.5 w/v% 트리클로산에서 Earthworm class를 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 2).As a result, as shown in the following Table 3 and FIG. 2, no change was observed in the skin of 6 of 8 earthworms treated with 0 w / v% triclosan, and in the 0.05 - 1 w / v% triclosan exposed group No change was observed in the skin of 4 of 8 individuals. On the other hand, in the case of 1.5 w / v% of triclosan, no change was observed in the skin of 7 individuals out of 20 exposed earthworms. In 4 individuals, irritation was recovered or recovered after 24 hours, After the time, the skin irritation became worse. therefore It was confirmed that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) in 1.5 w / v% triclosan according to the evaluation method described in Example 3 (Fig. 2).
(H314)(H314)
effecteffect
<< 실험예Experimental Example 2> 아세트산을 이용한 피부 자극 실험 2> Skin stimulation experiment using acetic acid
<실시예 2>에서 제조한 아세트산(Acetic acid)을 시험용액으로 준비한 후 상기 <실험예 1>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다. Acetic acid prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and the evaluation of earthworm skin irritation was carried out according to the method described in <Experimental Example 1>.
그 결과, 표 4 및 도 3에 나타낸 바와 같이 아세트산의 경우 0 - 4 w/v% 농도까지는 70%의 지렁이에서 피부에 아무런 변화가 나타나지 않았다. 그러나 8 w/v% 아세트산의 경우 총 10개체 중 5개체 지렁이에서 피부자극이 관찰되었으며 그 중 1개체에서는 24시간 이후 회복 가능한 피부자극(irritation)이 관찰되었고 4개체에서는 24시간 이후 피부자극이 더욱 악화되는 것으로 확인되었다. 한편 아세트산의 농도를 15 w/v%까지 증가시킬 경우 피부자극 중 회복 불가능한 손상으로 평가할 수 있는 earthworm corrosion이 나타났다. 따라서 <실시예 3>에 기재한 평가방법에 따라 8 w/v% 아세트산에서 Earthworm class를 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 3).As a result, as shown in Table 4 and FIG. 3, no change was observed in the skin of 70% of earthworm up to the concentration of 0 - 4 w / v% of acetic acid. However, in 8 w / v% acetic acid, skin irritation was observed in 5 out of 10 individuals. Among them, irritation was recovered after 24 hours in one of them, and skin irritation was recovered after 24 hours in 4 individuals It was confirmed to be exacerbated. On the other hand, when the concentration of acetic acid was increased to 15 w / v%, earthworm corrosion could be evaluated as irreversible damage during skin irritation. Therefore, it was confirmed that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) at 8 w / v% acetic acid according to the evaluation method described in Example 3 (FIG. 3).
<< 실험예Experimental Example 3> 황산을 이용한 피부 자극 실험 3> Skin stimulation experiment using sulfuric acid
<실시예 2>에서 제조한 황산(Sulfuric acid)을 시험용액으로 준비한 후 상기 <실험예 1>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다. Sulfuric acid prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and the evaluation of earthworm skin irritation was carried out according to the method described in <Experimental Example 1>.
그 결과, 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이 황산의 경우 0 - 0.2 w/v% 농도까지는 80%의 지렁이에서 피부에 아무런 변화가 나타나지 않았다. 그러나 0.5 w/v% 황산의 경우 총 지렁이 30개체 중 25개체에서 피부자극이 관찰되었으며 그 중 6개체에서는 24시간 이후 회복 가능 또는 회복되는 피부자극(irritation)이 관찰되었고 19개체에서는 24시간 이후 피부자극이 더욱 악화됨을 확인할 수 있었다. 한편 황산의 농도를 2 w/v%까지 증가시킬 경우 노출군의 절반 이상에서 피부 자극 중 회복 불가능한 손상으로 평가할 수 있는 earthworm corrosion이 나타났다. 또한 고농도인 1 - 2 w/v% 황산 노출군에서도 절반이상의 개체에서 피부자극 중 회복 불가능한 손상으로 평가할 수 있는 earthworm corrosion이 나타났다. 따라서 <실시예 3>에 기재한 평가방법에 따라 0.5 w/v% 황산에서 Earthworm class를 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 4).As a result, as shown in Table 5 and Fig. 4, in the case of sulfuric acid, no change was observed in 80% of the earthworm until the concentration of 0 - 0.2 w / v%. However, in 0.5 w / v% sulfuric acid, skin irritation was observed in 25 out of 30 earth worms. In 6 of them, irritation was recovered or recovered after 24 hours, It was confirmed that the stimulation was further deteriorated. On the other hand, when the concentration of sulfuric acid was increased to 2 w / v%, earthworm corrosion was found to be evaluated as irreversible damage during skin irritation in more than half of the exposed group. Also, in the high concentration of 1 - 2 w / v% sulfuric acid exposed group, more than half of the individuals showed earthworm corrosion which can be evaluated as irreversible damage during skin irritation. Therefore, it was confirmed that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) in 0.5 w / v% sulfuric acid according to the evaluation method described in Example 3 (FIG. 4).
