KR101913199B1 - Biomarkers for diagnosing Fabry disease and the use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물 및 파브리병 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하거나 파브리병을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 파브리병의 진단 및 치료 효과 평가와 관련된 신규 바이오 마커로서 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)를 발굴하였다. 상기 iC3b는 정상 대조군에 비해 파브리병 환자에서 발현 수준이 높아 이를 이용해 파브리병을 진단할 수 있으며, 나아가 효소 치료 후 장기적으로 상기 마커의 발현 양상이 점진적으로 변하므로, 파브리병 치료 과정에서 질환의 자연경과와 치료 효과를 판명하는데 중요한 바이오 마커로 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease and a composition for diagnosing Fabry disease, a kit comprising the composition, and a method for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease using the composition, And a method for providing information for diagnosing Fabry disease.
In the present invention, an inactive complement component 3b (iC3b) was unearthed as a new biomarker related to diagnosis and therapeutic effect evaluation of Fabry disease. The expression level of iC3b in Fabry disease is higher than that of normal control, so that it is possible to diagnose Fabry disease by using it. Further, since the expression pattern of the marker gradually changes after the enzyme treatment, It can be used as an important biomarker to elucidate the progress and therapeutic effect.

Description

파브리병 진단용 바이오마커 및 이의 용도 {Biomarkers for diagnosing Fabry disease and the use thereof}Biomarkers for diagnosis of Fabry disease and uses thereof

본 발명은 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물 및 파브리병 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 조성물을 이용하여 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하거나 파브리병을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 파브리병에 대한 효소 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease and a composition for diagnosing Fabry disease, a kit comprising the composition, a method for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease using the composition, A method for providing information for diagnosing a disease, and a method for screening an enzyme therapeutic for Fabry disease.

파브리병 (Fabry disease)은 X-염색체 연관 열성 유전 질환의 하나로 대표적인 리소좀 저장 질환 (Lysosomal Storage Disease; LSD)에 해당한다. 상기 파브리 질환은 리소좀 효소인 알파-갈락토시다아제 A (α-Galactosidase A)의 결핍으로 야기되는 것으로 알려져 있다. 알파-갈락토시다아제 A는 당지질의 말단 부위에 존재하는 알파-갈락토스 (α-Galactose) 결합 부위를 가수분해시키는 작용을 하는 효소로서, 상기 효소가 결핍되는 경우 체내에 말단 알파-갈락토스 잔기를 포함하는 당지질이 축적되어 파브리병이 발병되게 된다. Fabry disease is one of the X-chromosome-associated recessive genetic diseases, and is representative of Lysosomal Storage Disease (LSD). The Fabry disease is known to be caused by deficiency of the lysosomal enzyme alpha -galactosidase A. The α-galactosidase A is an enzyme that hydrolyzes the α-Galactose binding site present at the terminal region of the glycolipid. When the enzyme is deficient, it contains terminal α-galactose residues in the body The accumulation of glycolipids will result in the onset of Fabry disease.

상기 효소의 결핍으로 축적되는 주요 당지질은 관용명으로 트리헥소실라미드 (Trihexosylceramide)라고 불리는 글로보트리아오실세라미드 (Globotriaosylceramide; Gb3 또는 GL3)로, 이 물질은 환자의 혈장 내에 다량 분포하고 신장, 간, 심장, 비장 등 신체 각 장기에 축적되어 이들 장기들의 기능부전을 유발하고 만성 통증, 각막 혼탁, 자율 신경 기능 이상, 피부 상해 등을 다양한 증상을 일으킬 수 있으며 급기야는 사망에까지 이르게 한다. 특히 혈장과 직접 접촉하는 혈관내피세포는 Gb3가 축적되는 가장 대표적인 세포로 혈관내피세포 기능부전은 혈관기능 부전에 의한 혈관질환과 파브리병의 특징적인 신장 질환을 유발한다고 알려져 있다 (R.J. Desnick et al., α-Galactosidase A deficiency: Fabry disease, in: C.R. Scriver et al., The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th ed., McGraw-Hill, New York, 2001, pp. 3733-3774). 따라서 파브리병을 조기에 진단하는 것과 파브리병의 치료 과정에서 치료 효과를 평가하는 것이 매우 중요하다.The main glycolipid accumulated by the deficiency of the enzyme is globotriaosylceramide (Gb3 or GL3), commonly known as trihexosylceramide. This substance is distributed in a large amount in the plasma of the patient, Heart, and spleen, which can cause various dysfunctions such as chronic pain, corneal opacity, autonomic dysfunction, and skin injury, leading to death. In particular, vascular endothelial cells in direct contact with plasma are the most representative cells in which Gb3 accumulates. Vascular endothelial dysfunction is known to induce vascular diseases caused by vascular dysfunction and characteristic renal diseases of Fabry disease (RJ Desnick et al. , α-Galactosidase A deficiency: Fabry disease, in: CR Scriver et al., The metabolic and molecular bases of inherited disease, 8th ed., McGraw-Hill, New York, 2001, pp. 3733-3774). Therefore, it is very important to diagnose Fabry disease early and to evaluate the therapeutic effect in the treatment of Fabry disease.

현재 파브리병을 진단하기 위한 방법으로 상기 Gb3의 혈장 내 수준을 측정하는 것이 가장 많이 사용되고 있으나, Gb3는 실제로 혈장 내에서 측정 시기 및 환자의 상태에 따라 그 수준이 유동적으로 변할 수 있어, Gb3만을 측정하여 파브리병 진단이나 치료 효과를 평가하는 것은 다소 부족한 측면이 있다. 따라서 파브리병을 진단하거나 치료 효과를 평가할 수 있는 새로운 바이오 마커의 개발이 시급한 실정이다.Although Gb3 is the most widely used method for diagnosing Fabry disease, the level of Gb3 can be fluidly changed according to the time of measurement and the condition of the patient in plasma. Thus, only Gb3 It is somewhat lacking to evaluate the diagnosis and treatment effect of Fabry disease. Therefore, it is urgent to develop new biomarkers that can diagnose Fabry disease or evaluate the therapeutic effect.

이에, 본 발명자들은 파브리병과 상관관계를 가지는 신규한 바이오 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 및 베타 액틴 (beta actin)이 파브리병의 진단 및 치료 과정에서 치료 효과를 평가하기 위한 마커로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.As a result of intensive efforts to develop a novel biomarker having a correlation with Fabry disease, the present inventors have found that inactive complement components 3b and 3c (beta 3c) and beta actin are involved in the diagnosis and treatment of Fabry disease The present invention can be used as a marker for evaluating the therapeutic effect.

본 발명의 하나의 목적은 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to evaluate the efficacy of enzyme treatment for Fabry disease, which comprises an agent capable of detecting an inactive complement component 3b (iC3b) or beta actin And to provide a composition therefor.

