KR101912131B1 - 키다마이신을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 키다마이신(kidamycin)을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 키다마이신은 EGF에 의한 세포의 형질전환을 억제하고, 삼중음성 유방암세포의 오토파지(autophagy)를 유도하여 세포의 증식을 억제하여 삼중음성 유방암의 치료를 위한 항암제 또는 삼중음성 유방암 개선용 건강식품으로써 활용가능성이 클 것으로 판단된다.
Description
본 발명은 키다마이신(kidamycin)을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 유전적 요인과 환경적 요인에 의해 세포의 정상적 세포분열이 조절되지 않아 비정상적인 세포분열을 하게 되고, 또 세포 분열 횟수의 한계를 넘어 죽지 않게 됨으로써 발생한다. 이렇게 형질이 전환된 세포는 계속 증식하여 암 덩어리가 되며, 암 덩어리의 내부 중심부는 산소의 공급과 암세포의 성장을 위한 영양분의 공급이 제한을 받게 된다. 산소의 공급이 제한되면 암세포는 HIF-1 단백질을 발현시켜 혈관 신생에 관여하는 단백질 및 에너지 대사와 관련된 단백질의 발현을 증가시킨다. 그 결과로 암 조직은 다시 성장한다.
일반적으로 유방암은 여성에서 가장 흔한 질병 중 하나이다. 미국의 경우 일년에 약 24만 명의 유방암 환자가 발생하며, 약 4만 명의 환자가 사망하는 것으로 보고되어 있다. 우리나라에서는 최근 식생활의 서구화 및 비만 인구의 증가로 인하여 유방암 환자가 급격히 증가하고 있으며, 일년에 약 1만 8천여명의 환자가 발생하는 것으로 추정된다. 유방암 세포의 전이는 다른 암 종에 비하여 높지 않은 특징을 갖고 있기 때문에 유방암을 조기에 발견하여 적절한 치료가 진행되면 약 93%의 5년 생존율 보일 만큼 완치율이 높은 암 종이다. 하지만 조기 발견과 적절한 치료가 이루어지지 않으면 혈관과 림프관을 통해 암의 전이가 일어나게 되며, 따라서 암에 의한 치사율은 높아진다. 실제로 제4기 유방암의 경우 5년간 생존율은 34%로 전체 유방암 생존율에 비하여 매우 낮다.
유방암을 탁솔(taxol)과 같은 항암제 또는 방사선으로 치료할 경우, 초기 암 조직의 성장이 멈춰지고, 암의 크기가 작아지는 등 치료가 되는 것으로 보이지만, 일정기간이 지나면 다시 암이 자라나오게 되는 경우가 있다. 다시 자라나온 암세포를 대상으로 다시 동일한 항암제를 처리할 경우 항암제가 더 이상 작용하지 않게 되어 내성을 갖게 되며, 암세포의 전이율이 높아지는 등 더욱 악성의 형질을 갖게 된다. 삼중음성 유방암세포는 에스트로겐(estrogen)과 프로게스테론(progesterone) 수용체가 결손 되어 있고(ER-/PR-), HER2가 발현 되지 않은(HER2-) 것으로 알려져 있어, 탁솔(taxol), 타목시펜(tamoxifen), Her 2 활성억제제(trastuzumab)에 내성을 갖는 특징을 갖고 있다. 더욱이 주로 50세 이하의 젊은 여성이나 African-American/Hispanic 여성 중 변이된 BRCA1를 가진 여성에게서 발생 빈도가 높다. 미국에서 전체 유방암 환자 중 삼중음성 유방암 환자가 약 12~17% 정도 차지하는 것으로 알려져 있으며, 한국인에서는 전체 유방암 환자 중 약 15.9% 정도가 삼중음성 유방암을 갖는 것으로 보고되어 있다. 삼중음성 유방암 환자의 5년 생존율은 약 77% 정도로 다른 종류의 유방암 환자에서 보이는 약 93%에 비해 낮은 것으로 보고되어 있다. 또한, 삼중음성 유방암은 다른 종류의 유방암에 비해 조직학적 등급(grade)이 높고 침윤성의 유관암(ductal carcinoma) 형태를 가지는 등 다른 유방암에 비해 공격적인 특징을 가지고 있으며, 다수의 삼중음성 유방암은 호르몬 치료(Hormone therapy) 또는 트라스트주맙(trastzumab) 등에 효과가 없고 염색체 이수성 정도가 높으며(Degree of aneuploidy), 유전자-발현 프로파일(gene-expression profile)이 유사한 점 등 기저-유사 유방암 서브타입(basal-like breast cancer subtype)과 유사한 특징을 가지고 있다.
삼중음성 유방암을 상대로 한 표적치료의 한계는 목표로 하고자 하는 표적을 찾기가 어렵고, 따라서 이와 관련한 유효한 표적치료가 없다는데 있다. 삼중음성 유방암 환자들에게 화학요법(chemotherapy)이 효과적이나 심장독성, 심부전, 고혈압, 피부병 등의 부작용을 감소시킬 수 있는 치료 개선 방안을 연구할 필요성이 있다.
키다마이신(kidamycin)은 Streptomyces phaeoverticillatus var. takatsukiensis로부터 추출한 천연물로 그람양성균에 특이적으로 작용하는 항생제이면서 항암제 특성을 가지는 약물이다. 키다마이신(kidamycin)은 1971년 발견되어 1972년 Nobuo Kanda 등에 의해 Ehrich Ascites Carcinoma와 leukemia SN-36, leukemia L1210, Sarcoma-180 (solid), NF-sarcoma, Yoshida sarcoma 등에서 항암효과 연구를 진행한 이후, 키다마이신(kidamycin)의 항암 효과에 대한 분자기전 후속 연구는 진행되지 않았다.
