KR101904848B1

KR101904848B1 - 암 치료용, 접합 치료 백신의 개발용, 및 접종제용으로 사용되는 생물학적으로 안전한 klh 제품의 신규 생성을 위한 제조 방법

Info

Publication number: KR101904848B1
Application number: KR1020177000593A
Authority: KR
Inventors: 오르트빈 코트비츠; 토마스 슈티펠; 샴마나 엔. 무뚜크리쉬나
Original assignee: 비오신 아르쯔나이미텔 게엠베하
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2018-10-08
Also published as: RU2016149593A3; BR112016028956A2; WO2015188869A1; RU2681413C2; US20170121376A1; CA2951735A1; PT3154578T; BR112016028956B1; HUE043180T2; DK3154578T3; PL3154578T3; EP3154578A1; EP3154578B1; ES2717683T3; KR20170008323A; US10800820B2; IL249484B; LT3154578T; RU2016149593A; RU2681413C9

Abstract

본 발명은 생물학적으로 안전한 혈림프 혈청, 바람직하게는 헤모시아닌, 더욱 바람직하게는 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)의 제공에 관한 것이다. 헤모시아닌은 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제한다.

Description

암 치료용, 접합 치료 백신의 개발용, 및 접종제용으로 사용되는 생물학적으로 안전한 KLH 제품의 신규 생성을 위한 제조 방법 {Preparation methods for a novel generation of biological safe KLH Products used for cancer treatment, for the development of conjugated therapeutic vaccines and as challenging agents}

본 발명은 생물학적으로 안전한 혈림프 혈청, 바람직하게는 헤모시아닌, 더욱 바람직하게는 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)의 제공에 관한 것이다.

헤모시아닌(hemocyanin)은 수많은 연체동물 및 절지동물의 혈액에서 유리 용해된 형태로 발생하며 산소를 운반하는 청색 구리 단백질이다. 연체동물 중에서, 두족류(cephalopods), 군부(chitons), 대부분의 복족류(gastropods) 및 일부 쌍각류(bivalves)는 헤모시아닌을 함유한다. 절지동물 중에서, 헤모시아닌은 거미류, 검미류(xiphosurans), 연 갑각류(malacostracan crustaceans) 및 그리마류(Scutigera)에서 전형이다. 다양한 종의 곤충은 헤모시아닌으로부터 유래된 단백질을 함유한다. 헤모시아닌은 세포외 매질(medium)에 존재하며, 혈림프에 떠있다.

절지동물 헤모시아닌은 전자 현미경 하에 최대 25 nm의 지름을 가지고, 서브유닛은 75,000 달톤의 분자량을 가지는 반면, 연체동물 시아닌은 훨씬 크다. 그러므로 예를 들어 메가투라(Megathura)의 헤모시아닌은 35 nm의 지름을 가지고 2개의 서브유닛을 포함한다. 각각의 서브유닛은 대략 400,000 Da의 분자량을 가지고 8개의 산소-결합 도메인으로 나누어져 있으며, 각각의 도메인은 대략 50,000의 분자량을 가진다. 이 도메인은 면역학적으로 다르다.

전자 현미경 하에 볼 수 있는 복족류의 헤모시아닌은 대략 8 백만 Da의 분자량을 가지고, 다이데카머(didecamer)이다. 이와 대조적으로, 두족류의 헤모시아닌은 분리된 데카머(decamer)로서 배열되고, 그것은 또한 복족류의 헤모시아닌과 4차 구조에서 상당히 다르다.

전통적으로, 헤모시아닌은 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata) 유래 혈림프로부터 얻었다. 더 최근에는, 복족류 헤모시아닌을 위한 시장이 확장되어 하리오티스 투베르쿨라타(Haliotis tuberculata) 및 콘초레푸스 콘초레푸스(Concholepus concholepus) 유래 헤모시아닌을 포함한다. 다른 복족류 연체동물 유래 혈림프 또한 유용한 특성을 위한 조사 중에 있다.