본 발명의 다른 목적은 상기 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물을 포함하는, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease, comprising a composition for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for providing information for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease, which comprises measuring the protein expression level of an inactive complement element 3b or beta actin in a blood sample separated from an individual .

본 발명의 다른 목적은 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a diagnostic composition for Fabry disease, which comprises an agent capable of detecting an inactive complement element 3b or beta actin.

본 발명의 다른 목적은 상기 파브리병의 진단용 조성물을 포함하는, 파브리병의 진단용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for Fabry disease, which comprises the diagnostic composition of Fabry disease.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for providing information for diagnosis of Fabry disease, comprising measuring the level of protein expression of an inactive complement element 3b or beta actin in a blood sample isolated from an individual.

본 발명의 다른 목적은 (a) 파브리병 효소 치료제의 후보 물질을 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)을 발현하는 분리된 세포에 처리하여 상기 iC3b 또는 베타 액틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 단백질 발현 수준이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 대조군의 iC3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 파브리병의 효소 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 파브리병의 효소 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method of treating a candidate substance of Fabry disease enzyme therapeutic agent (a) by treating a candidate substance of a Fabry disease enzyme therapeutic agent into a separate cell expressing an inactive complement component 3b or a beta actin, Measuring the level of expression of the protein; And (b) when the protein expression level measured in the step (a) is lower than the protein expression level of iC3b or beta actin of the control group not treated with the candidate substance, selecting Fabry disease as an enzyme therapeutic agent, A method for screening an enzyme therapeutic for a disease.

본 발명에서는 파브리병 환자에서 특이적으로 발현되거나 파브리병의 장기간 효소 치료에 따라 발현이 변하는 단백질을 찾아, 파브리병을 진단하고 파브리병에 대한 효소 치료에 있어서 장기간의 효과를 판명할 수 있는 새로운 바이오 마커를 발굴하고자 하였다.In the present invention, a protein which is specifically expressed in a patient suffering from Fabry disease or whose expression is changed by treatment with a long-term enzyme of Fabry disease is searched for, and a new bio-enzyme capable of diagnosing Fabry disease, We tried to excavate the marker.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.This will be described in detail as follows. On the other hand, each description and embodiment disclosed in the present invention can be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. Further, the scope of the present invention is not limited by the detailed description described below.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물이다.One aspect of the present invention for achieving the above object is a method for detecting Fabry disease which comprises an agent capable of detecting an inactive complement component 3b or beta actin, This is a composition for evaluating the effect of the enzyme treatment.

다른 하나의 양태는, 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병의 진단용 조성물이다.Another embodiment is a diagnostic composition of Fabry disease comprising an agent capable of detecting an inactive complement element 3b or beta actin.

본 발명에서 용어 "파브리병 (Fabry disease, OMIM #301500)"은 α-갈락토시다아제 (α-galactosidase, GLA, EC 3.2.1.22)라는 세포 내 라이소좀의 가수분해 효소의 이상에 의해서 발생하는 희귀 대사성 유전질환이다. GLA의 결핍은 라이소좀 내에 Gb3 (globotriaosylceramide)의 축적을 야기하며, 이로 인해 말초 신경병증, 피부, 신장 질환, 심근병증, 뇌졸중의 심각한 합병증을 야기 한다. 2001년 재조합 효소제제의 개발 이 후 파브리병의 치료가 가능해졌으나 질환의 초기에 치료를 해야 임상적인 효능을 예상할 수 있다. The term " Fabry disease (OMIM # 301500) "in the present invention refers to a disease caused by an abnormality of intracellular lysosomal hydrolase called? -Galactosidase (GLA, EC 3.2.1.22) It is a rare metabolic genetic disorder. Deficiency of GLA causes accumulation of Gb3 (globotriaosylceramide) in lysosomes, which causes serious complications of peripheral neuropathy, skin, kidney disease, cardiomyopathy, and stroke. After the development of a recombinant enzyme in 2001, it became possible to treat Fabry disease, but the clinical effect can be anticipated by early treatment of the disease.

한편, 현재 알려진 파브리병 치료방법으로는 효소 대체 치료 (Enzyme Replacement Therapy; ERT) 방법이 있다. 효소 대체 치료는 재조합된 α-갈락토시다아제 A를 파브리병 환자에게 투여하여 결핍된 라이소좀 효소를 보충해주는 치료법으로서, 2003 년 미국에서 승인된바 있다. 효소 대체 치료에 이용되는 재조합 α-갈락토시다아제 A로 시판되는 것으로는 미국 젠자임사 (Genzyme)의 파브라자임 (Fabrazyme), 유럽 TKT사 (TransKaryotic Therapeutics, Inc.)의 레플라갈 (Replagal)이 있다. 최근 국내 제약회사 이수앱시스에서도 파바갈 (Fabagal)을 시판하여 치료제로 사용되고 있다. 효소 대체 치료는 혈장과 소변의 Gb3 농도를 낮추고, 신경통증을 완화하고 심장질환 발생을 완화하고 콩팥 기능을 안정화 시키는 등 파브리병에 대한 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다.Meanwhile, currently known Fabry disease treatment methods include Enzyme Replacement Therapy (ERT). Enzyme replacement therapy has been approved in the United States in 2003 as a remedy to supplement deficient lysosomal enzymes by administering recombinant α-galactosidase A to Fabry disease patients. Commercially available recombinant alpha -galactosidase A used in the enzyme replacement treatment includes Fabrazyme of Genzyme, USA, Replagal of TransKaryotic Therapeutics, Inc. of Europe, ). In recent years, domestic pharmaceutical company Isuappusisu has also been used as a therapeutic agent on the market of Fabagal. Enzyme replacement therapy is known to have a therapeutic effect on Fabry disease, such as lowering plasma and urine Gb3 levels, relieving neuropathic pain, relieving heart disease, and stabilizing renal function.

그러나 효소 대체 치료가 현재 파브리병을 치료하기 위한 가장 널리 알려진 치료법임에도 불구하고 중간 혹은 심한 정도의 콩팥 기능 손상 증상을 보이는 파브리병에서는 효소 대체 치료가 제한적이거나 효과가 없는 경우도 보고되고 있다 (Tondel C. et al., Agalsidase benefits renal histology in young patients with Fabry disease, J Am Soc Nephrol., 2013, 24(1):137-48).However, even though enzyme replacement therapy is currently the most widely-accepted treatment for Fabry disease, substitute therapy with enzymes has been reported to be limited or ineffective in patients with moderate to severe renal impairment (Tondel C , J. Am. Soc Nephrol., 2013, 24 (1): 137-48).