J Antibiot (Tokyo). 1972 Oct; 25(10):553-6.
본 발명의 목적은 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 또는 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 키다마이신(kidamycin)을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 키다마이신은 EGF에 의한 세포의 형질전환을 억제하고, 삼중음성 유방암세포의 오토파지(autophagy)를 유도하여 세포의 증식을 억제하여 삼중음성 유방암의 치료를 위한 항암제 또는 삼중음성 유방암 개선용 건강식품으로써 활용가능성이 클 것으로 판단된다.
도 1은 키다마이신(kidamycin)이 500 nM 이상에서 JB6Cl41의 세포증식과 EGF에 의한 형질전환을 억제한다는 결과를 나타낸다. (A) 키다마이신의 화학구조이다. (B) 마우스 피부 상피세포 JB6 Cl41 (1 × 103 cells)을 96-well 세포 배양 plate에 접종하고 세포증식을 24시간 간격으로 72시간 동안 MTS assay를 이용하여 측정하였다. 데이터 값은 4회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05). (C) 마우스의 상피세포주 JB6 Cl41(8 × 103 cells)을 0.3% agar가 포함되어있고 10% FBS가 첨가된 BME 배양액에 섞어 현탁액을 만들고 6개 실험군 중 5개 실험군에 EGF (10 ng/ml)을 처리하였으며 EGF를 처리하지 않은 실험군에는 DMSO를 처리하고 EGF를 처리한 실험군에 각각에 DMSO, 50, 250, 500, 1250 nM의 키다마이신을 처리하였다. 세포는 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 20일간 배양하였으며 형질전환 세포의 측정은 ECLIPSE Ti inverted microscope using the NIS-Elements AR (V. 4.0) computer software program을 이용하였다. 데이터 값은 3회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05).
도 2는 키다마이신이 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에 특이적으로 세포증식억제 효과가 있으며 세포주기에 영향을 준다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 103 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 103 cells) 세포를 96-well 세포 배양 plate에 접종하고 세포증식을 24시간 간격으로 96시간 동안 MTS assay를 이용하여 측정하였다. 데이터 값은 4회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05). (B) 사람 유방암 세포 MCF-7 (5 × 105 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(5 × 105 cells)을 60-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 500 nM의 키다마이신을 48시간 동안 처리한다. 세포들을 회수하고 70% 에탄올/1× PBS로 -20℃에서 2시간 동안 고정시킨다. 고정된 세포를 PBS로 wash하고 RNase A (200 μg/ml) 와 propidium iodide (20 μg/ml)를 15분간 처리하였다. 세포주기는 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 측정하였다. 데이터 값은 3회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05). (C) 사람 유방암 세포 MCF-7 (5 × 105 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (5 × 105 cells)을 60-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 500 nM의 키다마이신을 48시간 동안 처리하였다. 세포를 회수 70% 에탄올/1× PBS로 -20℃에서 2시간동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 wash하고 RNase A (200 μg/ml) 와 propidium iodide (20 μg/ml)를 15분간 처리하였다. Sub-G1은 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 측정하였다. 데이터 값은 3회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05).
도 3은 키다마이신이 MDA-MB-231 세포에서 오토파지(autophagy) 형성을 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (3 × 106 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (3 × 106 cells)을 100-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 DMSO 및 500 nM의 키다마이신을 처리하고 세포의 형태 변화를 24시간 간격으로 48시간 동안 광학 현미경을 통하여 관찰하였다. 화살표(Arrow)는 키다마이신에 의해 세포질에 형성된 액포(vacuole)를 표시하고 있다. (B) 사람 유방암 세포 MCF-7(3 × 106)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(3 × 106)을 100-mm dish에 접종하고 밤샘 배양하였다. 세포 각각에 DMSO, 100, 250, 500 nM의 키다마이신을 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 세포들을 회수하고 단백질을 추출한 후 LC3 항체를 이용하여 Western blotting을 수행하였다. β-actin은 각각 실험군 단백질의 양이 동량인지를 확인하기 위하여 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. (C) 사람 유방암 세포 MCF-7(2 × 104) 및 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(2 × 104)을 8-chamber slide에 접종하고 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 밤샘 배양하였다. Chamber 각각에 DMSO 및 키다마이신을 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양하였다. Lysotracker를 1시간 동안 처리하고 Hoechst를 30분간 처리하였으며, ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program을 이용하여 형광을 관찰하였다. (D) 사람 유방암 세포 MCF-7(2 × 104) 및 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(2 × 104)을 8-chamber slide에 접종하고 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 밤샘 배양하였다. 각 세포에 각각에 mCherry plasmid를 도입하고 30시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. Chamber 각각에 DMSO 및 키다마이신 500 nM을 처리하였고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였으며, ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program을 이용하여 형광을 관찰하였다.
도 4는 키다마이신이 MDA-MB-231에서 선택적으로 미토파지(mitophagy)를 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) 상단 패널, 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish에 접종하였고 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. Lysotracker를 30 nM의 농도로 1시간 동안 처리하고 Mitotracker 를 20 nM의 농도로 45분간 처리하였으며 Hoechst (1 ㎍/ml)를 30분간 처리하였다. 각각의 실험군은 LSM 710 laser scanning confocal microscope로 형광을 측정하였다. 하단 패널, 상단 패널에서 얻은 형광 Z-stack image를 LSM 710 laser scanning confocal microscope 의 3D image 프로그램을 이용하여 확인하였다.