캘리포니아 키홀 림펫 메가투라 크레눌라타(Californian keyhole limpet Megathura crenulata)의 헤모시아닌은 특히 면역학적으로 관심 있는 것이다. 헤모시아닌은 그러므로 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin: KLH)으로도 불린다. 헤모시아닌은 매우 효능있는 항원이다. 척추동물의 면역화는 면역 체계의 비특이적 활성화를 초래하며, 이는 현재까지 잘 알려져 있지 않다. 면역 체계의 일반적인 활성화에 의하여, 이전에는 용인되던 다른 외부 구조에 대한 면역 반응을 달성하는 것 또한 가능하다. KLH는 무엇보다도 합텐(hapten)에 대한 항체의 형성을 달성하기 위하여 합텐 담체로서 사용된다.

메가투라 크레눌라타에 더하여, 전복 하리오티스 투베르쿨라타(Haliotis tuberculata)도 아르캐가스트로포다(Archaegastropoda) 그룹에 속하며, 이것은 진화와 관련하여 상대적으로 오래되었다. 하리오티스(Haliotis)도 헤모시아닌을 생산하는 것으로 알려져 있다.

천연 KLH는 콜로이드성 용액 내 혈림프 (pH 6.0-8.0)에서 다이데카머 (분자량: 8 백만 Da 정도)로서 그리고 멀티데카머 (분자량: 12 내지 약 32 백만 Da)로서 발견된다. 이러한 응집체의 정량적 분포는 다양하다. KLH의 다이데카머 및 멀티데카머는 400,000 Da 정도의 평균 분자량을 갖는 2개 유형의 서브유닛으로 구성된다. 서브유닛의 두 개의 다른 유형뿐만 아니라 두 개의 다른 응집체 유형은 천연 KLH가 두 개의 다른 유형 KLH 1 및 KLH 2의 혼합물이라는 사실에 기인한다.

KLH는 KLH1 및 KLH2라고 불리는 두 개의 다른 헤모시아닌의 혼합물이다. KLH1의 서브유닛은 390 kDa 폴리펩티드이고, 이는 서브유닛 내 서열에 따라 1 a 내지 1 h로 명명된 8개의 구상 도메인으로 이루어진다. 한편, KLH2는 360 kDa의 분자량을 가지고, 가장 최근 데이터에 따르면 2 a 내지 2 h로 명명된 8개의 도메인을 또한 함유한다. 인 비보(in vivo)에서 서브유닛의 모든 유형은 호모-올리고머(homo-oligomer)를 형성하는 반면, 헤테로-올리고머(hetero-oligomer)는 관찰되지 않았다.

헤모시아닌은 시험 동물로부터 사육장에서 얻을 수 있다. 혈림프의 수집을 위해 설명된 방법은 바늘을 발 근육으로 삽입하여 페달 혈동(pedal blood sinus)을 관통하는 것을 수반한다 (Harris et al.,"Keyhole Limpet Haemocyanin: Negative Staining in the Presence of Trehalose," Micron, 26 (1) : 25-33 (1995). 동물을 죽이지 않고 다량의 혈림프를 수집할 수 있는 반자동 시스템이 설립되었다. 제조 절차는 제어된 환경에서 자란 동물로부터 상업적인 양의 헤모시아닌을 추출하는 것을 가능하게 한다 (WO 02/085389, US2002/192633).

헤모시아닌의 생물학적 자원인 조(crude) 혈림프로부터 헤모시아닌을 정제하기 위한 다양한 알려진 방법이 있다. 이러한 방법들은 분별 원심분리, 겔-투과 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다 (U.S. 등록특허번호 5,407,912). 정제된 헤모시아닌은 많은 형태로 상업적으로 이용가능하다.

유망한 새로운 치료적 제품으로의 헤모시아닌의 도입은 (예를 들어, Jurincic-Winkler et al., "Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Treatment in Patients with Superficial Bladder Carcinoma," Anticancer Res., 16 (4A): 2105-10 (1996); 및 Biomira, Inc. Company Press Release, Biomira. com, 2001를 참조) 미국 식품의약국(United States Food and Drug Administration) 및 기타 규제 기관에 의해 부과된 건강 및 안전 기준을 충족하는 조건 하에 생산된 헤모시아닌을 상업적 양으로 지속적으로 공급해야 하는 필요성을 야기하였다.

본래 기원 때문에, KLH와 같은 헤모시아닌은, 병원성 혈액 성분, 예를 들어 독소, 박테리아, 그것에 의해 생성된 내독소뿐만 아니라 바이러스와 같은 병원균에 의한 생물-오염(bio-contamination)의 위험에 처해있다.