따라서, 파브리병을 조기에 진단하는 것과 파브리병을 효소 치료하는 과정에서 그 치료 효과를 평가하는 것은 매우 중요하나, 현재까지 파브리병의 진단 및 파브리병에 대한 효소 치료제제의 장기간의 효과 및 반응성을 예측할 수 있는 확실한 지표가 없는 실정이다.Therefore, it is very important to diagnose Fabry disease early and to evaluate its therapeutic effect in the course of enzyme treatment of Fabry disease. However, the long-term effect and the reactivity of the enzyme treatment for Fabry disease and Fabry disease There is no clear indicator that can be predicted.

본 발명에서 용어, "마커", 생물학적 마커", "바이오 마커"는 상호 교환적으로 사용된다. 상기 마커는 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 분자들 또는 화합물로서, 생체의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 말한다. 본 발명에서 상기 마커는 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)이며, 이들의 대사산물 역시 본 발명의 범주에 포함된다. 이들의 수준을 측정함으로써 파브리병을 진단하거나, 파브리병의 효소 치료에서 효과를 평가할 수 있다.The term "marker ", " biological marker ", and" biomarker "are used interchangeably in the present invention. The marker is generally a molecule or compound that can be detected in a biological sample. In the present invention, the marker is an inactive complement component 3b or beta actin, and their metabolites are also included in the scope of the present invention. By measuring their level, Fabry disease is diagnosed Or to evaluate the efficacy of enzyme treatment of Fabry disease.

본 발명에서 용어 "효소 치료의 효과 평가"는 파브리병에 대한 효소 치료를 수행하면서 파브리병에 대한 치료가 효과적으로 이루어졌는지 여부를 판단하는 것을 말한다. 즉, 효소 치료 과정을 통해 파브리병의 증세가 완화되거나 호전되는 등 치료가 효과적으로 이루어졌다거나 또는 파브리병의 증세가 더욱 심화 혹은 악화되었는지를 평가하는 것으로, 본 발명에 개시된 내용에 따를 때, 구체적으로 의사의 임상적 판단이 아닌 본 발명의 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴을 마커로 사용하여 객관적으로 효소 치료의 효과를 평가할 수 있다. The term "evaluation of the effect of the enzyme treatment" in the present invention means judging whether or not the treatment for Fabry disease has been effectively performed while performing the enzyme treatment for Fabry disease. That is, it is evaluated whether the treatment of the Fabry disease is alleviated or improved through an enzyme treatment process, or the symptoms of Fabry disease are getting worse or worse. According to the disclosure of the present invention, The effectiveness of the enzyme treatment can be objectively assessed using the inactive complement component 3b of the present invention (beta 3b, iC3b) or beta actin as a marker rather than the clinical judgment of the physician.

상기 효소 치료는 예컨대 상술한 α-갈락토시다아제 A를 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 파브리병을 치료 또는 완화시킬 수 있는 공지된 효소 치료 방법을 모두 포함한다.The enzyme treatment may be, but not limited to, the above-mentioned? -Galactosidase A, and includes all known enzyme treatment methods capable of treating or alleviating Fabry disease.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대상 개체가 파브리병을 앓고 있는지 여부 또는 파브리병의 정도를 확인하는 것이다.The term "diagnosing" as used herein means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the subject is suffering from Fabry disease or the degree of Fabry disease.

본 발명에서 용어 "불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)"는 혈청 내에 존재하는 42 kDa의 항원으로, 보체 요소 3b (complement component 3b)가 프로테아제 인자 I (protease factor I)에 의해 분할되어 생성되는 단백질을 말한다. iC3b는 보체 신호경로의 진행을 막고, B-세포를 자극하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 전신성 홍반성 낭창 (systemic lupus erythematosis) 및 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis)에서 혈액 내 수준이 증가되는 것으로 보고된바 있으나, 파브리병과의 관련성은 현재까지 전혀 알려지지 않았다.In the present invention, the term " inactive complement component 3b, iC3b "is an antigen of 42 kDa present in the serum. The complement component 3b is divided by a protease factor I Refers to the protein that is produced. iC3b is known to block the progress of the complement signal pathway and to stimulate B-cells, and it has been reported that levels in the blood are increased in systemic lupus erythematosis and rheumatoid arthritis However, the association with Fabry disease has not been known at present.

본 발명에서 용어 "베타 액틴 (beta actin)"은 액틴의 6 종의 아형 (isoform) 중 하나로, 비근육 세포 골격 액틴 (nonmuscle cytoskeletal actin)을 의미한다. 베타 액틴은 세포 이동, 구조 등에 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 파브리병과의 관련성은 현재까지 전혀 보고된 바 없다.The term "beta actin" in the present invention means one of six isoforms of actin, and refers to a nonmuscle cytoskeletal actin. Beta actin is known to play a role in cell migration and structure, but no association with Fabry disease has been reported to date.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 정상 대조군에 비해 파브리병 환자의 혈장에서 iC3b 및 베타 액틴의 수준이 유의적으로 높은 것을 확인하였으며 (도 5), 효소 치료 전과 효소 치료 후의 파브리병 환자의 혈장을 2-DE (2-dimentional gel electrophoresis)로 분석하여 iC3b 및 베타 액틴의 발현 수준이 치료 전에 비해 치료 후 유의적으로 2 배 이상 감소하는 것을 확인하였다 (도 1 및 도 2).In a specific example of the present invention, iC3b and beta-actin levels in Fabry disease patients were significantly higher than those in normal controls (Fig. 5). Plasma levels of Fabry disease patients before and after enzyme treatment -De (2-dimentional gel electrophoresis), and the expression levels of iC3b and beta actin were significantly reduced by more than 2-fold after treatment compared to before treatment (FIGS. 1 and 2).

또한, 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 파브리병 환자를 장기간 효소 치료하는 과정에서 iCb3b 및 베타 액틴의 수준을 측정하여, 상기 두 단백질 모두 치료 기간이 경과함에 따라 발현 수준이 유의적으로 점차 감소하는 것을 확인하였다 (도 3 내지 도 5).In another specific embodiment of the present invention, the levels of iCb3b and beta actin in the long-term enzyme treatment of Fabry disease are measured, and the expression levels of both proteins gradually decrease with the lapse of the treatment period (Figs. 3 to 5).

추가로, 본 발명의 일 실시예에서는 파브리 마우스 모델에서도 정상 마우스에 비해 혈장 iC3b 레벨이 증가된 것을 확인하였다(도 7).In addition, it was confirmed that the plasma iC3b level was increased in the Fabry mouse model in comparison with the normal mice in the example of the present invention (Fig. 7).

따라서, 본 발명의 iCb3b 및 베타 액틴은 파브리병을 진단하거나, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 바이오 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. Therefore, iCb3b and beta actin of the present invention were found to be useful as a biomarker for diagnosis of Fabry disease or for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease.