도 5는 키다마이신이 MDA-MB-231의 미토콘드리아에서 ROS 발생을 증가시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM 또는 1 mM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. Mitosox™ Red를 5 μM 농도로 10분간 처리하였다. 10분 후 각각의 세포를 LSM 710 laser scanning confocal microscope를 이용하여 형광을 측정하였다. (B) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish 에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM, 1 mM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 MitoProbe™ JC-1을 2 μM의 농도로 15분간 처리하였으며, 각각의 세포들을 LSM 710 laser scanning confocal microscope을 이용하여 형광을 측정하였다. (C) 사람 유방암 세포 MCF-7 (8 × 103 cells) 및 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (8 × 103 cells) 세포를 이용하여 표시된 농도의 키다마이신이 포함된 soft agar와 혼합하여 동일한 키다마이신이 포함된 bottom agar 위에서 굳히고, 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 3주간 배양하였다. 성장한 콜로니(colony)는 ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program (NIKON Instruments Korea, Gangnam, Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였다.
도 2는 키다마이신이 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에 특이적으로 세포증식억제 효과가 있으며 세포주기에 영향을 준다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 103 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 103 cells) 세포를 96-well 세포 배양 plate에 접종하고 세포증식을 24시간 간격으로 96시간 동안 MTS assay를 이용하여 측정하였다. 데이터 값은 4회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05). (B) 사람 유방암 세포 MCF-7 (5 × 105 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(5 × 105 cells)을 60-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 500 nM의 키다마이신을 48시간 동안 처리한다. 세포들을 회수하고 70% 에탄올/1× PBS로 -20℃에서 2시간 동안 고정시킨다. 고정된 세포를 PBS로 wash하고 RNase A (200 μg/ml) 와 propidium iodide (20 μg/ml)를 15분간 처리하였다. 세포주기는 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 측정하였다. 데이터 값은 3회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05). (C) 사람 유방암 세포 MCF-7 (5 × 105 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (5 × 105 cells)을 60-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 500 nM의 키다마이신을 48시간 동안 처리하였다. 세포를 회수 70% 에탄올/1× PBS로 -20℃에서 2시간동안 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS로 wash하고 RNase A (200 μg/ml) 와 propidium iodide (20 μg/ml)를 15분간 처리하였다. Sub-G1은 유세포 분석(flow cytometry)을 통하여 측정하였다. 데이터 값은 3회의 측정치에 대한 평균값과 표준편차로 나타냈으며 통계적 유의도 측정을 위하여 Student's t-test를 사용하였다(* P < 0.05).
도 3은 키다마이신이 MDA-MB-231 세포에서 오토파지(autophagy) 형성을 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (3 × 106 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (3 × 106 cells)을 100-mm dish에 접종하고 하룻밤 배양하였다. 세포 각각에 DMSO 및 500 nM의 키다마이신을 처리하고 세포의 형태 변화를 24시간 간격으로 48시간 동안 광학 현미경을 통하여 관찰하였다. 화살표(Arrow)는 키다마이신에 의해 세포질에 형성된 액포(vacuole)를 표시하고 있다. (B) 사람 유방암 세포 MCF-7(3 × 106)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(3 × 106)을 100-mm dish에 접종하고 밤샘 배양하였다. 세포 각각에 DMSO, 100, 250, 500 nM의 키다마이신을 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 세포들을 회수하고 단백질을 추출한 후 LC3 항체를 이용하여 Western blotting을 수행하였다. β-actin은 각각 실험군 단백질의 양이 동량인지를 확인하기 위하여 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. (C) 사람 유방암 세포 MCF-7(2 × 104) 및 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(2 × 104)을 8-chamber slide에 접종하고 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 밤샘 배양하였다. Chamber 각각에 DMSO 및 키다마이신을 처리하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양하였다. Lysotracker를 1시간 동안 처리하고 Hoechst를 30분간 처리하였으며, ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program을 이용하여 형광을 관찰하였다. (D) 사람 유방암 세포 MCF-7(2 × 104) 및 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(2 × 104)을 8-chamber slide에 접종하고 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 밤샘 배양하였다. 각 세포에 각각에 mCherry plasmid를 도입하고 30시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. Chamber 각각에 DMSO 및 키다마이신 500 nM을 처리하였고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였으며, ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program을 이용하여 형광을 관찰하였다.
도 4는 키다마이신이 MDA-MB-231에서 선택적으로 미토파지(mitophagy)를 유도한다는 결과를 나타낸다. (A) 상단 패널, 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish에 접종하였고 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. Lysotracker를 30 nM의 농도로 1시간 동안 처리하고 Mitotracker 를 20 nM의 농도로 45분간 처리하였으며 Hoechst (1 ㎍/ml)를 30분간 처리하였다. 각각의 실험군은 LSM 710 laser scanning confocal microscope로 형광을 측정하였다. 하단 패널, 상단 패널에서 얻은 형광 Z-stack image를 LSM 710 laser scanning confocal microscope 의 3D image 프로그램을 이용하여 확인하였다.
