KR101910078B1

KR101910078B1 - 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 cip2a 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101910078B1
Application number: KR1020170115161A
Authority: KR
Inventors: 김재성; 김명옥; 황상구
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2017-09-08
Publication date: 2018-10-19

Abstract

본 발명은 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 CIP2A 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 니클로스아미드는 비소세포성 폐암 세포에서 세포 증식, 콜로니 형성, 종양 스피어 형성 및 미토콘드리아 기능장애를 억제한다. 또한, 니클로스아미드는 CIP2A의 발현을 억제하고, PP2A 활성을 증가시키며, 다중 발암 경로를 억제하여 항종양 활성을 가진다. 따라서 니클로스아미드는 CIP2A 억제 또는 PP2A를 활성화시키는 약물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 CIP2A 억제용 조성물{Composition for inhibiting CIP2A comprising niclosamide}

본 발명은 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 CIP2A 억제용 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 암으로 사망하는 주요 원인인 폐암은 소세포성 폐암(13%)과 비소세포성 폐암(87%)으로 나누어진다. 최근 표적 약물과 같은 보다 효과적인 치료제의 개발에도 불구하고 많은 비소세포성 폐암 환자의 장기적인 회복은 여전히 열악한 실정이다. 화학 요법은 현재 비소세포성 폐암의 표준 치료법으로 사용되고 있으나 약물에 대한 내성에 의해 제한되고 있다. 따라서 비소세포성 폐암 환자의 치료를 향상시키기 위해, 종양 저항성을 기반으로 하는 분자 메커니즘에 대한 이해가 필요하다.

단백질 포스파타아제 2A(Protein phosphatase 2A; PP2A)는 주요 세린/트레오닌 포스파타아제 중 하나로, 다중 암에서 키나아제 유도 세포 내 신호 전달 경로를 탈인산화 및 비활성화시킴으로써 종양 억제에 결정적인 역할을 한다. 많은 연구들에서 PP2A의 억제가 비소세포성 폐암을 포함한 다중 암의 진행 및 내성과 밀접하게 연관되어 있음을 보고한 바 있다. 더욱이, PP2A 불활성화는 세포의 형질전환 및 종양 진행 촉진의 중요한 단계이다. PP2A 활성의 억제는 Akt, c-Myc, ERK-1/2와 같은 많은 암 관련 신호 전달 체계의 상향 조절을 초래한다. 그러나 PP2A 활성의 회복은 종양의 진행을 감소시키고 비소세포성 폐암을 포함한 다중 암에서 항암제 민감성을 증가시킨다. 따라서, PP2A 재활성화는 종양 내성을 포함하는 항암 치료의 새로운 치료 전략으로 간주된다.

PP2A의 암 억제제(Cancerous inhibitor of PP2A; CIP2A)는 내인성 PP2A 활성을 억제하는 것으로 알려진 종양 유전자로, 다양한 암에서 Akt, c-Myc, E2F1, Plk1 및 mTORC1을 포함하는 다중 종양 단백질을 활성화시킨다. CIP2A는 많은 암에서 높게 발현되며, CIP2A의 억제는 다양한 암 모델에서 종양 형성을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다. 또한, CIP2A 넉아웃(Knockout) 마우스는 대부분의 정상 조직에서 낮은 발현으로 인해 발달 및 생존율에 중대한 결함을 보이지 않았다. 따라서 CIP2A 억제제는 부작용이 없는 항암제로 활용이 가능하다. 최근 연구에 따르면, 다양한 신호 경로(Chk1 억제제 UCN01, EGFR 억제제 afatinib, MEK 억제제 U0126, mTOR 억제제 temsirolimus 및 프로테아좀 억제제 bortezomib 또는 celastrol)를 통해 CIP2A를 억제하는 많은 항암제들이 보고된 바 있다. 그러나 이러한 약물은 심각한 세포 독성을 나타내며, 정상 세포 내 다른 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 선택적 항암 활성을 가지며, CIP2A를 보다 특이적으로 억제하는 억제제의 발굴이 중요하다.