그러므로 본 발명의 목적은 천연 헤모시아닌 내 병원균에 의한 바이오-버든(bio-burden)을 최소화하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 이는 안전하고 고도로 순수한 헤모시아닌을 제조할 수 있는 공정을 제공하는 추가적인 목적을 포함한다.

본 발명자들은 바다로부터 즉시 수확된 연체동물로부터 채취된 혈액 및 혈림프가 바이러스 박테리아, 독소 또는 내독소에 의해 오염될 수 있음을 확인하였다. 그러므로, 연체동물 및 그로부터 얻은 혈액 또는 혈림프에서 오염을 감소시키기 위한 필요가 있다.

일반적으로, 바이러스의 제거를 위해 사용될 수 있는 다른 공정이 있다: 바이러스 불활성화, 예를 들어 계면활성제/용매 방법을 사용한 단백질의 처리, 이온화 방사선, 열 처리 (약 60℃) 및 pH 3 미만 값에서 인큐베이션. 이러한 공정들은 KLH와 같은 헤모시아닌의 처리에 사용될 수 없는데, 이는 단백질의 변성을 초래하기 때문이다. KLH의 고 분자 구조 때문에 그것은 이러한 불활성화 방법에 매우 민감하다. 또한 지난 몇년 동안 개발되어 온 바이러스 나노여과와 같은 다른 접근법들도 사용될 수 없다. 이러한 필터들은 바이러스 오염과 표적 단백질 사이의 작은 크기 차이 때문에 유의미한 바이러스 제거율을 달성할 수 없다. 분자량을 분리하여 작동하는 겔여과도 바이러스의 크기는 헤모시아닌의 그것과 크게 다르지 않기 때문에 바이러스 오염물의 제거에 적절하지 않다.

따라서, 헤모시아닌 내 바이러스 부하를 감소시키고 헤모시아닌으로부터 바이러스를 분리하기 위한 새로운 수단을 제공할 필요가 있다.

본 발명의 기저를 이루는 또 다른 목적은 치료적으로 가치있는 양의 헤모시아닌, 예를 들어 KLH, 또는 이의 서브유닛, 예를 들어 이뮤노시아닌을 제공하는 것이다. 이러한 양은 정제되고 분리된 방식으로 제공될 필요가 있다. 따라서, 헤모시아닌 및 이의 서브유닛 (예를 들어 KLH 또는 이뮤노시아닌)을 분리하고 정제하는 수단 및 방법이 필요하다.

본 발명자들은 몇 가지 정제 방법을 시험하였다. 이들 중에, 초원심분리(ultracentrifugation)는 제공될 헤모시아닌의 한정된 양 때문에 조작이 제한적이다. 더 많은 시간과 비용이 소요된다. 헤모시아닌, 예를 들어 KLH, 또는 헤모시아닌 서브유닛, 예를 들어 이뮤노시아닌의 제조를 가능하게 하는 더 싼 분리 및 정제 접근법에 대한 필요가 있다. 겔여과 크로마토그래피는 성공적이지 않았다. 소수성 작용 크로마토그래피는 추가 평가를 위해 선택되었으나, 의도된 분리 및 정제에 부적합한 것으로 밝혀졌다.

이온 교환 크로마토그래피는 샘플 내 단백질과 해당 수지에 고정화된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피는 음전하를 띤 고체 지지체에 부착된 양전하를 띤 분자를 사용한다.

힘든 연구 프로그램을 수행한 후, 본 발명자들은 양전하를 띤 고체 지지체에 부착된 음전하를 띤 분자를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피가 의도된 분리 및 정제에 적합한 것으로 밝혀졌다는 것을 발견하였다. 더욱 바람직하게는, 특정 매트릭스 물질을 포함하는 특정 음이온 교환 컬럼이 제공된다 (구체예 1 참조). 또 다른 바람직한 구체예에서, 헤모시아닌, 예를 들어 KLH, 및/또는 이의 서브유닛, 예를 들어 이뮤노시아닌을 분리 및/또는 정제하는 특정 방법이 제공된다 (구체예 2-7 참조).