도 5는 키다마이신이 MDA-MB-231의 미토콘드리아에서 ROS 발생을 증가시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM 또는 1 mM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. Mitosox™ Red를 5 μM 농도로 10분간 처리하였다. 10분 후 각각의 세포를 LSM 710 laser scanning confocal microscope를 이용하여 형광을 측정하였다. (B) 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish 에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 각각의 세포에 키다마이신을 500 nM, 1 mM 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 MitoProbe™ JC-1을 2 μM의 농도로 15분간 처리하였으며, 각각의 세포들을 LSM 710 laser scanning confocal microscope을 이용하여 형광을 측정하였다. (C) 사람 유방암 세포 MCF-7 (8 × 103 cells) 및 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (8 × 103 cells) 세포를 이용하여 표시된 농도의 키다마이신이 포함된 soft agar와 혼합하여 동일한 키다마이신이 포함된 bottom agar 위에서 굳히고, 5% CO2, 37℃ 항온 배양기에서 3주간 배양하였다. 성장한 콜로니(colony)는 ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program (NIKON Instruments Korea, Gangnam, Seoul, Korea)를 이용하여 분석하였다.
본 발명은 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 상피성장인자(epidermal growth factor; EGF)에 의해 유도되는 암세포로의 형질전환을 억제할 수 있고, 삼중음성 유방암세포에서 G1 세포주기는 감소시키고, S 세포주기는 증가시킬 수 있다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포에서 오토파지(autophagy)를 유도할 수 있으며, 특히 미토파지(mitophagy)를 유도할 수도 있다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포의 미토콘드리아에서 ROS(Reactive oxygen species) 발생을 유도할 수 있다.
본 발명의 키다마이신(kidamycin)은 화학식 1로 표시되며, 분자식은 C39H48N2O9이고 분자량은 688.82이다.
< 화학식 1 >
본 명세서에 있어서, "삼중음성 유방암"은 에스트로겐(estrogen) 및 프로게스테론(progesterone) 수용체가 결손되고(ER-/PR-), HER2 유전자가 발현되지 않는 것으로 알려져 있어, 탁솔(taxol), 타목시펜(tamoxifen), Her 2 활성억제제(trastuzumab)에 내성을 갖는 특징을 갖고 있다. 미국에서 전체 유방암 환자 중 삼중음성 유방암 환자가 약 12~17% 정도 차지하는 것으로 알려져 있으며, 한국인에서는 전체 유방암 환자 중 약 15.9% 정도가 삼중음성유방암을 갖는 것으로 보고되어 있다. 삼중음성 유방암 환자의 5년 생존율은 약 77% 정도로 다른 종류의 유방암 환자에서 보이는 약 93%에 비해 낮은 것으로 보고되어 있다.
본 명세서에 있어서, "세포사멸(apoptosis)"는 발생 및 노화, 그리고 조직 내에서 세포의 수를 일정하게 조절하여 항상성을 유지하는 기전으로 세포 속에 프로그램되어 있는 세포사멸의 과정을 말한다. 또한, 면역반응이나 질병 또는 유해한 물질에 의하여 세포가 손상을 받았을 때에도 세포의 방어기전으로 일어난다. Ionizing x-ray 또는 UV의 조사, 유전자에 손상을 주는 항암제를 이용한 약물 치료를 수행하였을 경우에도 유발되며, 이러한 세포사멸 세포(apoptotic cell)에서는 단백질분해(protein cleavage), 단백질 교차결합(protein cross-linking), DNA 분해(DNA breakdown), 식세포 인식(phagocytic recognition)과 같은 여러 가지 특징들이 나타난다.
본 명세서에 있어서, "오토파지(autophagy)"는 세포 내에서 손상된 단백질이나 세포 내 소기관을 제거하여 세포가 건강한 상태를 유지하여 항상성을 유지하도록 하는 중요한 과정으로 일정 비율로 세포에서 항상 일어난다. 하지만, 세포에 영양공급이 불충분하거나, 세포 내 단백질 등이 손상을 받아 응집체(aggregates) 등을 형성하거나, 급격하게 세포 내에서 에너지가 필요한 상황에 처하거나, 변화하는 외부 환경에 세포가 적응하는 등 환경이 바뀌었을 경우 등에는 급격하게 증가한다.