대한민국 등록특허 제10-1184388호 (2012.09.13 등록)

본 발명의 목적은 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 CIP2A 억제용 또는 PP2A 활성화용 시약조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 니클로스아미드를 이용한 CIP2A 억제 방법 또는 PP2A 활성화 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 CIP2A 억제용 시약조성물 또는 PP2A 활성화용 시약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 니클로스아미드를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) CIP2A를 억제하는 방법 또는 PP2A를 활성화하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 니클로스아미드는 비소세포성 폐암 세포에서 세포 증식, 콜로니 형성, 종양 스피어 형성 및 미토콘드리아 기능장애를 억제한다. 또한, 니클로스아미드는 CIP2A의 발현을 억제하고, PP2A 활성을 증가시키며, 다중 발암 경로를 억제하여 항종양 활성을 가진다. 따라서 니클로스아미드는 CIP2A 억제 또는 PP2A를 활성화시키는 약물로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 임상적으로 승인된 약물을 이용하여 고속 대량 스크리닝을 수행한 후, 비소세포성 폐암 세포주에서 강력한 CIP2A 억제제로 니클로스아미드를 동정한 것이다.
도 2는 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 CIP2A 억제제로서 니클로스아미드의 효과를 확인한 것이다.
도 3은 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 CIP2A의 이소성 과발현에 의한 니클로스아미드 매개 암세포 증식 억제의 차단을 확인한 것이다.
도 4는 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 니클로스아미드의 CIP2A 의존 항종양 활성을 확인한 것이다.
도 5는 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 CIP2A의 이소성 과발현에 의한 니클로스아미드 매개 미토콘드리아 기능장애 회복을 확인한 것이다.
도 6은 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 CIP2A 억제를 통한 니클로스아미드의 PP2A 활성을 확인한 것이다.
도 7은 다양한 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 니클로스아미드에 의한 PP2A 활성 증가를 확인한 것이다.
도 8은 비소세포성 폐암 세포주를 이용하여 니클로스아미드 및 스핑고신 유도체 FY720에 의한 PP2A 활성 메커니즘을 확인한 것이다.

본 발명의 발명자들은 임상적으로 승인된 1,771개의 약물을 이용하여 고속 대량 스크리닝하여, 비소세포성 폐암 세포에서 강력한 CIP2A 억제제로 니클로스아미드(Niclosamide)를 동정하였고, CIP2A의 신규한 억제제로서의 효과를 평가하며, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 니클로스아미드(Niclosamide)를 유효성분으로 함유하는 CIP2A[Cancerous inhibitor of (Protein phosphatase 2A; PP2A)] 억제용 시약조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 니클로스아미드는 CIP2A의 발현을 억제하고, PP2A 활성을 증가시키며, 다중 발암 경로를 억제할 수 있다.

바람직하게는, 상기 니클로스아미드는 암세포 증식, 콜로니 형성, 종양 스피어 형성 및 미토콘드리아 기능장애를 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 니클로스아미드를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) CIP2A를 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 PP2A(Protein phosphatase 2A) 활성화용 시약조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 니클로스아미드를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) PP2A를 활성화하는 방법을 제공한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 세포주 및 시약

H1299, H460, A549, H23, H358, IMR90 및 MRC5 세포는 ATCC(Manassas, VA)에서 구입하였으며. 10% 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 함유된 DMEM(Gibco-BRL, Rockville, MD) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포를 보존하면서 최대 2개월간 ATCC 프로토콜에 따라 계대배양 한 후, Hoechst 33258 염색을 수행하여 마이코플라스마(mycoplasma) 감염을 매월 테스트하였다. 니클로스아미드(Niclosamide), UCN-01, U0126 및 셀라스트롤(Celastrol)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)은 CIP2A 억제를 위해 사용하였다. 포스콜린(Forskolin) 및 FTY720(Sigma-Aldrich)은 PP2A 활성화를 위해 사용하였다. 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA)(Sigma-Aldrich)는 MEK1/2-ERK 경로 활성화를 위해 사용하였다.

실시예 2: CIP2A 루시퍼라제 리포터 분석

CIP2A 프로모터 서열(CIP2A 프로모터 영역의 -865 bp 내지 +182 bp)을 지니는 CIP2A-865bp-pGL4.10Luc 벡터는 Jukka Westermarck 박사(University of Turku and Abo Akademi University)로부터 제공받았다. H1299 세포는 TurboFect 형질감염 시약(Thermo Scientific, St. Leon-Rot, Germany)을 이용하여 제조사에서 제공한 프로토콜을 따라 CIP2A-865bp-pGL4.10Luc 벡터로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포는 용해 완충액으로 수확하고, 듀얼 루시퍼라제 리포터 분석 키트(Dual Luciferase Reporter Assay Kit, Promega, Madison, WI)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다.

