KR101911949B1 - 지렁이를 이용한 in situ 토양질 평가방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토양선호 분산에세이(dispersal assay)라 칭하는 지렁이의 토양선호도를 이용한 현장 평가가 가능한 새로운 토양질 평가방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 토질을 평가하고자 하는 지역에 기준토양(reference soil)을 포함하는 실험튜브를 설치하고 지렁이를 튜브 내에 위치시킨 후, 지렁이가 토양선호도에 따라 주위 토양으로 분산되어 나오거나, 초기토양에 남아있는 지렁이의 수를 계수하여 토양 독성을 in situ 스크리닝 테스트하는 토양질 평가방법이다. 본 발명의 토양선호 분산에세이는 물리화학적 토양 특징들과 높은 관련성을 나타내고, 낮은 편차(variance)를 나타내므로 간편하고 경제적이며 정확도 높게 토양질을 평가할 수 있다.

Description

지렁이를 이용한 in situ 토양질 평가방법{In situ soil quality assessment method using earthworm}

본 발명은 지렁이를 이용한 토양질의 평가방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 지렁이의 토양선호도를 이용하여 토양질 및 토양독성을 평가하는 in situ 토양질 평가방법에 관한 것이다.

토양은 음식, 물질 및 모든 육상 생물의 서식지를 제공하는 매우 중요한 매체이다. 또한, 토양은 수자원을 저장하고, 영양분을 재활용하며, 오염물질의 필터로써 기능할 수 있기에 토양은 다수의 화학물질을 함유하고 축적하는 것이 가능하다. 따라서 토양의 기능적 품질을 유지하는 것은 토양 환경시스템을 유지시키는데 매우 중요하다. 이러한 토양의 특성은 장소마다 다르기 때문에 토양의 품질을 간단한 설명만으로 평가하기에는 매우 복잡하다. 따라서, 신뢰성 있는 생태위해성 평가(reliable ecological risk assessments)를 위하여 현장-특이적인 평가방법이 필요하다.

기존 현장-특이적 토질 평가방법 중 하나는 특정 생물을 환경 샘플들에 노출시켜 토질을 평가하는 바이오에세이(bioassay)이다. 다양한 종류의 바이오에세이가 존재하며, 그 중 지렁이 또는 톡토기(springtail)를 이용한 회피 테스트는 토질측정을 위해 전형적으로 사용되는 테스트 중 하나이다. 또 다른 유형의 바이오에세이로는 토양 호흡 또는 효소 활성을 측정하는 미생물 바이오에세이, 접촉 테스트, 미끼-얇은 판 테스트(bait-lamina tests), Microtox®, elutriate 에세이 등이 있으며, 일부 표준보고서는 토양에서 지렁이와 미세 절지동물을 포함한 토양 무척추동물을 샘플링하여 실제 생물 다양성을 산정하는 방법을 제시하고 있다. 또한, 토양 세척과 같은 다양한 정화 기술로 정화된 토양은 토양의 생물학적 특성을 변화시켜 일부 육상생물의 생존을 방해할 수 있기 때문에, 토양의 품질을 예측하기위해서는 생물학적 분석이 필요하다. 따라서 이러한 생물학적 분석에 추가하여 현장 특이적인 시험을 위해서는 광범위한 토양 변수의 검증이 필요하다.

지렁이는 섭취, 분해 및 미생물 분해 과정을 통해 토양의 물리적인 구조를 변형시키며, 지렁이의 존재는 토양 비옥도를 향상시킬 수 있다. 따라서 지렁이는 토양 생태 독성평가에서 사용되는 가장 중요한 표준시험종(species)이다. 토양 생태 독성평가시 지렁이의 사망, 회피행동 및 생식활성을 측정해 활용한다. 또한, 지렁이 종을 사용하는 많은 바이오에세이들은 Neutral red retention, 식균 작용, 및 효소 반응을 평가하여 체강 세포의 리소좀 안정성을 측정하는 기술을 사용해 오염물질 노출 위험 정도를 평가한다. 현장-특이적 토양 평가방법에서는 회피 테스트가 토양독성을 평가하는데 주로 사용되며, 현장 규모(field scale)에서 이를 측정하기 위한 표준방법이 확립되어있다. 또한, 최근 현장특이적 에세이를 위한 잠재적인 바이오마커로써 지렁이 배설물을 이용한 미생물군의 생존능력 평가방법이 제안되었으며, 지렁이 종의 조직잔류물 및 체강세포 내용물을 사용하는 일부 테스트는 현장 기반 바이오마커로 사용 가능하다. 그러나, 토양 독성 평가에 사용 가능한 상기 바이오에세이들을 시간이 많이 소모되거나 비용이 과도하게 들어 경제성이 떨어진다는 문제가 있다.