본 발명의 파브리병에 대한 진단용 조성물 및 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물은 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴을 검출할 수 있는 제제를 포함한다. 본 발명에서 용어 "검출할 수 있는 제제"는 검출하고자 하는 바이오 마커의 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 의미한다. 상기 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴을 검출할 수 있는 제제는 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The diagnostic composition for the Fabry disease of the present invention and the composition for evaluating the effect of the enzyme treatment include an agent capable of detecting the inactive complement element 3b or beta actin. The term "detectable agent" in the present invention means a preparation capable of measuring the gene expression level or protein expression level of a biomarker to be detected. The agent capable of detecting the inactive complement element 3b or beta actin may be an antibody that specifically binds to inactive complement element 3b or beta actin, but is not limited thereto.

특히 본 발명에서 용어 "단백질 발현 수준 측정"이란 파브리병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예컨대 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것일 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯 (western blotting), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), FACS 및 단백질 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "measurement of protein expression level" is used to identify the presence and expression level of a biomarker protein in a biological sample to diagnose Fabry disease. For example, an antibody that specifically binds to the marker protein is used To identify the amount of protein. Analysis methods for this are western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket But are not limited to, immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS and protein chips.

본 발명에서 용어 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 타겟 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로, 다른 물질에 비하여 타겟 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.The term "specifically binds" in the present invention means that the binding ability to a target substance is excellent as compared with other substances, so that the presence or absence of a target substance can be detected by binding.

본 발명에서 용어 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이것의 단편으로부터 유래되거나 이를 본떠서 만든 실질적으로 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에서 항체는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체 구조를 포함할 수 있다. 항체 단편은 전체 길이의 항체의 일부분, 항체의 가변 도메인, 또는 적어도 항체의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 항체 단편의 예는 디아바디 (diabody), 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.The term "antibody" in the present invention means an immunoglobulin gene or immunoglobulin gene capable of specifically binding to an antigen or epitope, or a peptide or polypeptide substantially encoded thereby derived from or fragments thereof do. Antibodies in the present invention may include various forms of antibody structures including, but not limited to, whole antibodies and antibody fragments. The antibody fragment may comprise a portion of the full length antibody, a variable domain of the antibody, or at least an antigen binding site of the antibody. Examples of antibody fragments include multispecific antibodies formed from diabodies, single-chain antibody molecules and antibody fragments.

한 구체 예에서, 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예컨대 융합 방법, 재조합 DNA 방법 또는 파아지 항체 라이브러리 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991 등에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 당업자가 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 보체인자 B 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성 (affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.In one embodiment, the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Antibodies to inactive complement elements 3b or beta actin can be produced by methods routinely practiced in the art, such as fusion methods, recombinant DNA methods, or phage antibody library methods. General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley / Greene, NY, 1991 and the like. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known to those skilled in the art and can be readily practiced by those skilled in the art . Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a suitable factor animal with a complement factor B protein antigen, collecting the antiserum from the animal, and then separating the antibody from the antiserum using a known affinity technique.

본 발명의 파브리병에 대한 진단용 조성물 및 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물은 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴 검출할 수 있는 제제를 포함할 수 있고, 나아가 파브리병을 진단하거나 효소 치료의 효과를 평가할 수 있는 다른 단백질, 예컨대 Gb3 등을 검출할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.The diagnostic composition for the Fabry disease of the present invention and the composition for evaluating the effect of the enzyme treatment can comprise an inactive complement component 3b and / or a beta-actin detectable agent, and further can be used for diagnosis of Fabry disease, Such as < RTI ID = 0.0 > Gb3, < / RTI >

본 발명의 다른 양태는, 상기 조성물을 포함하는 파브리병에 대한 효소 치료의 효과 평가용 키트이다.Another aspect of the present invention is a kit for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease comprising the composition.

본 발명의 다른 양태는, 상기 조성물을 포함하는 파브리병의 진단용 키트이다.Another aspect of the present invention is a diagnostic kit for Fabry disease comprising the above composition.

파브리병 및 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.The Fabry bottle and the above composition are as described above.

상기 키트는 구체적으로 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 또는 LC-MS/MS용 정량 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The kit may specifically be an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit or a quantitative kit for LC-MS / MS, but is not limited thereto.

또한, 상기 파브리병에 대한 효소 치료의 효과 평가용 키트 또는 파브리병의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.In addition, the kit for evaluating the effect of the enzyme treatment on the Fabry disease or the diagnostic kit for the Fabry disease may further comprise one or more other components, solutions or devices suitable for the assay method.

본 발명의 다른 양태는 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 정보의 제공 방법이다.Another aspect of the invention is a method of providing information for assessing the effect of an enzyme treatment on Fabry disease, comprising measuring the level of protein expression of an inactive complement factor 3b or beta actin in a blood sample isolated from an individual.

본 발명의 다른 양태는 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병의 진단을 위한 정보의 제공 방법이다. 상기 진단을 위한 정보의 제공 방법은 진단방법일 수 있다.Another aspect of the invention is a method of providing information for diagnosis of Fabry disease, comprising measuring the level of protein expression of an inactive complement factor 3b or beta actin in a blood sample isolated from an individual. The method of providing information for diagnosis may be a diagnostic method.

불활성 보체 요소 3b, 베타 액틴 및 파브리병에 대하여는 상술한 바와 같다.Inert complement element 3b, beta actin and Fabry disease are as described above.

본 발명에서는 개체로부터 분리된 혈액 시료를 사용하여 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴의 수준을 측정함으로써, 비침습적이며 편리한 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 정보의 제공 방법 및 파브리병의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.In the present invention, a method of providing information for evaluating the effect of enzyme treatment on non-invasive and convenient Fabry disease by measuring the level of inactive complements 3b and / or beta actin using a blood sample isolated from an individual, And provides a method of providing information for diagnosis of a disease.

상기 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The blood sample may be a whole blood, a plasma sample, or a serum sample, but is not limited thereto.

구체적으로 상기 정보 제공 방법은 파브리병에 대해 효소 치료를 진행 중인 개체 또는 파브리병 의심 개체로부터 분리된 혈액 시료로부터 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴의 수준을 측정하고, 효소 치료 수행 전 개체의 분리된 혈액 시료 또는 정상 대조군의 분리된 혈액 시료로부터 측정된 것과의 수준을 비교함으로써, 효소 치료의 효과를 평가하거나 파브리병을 진단하는데 필요한 정보를 제공할 수 있다.Specifically, the information providing method includes measuring the level of inactive complements 3b and / or beta actin from a blood sample isolated from a subject suspected of being subjected to enzyme treatment or Fabry disease susceptibility to Fabry disease, By comparing the level of the enzyme with that measured from a blood sample or a separate blood sample of a normal control, the effect of the enzyme treatment can be assessed or the information necessary for diagnosis of Fabry disease can be provided.