본 발명의 바람직한 구체예는:

1. 30 μm 이상, 바람직하게는 40 μm 이상의 입자 크기, 및 3 000 내지 8 000 Å (옹스트롬: Angstroem), 바람직하게는 6 000 - 8 000 옹스트롬의 기공 크기를 갖는 매트릭스 물질을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼.

2. a) 해양 연체동물로부터 유래된 헤모시아닌 제제(formulation)를 제공하는 단계;

b) a)에서 제공된 제제의 전도도를 희석 버퍼의 첨가에 의해 10 mS/cm 내지 30 mS/cm의 값으로 감소시키는 단계;

c) 단계 b)에서 얻은 희석된 헤모시아닌 제제를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 단계;

d) 상기 컬럼을 버퍼로 세척(rinsing)하여 헤모시아닌을 정제, 바람직하게는 염 및 다른 단백질을 제거하는 단계; 및

e) 제2 버퍼의 첨가에 의해 상기 컬럼으로부터 헤모시아닌 또는 이뮤노시아닌을 용리하는 단계를 포함하는 헤모시아닌 또는 이뮤노시아닌을 분리 및/또는 정제하는 방법.

3. 구체예 2에 있어서, 정제를 위한 버퍼는 pH 7 내지 8의 버퍼인 것인 방법.

4. 구체예 2 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 헤모시아닌이 용리되고, 여기에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이온을 포함하는 pH 7 내지 8의 버퍼가 사용되는 것인 방법.

5. 구체예 2 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 이뮤노시아닌이 용리되고, 여기에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이온이 없는 pH 9 내지 10의 버퍼가 사용되는 것인 방법.

6. 구체예 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 매트릭스 물질은 30 μm 이상, 바람직하게는 40 μm 이상, 더욱 바람직하게는 50 μm +/- 5 μm의 입자 크기의 입자를 포함하는 음이온 교환 매트릭스인 것인 방법.

7. 구체예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 음이온 교환 매트릭스는 3 000 내지 8 000 옹스트롬, 바람직하게는 6 000 - 8 000 옹스트롬의 기공 크기의 기공을 포함하는 것인 방법.

8. 헤모시아닌 또는 이의 서브유닛을 정제하기 위한, 구체예 1의 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 용도이다.

전하를 띤 헤모시아닌 또는 이의 서브유닛 (KLH 또는 이뮤노시아닌)의 음이온 교환 컬럼으로의 결합을 최적화하기 위하여, 컬럼 상에 놓인 단백질 제제 (용액 또는 현탁액)는 그 전도도가 더 낮을 필요가 있었다. 다른 분리 및 정제 방법 중 음이온 교환 크로마토그래피의 선택뿐만 아니라 매트릭스 물질의 선택을 실시예 9에 설명하였다.

본 발명자들이 직면한 한 가지 과제는 가장 바람직한 매트릭스(matrix) 물질의 확인이었다. 헤모시아닌 및 이의 서브유닛의 크기 때문에, 작은 입자를 갖는 매트릭스 물질은 유용하지 않음이 밝혀졌다. 적어도 30 μm 지름의 입자 크기가 도움이 되는 것으로 밝혀졌다. 더욱 바람직한 구체예에서, 입자 크기는 적어도 45 μm 지름, 훨씬 더 바람직하게는 50 μm +/- 5 μm 지름이다. 매트릭스 물질의 용량(capacity)은 "통과-기공(through-pores)" 또는 "기공"의 크기에 의존하였다. 적어도 3,000 옴스트롱(Angstroem)의 기공을 갖는 다공성 물질이 가장 바람직한 것으로 밝혀졌다. 기공 크기는 3,000-8,000 옴스트롱 또는 바람직하게는 6,000-8,000 옴스트롱일 수 있다. 상기 물질은 6-10 범위, 바람직하게는 7-9 범위의 pH에서 이온 교환 크로마토그래피에 유용한 종래 물질일 수 있다. 그러한 매트릭스 물질을 갖는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것은 90% 이상, 바람직하게는 95% 더욱 바람직하게는 99%의 가장 높은 순도를 달성하였다. KLH의 15 mg/ml 이상, 바람직하게는 17 mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 23 mg/ml 이상의 매트릭스 물질이 컬럼에 결합된다.