실시예 3: 고속 대량 스크리닝

고속 대량 스크리닝을 위해, H1299-CIP2A-Luc 세포(1 × 10⁴ 세포/웰)를 96 웰 플레이트(Greiner Microlon, Madrid, Spain)에 접종하였다. 한국 화학물 은행(http://www.chembank.org)에서 제공하는 1,771 개의 임상 승인된 화합물을 디메틸 설폭사이드(Dimethylsulfoxide; DMSO)에 녹인 후, DMEM 배지를 이용하여 희석시켰다. 시험 화합물[셀라스트롤 (10 μM, Sigma-Aldrich) 또는 DMSO]을 세포가 들어있는 분석 플레이트에 10 μM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 이후, 이중 루시퍼라제 리포터 분석 키트(Promega)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 또한, 화합물의 세포 독성을 확인하기 위해, 제조사에서 제공한 프로토콜을 따라 MTT 분석(Sigma-Aldrich)을 수행하였다.

실시예 4: RT- PCR 및 정량 RT- PCR

RT-PCR 및 정량 RT-PCR은 이전에 보고된 논문(Cancer Res 73(22) (2013) 6667-78)을 참고하여 수행하였다. 간략하게, Qiazol 시약(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 총 RNA를 분리하고, ImProm-II ™ 역전사 시스템(Promega)으로 역전사 시켰다. 사용된 PCR 프라이머(primer)는 다음과 같다 : CIP2A, 5'-ATATGGCAAGATTGACCTG-3 '(정방향) 및 5'-TCAAATGAGGAGTTAAACAC-3'(역방향); GAPDH, 5'-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3 '(정방향) 및 5'-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 '(역방향). 정량 RT-PCR은 chromo 4 cycler(Bio-Rad)와 SYBR Premix Ex Taq(Takara Bio, Shiga, Japan)을 이용하여 3회 반복 수행하였다. 표적 유전자의 증폭 신호는 동일한 반응에서 GAPDH의 증폭 신호로 표준화 시켰다.

실시예 5: 플라스미드 구조물

Strep-CIP2A pEXPR-IBA105 벡터(IBA BioTAGnology, Gottingen, Germany)로부터 증폭된 Strep-CIP2A DNA 단편을 XhoI 및 NotI 효소 부위를 이용하여 CSII-EF-MCS(Hiroyuki Miyoshi 및 Miyawaki로부터 제공 받음) 벡터로, 또는 NotI 및 EcoRI 효소 부위를 이용하여 pRetroX-Tight-Pur 벡터(Clontech, Mountain View, CA)로 서브 클로닝하였다. DNA 단편을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다 : CSII-EF-MCS-Strep-CIP2A, 5'-CCGGTCTCGAGATGGCTAGCTGGAGCCAC-3 '(정방향) 및 5'-GGATCCGCGGCCGCCTATATACTGAGATTCACAGT-3'(역방향); pRetroX-Tight-Pur-Strep-CIP2A, 5'-ATAAGAATGCGGCCGCATGGCTAGCTGGAGCCACCCG-3 '(정방향) 및 5'-CCGGAATTCCTATATACTGAGATTCACAGTTTCTGG-3'(역방향).

실시예 6: 바이러스 감염에 의한 안정한 세포주 제조

CIP2A를 과발현시키기 위해, TurboFect 시약(Thermo Scientific)을 이용하여 CSII-EF-MCS-Strep-CIP2A 벡터를 packaging(CMV-Δ8.2) 및 envelope(VSVg) 벡터와 함께 293FT 세포로 동시 형질감염시켰다. 12시간 후, 신선한 배지로 대체하고 24시간 후, 상등액을 수확하였다. 8 μg/mL 폴리브렌(Polybrene)을 이용하여, 세포를 상등액으로 30시간 동안 감염시켰다.

CIP2A의 유도성 발현을 위해, 레트로바이러스 기반 유도성 발현 시스템(pRetro-X Tet-On Advanced Inducible Expression System)을 Clontech로부터 구입하였다. 레트로바이러스 입자는 제조사에서 제공한 프로토콜을 따라 제조하였다. 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 세포는 G418(600 μg/mL; Sigma-Aldrich) 및 퓨로마이신(Puromycin, 0.8 μg/ml; Sigma-Aldrich)을 함유하는 배지에서 성장시켜 선별하였다. 바이러스 형질도입 효율은 면역세포화학법 및 Strep-tag의 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다.