따라서, 본 발명자들은 현존하는 토양독성 평가 바이오에세이들의 문제점을 해결하기 위하여 현장 규모에 적용가능하고 간단 신속하게 토질을 평가할 수 있는 새로운 유형의 토질평가 바이오에세이를 개발하였다. 구체적으로 1) 지렁이의 회피 행동을 이용하여 “분산 에세이(dispersal assay)"라는 생물학적 분석법을 개발하고, 2) 현장 규모에서 토양선호 분산에세이(dispersal assay) 적용 및 3) 토양선호 분산에세이의 결과와 전통적인 독성 종말점의 결과를 다변량 통계 분석을 사용하여 비교하였다.

한국등록특허 제 1,665,370호 한국등록특허 제 1,636,622호 한국등록특허 제 1,542,203호

Gupta SK,Schwitzgueb'el J.2003. Trends in soil science in Switzerland: improvement of food chain safety with the help of sustainable land use management.J Soils Sediments 3:247. Kwak JI,Kim SW,An Y-J. 2014. A new and sensitive method for measuring in vivo and in vitro cytotoxicity in earthworm coelomocytes by flow cytometry.Environ

본 발명자들은 이전의 토양독성 평가 바이오에세이들의 문제점을 해결하기 위하여, 지렁이의 토양선호도를 이용한 현장 규모에서 적용가능하고 간단 신속하게 토질을 평가할 수 있는 새로운 유형의 토양질 평가방법을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 기준토양을 관의 일측면에 채우는 단계;

2) 상기 단계 1)의 기준 토양이 채워진 관에 지렁이를 첨가하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 지렁이가 첨가된 관을 평가 대상 토양에 설치하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 지렁이의 행동 양상을 측정하는 단계를 포함하는 토양 질 평가방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 토양에서 유효인산염(available phosphate; AvP), 유효실리케이트(available silicate; AvS), 양이온 교환용량(cation exchange capacity; CEC), 전기전도도(electric conductivity; EC), 유기물 함량, 토양 pH, 토양의 Sand/Silt/Clay 구성비율 및 용수량(water holding capacity ; WHC)을 측정하는 단계; 및

2) 상기 측정값에 대해 다변량 통계분석법 수행하는 단계를 포함하는 토양질 평가방법을 제공한다.

본 발명의 지렁이 토양선호도를 이용한 토양질 평가방법은 평가시간이 짧아 경제적이며, 현장에 직접 적용 가능해 간편하고 높은 정확도로 토양질을 평가할 수 있다.

도 1의 (A)는 지렁이의 토양선호 분산에세이(dipersal assay)를 디자인한 것이며, 이러한 분산에세이를 (B)실험실 및 (C)현장 스케일(field scale)에서 적용한 것을 나타낸다.
도 2의 (A)는 Cu-amended RS (0, 50, 500 mg/kg) 상에서 수행한 토양선호 분산에세이 결과를 나타낸다. 지렁이의 상태는 분산상태, 초기 토양에 머무름, 회피(avoidance) 또는 사망(dead)으로 분류하였다. RS 평균값에서 에러 바(Error bar)는 표준편차(n=30)를 나타내며, 별표(*)는 RS 평균과의 유의차(significant difference)(p < 0.05)를 각각 나타낸다. (B) 각각의 현장 장소(S1-S6)에서의 분산에세이 결과를 나타낸다. 지렁이의 상태는 분산, 초기 토양에 머무름, 회피, 사망 및 실패(failed)로 구분된다. 실패는 테스트 기간동안 튜브가 이탈한 것을 의미한다. one-way ANOVAs 이후 Bonferroni 다중 비교 테스트를 사용하여 표준 편차(n=50)를 의미하는 에러 바와 유의차(a,b로 표시)를 결정하였다.
도 3은 각각의 현장에서의 토양선호 분산에세이 결과를 도해적 표현으로 나타낸 것이다. 각각의 장소(S1-S6), 그룹당 10개의 튜브를 갖는 5 개의 그룹을 사용하였다. 지렁이의 상태는 분산, 초기 토양에 머무름, 회피, 사망 및 실패(failed)로 구분하였다. 실패는 테스트 기간 동안 고정된 튜브가 이탈된 것을 의미한다.
도 4의 (A)는 RS 및 S1-S6 토양이 준비된 실험실에서 7일 후 지렁이(Eisenia andrei)의 급성 독성 영향을 나타낸다. 생존률(survival rates), 토양 침투율(soil penetration rates), 체강세포 생존률(coelomocytes viability), 및 비정상성을 평가하였다. 절단(fragmentation), 얇아짐(thining), 부풀어오름(swelling), 출혈(bleeding) 및 점액분비(mucous secretion)를 지렁이 비정상성으로 취급해 계수하였다. 에러 바는 표준편차(n= 10-30)를 의미한다. (B) PCA(principal component analysis) 후의 S1-S6의 적재 그림(loading plots)을 나타낸다. x 및 y 축은 각각 PC1(principal component 1)을 나타내고 PC2(principal component 2)를 나타낸다. loading persite는 텍스트와 파란 선으로 표시하였다.
도 5는 현장에서의 토양선호 분산에세이의 연속적 과정을 나타낸다. (a)갈퀴를 사용해 토양을 평평하게 하고, (b)토양에 수분을 공급하고(2L / 100cm²), (c) 지렁이를 각 관에 넣은 후 (d)24시간 이후에 지렁이 상태를 기록한다.
도 6은 토양선호도를 이용한 분산에세이에서 튜브를 표적 현장에 삽입하는 사진이다(S1 - S6).
도 7은 현장 테스트가 끝난 후의 (a)분산 (b)초기 토양에 머무름 (c)회피 (d)실패(failed)와 같은 지렁이의 상태를 보여준다.