이때, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하는 경우 효소 치료 후의 혈액 시료에서 측정된 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴의 수준이 치료 전 혈액 시료에서의 수준보다 통계학적으로 유의적으로 감소한 경우 치료가 효과적인 것으로 평가할 수 있고, 증가하거나 유사한 수준인 경우 치료가 효과적이지 않은 것으로 평가할 수 있다.In this case, when the effect of the enzyme treatment on Fabry disease is evaluated, the level of the inactive complement element 3b and / or beta actin measured in the blood sample after the enzyme treatment is statistically significantly lower than that in the pre-treatment blood sample Treatment can be assessed as effective, and treatment at an increased or similar level can be evaluated as ineffective.

또한, 파브리병을 진단하는 경우 파브리병 의심 개체의 혈액 시료에서 측정된 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴의 수준이 정상 대조군의 혈액 시료에서의 수준보다 통계학적으로 유의적으로 높은 경우 파브리병으로 판정할 수 있다.Also, in the case of diagnosing Fabry disease, if the levels of inactive complement elements 3b and / or beta actin measured in blood samples of Fabry disease suspect individuals are statistically significantly higher than those in blood samples of normal controls, .

상기 불활성 보체 요소 3b 또는/및 베타 액틴의 수준을 측정하는 것은, 구체적으로 해당 불활성 보체 요소 3b 또는 베타 액틴에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF (matrix desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석, SELDI-TOF (sulface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS (liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry), 또는 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)로 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The level of the inactive complement element 3b and / or beta actin may be measured using an antibody specifically binding to the inactive complement element 3b or beta actin, and more specifically, immunoassay, ligand binding assay , MALDI-TOF (matrix desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) analysis, SELDI-TOF (sulface enhanced laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry) analysis, radiation immunoassay, (LC-MS), liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry (LC-MS), solid-phase liquid chromatography-mass spectrometry spectrometry, or enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

본 발명의 다른 양태는, (a) 파브리병 효소 치료제의 후보 물질을 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)을 발현하는 분리된 세포에 처리하여 상기 iC3b 또는 베타 액틴 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 단백질 발현 수준이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 대조군의 iC3b 또는 베타 액틴의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 파브리병의 효소 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 파브리병의 효소 치료제를 스크리닝하는 방법이다.Another aspect of the present invention relates to a method for treating a Fabry disease enzyme therapeutic agent comprising: (a) treating a candidate substance of a Fabry disease enzyme therapeutic agent to separate cells expressing an inactive complement component 3b or beta actin, Measuring the level of expression of the actin protein; And (b) when the protein expression level measured in the step (a) is lower than the protein expression level of iC3b or beta actin of the control group not treated with the candidate substance, selecting Fabry disease as an enzyme therapeutic agent, It is a method of screening an enzyme therapeutic of a disease.

불활성 보체 요소 3b, 베타 액틴 및 파브리병에 대하여는 상술한 바와 같다.Inert complement element 3b, beta actin and Fabry disease are as described above.

상기 iC3b 또는 베타 액틴은 파브리병 환자의 효소 치료 과정에서 그 수준이 감소하므로, 파브리병 환자에 대한 효소 치료를 위한 후보 물질을 분리된 세포에 처리하여 처리 전/후의 iC3b 또는 베타 액틴의 수준을 측정함으로써 그 후보 물질이 파브리병의 효소 치료에 효과가 있는지를 확인할 수 있으며, 이를 통해 파브리병에 대한 효소 치료의 후보 물질을 스크리닝할 수 있다.Since the level of iC3b or beta actin decreases in the enzymatic treatment of Fabry disease patients, candidates for enzyme treatment for Fabry disease patients are treated with isolated cells to measure levels of iC3b or beta actin before and after treatment Thereby confirming whether or not the candidate substance is effective in the treatment of Fabry disease. Thus, candidates for enzyme treatment for Fabry disease can be screened.

구체적으로, 상기 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 또는 베타 액틴 (beta actin)을 발현하는 세포는, 파브리병 환자로부터 분리된 세포 또는 인위적으로 제조된 파브리병 모델 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Specifically, the cell expressing the inactive complement component 3b or beta actin may be a cell isolated from a Fabry disease patient or an artificially produced Fabry disease model cell, But is not limited to.

본 발명에서는 파브리병의 진단 및 치료 효과 평가와 관련된 신규 바이오 마커로서 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 및 베타 액틴 (beta actin)을 발굴하였다. 상기 iC3b 및 베타 액틴은 정상 대조군에 비해 파브리병 환자에서 발현 수준이 높아 이를 이용해 파브리병을 진단할 수 있으며, 나아가 효소 치료 후 장기적으로 상기 마커의 발현 양상이 점진적으로 변하므로, 파브리병 치료 과정에서 질환의 자연경과와 치료 효과를 판명하는데 중요한 바이오 마커로 사용될 수 있다. In the present invention, inactive complement components 3b (iC3b) and beta actin have been discovered as new biomarkers related to diagnosis and therapeutic effect evaluation of Fabry disease. The expression level of iC3b and beta actin is higher in Fabry disease than in normal control, so that Fabry disease can be diagnosed using the same, and furthermore, the expression pattern of the marker gradually changes after the enzyme treatment, It can be used as a biomarker to determine the natural course and therapeutic effect of the disease.