실시예 7: 미토콘드리아 막 전위 및 과산화물 생성 측정

미토콘드리아 막 전위(Ψm)는 형광 프로브 JC-1을 이용하여 측정하였다. 니클로스아미드 처리 후, 세포를 37℃에서 30분 동안 1 μg/ml 농도의 JC-1(Molecular Probes, Invitrogen)과 함께 배양하였다. 적색 및 녹색 형광은 유세포 분석기로 측정하였다.

미토콘드리아 반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS) 생산은 pEGFR-mito-roGFP(환원-산화 민감성 녹색 형광 단백질)를 이용하여 측정하였다. TurboFect 시약(Thermo Scientific)을 이용하여 세포를 pEGFR-mito-roGFP 벡터로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 DMSO, 400 μM 과산화수소(H₂O₂) 또는 5 μM 니클로스아미드로 4시간 처리하였다. 발광 강도는 400 또는 480 nm에서 여기 및 515 nm 방출에서 SpectraMax i3x 플레이트 리더기(Molecular Devices, Silicon Valley, CA)를 이용하여 측정하였다. 400:480 nm 비율은 형질감염 되지 않은 세포의 기본 형광을 제외한 후 측정하였다.

roGFP의 강도 및 세포 내 위치(localization)를 관찰하기 위해, 커버 슬라이드에서 배양한 세포를 DMSO, 400 μM 과산화수소 또는 5 μM 니클로스아미드로 4시간 처리하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드(Paraformaldehyde)가 포함된 인산완충식염수(PBS)로 15분 동안 고정시키고, 세척한 다음 DAPI가 포함된 마운팅(mounting) 배지를 이용하여 마운팅하였다. 그 후, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 710, Carl Zeiss, Inc.)을 이용하여 이미지를 획득하였다.

실시예 8: 콜로니 형성 분석

콜로니 형성 분석은 이전에 보고된 논문(Proteomics 10(14) (2010) 2589-604)을 참고하여 수행하였다. 간략하게, 500개의 세포를 60 mm 조직 배양 접시에 접종하고, DMSO 또는 1μM 니클로스아미드로 처리하였다. 10 내지 14일 후, 콜로니를 메탄올로 고정시키고, 트리판 블루(trypan blue)로 염색하였다. 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니 만을 살아있는 콜로니로 간주하였다.

실시예 9: 스피어 형성(Sphere forming) 분석

세포(H1299 세포 3,000개와 A549 세포 5,000개)를 B-27(1:50, Invitrogen), 20 ng/mL FGF(R & D Systems, Minneapolis, MN) 및 20 ng/mL EGF(R & D Systems)가 함유된 무혈청 DMEM-F12 배지(Gibco Laboratories, Grand Island, NY) 하에 초저 부착 플레이트(ultra-low attachment plate)에 접종하고, DMSO 또는 1μM 니클로스아미드로 처리하였다. 10 내지 14일 후, 스피어를 메탄올로 고정시키고, 평균 스피어의 수 및 크기를 ImageJ 소프트웨어로 계산하였다. 직경이 50 mm 미만인 스피어는 분석에서 제외하였다.

실시예 10: 웨스턴 블랏 분석

실험에 사용된 항체는 다음과 같다 : CIP2A, c-Myc, STAT3, phospho-Erk1/2, β-actin(Santa Cruz Biotechnology, CA), Strep-tag(Qiagen) 및 β-catenin(BD)에 대한 마우스 단일 클론 항체; phopho(Ser473)-Akt(Epitomics, Burlingame, CA, USA), phospho(Thr705)-STAT3, phospho(Ser62)-c-Myc, Akt 및 Erk1/2(Cell Signaling Technology Inc.)에 대한 토끼 단일 클론 항체.

단백질을 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동으로 분리하고, PVDF 막으로 옮긴 다음 특정 항체를 이용하여 검출하였다. HRP가 접합된 2차 항체는 화학 발광 검출 시스템(Amersham Life Science, Piscataway, NJ)을 이용하여 검출하였고, 밴드의 이미지는 Amersham Imager 600 시스템(GE Healthcare)을 이용하여 획득하였다.

실시예 11: 면역형광법

면역형광법은 이전에 보고된 논문(Cancer Res 73(22) (2013) 6667-78)을 참고하여 수행하였다. 간략하게, 4% 파라포름알데히드로 고정된 세포를 투과하고, 0.2% Triton X-100 및 5% 우태아혈청이 포함된 PBS로 차단하였다. 고정된 세포를 Strep-tag(Qiagen)에 대한 1차 항체 및 2차 항 마우스 Alexa-488 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 배양하였다. 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 710, Carl Zeiss, Inc.)을 이용하여 획득하였다.