혈림프 혈청과 같은 헤모시아닌 제제 또는 이뮤노시아닌과 같은 이의 서브유닛은, 컬럼에 직접적으로 적용될 수 없다. 본 발명자들은 전형적인 헤모시아닌 제제, 및 해양 연체동물로부터 유래된 혈림프 혈청이 헤모시아닌 및 다른 혈청 성분과는 별도로, 높은 수준의 염화나트륨 및 기타 미네랄을 함유함을 확인하였다. 이것은 대략 50 mS/cm의 범위의 매우 높은 전도도를 초래한다. 이러한 조건하에, 단백질 제제 (예를 들어 혈림프 혈청)는 이온 교환 컬럼에 결합할 수 없다. 단백질 제제의 정량적인 결합을 달성하기 위하여, 버퍼에서의 희석이 필요하다. 버퍼는 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 7.5 범위의 pH에서의 버퍼이다. 버퍼는 바람직하게는 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 이온을 포함한다. 버퍼는 미네랄 및 염 성분을 희석하기 위해 적합한 것이 필요하다. 특히, 버퍼는 전도도를 낮추기 위해 적합한 것이 필요하다. 헤모시아닌 제제 (또는 더 일반적인 용어로 단백질 제제)의 정량적인 결합을 달성하기 위해, 전도도는 25 mS/cm 미만, 바람직하게는 20 mS/cm 미만으로 낮추어야 한다. 바람직한 범위는 10 내지 20 mS/cm이다.

바람직한 매체(medium)는 Poros® 50 HQ이다.

샘플의 직선 유속은 10 ml/분 내지 100 ml/분, 바람직하게는 30 내지 70 ml/분, 가장 바람직하게는 50 ml/분일 수 있다.

상술된 바와 같이 전도도를 감소시킨 후, 단백질 제제 (헤모시아닌 제제)를 음이온 교환 컬럼에 로딩(loading)한다.

중성 pH 조건 (pH 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 7.5) 하에, 헤모시아닌은 음이온 교환 컬럼에 결합된다. 다른 단백질, 염, 미네랄 및/또는 다른 분자의 용리를 실시한다. 바람직하게는, 희석 및 전도도 감소에 사용되는 버퍼가 이용된다.

세척하는(rinsing) 단계 후, 헤모시아닌 제제로부터 정제된 단백질은 이온 교환 컬럼에 결합된다.

해리 없이, 헤모시아닌, 예를 들어 KLH를 용리하려는 경우, 헤모시아닌은 중성 범위 (pH 6 내지 8, 바람직하게는 7 내지 7.5)의 용리 버퍼를 사용하여 컬럼으로부터 용리시킨다. 용리 버퍼는 세척 버퍼와 비교하여 그 이온 강도가 증가된다. 바람직한 구체예에서, 용리 버퍼는 Ca++ 및 Mg++ 이온을, 더욱 바람직하게는 0.01 M 내지 0.1 M 농도로, 더욱 더 바람직하게는 0.05 내지 0.01 M로 각각 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 버퍼는 대안적으로 또는 추가적으로 TRIS/HCL을, 바람직하게는 0.1 내지 1 M의 농도로 포함한다.

세척 및 용리 버퍼의 차이점은 염 농도일 수 있다.

전형적으로 용리를 위해, 용리 구배는 0.01 내지 1 M 염화나트륨, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.7 M, 가장 바람직하게는 0.075 내지 0.575 M 염화나트륨을 사용하여 적용된다.

헤모시아닌을 이의 서브유닛, 예를 들어 KLH 서브유닛 또는 이뮤노시아닌으로 해리시키려는 경우, 용리 전에, 알칼리성 버퍼를 첨가한다 (pH 8 내지 10, 바람직하게는 9 내지 10). 해리 버퍼는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 해리 버퍼일 수 있다. 바람직하게는 해리 버퍼는 글리신(glycine) 및 NaOH를 함유한다. 그것은 또한 NaCl 및/또는 EDTA를 함유할 수 있다. 이러한 조건하에, 헤모시아닌은 이의 서브유닛으로 해리한다. 해리 버퍼는 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺가 결여되고, 바람직하게는 컬럼으로부터 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이온을 제거하기 위한 양 및 농도로 사용된다. 해리 버퍼는 또한 용리를 위해 사용될 수 있다. 다시, 증가된 염 농도를 갖는 용리 구배가 용리에 사용된다. 바람직한 구체예에서, 용리 구배는 상기와 같이 헤모시아닌에 대해 기술된 바와 같다.