도 1은 8 명의 파브리병 환자에서 효소 치료 전 혈장과 효소 치료 후 7.5 ±2.7 (4 - 12) 개월에 채집한 혈장을 프로테오믹스 (proteomics)로 분석하여 얻은 2DE 사진이다. 효소 치료 전후에 2 배 이상 발현 양상이 변한 스팟 (spot) 중 iC3b (spot 409)에 해당하는 스팟을 각각의 환자별로 화살표로 표시하였다.
도 2는 8 명의 파브리병 환자에서 효소 치료 전 혈장과 효소 치료 후 7.5 ±2.7 (4 - 12) 개월에 채집한 혈장을 프로테오믹스 (proteomics)로 분석하여 얻은 2DE 사진이다. 효소 치료 전후에 2 배 이상 발현 양상이 변한 스팟 (spot) 중 베타 액틴 (beta actin) (spot 654)에 해당하는 스팟을 각각의 환자별로 화살표로 표시하였다.
도 3은 7 명의 파브리병 환자의 혈장을 효소 치료 전과 효소 치료 후 3 - 12 개월 마다 채집하여, 치료 후 64.5 ± 15.2 (46 - 96) 개월까지 혈장에서 베타 액틴의 발현 양상을 조사한 것이다.
도 4는 7 명의 파브리병 환자의 혈장을 효소 치료 전과 효소 치료 후 3 - 12개월 마다 채집하여, 치료 후 64.5 ± 15.2 (46 - 96) 개월까지 혈장에서 iC3b의 발현 양상을 조사한 것이다.
도 5는 8 명의 파브리병 환자에서 효소 치료 전, 치료 후 7.5 ± 2.7 (4 - 12) 개월, 및 64.5 ± 15.2 (46 - 96) 개월에 채집한 혈장에서 iC3b와 베타 액틴의 발현 양상을 확인한 것이다. 발현 양상의 평균을 막대그래프로 표시하였고, 이를 연령과 성별을 맞춘 8 명의 정상인의 평균 막대그래프와 비교하였다.
도 6은 7 명의 파브리병 환자에서 효소 치료 전과 효소 치료 후 3 - 12개월 마다 혈장을 채집하여, 치료 후 64.5 ± 15.2 (46 - 96) 개월까지 혈장에서 iC3b의 발현 양상을 조사하고, 이를 파브리병에서 이미 바이오마커로 알려진 Gb3의 수치 변화와 비교한 것이다.
도 7은 파브리 마우스와 정상 마우스의 혈장에서 iC3b 레벨을 비교한 것이다.
도 8은 11명의 파브리 남성 환자의 신조직 소견을 정리한 표를 기재한 것이다.
도 9는 파브리 환자에서 Gb3를 함유하는 침전물(A 및 B), C3 면역 침전물(C 및 D)을 확인한 것이다.FIG. 1 is a 2DE photograph of plasma albumin collected from 8 Fabry disease patients treated with plasma before enzyme treatment and 7.5 ± 2.7 (4-12) months after treatment with proteomics. Spots corresponding to iC3b (spot 409) in the spot where the expression pattern changed more than twice before and after the enzyme treatment were indicated by arrows for each patient.
FIG. 2 is a 2DE photograph of plasma albumin collected from 8 Fabry disease patients treated with plasma before enzyme treatment and 7.5 ± 2.7 (4-12) months after treatment with proteomics. Spots corresponding to beta- actin (spot 654) among the spots in which expression patterns changed more than twice before and after the enzyme treatment were indicated by arrows for each patient.
FIG. 3 shows platelet counts of seven Fabry disease patients before and 4-12 months after the enzyme treatment, and the expression of beta-actin in plasma was measured at 64.5 ± 15.2 (46-96) months after treatment.
FIG. 4 is a graph showing the plasma levels of iC3b in plasma from 7 Fabry disease patients before plasma treatment and 3 to 12 months after the enzyme treatment and at 64.5 ± 15.2 (46-96) months after treatment.
FIG. 5 shows the expression patterns of iC3b and beta actin in plasma collected from 8 Fabry disease patients before treatment, 7.5 ± 2.7 (4-12) months, and 64.5 ± 15.2 (46-96) months after treatment . The mean expression pattern was expressed as a bar graph and compared with the mean histogram of eight normal subjects with age and gender.
FIG. 6 is a graph showing the plasma levels of iC3b in plasma from 7 Fabry disease patients before plasma treatment and 3-12 months after the treatment, and after 64.5 ± 15.2 (46-96) months after treatment, Compared with changes in Gb3, already known as biomarkers.
Figure 7 compares iC3b levels in the plasma of Fabry mice and normal mice.
Fig. 8 shows a table summarizing the renal histology of 11 Fabry male patients.
Fig. 9 shows the precipitates (A and B) and C3 immunoprecipitates (C and D) containing Gb3 in the Fabry patient.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예Example 1: 파브리병 환자의 효소 치료 전후에 단백질 발현 양상 비교 1: Protein expression pattern before and after enzyme treatment in Fabry disease patients

8 명의 파브리병 환자를 대상으로 효소 치료 전과 효소 치료 후 7.5 ± 2.7 (4 - 12) 개월에 혈장을 분리하고, 프로테오믹스 분석을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교하고자 하였다. 대상 개체의 혈장에서 알부민, 면역글로불린 등 발현이 높은 단백질을 MARC (multiple affinity removal column)를 이용하여 제거 후, 2-DE (2-dimensional gel electrophoresis) 이미지 분석을 수행하였다.Plasma was isolated from 8 Fabry disease patients before and 7-12 months after enzyme treatment and proteomic analysis was performed to compare protein expression patterns. 2-DE (2-dimensional gel electrophoresis) image analysis was performed after removal of albumin, immunoglobulin, and other highly expressed proteins from the plasma of the subject using multiple affinity removal column (MARC).

구체적으로 MARC로 필터링한 혈장을 2-DE 이미지 분석을 이용하여 2 배 이상의 발현 차이가 나는 단백 스팟을 선별한 후, MALD-TOF MS 분석 및 MALD-TOF MS/MS 분석 모두에서 P 값이 < 0.05으로 유의한 차이를 보이는 단백질을 선택하였다. 그 결과, 효소 치료 후 발현 양상이 변화하는 총 15 개의 단백질을 선택할 수 있었다. 이들 15 개의 단백질은 모두 발현이 감소하는 양상으로 나타났다.The MALD-TOF MS and MALD-TOF MS / MS analyzes showed a P value of <0.05, respectively, after screening of plasma spots with a 2-fold or greater difference in expression using 2-DE image analysis. Were selected. As a result, a total of 15 proteins whose expression pattern changed after enzyme treatment could be selected. All of these 15 proteins showed a decrease in expression.

실시예Example 2: 효소 치료 후  2: After enzyme treatment 유의적Significant 차이가 나는 단백질의 동정 Identification of Differing Proteins

상기 2-DE 이미지 분석을 통해 2 배 이상 발현 양상이 차이가 나는 15 개의 단백질에 대해 MALDI-TOF/TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight) 분석 및 Mascot Database를 이용하여 단백질을 동정하였다.The MALDI-TOF / TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight / time-of-flight) analysis and 15 MALDI-TOF / TOF Protein was identified using a database.

구체적으로, MALD-TOF MS (mass spectrometry) 분석과 MALD-TOF MS/MS 분석 모두에서 P 값이 < 0.05로 유의한 차이를 보이는 단백질을 Mascot 알고리즘 (Matrixscience, USA)을 이용해 펩타이드 서열을 분석하였다.Specifically, peptides showing significant differences in P value <0.05 between both MALD-TOF MS (mass spectrometry) analysis and MALD-TOF MS / MS analysis were analyzed using Mascot algorithm (Matrixscience, USA).

다음으로, 효소 치료 전후에 유의하게 발현 양상이 변하는 단백질을 UniProt (www.uniprot.org), PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) 및 GeneCards (www.genecards.org) 등을 이용하여 기능 분석을 시행하였다.Next, proteins with significantly altered expression patterns before and after the enzyme treatment were isolated using UniProt (www.uniprot.org), PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), and GeneCards (www.genecards.org) The functional analysis was performed.