(H314)(H314)
<< 실험예Experimental Example 4> 질산을 이용한 피부 자극 실험 4> Skin stimulation experiment using nitric acid
<실시예 2>에서 제조한 질산(Nitric acid)을 시험용액으로 준비한 후 상기 <실험예 1>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다.Nitric acid prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and then earthworm skin irritation evaluation was performed according to the method described in <Experimental Example 1>.
그 결과, 표 6 및 도 5에 나타낸 바와 같이 질산의 경우, 0 - 1 w/v% 농도까지는 70%의 지렁이에서 피부에 아무런 변화가 나타나지 않았다. 그러나 2 w/v% 질산의 경우 총 지렁이 30개체 중 23개체에서 피부자극이 관찰되었으며 그 중 한 개의 개체에서는 24시간 이후 회복 가능 또는 회복되는 피부자극(irritation)이 관찰되었으며, 22개체에서는 24시간 이후 피부자극이 더욱 악화됨을 확인하였다. 따라서 <실시예 3>에 기재한 평가방법에 따라 2 w/v% 질산에서 Earthworm class를 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 5).As a result, as shown in Table 6 and Fig. 5, in the case of nitric acid, no change was observed in the skin in the earthworm of 70% up to the concentration of 0-1 w / v%. However, in 2 w / v% nitric acid, skin irritation was observed in 23 out of 30 earthworms. In one of them, irritation was recovered or recovered after 24 hours, After that, it was confirmed that the skin irritation became worse. Therefore, it was confirmed that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) in 2 w / v% nitric acid according to the evaluation method described in Example 3 (FIG. 5).
<< 실험예Experimental Example 5> 5> 소듐카보네이트를Sodium carbonate 이용한 피부 자극 실험 Used skin irritation experiment
<실시예 2>에서 제조한 소듐카보네이트(Sodium carbonate)을 시험용액으로 준비한 후, 상기 <실험예 1>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다.Sodium carbonate prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and then an earthworm skin irritation evaluation was carried out according to the method described in <Experimental Example 1>.
그 결과, 표 7 및 도 6에 나타낸 바와 같이 소듐카보네이트 0 - 1 w/v% 농도까지는 70%의 지렁이의 피부에 아무런 변화가 발생하지 않았다. 그러나 2 w/v% 소듐카보네이트의 경우, 총 지렁이 10개체 중 5개체에서 피부자극이 관찰되었으며 그 중 1개체에서는 24시간 이후 회복 가능 또는 회복되는 피부자극(irritation)이 관찰되었고 4개체에서는 24시간 이후 피부자극이 더 악화되는 것으로 확인하였다. 또한 고농도인 3 - 4 w/v% 소듐카보네이트 노출군 개체의 절반에서 earthworm irritation 또는 earthworm corrosion이 나타났다. 따라서 실시예 3에 기재한 평가방법에 따라 0 - 1 w/v% 농도의 소듐카보네이트에서 Earthworm class를 Earthworm-H314(Earthworm corrosion)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 6). As a result, as shown in Table 7 and FIG. 6, no change was observed in the skin of 70% earthworm up to the concentration of 0 - 1 w / v% of sodium carbonate. However, in the case of 2 w / v% sodium carbonate, skin irritation was observed in 5 out of 10 earth worms. In 1 of them, skin irritation was recovered or recovered after 24 hours, And the skin irritation was further deteriorated. In addition, earthworm irritation or earthworm corrosion appeared in half of the high exposure group of 3 - 4 w / v% sodium carbonate exposure. Therefore, according to the evaluation method described in Example 3, it was confirmed that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H314 (Earthworm corrosion) in sodium carbonate of 0-1 w / v% concentration (FIG. 6).
<< 실험예Experimental Example 6> 이소프로판올을 이용한 피부 자극 실험 6> Skin stimulation experiment using isopropanol
<실시예 2>에서 제조한 이소프로판올(Isopropanol)을 시험용액으로 준비한 후, 상기 <실험예 1>에 기재된 방법에 따라 지렁이 피부자극성 평가를 수행하였다.Isopropanol prepared in Example 2 was prepared as a test solution, and an earthworm skin irritation evaluation was carried out according to the method described in <Experimental Example 1>.