실시예 12: PP2A 활성 분석

PP2A 활성 분석은 이전에 보고된 논문(Cancer Res 73(22) (2013) 6667-78)을 참고하여 수행하였다. 간략하게, 세포 용해물을 항 PP2A-Aα/β 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)로 침전시켰다. 단백질 A 세파로즈 비드(Protein A sepharose bead, GenDEPOT, Barker, TX)를 이용하여 면역 복합체를 수집하였다. 세척된 비드의 1/4은 PP2A 면역 침전 효율을 확인하기 위해, 웨스턴 블랏 분석에 사용하였다. 나머지 비드는 RediPlate 96 EnzChek Serine/Threonine Phosphatase 분석 키트(Invitrogen)를 이용하여 PP2A 활성 분석에 사용하였다. 오카다산(Okadaic acid; OA) (50 nM, Sigma-Aldrich) 또는 포스콜린(40 μM; Sigma-Aldrich)을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 PP2A의 억제 또는 활성화에 사용하였다.

실시예 13: 시너지 분석

약물 조합의 효과는 Calcusyn 소프트웨어(Biosoft, Ferguson, MO)를 이용하여 Chou-Talalay 조합 지수법으로 평가하였다.

실시예 14: 니클로스아미드 유사체의 합성

니클로스아미드 유사체 1은 이전에 보고된 논문(ACS Med Chem Lett 4(2) (2013) 180-185)을 참고하여 합성하였다. 간략하게, 5-클로로살리실산(5-chlorosalicylic acid) 및 2-클로로-4-니트로아닐린(2-chloro-4-nitroaniline)을 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해시키고, 디브로모 트리페닐포스포란(dibromo triphenylphosphorane)을 첨가하였다. 냉각시킨 후, 여과에 의해 침전물을 획득하였다. 침전물을 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)로 세척하고, 고 진공 하에서 건조시켜 화합물 1을 획득하였다.

THF에 용해시킨 N-boc-에탄올아민을 DIAD가 첨가된 5-클로로-N-(2-클로로-4-니트로페닐)-2-히드록시벤즈아미드(5-chloro-N-(2-chloro-4-nitrophenyl)-2-hydroxybenzamide) 및 트리페닐포스핀(triphenylphosphine) 용액에 첨가한 후, 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 휘발성 화합물을 증발시키고, 잔류물은 20% 에틸 아세테이트(ethyl acetate)가 함유된 헥산을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 2를 획득하였다.

TFA(0℃에서)를 디클로로메탄에 용해시킨 터트-부틸(2-(4-클로로-2-((2-클로로-4-니트로페닐)카바모일)페녹시)에틸)카바메이트(tert-butyl (2-(4-chloro-2-((2-chlor-4-nitrophenyl)carbamoyl)phenoxy)ethyl)carbamate)에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 0℃로 냉각시킨 후, 백색 침전물을 여과시켜 획득하고, 차가운 디에틸 에테르로 세척하여 니클로스아미드 유사체 1을 획득하였다.

3-클로로-4-히드록시벤조산 반수화물(3-Chloro-4-hydroxybenzoic acid hemihydrate) 및 3-클로로-4-니트로아닐린(3-chloro-4-nitroaniline)을 아세토니트릴에 용해시키고, 아세토니트릴에 용해시킨 디브로모 트리페닐포스포란을 첨가하였다. 냉각시킨 후, 여과에 의해 침전물을 획득하였다. 침전물을 차가운 디에틸에테르로 세척하고, 고 진공 하에서 건조시켜 니클로스아미드 유사체 2를 획득하였다.

실험예 1: 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드에 의한 CIP2A 발현 억제

비소세포성 폐암 세포에서 CIP2A를 억제하는 약물을 스크리닝한 결과, 도 1A 및 도 1B와 같이, 적어도 50%의 루시퍼라제 억제(셀라스트롤과 비교했을 때)를 보이며 세포 생존율이 30% 이상으로 감소한 화합물을 1차 유효물질로 간주하였다. 도 1C와 같이, 1,771개의 화합물로부터 160개의 1차 유효물질을 획득할 수 있었다.