본 명세서에 있어서, "미토파지(mitophagy)"는 선택적 오토파지(autophagy) 중 하나로서, 미토콘드리아(mitochondria)를 특이적으로 제거하기 위한 오토파지(autophagy)이며, 오래되거나 손상을 입은 미토콘드리아를 제거함으로써 미토콘드리아의 온전성을 유지할 수 있게 한다. 미토파지(mitophagy)는 비정상적인 기능을 하는 미토콘드리아를 정상적인 미토콘드리아로 회전시키는 것뿐만 아니라 저산소(hypoxia)와 기아와 같은 스트레스 환경에서 전체 미토콘드리아 양을 조절하는 역할을 하며 이로 인하여 ROS의 발생을 줄이고 산소로부터 중요한 영양분 등을 보호하며 이와 같은 기능으로 에너지와 관련된 스트레스 상황에서도 세포가 살아남을 수 있도록 하는 기능을 수행한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 화합물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 키다마이신을 유기 및 무기산을 이용해 형성할 수 있으며, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 메탄술폰산, 히드록시에탄술폰산, 황산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산 및 기타 다양한 산으로 형성된 질산염, 인산염, 붕산염, 타르타르산염, 시트르산염, 숙신산염, 벤조산염, 아스코르브산염 또는 살리실산염 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 키다마이신(kidamycin)을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 키다마이신 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 키다마이신의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 시약
버퍼를 만드는데 필요한 Tris, NaCl, sodium dodecyl sulfate (SDS) 등의 화학물질 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 키다마이신(kidamycin)은 한국생명공학연구원의 홍영수 박사 연구팀이 Streptomyces phaeoverticillatus var. takatsukiensis 에서 추출한 것을 사용하였다. 세포배양을 위한 배지[Minimum Essential Medium Eagle(MEM), Dulbecco's Modification of Eagle's Medium(DMEM), Mammary Epithelium Basal Medium(MEBM) 등]는 Corning (Manassas, VA, USA), Lonza (Walkersville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 DC protein assay kit는 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA) 제품을 사용하였으며, 세포의 증식을 분석하기 위하여 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS)] kit를 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
2. 세포 배양
마우스 상피 세포주(Mouse epidermal cell line; JB6 Cl41), 사람 삼중음성 유방암 세포주인 MDA-MB-231과 사람 유방암 세포주인 MCF-7은 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) 에서 구입하였다. JB6 Cl41은 5%의 영아소혈청(fetal bovine serum: FBS)과 항생제(100 Units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)을 첨가한 minimum essential medium (MEM) (Corning; Manassas, VA, USA)을 사용하여 배양하였다. MCF-7은 minimum essential medium (MEM) (Corning; Manassas, VA, USA)에 10% 영아소혈청(FBS)과 항생제(100 Units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)와 인슐린(10㎍/ml)을 첨가한 배지를 이용하여 배양하였고, MDA-MB-231은 Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) (Corning; Manassas, VA, USA)에 10% 영아소혈청(FBS)과 항생제 (100 Units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)을 첨가한 배지를 이용하여 배양하였다. 이 세포들은 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 항온배양기에서 배양하였으며, 2일 마다 배양액을 교체하였고, 세포가 배양용기의 표면적에 약 90% 정도 증식하면 계대하였다.
3. 세포 증식 분석 (MTS 분석)
세포들을 (JB6 Cl41; 1 × 103 cells/well, MCF-7; 2 × 103 cells/well, MDA-MB-231; 2 × 103 cells/well) 96-well plate에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 키다마이신(kidamycin)을 100 nM, 500 nM, 1000 nM의 농도로 처리하였으며, 각각의 96-wll plate를 0, 24, 48, 72, 96시간 별로 세포의 증식을 흡광도계를 이용하여 측정하였다. 흡광도를 측정하기 위하여 각 well에 20 ㎕의 MTS-based Cell Titer 96®Aqueous One Solution을 첨가 후 1시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 반응시켰으며, xMark™ Microplate Absorbance Spectrophotometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 키다마이신(kidamycin)에 의한 세포증식 억제 효과는 세포를 접종한 후 2시간째를 기점으로 24시간 마다 5일간 측정하였으며, 매 24시간째에 표시된 농도의 키다마이신(kidamycin)이 포함된 배지를 이용하여 배양액을 교체하였다.
4. 앵커리지 비의존적 세포 형질전환 분석(Anchorage-independent cell transformation assay)
1×BME, MEM, DMEM에 10% FBS와 0.5% agar 그리고 농도별 키다마이신(kidamycin)을 첨가한 3 ml의 bottom agar를 6 well plate에 분주하여 굳힌 후 마우스 피부 상피세포 JB6 Cl41 (8 × 103/well), 사람 유방암 세포 MCF-7 (8 × 103/well), 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (8 × 103/well)을 각각 1X BME, MEM, DMEM에 섞고 여기에 10% FBS 그리고 0.33% agar와 농도별 키다마이신(kidamycin)을 첨가하여 만든 1 ml top agar를 bottom agar 위에 분주하여 굳히고 약 20일간 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 배양하였다. ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program (NIKON Instruments Korea, Gangnam, Seoul, Korea) 를 이용하여 콜로니(colony) 숫자를 측정하였다.
5.
Lysotracker
염색 분석
8-chamber slide의 각 chamber에 사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231(2 × 104 cells)을 접종하였고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 24시간 후 키다마이신(kidamycin)을 처리 후 24시간 동안 배양하였으며 LysoTracker® Red DND-99 (Life technologies, OR, USA) 를 30 nM의 농도로 각 세포의 배양액과 희석하여 1시간 동안 처리하였다. 칼슘-PBS로 3회 wash 후 4% 포르말린으로 고정한 다음 Hoechst (1 ㎍/ml)를 PBS에 희석하여 30분간 세포에 처리하였다. 그 후 8-chamber slide에 CLEAR-MOUNT with TRIS Buffer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA)를 이용하여 커버슬라이드를 부착하였다. ECLIPSE Ti inverted microscope와 the NIS-Elements AR (V.4.0) computer software program (NIKON Instruments Korea, Gangnam, Seoul, Korea)을 이용하여 형광을 측정하였다.
6.
Mitotracker
염색 분석
사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish (SPL Life Sciences, Pocheon, South Korea)에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 24시간 후 키다마이신(kidamycin)을 500 nM 농도로 각 세포의 배양액과 희석하여 처리 후 24시간 배양하였다. 그 후 Mitotracker® Green FM (Invitrogen, OR, USA)을 20 nM의 농도로 각 세포의 배양액에 희석하여 45분간 처리하였다. 칼슘-PBS로 3회 wash 후 Hoechst (1 ㎍/ml)를 PBS에 희석하여 30분간 세포에 처리하였다. 이후 칼슘-PBS로 배양액을 교체한 후 LSM 710 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 형광을 측정하였다.