이하 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명은

1) 기준토양을 관의 일측면에 채우는 단계;

2) 상기 단계 1)의 기준 토양이 채워진 관에 지렁이를 첨가하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 지렁이가 첨가된 관을 평가 대상 토양에 설치하는 단계; 및

4) 상기 단계 3)의 지렁이의 행동 양상을 측정하는 단계를 포함하는 토양 질 평가방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 기준토양은 지렁이에 대해 세포독성을 나타내지 않는 토양을 의미하며, 즉 지렁이의 서식에 적절한 환경을 가지는 토양이면 특별히 그 구성을 한정하지 않는다.

상기 기준토양의 양은 2 내지 9g, 적절하게는 4 내지 8g을, 보다 적절하게는 5g을 첨가하는 것이 바람직하다. 관에 기준 토양을 10 g 이상 첨가할 경우, 하기 표 3의 테스트 2에 나타낸 바와 같이 낮은 분산율을 나타내는 바, 지렁이 이동 효율이 떨어져 토양질 평가 효율이 감소한다. 한편, 2 g 미만의 토양을 첨가할 경우, 토양의 양이 과도하게 적어 지렁이가 기준토양에 서식하기에 불충분한 바, 지렁이 토양선호도뿐만 아니라, 부적절한 기준토양 서식환경에 의해 지렁이가 이동해 버릴 수 있으므로 토질 평가 정확성이 감소하는 바 부적절하다.

한편, 상기 관은 특정 재질, 모양, 길이 등을 한정하지는 않으나 원형관임이 바람직하며, 관의 지름은 5 내지 30 mm, 보다 적절하게는 10 내지 20 mm인 것이 바람직하다. 관의 크기가 과도하게 작거나 클 경우 지렁이의 분산율이 감소하여 토질 평가 정확성이 감소하는 바, 부적절하다.

한편, 상기 지렁이는 튜브 삽입이 가능한 지렁이류라면 그 종류를 특별히 한정하지 않으나, 바람직하게는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei) 또는 줄지렁이(Eisenia fetida)인 것이 적절하며 또한, 아무처리도 하지 않은 건강한 지렁이를 사용하는 것이 적절하다. 일반적으로 다른 기존 토양 독성 평가를 위해 사용하는 지렁이의 경우, 대부분 위장 내용물(gut content)이 제거된 지렁이를 사용하나, 본 발명의 토양질 평가의 경우 서로 다른 환경이 토양이 주어졌을 때 토양선호에 따라 지렁이가 이동해야 하므로, 지렁이에 아무 처리도 하지않은 건강한 지렁이를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 상기 단계 2)의 지렁이가 첨가된 관을 평가대상 토양에 설치할 때 2 내지 20 mm 깊이, 바람직하게는 5 내지 15 mm 깊이, 보다 바람직하게는 10 mm 깊이로 심는 것이 바람직하다. 2 mm 미만의 깊이로 심는 경우 관이 불안정하게 고정되어 바람 등의 기타 환경적 요인에 의해 영향을 받을 가능성이 크며, 20 mm 이상의 깊이로 심는 경우 지렁이의 수직이동률이 감소하는 바, 부적절하다.

한편, 상기 단계 4)의 행동양상은 지렁이의 분산(dispersal) 또는 머무름(remaining)을 의미한다. 지렁이의 분산은 관 내 RS(Reference soil)에 존재하던 지렁이가 실험 시작 20 내지 26시간 후 필드 토양(field soil)으로 이동해 나온 경우 지렁이의 행동양상을 분산되었다 칭하며, 머무름은 실험 시작 20 내지 26 시간 후에도 여전히 RS(Reference soil)에 남아있는 지렁이의 행동양상을 뜻한다. 본 발명은 분산된 지렁이의 수와 머무른 지렁이의 수를 계수하여 분산률을 측정함으로써 토양질을 평가한다.

또한, 상기 단계 4)의 측정에서 측정 조건을 특별히 한정하지는 않으나, 빛이 존재하는 조건에서 20 내지 26시간 수행하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 24시간 수행하는 것이 적절하다. 20 시간 미만의 시간 동안 수행할 경우, 토양 선호에 따른 지렁이의 이동이 충분히 일어나지 않으며, 26 시간을 초과해 수행할 경우, 26시간동안 지렁이를 이동시킨 결과와 크게 차이가 나지 않아 비효율적이므로 20 내지 26시간 수행하는 것이 적절하다.

한편, 상기 토양질은 토양의 물리화학적 특성이라면 그 종류를 한정하지 않으나, 본 발명의 지렁이의 토양선호도를 이용한 분산 에세이에서 측정가능한 토양질은 토양의 금속 독성, 전기전도도(EC ; electric conductivity) 및 토양 pH로 구성된 군 중 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.