CIP2A는 정상적으로 분화된 폐 세포와 비교하였을 때, 폐암 세포에서 우세하게 과발현되기 때문에 정상 세포에서 독성이 약한 화합물을 확인하기 위하여, 160개의 1차 유효물질을 스크리닝하였다. 그 결과, 도 1D와 같이, IMR90 정상 폐 섬유아세포를 이용하여, 세포 생존율이 20% 이하로 감소한 2차 유효물질을 선별하였다.

24개의 2차 유효물질을 이용하여 CIP2A 억제능을 웨스턴 블랏으로 평가한 결과, 도 1E와 같이, 니클로스아미드가 가장 효과적인 화합물인 것을 확인하였다. 주목할만한 점은 도 1 B 및 도 1D를 참조하여 보면, 니클로스아미드의 세포 독성은 암세포에 특이적인 반면, 셀라스트롤은 암세포뿐만 아니라 정상 세포에도 세포 독성을 나타내었다.

강력한 CIP2A 억제제로 니클로스아미드를 검증하기 위해, UCN-01, U0126 및 셀레스트롤과 같은 다른 화합물들과 니클로스아미드의 CIP2A 억제능을 비교하였다. 그 결과, 도 2A 및 도 2B를 참조하여 보면, CIP2A 리포터 분석 결과, 니클로스아미드가 가장 효과적인 억제 화합물 중 하나이며, 니클로스아미드의 처리가 CIP2A 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인하였다.

TPA가 MEK1/2-ERK 경로를 활성화시킴으로써 CIP2A 발현을 유도하기 때문에, 니클로스아미드가 TPA에 의한 CIP2A의 발현을 차단할 수 있는지를 실험하였다. 그 결과, 도 2C와 같이, 니클로스아미드 처리는 TPA에 의한 CIP2A의 발현을 효과적으로 차단하고, MEK-ERK 경로를 통한 CIP2A 발현을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2D 및 도 2E와 같이, 니클로스아미드 처리는 CIP2A 발현을 시간 및 농도 의존적으로 감소시켰으며, 상기 억제가 H1299 세포에서 전사 수준에서 조절되는 것을 확인하였다. 또한, 도 2F 및 도 2G와 같이, 니클로스아미드에 의한 CIP2A 발현의 억제는 A549, H460, H358 및 H23을 포함하는 다양한 비소세포성 폐암 세포주에서 확인되었다. 따라서 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드가 CIP2A의 새로운 억제제임을 시사한다.

실험예 2: 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드의 CIP2A 의존 항종양 활성

비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드가 CIP2A 발현 억제를 통해 항종양 활성을 발휘하는지를 분석하기 위해, 정상 폐 섬유아세포에서의 CIP2A 발현과 비소세포성 폐암 세포에서의 CIP2A 발현을 비교하였다.

그 결과, 도 3A를 참조하여 보면, CIP2A는 H1299, A549 및 H460을 포함한 다양한 비소세포성 폐암 세포주에서 과발현되는 반면, IMR90 및 MRC5 세포를 비롯한 정상 폐 섬유아세포 세포에서는 검출되지 않았다. 또한, 도 3B와 같이, 니클로스아미드 처리는 H1299, A549 및 H460을 포함한 비소세포성 폐암 세포주의 생존율을 선택적으로 억제한 반면, 정상 폐 섬유아세포인 IMR90 세포의 생존율은 억제하지 않는 것을 확인하였다.

니클로스아미드 유도 항종양 활성에서 CIP2A의 역할을 확인하기 위하여, 도 3C와 같이, H1299 및 A549 세포에서 CIP2A 렌티바이러스 벡터를 이용하여 strep-tagged CIP2A를 발현하는 안정한 세포주를 확립하였다. 그 결과, 도 3D를 참조하여 보면, H1299 및 A549 세포에서 CIP2A의 이소성 과발현은 니클로스아미드에 의한 암세포 증식 억제를 차단하였다. 이를 확인하기 위해, 도 3E와 같이, 독시사이클린 유도 strep-CIP2A H1299 세포주를 확립하였다. 그 결과, 도 3F를 참조하여 보면, H1299 세포에서 독시사이클린 유도 CIP2A는 니클로스아미드에 의한 암세포 증식 억제를 완전히 차단하였다. 따라서 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드의 항종양 활성이 CIP2A에 의존한다는 것을 시사한다.