7. 미토콘드리아 막 전위 분석
사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish (SPL Life Sciences, Pocheon, South Korea)에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 24시간 후 키다마이신(kidamycin)을 vehicle(DMSO), 100 nM, 250 nM, 500 nM의 농도로 각각 세포의 배양액에 희석하여 24시간 배양하였다. 그 후 양성 대조군(positive control)으로 사용하기 위해 DMSO를 처리한 세포에 CCCP (carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone)를 50 μM의 농도로 각각 세포의 배양액에 희석하여 처리하였고 MitoProbe™ JC-1 (Life technologies™, OR, USA)를 2 μM의 농도로 각각의 세포 배양액에 희석하여 15분간 처리하였다. 15분 후 칼슘-PBS로 배양액을 교체하였고, LSM 710 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 형광을 측정하였다.
8. 미토콘드리아
ROS
검출 분석
사람 유방암 세포 MCF-7 (2 × 104 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 (2 × 104 cells)을 confocal dish (SPL Life Sciences, Pocheon, South Korea)에 접종하고 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 24시간 후 DMSO, 키다마이신(kidamycin)을 500 nM 농도로 각각 세포 배양액에 희석하여 처리 후 24시간 배양하였다. 여기에 MitoSOX™ Red (Invitrogen, OR, USA)를 5 μM 농도로 각각 세포 배양액에 희석하여 10분간 처리하였고 칼슘-PBS로 배양액을 교체한 후 LSM 710 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 형광을 측정하였다.
9. 세포 주기 분석
사람 유방암 세포 MCF-7 (5 × 105 cells)과 사람 삼중음성 유방암 세포주 MDA-MB-231 (5 × 105 cells)을 60-mm dish에 접종 후 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 키다마이신(kidamycin)을 [비처리군 (DMSO) 및 처리군 (100 nM, 250 nM, 500 nM)]을 각 세포 배양액에 희석하여 24시간 동안 처리하였고, PBS로 wash 후 0.1% Trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 회수한 다음 1× PBS로 wash 하였다. ice-cold 70% 에탄올(ethanol)로 -20℃에서 2시간 동안 고정하고, ×1000 g에서 각 세포들을 원심 분리하여 회수하였다. 250 ㎕의 0.6% Triton-X100-1X PBS로 세포를 부유하고 RNase A (200 μg/ml) 와 propidium iodide (20 μg/ml)를 첨가하여 4℃에서 15분간 방치하였다. 세포주기는 flow cytometry (BD FACS Calibur™ flow cytometry, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 측정하였다.
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실시예
1>
키다마이신(kidamycin)에
의한 JB6
Cl41
세포의 증식억제 및
EGF에
의한 형질전환 억제
문헌의 보고에 의하면 키다마이신(kidamycin)은 항생제 활성을 갖고 있는 천연물질이며, 항암 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(도 1A). 본 발명에서는 마우스 피부 상피 세포인 JB61 Cl41 세포를 이용하여 키다마이신이 세포의 증식과 암화에 미치는 영향을 검증하였다(도 1B 및 도 1C). 그 결과 키다마이신은 JB6 Cl41 세포의 증식을 농도 의존적으로 억제하였다. 세포증식 억제의 효능을 비교하여 보면, 키다마이신은 약 500 nM의 농도에서 JB6 Cl41 세포의 증식을 약 50% 억제하였다 (도 1B). 키다마이신을 사용하여 앵커리지 비의존적(anchorage-independent) 조건에서 상피성장인자(epidermal growth factor; EGF)에 의해 유도되는 세포의 형질전환 억제능을 검증하였다. JB6 Cl41 세포는 EGF 자극에 의해 앵커리지 비의존적(anchorage-independent) 조건에서 콜로니(colony)를 형성하여 암세포로 형질이 전환되는 것을 확인하였다(도 1C, 상단 패널 내 DMSO). 그러나 키다마이신을 EGF와 병용 처리하였을 경우, EGF에 의해 유도되는 JB6 Cl41 세포의 형질전환이 농도의존적으로 감소됨을 확인하였다 (도 1C). 따라서 키다마이신은 세포의 증식을 억제하며, 앵커리지 비의존적(anchorage-independent) 조건에서 EGF에 의해 유도되는 세포의 형질전환을 억제하는 효능이 있는 것을 확인하였다.
<
실시예
2>
키다마이신(kidamycin)에
의한 MCF-7 및 MDA-MB-231 세포의 증식억제 효능
키다마이신에 의한 항암효과를 검증하기 위하여 유방암 세포 MCF-7과 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231을 이용하였다. 키다마이신을 MCF-7과 MDA-MB-231에 처리하여 세포의 증식억제 효과를 분석한 결과, MCF-7 유방암 세포는 1 μM 농도의 키다마이신 처리에 의해서 약 30%의 세포증식을 억제하는 것을 확인하였다(도 2A, 왼쪽 그래프). 이에 반하여 키다마이신은 MDA-MB-231 삼중음성 유방암 세포에서 500 nM의 농도로 처리하였을 경우 약 30%와 1 μM의 농도에서는 약 50%의 세포증식 억제효과를 보였다(도 2A, 오른쪽 그래프). 따라서 키다마이신은 유방암 세포 중에서 삼중음성 유방암 세포에 특이성을 갖고 암세포의 성장을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 2A).