상기 금속은 특별히 그 종류를 한정하지 않으나, As, Cd, Cu, Ni, Pb 및 Zn으로 구성된 군 중 하나임이 바람직하며, 특히 As, Cu, Ni인 것이 바람직하다. 토양 내 금속의 농도가 증가할수록 지렁이의 회피 행동이 유도되며, 전기전도도가 지렁이의 분산율에 유의미한 영향을 미쳐 높은 전기전도도를 나타낼수록 지렁이의 회피 행동을 유도하고 생식에 부정적인 영향을 미치므로 본 발명의 지렁이의 토양선호도를 이용한 분산에세이로 토양의 금속 독성, 전기전도도를 측정할 수 있다.

또한, 토양 pH도 지렁이의 생존에 영향을 미치는 바, 본 발명의 지렁이의 토양선호도를 이용한 분산에세이로 토양의 pH도 측정가능하다.

이하 실시예 및 실험예에서는 본 발명의 지렁이 토양선호 분산에세이 실험디자인 및 최적 조건을 설정하였으며, 현장 스케일에서 적용가능성 평가, 전통적인 독성 종말점과의 비교 및 통계적 분석을 통해 지렁이 토양선호 분산에세이가 현장 적용가능한 새로운 토양질 평가방법으로써의 사용가능성을 평가하였으며 그 결과를 나타내었다.

그 결과, 현장규모에서 토양의 금속농도, 전기전도성 및 토양 pH에 의해 지렁이가 민감한 반응성을 나타내 분산이동을 일으키며, 본 발명의 분산에세이는 상대적으로 빠르고(24h 내), 물리화학적인 토양의 특징들과의 높은 관련성을 보이며, 낮은 편차(variance)를 나타내므로 간편하면서도 경제적이고 정확도 높게 토양질 평가가 가능한 새로운 토양질 평가방법임을 확인하였다.

또한, 본 발명은

1) 토양에서 유효인산염(available phosphate; AvP), 유효실리케이트(available silicate; AvS), 양이온 교환용량(cation exchange capacity; CEC), 전기전도도(electric conductivity; EC), 유기물 함량, 토양 pH, 토양의 Sand Silt Clay 구성비율 및 용수량(water holding capacity ; WHC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 측정하는 단계;

2) 상기 측정값에 대해 다변량 통계분석법 수행하는 단계를 포함하는 토양질 평가방법을 제공한다.

상기 단계 2)의 다변량 통계분석법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 다변량통계분석 방법, 즉 3개 이상의 다변량 데이터의 분석에 적용되는 일반적인 다변량통계분석 방법이면 제한없이 이용이 가능하나, 본 발명의 다변량 통계 분석법은 PCA(Principal Component Analysis), PLS(Partial Least Square-discriminant analysis) 및 OPLS-DA(Orthogonal Partial Least Square-discriminant analysis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이로 제한되는 것은 아니다.

그 결과, 본 발명의 분산시험은 토양선호에 따른 지렁이의 분산율을 측정하고 상기 분산율은 물리화학적인 토양의 특징들과의 높은 관련성을 보이며, 평가하고자 하는 토양의 각종 측정값들과의 다변량 통계분석적 분석으로 간편하면서도 경제적으로 현장의 토양질 평가가 가능한 토양질평가방법이다.

이하 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만 이는 본 발명의 권리범위를 이로 한정하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험 장소 독성 확인

본 발명자들은 실험장소와 기준토양(Reference soil; RS)을 선별하였으며, 각 실험장소 토양의 독성을 확인하였다. 보다 구체적으로 충청남도의 J 마을과 근접한 곳에 위치한 금속함유 지역을 실험장소(S1-S6)로 선택하였으며, 실험 지역의 토양의 경우 근처에 위치한 용광로 굴뚝에서 발생하는 먼지에 의한 영향을 크게 받았기에, 기준 토양(Reference soil; RS)은 다른 지역에서 채취하였다.

각 현장(S1 - S6)에서 무작위로 수집한 표면 토양 샘플(0-10 cm)을 공기중에서 2주간 24 ℃ 조건에서 건조시킨 후, < 2 mm의 입자 크기로 체질하였다. 그 후, 실험장소의 독성을 확인하기 위해서 유효인산염(available phosphate; AvP)과 유효실리케이트(available silicate; AvS)를 1M 소듐 아세트산(NaOAc) 침출 용액을 사용하여 측정하였으며, 양이온 교환 용량(cation exchange capacity; CEC) 측정법은 아세트산 암모늄(ammonium acetate; NH₄OAc) 및 염화칼륨(potassium chloride; KCl)을 사용한 추출 방법을 사용하여 수행하였다. 또한, 전기 전도도(electric conductivity; EC)는 EC meter를 사용하여 측정하였으며, 토양 pH(1 : 5 추출), 열작 감량(loss on ignition)에 의한 유기물(organic matter, OM), 토양 질감 및 용수량(water holding capacity ; WHC)을 포함하는 토양의 다른 물리화학적 특징들을 측정하였다.