이들 단백질의 기능을 분석한 결과, 상기 15 개의 단백질은 각각 파브리병에서 혈관 내 염증 반응과 관련된 단백질, 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b), 베타 액틴 (beta actin, ACTB)과 이 단백과 결합하는 PFN1 (Profilin-1) 및 VCL (vinculin), 및 보체계 활성화에 관여하는 C1QC, C3, C4 단백질임을 확인하였다. As a result of analysis of the functions of these proteins, the above 15 proteins were respectively identified as proteins related to the vascular inflammation reaction in Fabry disease, inactive complement component 3b (iC3b), beta actin (ACTB) C3 and C4 proteins involved in the activation of the complement system, and PFN1 (Profilin-1) and VCL (vinculin), which are associated with the complement system.

본 발명자들은 이 중 특히 유의적인 차이를 나타내는 iC3b 및 베타 액틴 (beta actin)에 주목하여 다음 실험을 진행하였다. 상기 두 단백질의 2-DE 사진을 도 1 및 도 2에 나타내었다.The present inventors paid attention to iC3b and beta actin, which show a particularly significant difference among them, and conducted the following experiment. 2-DE photographs of the two proteins are shown in FIGS. 1 and 2. FIG.

실시예Example 3: 효소 치료 전후의  3: Before and after enzyme treatment iC3biC3b 및 베타  And beta 액틴의Actin 발현 수준 확인 Identify expression levels

다음으로, 상기 기능 분석을 통하여 파브리병의 병인에 유의한 연관관계가 있을 것으로 예상되는 iC3b 및 베타 액틴에 대하여 웨스턴 블롯 (Western blot) 방법으로 발현을 검증하였다. Next, the expression of iC3b and beta actin, which are expected to have a significant correlation with the pathogenesis of Fabry disease, was verified by Western blot analysis using the above-mentioned functional analysis.

구체적으로, 연령과 성별을 맞춘 7 명의 파브리병 환자에서 효소 치료 후 3 - 12 개월 마다 혈장을 채집하였으며, 효소 치료 후 64.5 ± 15.2 (46 - 96)개월까지 혈장에서 iC3b 및 베타 액틴 단백질의 장기간 발현 양상을 웨스턴 블롯으로 조사하였다. Plasma samples were collected every 7 to 12 months after enzyme treatment in 7 Fabry disease patients with age and gender. The long - term expression of iC3b and β - actin protein in plasma was measured at 64.5 ± 15.2 (46 - 96) The patterns were examined by western blotting.

그 결과 iC3b 및 베타 액틴이 효소 치료를 함에 따라서 장기적으로 발현 양상이 점차 감소함을 알 수 있었다 (도 3 내지 도 5). 따라서, 본 발명의 iC3b 및 베타 액틴은 파브리병의 효소 치료가 효과적으로 이루어졌는지 확인할 수 있는 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었으며, 정상인에서 상기 마커들이 파브리병 환자에 비해 유의적으로 낮은 수준으로 발현될 것임을 예측할 수 있었다.As a result, it was found that the expression patterns of iC3b and beta actin gradually decreased in the long term as the enzyme treatment was performed (FIGS. 3 to 5). Therefore, it was found that the iC3b and beta actin of the present invention can be used as markers for confirming the efficient treatment of Fabry disease, and the markers in normal individuals are expressed at a significantly lower level than those of Fabry disease .

실시예Example 4: 정상인과의 비교 4: Comparison with normal person

정상인에서 iC3b 및 베타 액틴이 파브리병 환자에 비해 유의적으로 낮은 수준으로 발현되는지 확인하기 위해, 정상인 및 파브리병 환자에서 iC3b 및 베타 액틴 단백질의 발현 수준을 비교하였다.We compared the expression levels of iC3b and beta actin protein in normal and Fabry disease patients to confirm that iC3b and beta actin are expressed at a significantly lower level compared to patients with Fabry disease.

구체적으로, 연령과 성별을 맞춘 8 명의 정상인 및 8 명의 효소 치료 전 파브리병 환자에서 채집한 혈장에서 iC3b 및 베타 액틴의 발현 양상을 웨스턴 블롯으로 비교하였다. 상기 8 명의 정상인 및 8 명의 효소 치료 전 파브리병 환자에서 확인된 결과를 정상인 평균 및 파브리병 환자 평균으로 나타내었으며, 이를 Wilcoxon signed rank test로 통계 분석을 수행하였다.Specifically, the expression patterns of iC3b and beta actin were compared by Western blot in plasma collected from 8 normal and 8 enzyme-treated Fabry disease patients with age and gender. Statistical analysis was performed using the Wilcoxon signed rank test. The results were expressed as the mean of the normal and Fabry disease patients in the 8 normal and 8 pre-treatment Fabry disease patients.

그 결과 iC3b 및 베타 액틴 모두 파브리병 환자의 혈장에서 정상인 보다 통계적으로 유의한 수준으로 높은 값을 보이는 것을 알 수 있었다 (도 5). 따라서 예상한 바와 같이 본 발명의 마커인 iC3b 및 베타 액틴은 파브리병의 효소 치료 과정에서의 효과를 평가할 수 있을 뿐만 아니라, 파브리병의 진단 마커로도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.As a result, both iC3b and beta actin showed a statistically significant higher value in plasma of patients with Fabry disease than normal (Fig. 5). Thus, as expected, iC3b and beta actin, the markers of the present invention, could be used not only to evaluate the effect of Fabry disease in the enzymatic treatment process, but also as a diagnostic marker of Fabry disease.

실시예Example 5: 기존  5: Existing 마커와의With a marker 비교 compare

본 발명에서 확인된 마커의 효과를 더 확인하기 위하여, 기존에 알려진 파브리병 진단 마커와 함께 발현 수준을 비교하였다. 구체적으로, iC3b의 효소 치료 후 장기간의 변화 양상을 기존에 파브리병에서 진단적 바이오 마커로 사용되어 왔던 Gb3의 발현 양상과 비교하였을 때, 유사한 패턴을 보이는 것을 확인하였다 (도 6). 한편, Gb3의 변화 양상은 치료 후 단기간 내에 정상화되어 치료 효과를 정확히 판단하기에는 부족하였으나, iC3b의 경우 효소 치료에 따라 그 수준이 점진적으로 감소함을 알 수 있었다. 또한 효소 치료제의 공급이 원활하지 않았던 시기 동안 Gb3는 대부분의 환자에서 수치의 큰 변화가 없었으나, iC3b는 일부 환자에서 수치가 증가함을 확인 할 수 있어서, iC3b가 Gb3 보다 더욱 유용하게 효소 치료의 적절성 및 장기적 치료 효과를 판명하는데 도움이 되는 바이오 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다. In order to further confirm the effect of the markers identified in the present invention, expression levels were compared with known Fabry disease diagnostic markers. Specifically, a similar pattern was observed when the long-term change pattern of iC3b after the enzyme treatment was compared with the expression pattern of Gb3 that had been used as a diagnostic biomarker in Fabry disease (FIG. 6). On the other hand, the change pattern of Gb3 was normalized within a short period of time after the treatment and it was not enough to accurately determine the therapeutic effect. However, it was found that the level of iC3b gradually decreased according to the enzyme treatment. In addition, during the period when the supply of the enzyme treatment was not smooth, Gb3 was not significantly changed in most patients, but iC3b was found to increase in some patients, suggesting that iC3b is more useful than Gb3 It can be used as a biomarker to help determine the suitability and long term therapeutic effect.