키다마이신에 의한 세포증식 억제 효과와 세포주기와의 상관성을 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 실험을 수행하였다. 그 결과 유방암 세포 MCF-7은 각각 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 세포주기의 변화가 관찰되지 않았다(도 2B). 이에 반하여 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231은 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 G1/G0 세포주기는 감소하고, S 세포주기는 증가하였으며, G2/M 세포주기는 변하지 않는 것을 관찰하였다(도 2B). 키다마이신 처리에 의해서 S 세포주기 집적화로 인하여 세포의 증식이 억제되는 것으로 판단하여 Sub-G1 세포주기를 분석하여 세포사멸(apoptosis) 유도가 일어나는지 예측하고자 하였다. 그러나 키다마이신에 의해 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에서 유의적인 sub-G1 세포주기의 집적화는 관찰되지 않았다(도 2C). 이상의 결과를 종합하면, 키다마이신은 S 세포주기의 집적을 통하여 세포의 증식을 억제하지만 세포사멸(apoptosis) 유도는 일어나지 않는 것으로 판단된다.
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실시예
3>
키다마이신(kidamycin)에
의한
MDA
-MB-231 세포에서의
오토파지
(autophagy) 형성
키다마이신에 의해 세포의 증식과 암화, 암세포의 증식이 억제되고, S 세포주기의 집적현상이 관찰되지만 세포사멸은 관찰되지 않았다. 따라서 키다마이신 처리에 의한 유방암 세포 MCF-7과 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서 형태 변화를 관찰하였다. MCF-7 유방암 세포는 키다마이신 처리에 의해 세포의 형태나 세포 증식에 차이를 보이지 않았다(도 3A, 왼쪽 패널). 이에 반하여 MDA-MB-231 세포는 각 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 세포가 길쭉해지는 형태의 변화를 유도하였으며, 세포 안에 오토파지(autophagy) 유도에 의해 주로 관찰되는 작은 액포(vacuole)의 형성이 확인되었다(도 3A, 오른쪽 패널). 세포질에 형성된 액포(vacuole) 형성이 오토파지(autophagy) 인지 확인하기 위하여 키다마이신을 농도별로 처리하고 LC3-1과 LC3-II의 증감을 검증하였다. 그 결과 키다마이신 처리에 의해 LC3의 축적이 이루어짐을 검증하였다(도 3B). 오토파지(autophagy)의 형성은 세포질에서의 리소좀 활성화(lysosome activation)와 밀접한 관계가 있다. 따라서 키다마이신에 의한 리소좀(lysosome)의 활성화를 산성 리소좀(acidic lysosome)을 염색하는 lysotracker를 이용하여 염색한 결과 키다마이신 처리에 의해 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서 리소좀(lysosome)의 활성이 유도된 반면 유방암 세포 MCF-7에서는 유도되지 않았다(도 3C). 키다마이신에 의한 액포(vacuole) 형성과 리소좀(lysosome)의 형성이 오토파지(autophagy)임을 확증하기 위하여 mCherry를 이용하여 검증하였다. 유방암 세포 MCF-7 및 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에 mCherry를 도입하고 키다마이신 처리에 의한 GFP 및 RFP를 형광현미경을 이용하여 검증한 결과 유방암 세포 MCF-7에서는 GFP와 RFP가 동시에 관찰되어 키다마이신에 의해 오토파지(autophagy) 형성이 관찰되지 않았으나, 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서는 GFP는 관찰되지 않고 RFP만 관찰되어 산성 리소좀(acidic lysosome)의 활성화에 의한 오토파지(autophagy)이 형성됨을 확인하였다(도 3D). 따라서 키다마이신은 삼중음성 유방암 세포에서 선택적으로 오토파지(autophagy)을 유도함을 확인하였다.
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실시예
4>
키다마이신(kidamycin)에
의한 삼중음성 유방암 세포 특이적
미
토파지(mitophagy)의 형성
도 3을 바탕으로 MCF-7과 MDA-MB-231 세포에서 키다마이신 처리에 의해 오토파지(autophagy)가 유도되는지 재확인하기 위하여 활성화된 리소좀(lysosome)을 염색하는 lysotracker로 염색한 결과 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 유방암 세포 MCF-7에서는 lysotracker에 의한 염색이 관찰되지 않았으나 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서는 lysotracker에 의한 염색이 증가되는 것을 확인하였다(도 4A). 또한 mitotracker를 동시에 염색하였을 경우, 유방암 세포 MCF-7 및 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서는 mitotracker에 의한 염색이 동시에 관찰되었지만 lysotracker와 mitotracker가 동시 염색이 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서만 관찰되어 키다마이신에 의해 되어 미토파지(mitophagy)가 유도됨을 확인하였다(도 4A, 상단 패널). 활성화된 리소좀(lysosome)과 미토콘드리아(mitochondria)가 함께 위치하는 것을 명확히 분석하기 위하여 공초점 현미경 결과를 3D 구조로 분석하였다. 그 결과 유방암 세포 MCF-7에서는 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 lysotracker 염색이 관찰되지 않았으며, mitotracker와 핵이 분리되어 서로 다른 층(layer)에 위치하고 있음을 관찰하였다(도 4A, 하단 왼쪽 패널). 유방암 세포 MCF-7와는 달리 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서는 500 nM의 키다마이신 처리에 의해 lysotracker에 의한 염색이 명확히 유도됨을 관찰하였으며, lysotracker와 mitotracker의 동시염색에 의한 노란색 또는 오랜지색으로 보이는 functa가 관찰되었다(도 4A, 하단 오른쪽 패널). 더욱이 lysotracker와 mitotracker에 의해 염색된 functa가 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서 선택적으로 관찰되었으며, 노란색 또는 오랜지색 functa가 파랗게 보이는 핵과 다른 layer에서 관찰되었다(도 4A, 하단 오른쪽 패널). 이상의 결과를 종합하면, 키다마이신은 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서 선택적으로 미토파지(mitophagy)를 유도하는 것으로 판단된다.