그 결과, 표 8 및 도 7에 나타낸 바와 같이 이소프로판올의 경우 0 - 70 w/v% 농도까지는 70%의 지렁이에서 피부에 아무런 변화가 발생하지 않았다. 그러나 80 w/v% 이소프로판올의 경우 총 30개체 중 15개체에서 자극이 나타났으며 모두 회복 가능 또는 회복되는 피부자극(irritation)이 관찰되었다. 따라서 본 시험법을 통해 80 w/v% 이소프로판올에서 Earthworm class를 Earthworm-H315(Earthworm irritation)으로 평가할 수 있음을 확인하였다(도 7).As a result, as shown in Table 8 and FIG. 7, in the case of isopropanol, no change occurred in the skin of 70% of earthworm up to the concentration of 0 - 70 w / v%. However, in the case of 80 w / v% isopropanol, irritation was observed in 15 out of 30 individuals and irritation was recovered or recovered. Therefore, it was confirmed by this test method that the Earthworm class can be evaluated by Earthworm-H315 (Earthworm irritation) in 80 w / v% isopropanol (FIG. 7).
Claims (12)
(b) 지렁이 피부를 분석하는 단계를 포함하고
여기에서, 단계 (a) 처리 이후, 1 내지 3시간 내 지렁이 피부를 1차 분석하고, 22시간 내지 26시간 이내 지렁이 피부를 2차 분석하며, 단계 (b)는 지렁이 피부의 괴사, 궤양, 출혈, 부종, 변색 및 탈모로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 분석하는, 피검물질 내 아세트산 1 w/v% 내지 20 w/v%, 황산 0.05 w/v% 내지 4 w/v%, 질산 0.2 w/v% 내지 5 w/v%, 소듐카보네이트 0.2 w/v% 내지 6 w/v%, 이소프로판올 10 w/v% 내지 90 w/v% 농도로 함유가능성에 대한 정보를 제공하기 위한, 피검물질의 피부독성의 in vivo 평가방법.
(a) treating the test substance with the earthworm skin on the filter paper containing water; And
(b) analyzing the earthworm skin,
Here, after the step (a) treatment, the earthworm skin is firstly analyzed within 1 to 3 hours, and the earthworm skin is analyzed secondarily within 22 to 26 hours. Step (b) 1 w / v% to 20 w / v% of acetic acid, 0.05 w / v% to 4 w / v% of sulfuric acid, 0.2 w / v% of nitric acid, to provide information on the likelihood of inclusion in a concentration of 5 w / v% to 5 w / v%, sodium carbonate 0.2 w / v% to 6 w / v%, and isopropanol 10 w / v% to 90 w / v% Method for in vivo evaluation of skin toxicity of a substance.
The method of claim 5, wherein the earthworm is selected from the group consisting of red worms ( Eisenia andrei) or line earthworms (Eisenia fetida) in the in vivo toxicity of a test substance to the skin, characterized Assessment Methods.
The method of claim 5, wherein the test substance is a liquid, solid, granular, powder, emulsion, paste, cream or gel - in vivo evaluation of dermal toxicity of the method, a test substance, characterized in that type.
6. The method of claim 5, wherein the material to be tested is selected from the group consisting of surfactants, cosmetics, hair dyes, tanning agents, cleansers, soaps, fabric softeners, kitchen detergents, laundry detergents, deodorants, ≪ / RTI > in vivo .
6. The method of claim 5, wherein the analyte is selected from the group consisting of acetic acid, sulfuric acid, nitric acid, sodium carbonate, isopropanol, Wherein said method comprises the steps of:
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003101187A1 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Raven Biotechnologies, Inc. | Animal model for toxicology and dose prediction |
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-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003101187A1 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Raven Biotechnologies, Inc. | Animal model for toxicology and dose prediction |
| KR101308359B1 (en) | 2011-12-14 | 2013-09-16 | 서울시립대학교 산학협력단 | Procedure for testing soil ecotoxicity of nanomaterials by using soil exposure method |
| JP2014240825A (en) * | 2012-07-10 | 2014-12-25 | 国立大学法人信州大学 | Analysis method and analysis device of soil biochemical characteristics |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ‘무척추동물을 이용한 피부독성 대체시험법 기초연구’, 곽진일 등, 환경독성보건학회 심포지엄 및 학술대회집 pp166(2009.11.30. 공개)* |
| Dasong Lin 등, Chemosphere vol.81 pp.1328-1333(2010.09.09. 공개)* |
| Earthworm Biomarkers in Ecological Risk Assessment(2005.12.31.)* |
| Eye Irritation Skin Irritationa and Skin Sensitization Studies on Surfactin C, 실험동물학회지 137-138 페이지(2008.12.12. 공개) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109953001A (en) * | 2019-03-06 | 2019-07-02 | 浙江省农业科学院 | Cadmium and Pesticide Atrazine, chlopyrifos are to the joint toxicity test method of earthworm |
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