니클로스아미드가 종양 세포 및 암 줄기세포에 대하여 항종양 활성을 보임에 따라 CIP2A의 니클로스아미드 유도 항종양 활성에 대한 역할을 종양 모델에서 콜로니 형성 및 종양 스피어 형성 분석과 같은 접근법을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 4A 및 도 4B를 참조하여 보면, 니클로스아미드 처리는 대조군 H1299 및 A549 세포에서 콜로니 형성을 감소시켰으며, 상기 억제는 CIP2A의 이소성 과발현에 의해 차단되는 것을 확인하였다. 마찬가지로, 도 4C 및 도 4D를 참조하여 보면, 니클로스아미드 처리는 대조군 H1299 및 A549 세포에서 종양 줄기세포로 구성된 종양 스피어(sphere) 형성을 억제하였으나, CIP2A의 과발현 시, 완전히 차단되는 것을 확인하였다. 따라서 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포주에서 니클로스아미드 활성이 CIP2A에 의존한다는 것을 뒷받침한다.

실험예 3: 비소세포성 폐암 세포에서 CIP2A 과발현에 의한 니클로스아미드 유도 미토콘드리아 기능장애 회복

니클로스아미드의 항기생충 및 항종양 효과가 미토콘드리아 기능장애와 관련되어 있기 때문에, 니클로스아미드로 유도된 미토콘드리아 기능장애에서 CIP2A의 역할을 분석하였다.

그 결과, 도 5A 및 5B를 참조하여 보면, H1299 및 A549 세포에서 CIP2A 과발현은 니클로스아미드에 의해 유도된 미토콘드리아 막 전위의 감소를 회복시켰다. 또한, 미토콘드리아 ROS의 형광 센서인 pEGFR-mito-roGFP 벡터를 이용하여 미토콘드리아 ROS 생산을 측정한 결과, 도 5C 내지 도 5F를 참조하여 보면, 니클로스아미드 처리는 미토콘드리아 ROS 생산을 현저하게 유도하는 반면, CIP2A의 과발현 시, 완전히 차단되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 CIP2A의 과발현 그 자체가 미토콘드리아에서 내인성 ROS 생산을 억제하고, CIP2A가 미토콘드리아의 ROS를 조절할 수 있음을 의미한다. 따라서 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드로 유도된 미토콘드리아 기능장애가 CIP2A에 의존함을 시사한다.

실험예 4: 비소세포성 폐암 세포에서 CIP2A 억제를 통한 니클로스아미드의 PP2A 활성 증가

비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드가 다양한 발암 단백질의 인산화를 억제하고, CIP2A가 다중 암에서 PP2A를 억제하는 것을 확인함으로써, 니클로스아미드가 CIP2A의 억제를 통해 PP2A를 활성화 시키고, 이는 다중 발암 단백질의 인산화 비활성화에 기여할 것이라고 가정하였다.

그 결과, 도 6A 및 6B를 참조하여 보면, H1299 및 A549 세포에서 니클로스아미드 처리가 phospho(Ser63)-c-Myc, phospho(Ser473)-Akt 및 phospho(Thr705)-STAT3을 비롯한 다중 발암 단백질의 인산화를 감소시키는 것을 확인하였다.

다음으로, 니클로스아미드가 다중 키나아제 활성을 억제한다는 여러 문헌이 보고된 바, 니클로스아미드에 의한 다중 키나아제 활성 억제가 직접 억제를 통해 일어날 것으로 가정하였다. 니클로스아미드의 잠재적 직접 효과는 Akt, JAK1/2/3, ERK 및 p70S6K를 포함한 44종의 키나아제로 구성된 광범위한 종양학 패널을 이용하여 시험관 내(in vitro) 키나아제 분석을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 니클로스아미드가 다중 키나아제를 직접 억제하지 않는다는 것을 확인하였다.

다음으로, 니클로스아미드가 PP2A 활성을 증가시키는지를 분석하였다. 그 결과, 도 6C 및 도 6D를 참조하여 보면, H1299 세포에서 니클로스아미드 처리가 PP2A 활성을 증가시키고, 처리 12시간째에 활성이 피크에 도달함을 확인하였다. 도 6E와 같이, PP2A 활성화는 H358 및 H23 세포를 포함하는 다른 비소세포성 폐암 세포주에서도 관찰되었고, 이는 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드가 잠재적인 PP2A 활성화 약물임을 시사한다. 특히, 도 6F 및 도 6G를 참조하여 보면, H1299 및 A549 세포에서 니클로스아미드에 의한 PP2A 활성 증가는 CIP2A 과발현에 의해 억제되었다. 또한, 도 6H 및 도 6I와 같이, H1299 세포에서 인산화 STAT3, p-Akt, c-Myc 및 p-ERK-1/2의 니클로스아미드 매개 감소가 독시사이클린 유도 strep-CIP2A에 의해 회복되는 것을 관찰하였다. 따라서 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포주에서 니클로스아미드가 CIP2A의 억제를 통해 종양 억제제인 PP2A를 활성화 시킴을 시사한다.