실시예Example 6: 파브리병 마우스 모델에서의 혈장  6: Plasma in a Fabry bottle mouse model iC3biC3b 측정 Measure

본 발명에서 확인된 마커의 유의성을 파브리병 마우스 모델을 통하여 확인하고자 하였다. 10주령의 파브리 마우스 모델 (kindly provided by Dr. Roscoe O. Brady of the National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)) 4마리, 및 연령과 성별을 맞춘 3마리의 정상 마우스에서, 혈장 iC3b 레벨을 측정하였다.The significance of the markers identified in the present invention was confirmed by the Fabry bottle mouse model. In three normal mice matched for age and gender, four plasma mice of a 10 week old Fabry mouse model (kindly provided by Dr. Roscoe O. Brady of the National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)), plasma iC3b levels Respectively.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 파브리 마우스의 혈장에서 iC3b 레벨이 증가된 것을 확인할 수 있었다 (P=0.006, Student t test).As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that iC3b level was elevated in plasma of Fabry mouse ( P = 0.006, Student t test).

실시예Example 7:  7: 파브리Fabry 환자의  Patient 신조직에서의In a new tissue 보체계Complement system 활성도 조사 Activity investigation

추가로 파브리 환자의 신조직 소견을 통하여, iC3b를 포함한 보체계의 활성도를 조사하여, 본 발명에서 확인된 마커의 유의성을 확인하고자 하였다.Further, the activity of the complement system including iC3b was investigated through the renal histology of the Fabry patient to confirm the significance of the marker identified in the present invention.

구체적으로, 11명의 classical Fabry disease를 보인 남성 환자의 신조직 소견을 조사하였다.Specifically, we examined the renal histology of 11 patients with classical Fabry disease.

그 결과, 도 8의 표에 나타난 바와 같이, 사구체의 전체적 경화가 5명, 분절성 초점성 경화가 1명, 세뇨관의 경화가 5명, 간질 염증이 5명에서 보였다.As a result, as shown in the table of FIG. 8, the glomerular sclerosis was observed in 5 patients, the segmental focal sclerosis in 1 patient, the tubular sclerosis in 5 patients, and the epileptic inflammation in 5 patients.

특히, 면역형광검사에서 면역글로불린 IgM 및 C3 보체가 각각 7명 및 8명에서 보이는 소견을 확인할 수 있었다. 이러한 면역 침전물은 다양한 정도로 사구체 혹은 메산지움에 축적된 것을 확인할 수 있었다(도 9의 C 및 D).In particular, immunoglobulin IgM and C3 complement were found in 7 and 8 individuals, respectively. These immunoprecipitates were accumulated in the glomeruli or mesangium at various degrees (C and D in Fig. 9).

한편, 기존의 마커인 Gb3를 함유하는 침전물은 모든 환자의 사구체 혹은 세뇨관에서 발견되었다(도 9의 A 및 B).On the other hand, precipitates containing Gb3, a conventional marker, were found in the glomeruli or tubules of all patients (Figs. 9A and B).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.

Claims (12)

불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물.
A composition for assessing the effect of an enzyme treatment on Fabry disease, comprising an agent capable of detecting an inactive complement component 3b (iC3b).
제1항에 있어서, 상기 iC3b를 검출할 수 있는 제제는 각각 iC3b에 특이적으로 결합하는 항체인, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물.
2. The composition according to claim 1, wherein the agent capable of detecting iC3b is an antibody that specifically binds to iC3b, respectively, for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease.
제1항에 있어서, 상기 효소 치료는 α-갈락토시다아제 A (α-galactosidase A)를 이용한 효소 치료인 것인, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 조성물.
The composition for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease according to claim 1, wherein said enzyme treatment is an enzyme treatment using? -Galactosidase A.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 키트.
A kit for evaluating the effect of an enzyme treatment on Fabry disease, comprising a composition according to any one of claims 1 to 3.
개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b) 의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병 (Fabry disease)에 대한 효소 치료의 효과를 평가하기 위한 정보의 제공 방법.
Providing information for evaluating the effect of enzyme treatment on Fabry disease, comprising measuring the protein expression level of an inactive complement component 3b (iC3b) in a blood sample separated from the subject Way.
제5항에 있어서, 효소 치료 후의 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 iC3b의 단백질 발현 수준을 효소 치료 전의 대조군 내의 iC3b의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 파브리병에 대한 효소 치료의 효과 평가를 위한 정보의 제공 방법.
6. The method according to claim 5, further comprising the step of comparing the protein expression level of iC3b in the blood sample isolated from the subject after the enzyme treatment with the protein expression level of iC3b in the control before the enzyme treatment, A method of providing information for evaluation.
불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 파브리병의 진단용 조성물.
A diagnostic agent capable of detecting an inactive complement component 3b (iC3b).
제7항에 있어서, 상기 검출할 수 있는 제제는 iC3b에 특이적으로 결합하는 항체인, 진단용 조성물.
8. The diagnostic composition of claim 7, wherein the detectable agent is an antibody that specifically binds to iC3b.
제7항 또는 제8항에 따른 조성물을 포함하는, 파브리병의 진단용 키트.
A diagnostic kit for Fabry disease, comprising the composition according to claim 7 or 8.
개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파브리병의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
And measuring the protein expression level of the inactive complement component 3b (iC3b) in the blood sample separated from the subject.
제10항에 있어서, 효소 치료 후의 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 iC3b의 단백질 발현 수준을 효소 치료 전의 대조군 내의 iC3b의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 파브리병의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
11. The method according to claim 10, further comprising the step of comparing the protein expression level of iC3b in a blood sample separated from the individual after the enzyme treatment with the protein expression level of iC3b in the control before the enzyme treatment Delivery method.
(a) 파브리병 효소 치료제의 후보 물질을 불활성 보체 요소 3b (inactive complement component 3b, iC3b)를 발현하는 분리된 세포에 처리하여 상기 iC3b 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 측정한 단백질 발현 수준이 상기 후보 물질을 처리하지 않은 대조군의 iC3b의 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 파브리병의 효소 치료제로 선택하는 단계를 포함하는, 파브리병의 효소 치료제를 스크리닝하는 방법.
(a) treating a candidate substance of a Fabry disease enzyme therapeutic agent to a separate cell expressing an inactive complement component 3b (iC3b) to measure the expression level of the iC3b protein; And
(b) an enzyme treatment of Fabry disease when the protein expression level measured in step (a) is lower than the protein expression level of iC3b of the control group not treated with the candidate substance, Lt; / RTI &gt;
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