총 금속(As, Cd, Cu, Ni, Pb, 및 Zn) 농도는 토양 샘플의 산성분해 과정(acid digestion process)을 거친 후에 ICP-AES(inductively coupled plasma atomic emission spectrophotometer)을 사용하여 분석하였다. 물리화학적인 토양 특성들 및 금속 농도는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 표 1은 유효인산염(AvP), 유효실리케이트(AvS), 양이온 교환 용량(CEC), 전기 전도도(EC), 유기물(OM), pH, 모래, 실트 및 점토의 포함 백분율, 토양 질감(Tex) 및 물 보유 용량(Water holding capacity; WHC)을 포함하는 실험 지역 토양(Rs, S1-S6)의 물리화학적 특징들을 나타낸다. 표 2는 각 실험 토양(RS 및 S1-S6)에서의 총 중금속(As, Cd, Cu, Ni Pb, Zn)의 농도를 나타낸다. 각 지역마다 두개의 샘플을 분석하였으며, 각 샘플은 3회 분석하고 평균을 산출하였다(단위 : mg/kg 건조 토양). N.D.는 금속이 미검출되었음을 나타낸다.

Indicators Unit	AvP mg/kg	AvS mg/kg	CEC Cmol+/kg	EC ds/m	OM %	pH -	Sand %	Silt %	Clay %	Tex -	WHC ml/g
RS	24	33	13	5.54	3.39	6.71	93	6.8	0.2	Sand	0.34
S1	39	49	8	0.87	5.83	5.42	61.6	38.09	0.31	Sandy loam	0.43
S2	244	294	4	1.91	2.17	7.54	78.81	20.94	0.25	Loamy sand	0.26
S3	24	105	7	20.84	5.5	5.44	64.21	35.27	0.51	Sandy loam	0.37
S4	75	240	23	2.81	5.2	6.27	10	15	75	Clay	0.65
S5	388	229	24	3.1	6.27	6.33	12	11	77	Clay	0.62
S6	39	54	16	0.52	6.01	5.25	10	59	31	Silty Clay Loam	0.47

Metal Unit	As mg/kg	Cd mg/kg	Cu mg/kg	Ni mg/kg	Pb mg/kg	Zn mg/kg
RS	11.24	N.D.	2.41	2.61	19.17	16.36
S1	502.49	N.D.	113.29	32.61	98.16	110.31
S2	43.55	N.D.	45.31	9.48	96.28	123.95
S3	22.50	N.D.	53.73	112.53	35.89	87.55
S4	38.02	N.D.	26.74	18.13	51.55	77.62
S5	30.04	N.D.	29.68	19.49	51.09	82.24
S6	6.25	N.D.	27.52	88.57	30.62	82.31

< 실시예 2> 토양선호 분산에세이 실험 디자인

분산에세이 시험을 위해서 지렁이 Eisenia andrei(300 내지 600 mg)을 테스트 종으로 선택하였다. 분산 튜브(높이 950 mm, 폭 15 mm, 양 측면 개방)의 바닥을 30 % 물을 함유 한 RS로 채우고, 20 ℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 평형화 반응을 시켰다. 평형이 완료된 후, 튜브를 토양 표면기준으로 외부로 85 mm 정도 노출되도록 표적 토양에 삽입하였다(도 1). 그런 다음, E. Andrei 한마리 씩을 각각의 튜브에 첨가하고 24시간후에 지렁이의 분산(dispersal)이동을 측정하였다. 구체적으로 토양의 질을 정량적으로 측정하기 위해 분산된 지렁이(RS로부터 시험장 토양으로 이동한 지렁이)의 수, RS에 남아 있는 지렁이의 수 또는 시험이 끝날 때까지 상기 두 상태에 모두 해당하지 않거나 죽은 지렁이의 수를 계수해 평가하였다(도 1A).

< 실시예 3> 현장 스케일에서 토양선호 분산에세이의 적용

본 발명의 토양선호 분산에세이를 적용해 토양질 평가를 할 수 있는지를 평가하기 위해, 금속-amended 토양에서 에세이 테스트를 수행하였다.

우선 본 발명자들은 크리스탈라이징 디쉬(crystallizing dish)에서 CuCl₂ ·2H₂O(>99%, Sigma Chemical Co., Inc)을 사용하여 Cu 농도가 0, 50 및 500 mg/kg인 다양한 범위의 RS를 제조하였다(각 디쉬마다 Cu-amended RS 200 g, 3개 디쉬 제조). 아무처리도 하지 않은 RS(non-treated RS)를 포함하는 10개의 분산 튜브를 각각의 Cu 처리(Cu treatment) 디쉬당 10 mm 간격으로 삽입하였으며, Cu 처리당 30개의 복제 튜브들을 만들었다(도 1B). 24시간 후에 얼마나 많은 지렁이들이 튜브에서 분산되었는지, RS에 남아있는지, 아니면 둘 다를 회피했거나 또는 죽은 지렁이의 수를 계수하였다.