실험예 5: 비소세포성 폐암 세포에서 CIP2A 억제를 통한 PP2A 활성화 약물로서 니클로스아미드의 작용

유사한 화학 구조를 가진 니클로스아미드 유사체가 PP2A를 활성화시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, 도 7A와 같이, 두 가지 다른 니클로스아미드 유사체를 합성하였다. 도 7B를 참조하여 보면, 세포 생존율 분석에서 유사체 1이 항종양 활성을 갖는 반면, 유사체 2는 항종양 활성을 가지지 않은 것을 확인하였다. 또한, 도 7C 및 도 7D를 참조하여 보면, 니클로스아미드와 유사체 1 처리는 5종의 비소세포성 폐암 세포주에서 CIP2A를 억제하는 반면, 유사체 2는 CIP2A를 억제하지 못하는 것을 확인하였다. 또한, 도 7E와 같이, CIP2A 과발현은 니클로스아미드 또는 유사체 1에 의한 세포 생존율 억제를 차단시켰으며, 도 7F와 같이, 니클로스아미드 및 유사체 1은 PP2A 활성을 증가시키고, 증가된 PP2A 활성은 CIP2A 과발현된 세포에서 차단되는 것을 확인하였다. 그러나 도 7E 및 도 7F와 같이, 유사체 2는 세포 생존율 및 PP2A 활성을 조절하지 않았으며, 이는 비소세포성 폐암 세포주에서 니클로스아미드가 PP2A를 활성화시킨다는 사실을 뒷받침한다.

스핑고신 유사체인 FTY720은 비소세포성 폐암을 포함한 다양한 암에서 PP2A를 재활성화시키고 SET-PP2Ac 상호 작용을 억제함으로써 암세포의 세포 사멸을 촉진한다고 보고된 바, 니클로스아미드의 PP2A 활성화 능력 및 항종양 활성을 FTY720과 비교하였다. 그 결과, 도 8A 및 도 8B를 참조하여 보면, 3가지 화합물 모두 PP2A 활성을 증가시켰으나, FTY720 및 니클로스아미드만이 H1299 세포의 생존율을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 도 8C를 참조하여 보면, H1299 세포에서 니클로스아미드 및 FTY720의 병용 처리가 상승 효과를 나타냄을 발견하였다.

다음으로, 비소세포성 폐암에서 FTY720이 CIP2A를 억제하는지를 평가하였다. 그 결과, 도 8D 및 도 8E를 참조하여 보면, 니클로스아미드만이 5종의 비소세포성 폐암 세포주에서 CIP2A를 유의하게 감소시켰다. 또한, 도 8F를 참조하여 보면, H1299 세포에서 CIP2A 과발현은 니클로스아미드에 의해 유도된 세포 생존율 억제를 차단시켰다. 또한, 도 8G를 참조하여 보면, H1299 세포에서 CIP2A의 과발현에 의해 니클로스아미드 유도 PP2A 활성이 감소되는 반면, FTY720 유도 PP2A 활성은 영향을 받지 않았다. 따라서, 상기 결과는 비소세포성 폐암 세포에서 니클로스아미드가 CIP2A의 억제를 통해 PP2A를 활성화 시킴을 시사한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

니클로스아미드(Niclosamide)를 유효성분으로 함유하는 CIP2A[Cancerous inhibitor of PP2A(Protein phosphatase 2A)] 억제용 시약조성물.
제 1항에 있어서, 상기 니클로스아미드는 CIP2A의 발현을 억제하고, PP2A 활성을 증가시키며, 다중 발암 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 CIP2A 억제용 시약조성물.
제 1항에 있어서, 상기 니클로스아미드는 암세포 증식, 콜로니 형성, 종양 스피어 형성 및 미토콘드리아 기능장애를 억제하는 것을 특징으로 하는 CIP2A 억제용 시약조성물.
니클로스아미드를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) CIP2A를 억제하는 방법.
니클로스아미드를 유효성분으로 함유하는 PP2A(Protein phosphatase 2A) 활성화용 시약조성물.
니클로스아미드를 암세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) PP2A를 활성화하는 방법.