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실시예
5>
키다마이신(kidamycin)에
의한
ROS
형성과 미토콘드리아 막 전위차 변이에 미치는 영향
세포 내에는 미토콘드리아가 손상을 받아 미토콘드리아 내막에서 에너지를 효과적으로 생산하지 못하는 경우 손상된 미토콘드리아를 제거하기 위한 미토파지(mitophagy)를 유도한다는 사실이 알려져 있다. 따라서 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서 키다마이신에 의한 미토파지(mitophagy) 형성이 미토콘드리아의 손상과 관련이 있을 것으로 가설을 세우고, 키다마이신 처리에 의한 미토콘드리아에서의 ROS 생성을 mitosox로 염색한 후 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. 예상했던 실험 결과와 동일하게 키다마이신은 유방암 세포 MCF-7에서 mitosox에 의해 염색되지 않았으며, 온전히 mitotracker에 의해서만 염색되었다(도 5A). 유방암 세포 MCF-7와는 반대로, 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231에서는 500 nM의 키다마이신에 의하여 mitosox에 의한 염색이 관찰하였으며, mitosox에 의한 염색이 mitotracker와 동일한 자리에서 함께 염색되는 것을 관찰하였다(도 5A). 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서 키다마이신에 의해 생성된 ROS가 미토콘드리아의 손상을 유도하여 미토콘드리아 내막의 전위차에 영향을 주는지를 관찰하였다. 그 결과, 유방암 세포 MCF-7에서 JC-1/red의 염색이 MDA-MD-231 세포에 비하여 약하게 염색되었으며, JC-1/green 염색은 두 세포에서 동일하게 염색되었다(도 5B). 그러나 키다마이신 처리에 의하여 JC-1/red 염색이 유방암 세포 MCF-7과 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서 증가하지 않았으며, 키다마이신의 농도를 500 nM에서 1 μM로 증가하여도 유방암 세포 MCF-7과 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서 JC-1/red의 양적 변화는 관찰되지 않았다(도 5B). 그러나 CCCP-1 처리에 의해서는 JC-1/red의 염색이 유방암 세포 MCF-7과 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231 세포에서 사라지며 JC-1/green의 변화는 유도하지 않음을 관찰하여 실험이 정상적으로 수행되었음을 확인하였다(도 5B). 키다마이신에 의한 미토파지(mitophagy)의 형성과 세포 내(in vitro) 유방암 조직의 성장에 미치는 영향을 앵커리지 비의존적(anchorage-independent) 콜로니 성장 실험을 통하여 검증하였다. 그 결과 키다마이신은 500 nM에서 유방암 세포 MCF-7의 콜로니 성장을 억제하지 않았지만 MDA-MB-231 세포에서는 키다마이신 500 nM의 농도에서 앵커리지 비의존적(anchorage-independent) 조건에서 콜로니의 성장을 거의 완벽하게 억제하였다. 이상의 결과를 요약하면, 키다마이신은 삼중음성 유방암 세포 MDA-MB-231의 미토콘드리아에서 ROS 발생을 유도하며, ROS의 생성과 미토파지(mitophagy)의 유도가 서로 밀접한 관계가 있는 것으로 판단되며, 삼중음성 유방암 세포의 성장을 500 nM의 농도에서 거의 완벽하게 억제하여 삼중음성 유방암 세포를 대상으로 한 항암제로서의 개발 가능성을 보여주었다.
Claims (9)
- 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 상피성장인자(epidermal growth factor; EGF)에 의해 유도되는 암세포로의 형질전환을 억제하는 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포에서 G1 세포주기는 감소시키고, S 세포주기는 증가시키는 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포에서 오토파지(autophagy)를 유도하는 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포에서 미토파지(mitophagy)를 유도하는 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 삼중음성 유방암세포의 미토콘드리아에서 ROS(Reactive oxygen species) 발생을 유도하는 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬화수소산염, 메탄술폰산염, 히드록시에탄술폰산염, 황산염, 아세트산염, 트리플루오로아세트산염, 말레산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 질산염, 인산염, 붕산염, 타르타르산염, 시트르산염, 숙신산염, 벤조산염, 아스코르브산염 및 살리실산염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염인 것을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼중음성 유방암은 에스트로겐(estrogen) 및 프로게스테론(progesterone) 수용체가 결손되고(ER-/PR-), HER2 유전자가 발현되지 않는 것(HER2-)을 특징으로 하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 키다마이신(kidamycin) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020170095294A KR101912131B1 (ko) | 2017-07-27 | 2017-07-27 | 키다마이신을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물 |
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| KR1020170095294A KR101912131B1 (ko) | 2017-07-27 | 2017-07-27 | 키다마이신을 유효성분으로 함유하는 삼중음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물 |
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2017
- 2017-07-27 KR KR1020170095294A patent/KR101912131B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0200818A1 (en) * | 1984-12-06 | 1986-11-12 | Microbial Chemistry Research Foundation | Derivatives of the pluramycin group having anti-tumor activity, process for their preparation and their use as medicaments |
| CN1634583A (zh) * | 2004-11-22 | 2005-07-06 | 山东蓝金生物工程有限公司 | 一种含抗肿瘤抗生素的抗癌药物组合物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CANCER RESEARCH, VOLUME71, ISSUE5, PAGES1772~1780 * |
| J Antibiot (Tokyo). 1972 Oct; 25(10):553-6. |
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