현장에서 에세이를 수행하기 위해서, 분산 튜브들을 2015년 9월 22일에 목표지점에 삽입하였다. 각각의 현장의 표면 토양(S1-S6)을 먼저 갈퀴로 평평하게 한후, 수돗물을 토양에 2 L / 100 cm² 비율로 토양에 고르게 부었다. 그 후, 튜브를 구멍에 넣고, 튜브가 토양 표면 위로 85 mm 돌출되도록 하였다(도 5). 이어서, 각각의 분산 튜브당 한 마리의 E. Andrei를 투입하였으며, 24시간이 지난 후 300개의 튜브를 2015년 09월 23일에 제거하고 지렁이의 상태(분산, 잔류, 사망 또는 회피행동을 보이는 것)를 각 튜브마다 기록하였다(도 7).

< 실시예 4> 전통적인 독성 종말점 비교 및 통계적 분석

본 발명의 토양선호 분산에세이와 전통적인 독성 종말점을 비교하기 위해, 본 발명자들은 수정된 OECD 시험 가이드 No. 207에 따라 현장 토양(RS, S1-S6)에 대한 지렁이 급성독성시험을 수행하였다. 이 시험에서 성체 E. andrei(300-600 mg)을 시험종으로 사용하였으며 급성독성시험 3시간 전, 암조건 20 ± 1℃에서 지렁이의 장 내용물을 습기가 있는 여과지에서 제거하였다. 각각의 지역 토양 5 g을 평평한 바닥 유리병(높이 50 mm, 넓이 25 mm, 부피 20 mL)에 넣은 후, 물 저장 용량의 70 %까지 희석하였다.

각각의 바이알(vial)마다 지렁이를 추가하였으며, 지렁이의 회피 행동을 방지하기 위해 실리콘 마개를 사용하였다. 따라서 지렁이는 다른 대안을 선택할 수 없었으므로 전통적인 독성 종말점의 결과는 토양자체의 품질을 반영한다. 20±1℃ 암조건에서 7일간 노출시킨 후, 지렁이의 생존, 형태학적 이상(점액 분비 및 출혈, 팽찬 얇아짐) 및 토양 침투 속도를 각 토양 타입당 10 내지 30회 반복 관찰하였다.

이 시험을 진행한 후, 생존한 지렁이를 세포 내 에스터라아제 활성을 측정하는데 사용하였다. 살아있는 지렁이로부터 체강세포를 추출하고, Lumbricus balanced salt 용액(LBSS;1.5 mM NaCl, 4.8 mM KCl, 1.1 mM MgSO₄ ·7H₂O, 0.4 mM KH₂PO₄, 0.3 mM Na₂HPO₄ ·7H₂O, 4.3 mM NaHCO₃, 및 3.8 mM CaCO₃) 0.1 mL 안에서 Calcein-AM (Calceinacetoxymethyl ester, Sigma Chemical Co., Inc., USA)으로 염색하였다. 세포 내 에스테라아제 활성으로 인해 가수분해된 Calcein의 강도를 유동세포 계측기(flow cytometer, FACScalibur flow cytometer, BD Ciosciences, USA)로 결정하였다. 각각의 반복(replicate)당 20,000개의 행적(events)들을 FL1 채널(488 nm에서 excitation)을 사용해 평가하였으며, 지렁이 체내 금속의 총 농도를 산성 분해 후에 측정하였다.

급성독성평가 이후 생존한 지렁이 개체들은 증류수를 사용하여 세척하였으며 습기가 있는 여과지에서 24 h 동안 위장 내용물을 제거하였다. 그 후, 지렁이를 100℃에서 건조시키고, 샘플들을 질산(nitric acid, 70%) 3 mL와 함께 넣은 후 24-well hot plates(THB-1024 HOT Block Digester, Tekton, Korea) 121℃에서 밤새 가열하였다. 그 다음으로 증류수를 첨가하고, ICP-AES(JY-138-UL-TRACE, Jobin-Yvon, France)를 통해 금속농도를 측정하였다.

상이한 분석결과를 비교하기 위해, 토양 특성 및 금속 농도를 사용해 다변량 통계 분석법(PCA ; Principal Component Analysis)를 수행하였다. PCA에서는 AvP, AvS, CEC, EC, OM, pH, 모래, 실트, 점토 및 WHC가 사용되었고 As, Cd, Cu, Ni, Pb, 및 Zn의 금속농도 또한 포함되어있다. 이용가능한 principal components(PC)는 고유치(eigenvalues)와 총 변량의 비율을 사용하여 결정하였고, 토양 유형별(S1-S6) 데이터 로딩은 이용가능한 각 PC에서 비교하였다.

< 실시예 5> 통계적 분석법

본 발명자들은 ANOVAs를 그룹간의 유의한 차이(p < 0.05)를 확인하는데 사용하였다. 추가적으로, post-hocBonferroni 다중 비교 테스트를 사용하여 시험 그룹간의 유의한 차이를 결정하였고 통계적 분석 수행시 Origin software(Ver. 8.0, OriginLab Corporation, MA, USA)를 사용하였다.

< 실험예 1> 토양선호 분산에세이를 위한 최적 조건 결정

어떠한 테스트 조건들이 분산에세이 결과에 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다섯 개의 다른 테스트 세트를 설계하였다(표 3). 보다 구체적으로, 상기 테스트 조건은 지렁이 장 내용물의 제거여부, 토양 부피의 변화(5 g 내지 10 g), 통풍 여부, 및 튜브가 빛을 받았는지 여부이다. 상기 테스트를 위해 크리스탈라이징 디쉬(높이 65 mm, 폭 125 mm)안에 RS 200 g을 투입하고 각각의 튜브에 한 마리의 지렁이를 투입하고 24시간 후에 분산율을 측정하였으며. 시험당 10-30번 반복 수행하였다.

테스트 결과, 토양(10 g)을 많이 사용한 경우 분산률(표 3의 테스트 Set2)이 토양 5 g을 사용한 경우보다 낮게 나타났다. 따라서 최적 토양 용적을 5g으로 결정하였다. 또한, 빛의 존재는 지렁이의 분산률을 증가시켰으며 이는 지렁이가 빛에 대해 부정적인 반응을 나타내기 때문이다(표 3의 테스트 Set4). 한편, 일반적으로 신뢰성 있는 토양 독성 측정방법에서는 장 내용물을 제거한 지렁이를 사용하여 토양선호 분석에세이를 수행한다. 반면, 본 발명의 토양질 분석방법의 경우, 지렁이가 생존을 위해 들판으로 이동할 필요가 있기 때문에 건강하고 아무 처리도 하지 않은 지렁이를 사용하였다. 그 결과, 위장 내용물이 없는 지렁이와 비교해보았을 때, 위장 내용물이 없는 신선한 지렁이가 가장 높은 분산률을 나타냈다(표 3의 테스트 set 5). 따라서 테스트 set 5의 조건이 토양선호 분산에세이에 가장 적합하다.

한편, RS 토양 5 g, 환기 없음, 빛이 존재하는 조건에서 Cu-amended RS를 조사한 결과, 24시간 이후의 지렁이의 분산률은 Cu를 첨가하지 않은 토양에서는 83 ± 15%, Cu가 50 mg/kg 첨가된 토양에서는 50 ± 17%, 및 Cu가 500 mg/kg 첨가된 토양에서 13 ± 6%(도 2A)로 나타났다. 즉, Cu 농도가 증가할수록 지렁이의 분산률이 감소하였으며, 이는 Cu 독성 수준에 따라 E. andrei의 회피 행동이 증가함을 나타낸다. 도 2A에 나타낸 바와 같이 50 mg/kg Cu 농도에서 지렁이의 분산율이 현저하게 감소하였으며, 상기 결과는 이전 연구결과, 100 mg/kg 이상의 Cu 농도에서 지렁이 회피 행동이 유도됨이 보고된 것과 비교해 훨씬 민감한 결과이다. 따라서 본 발명 토양선호 분산 에세이는 토질평가에 사용하기 충분히 민감함을 확인하였다.

Set	1	2	3	4	5
Worm state	Gut	Gut	Gut	Gut	Fresh
Soil volume(g)	5	10	5	5	5
Ventilation	No	No	Yes	No	No
Light	Yes	Yes	Yes	No	Yes
Replication (n=)	20	10	10	10	30
Dispersal(%)	85	20	90	70	100
Remaining(%)	10	80	10	0	0
Avoidance or dead(%)	5	0	0	30	0

< 실험예 2> 토양선호 분산에세이를 사용하여 현장 토질 평가

S1-S6 현장 테스트 결과 분산율이 42 ± 13%(S3) 부터 80 ± 10%(S4)까지 로 나타났으며, RS에 남은 비율은 16 ± 11%(S2)에서 50 ± 14%(S6)까지 다양하게 나타났다. 회피율과 죽은 지렁이의 비율은 무시할 정도의 비율(0 - 2%)이었으며, 시험 도중 제거된 튜브는 실패한 복제본으로 계수하였다(도 2B). 도 2B에 나타낸 바와 같이, 현장 테스트에서 S1의 분산 비율 감소는 금속 As의 높은 농도(502.49 mg/kg; 표 2) 때문이며, S3의 분산 비율 감소는 지렁이의 회피 행동을 유도하고 생식에 부정적인 영향을 미치는 높은 EC(20.84 ds/m; 표 2)에 의한 것이고 S6의 분산률 감소는 금속 Ni의 높은 농도(88.6 mg/kg)와 지렁이 생존에 적절한 pH(pH 6.0 ~ 7.0)보다 상대적으로 낮은 pH(pH 5.25; 표 2)에 의한 것임을 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 현장 장소는 크게 두가지의 그룹, "나쁜" 그룹(S1, S3 및 S6) 및 "양호한" 그룹 (S2, S4 및 S5)으로 구분하였다.

< 실험예 3> 토양선호 분산에세이 및 통계적 분석을 통한 전통적 종말점(Traditional Endpoint) 비교

도 4에 나타낸 바와 같이, S3를 제외한 모든 장소에서는 지렁이 생존, 형태학적 이상, 토양 침투 비율, 및 체강세포의 세포내부 에스터레이즈 활성에서 무시할 만한 효과를 나타냈다. 이와는 대조적으로, S3에서 지렁이 사망률은 100%에 이르렀으며, 다른 종말점을 평가할 수 없었다(도 4A).

PCA는 각 토양 종류별 토양질과 물리화학적 성질 간의 관계를 평가하기 위해 사용하였다. PCA는 토양의 물리적 변수와 화학적 변수 사이의 관계를 찾는 데 흔히 사용하는 방법이며, PCA를 통해 매개변수가 서로 얼마나 큰 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 표 4에 나타낸 바와 같이 첫 번째(PC1)와 두 번째(PC2)는 각각 전체 편차(고유값 > 1)의 51.9% 와 20.4%를 나타내었다. 모든 토양(S1-S6)의 데이터 로딩(data loading)은 PC1 하에서 분산되었지만 두 그룹은 PC2에 대해서 파지티브(positive) 또는 네거티브(negative) 로딩을 나타냈다(도 4B). 네가티브 그룹은 S1, S3 및 S6을 포함하고, 그들의 고유벡터는 각각 -0.118, -0.440, 및 -0.549로 나타났다. 다른 연구 장소(S2, S4, 및 S5)는 각각 고유벡터 0.370, 0.341 및 0.488의 파지티브 로딩(positive loading)을 나타냈다. 결과적으로 PCA 결과는 토양선호 분산에세이 결과와 매우 유사함을 확인하였다.

하기 표 4는 토양 종류별 물리화학적 특징(금속 농도 포함)의 PCA 결과를 나타낸 것이며, 이 표에는 모든 주성분(PC)이 나와 있고 첫번째(PC1)와 두번째(PC2)는 그들의 고유값(>1)으로 결정하였다.

PCA	PC1	PC2	PC3	PC4	PC5	PC6
Eigenvalue	3.112	1.224	0.897	0.471	0.281	0.015
Percentage of Variance	0.519	0.204	0.150	0.079	0.047	0.003
Cumulative	0.519	0.723	0.872	0.951	0.998	1.000
Eigenvector(EV)
S1	0.457	-0.118	0.218	-0.682	0.508	-0.082
S2	0.479	0.370	-0.285	-0.031	-0.369	-0.645
S3	0.455	-0.440	-0.082	-0.144	-0.593	0.468
S4	0.226	0.341	0.862	0.218	-0.189	0.079
S5	0.412	0.488	-0.343	0.278	0.348	0.525
S6	0.366	-0.549	0.058	0.624	0.311	-0.276

도 4A는 전통적 종말점을 사용한 실험 결과를 나타내며, 높은 EC수치(20.84 ds/m; 표 2)를 가진 S3만이 지렁이 사망률에서 유의미한 효과를 나타냈을 뿐, 매우 높은 AS 농도를 가지는 S1 또는 부적절한 pH 수치를 가지는 S6과 같은 다른 토양 종류에서는 지렁이의 생존력이 감소하지 않았다.

상기 결과를 분석하기 위해 지렁이내 중금속의 생체 이용가능성(bio-availability)를 측정하였다. 측정 결과, RS 및 S1 토양에서 지렁이 체내 As농도가 42.58 ± 20.57, 건조조직에서는 15.17 ± 3.49 mg/kg을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 표 2에 나타난 각 토양의 As 농도가 RS보다 S1이 약 44배 더 높음에 불구하고, S1에 노출되어 지렁이 체내에 축적된 As의 양은 상대적으로 낮음을 의미한다. 한편, RS 및 S1의 BCF(bio-concentration factor ; 지렁이 조직 농도/토양 농도)는 각각 3.8 및 0.03으로 나타났다. 따라서, 일반적으로 회피 테스트는 사망률과 생식을 포함한 전통적인 표준 종점보다 더 민감한 반응성을 가짐을 확인하였다.

Claims (7)

1) 기준토양 4 내지 8 g을 지름 10 내지 20 mm의 관의 일측면에 채우는 단계;
2) 상기 단계 1)의 기준 토양이 채워진 관에 지렁이를 첨가하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 지렁이가 첨가된 관의 기준토양이 채워진 일측면을 평가 대상 토양에 설치하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 지렁이의 분산(dispersal) 또는 머무름(remaining)의 행동 양상을 빛이 존재하는 조건에서 측정하는 단계를 포함하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 기준토양은 지렁이에 대해 세포독성을 나타내지 않는 토양인 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 지렁이는 붉은줄지렁이(Eisenia andrei) 또는 줄지렁이(Eisenia fetica)인 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 지렁이는 온전한 지렁이인 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 설치는 지렁이가 첨가된 관을 평가대상 토양에 5 내지 15 mm 깊이로 심는 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 측정은 빛이 존재하는 조건에서 20 내지 26시간 수행하는 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

제 1항에 있어서, 상기 토양질은 토양의 금속 독성, 전기전도도(electric conductivity) 및 토양 pH로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 in situ 토양질 평가방법.

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