다른 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 아래에 제시한 방법 및 화합물 및 조성물을 제공한다:

제1 양상에서 본 발명은 연체동물로부터 혈림프 혈청을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 저온 마취 하에 연체동물의 페달 혈동을 천공(puncturing)하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 연체동물은 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)이다. 다른 연체동물은 예를 들어 하리오티스 투베르쿨라타(Haliotis tuberculata) (유럽 전복), 하리오티스 루브라(Haliotis rubra) (호주 전복)이다

바람직한 구체예에서, 천공하는 동안 연체동물은 특정 격리 조건 하에 유지되고, 여기에서 자연 자원으로부터 얻어진 후의 연체동물은 유기 사료 공급이 없거나 및/또는 수족관 시스템 내 물이 생물학적 오염물의 제거에 의해 정제되는 조건 하에 격리 수족관 시스템에 유지된다. 생물학적 오염물을 제거하는 것은 바이오-여과(bio-filtration), 단백질 스키밍(protein skimming) 등을 포함할 수 있다.

천공에서 얻은 혈액은, 바람직하게는 0.2 μm 멤브레인 여과를 사용하여, 추가적으로 멸균될 수 있다.

제2 양상에서 본 발명은 제1 양상의 방법에서 얻은 것과 같은 혈림프 혈청을 제공하는 단계, 및 혈림프 혈청으로부터 헤모시아닌, 예를 들어 KLH를 바람직하게는 직접 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 단계를 포함하는 천연 헤모시아닌을 분리하는 방법을 제공한다.

바람직한 구체예에서, 직접 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피이다.

상기 방법은 헤모시아닌을 헤모시아닌 올리고머의 서브유닛으로 해리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선택적으로 헤모시아닌 서브유닛을 정제하는 단계 또한 수행된다. 선택적으로, 서브유닛을 헤모시아닌의 올리고머 형태로 재회합하는 단계가 수행된다.

바람직한 구체예에서 잠재적인 생물학적 오염을 제거하기 위하여 나노여과하는 단계를 포함하는 헤모시아닌 서브유닛의 정제가 수행된다.

바람직하게는, 재회합 단계는 정용여과(diafiltration) 단계 또는 투석(dialysis) 단계를 포함하여 일어난다.

재회합된 헤모시아닌은 최종적으로 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.

바람직하게는, 헤모시아닌은 장기간 보관을 위하여 안정화 퍼퍼(puffer) 시스템과 혼합된다.

이 양상에서, 헤모시아닌, 예를 들어 천연의 KLH를 해리하여 서브유닛을 얻는 단계, 그렇게 얻은 서브유닛을 바이러스를 제거하는 필터, 바람직하게는 15 내지 35 nm, 더욱 바람직하게는 20 내지 25 nm의 기공 크기를 갖는 나노필터를 사용하여 나노여과하는 단계 및 나노여과 후 얻은 서브유닛을 재회합하여 합성 헤모시아닌, 바람직하게는 합성 KLH를 얻는 단계를 포함하는, 합성 KLH와 같은 합성 헤모시아닌을 제조하는 방법이 또한 제공된다.

바람직한 구체예에서, 서브유닛은 이뮤노시아닌(immunocyanin)이다. 더욱 바람직하게는, 서브유닛은 각각 800,000, 500,000, 400,000, 350,000 또는 300,000 달톤 보다 작다. 가장 바람직하게는, 서브유닛은 300,000 내지 500,000 달톤이다.

본 발명의 이 양상에서, 헤모시아닌의 서브유닛으로의 해리는 8 내지 10, 바람직하게는 9 내지 10의 pH를 적용하여 실시된다. 바람직하게는, 해리는 알칼리성 pH 8 내지 10, 바람직하게는 9 내지 10에서 2가 양이온 칼슘 (Ca⁺⁺) 및 마그네슘 (Mg⁺⁺)의 제거 하에 일어난다. Ca⁺⁺및 Mg⁺⁺의 제거는 킬레이트 형성제, 예를 들어 EDTA의 첨가에 의해 실시될 수 있다. 이러한 조건하에, 천연 KLH는 서브유닛으로 해리된다. 해리는 가역적이고, 즉 서브유닛은 중성 pH 값 (6 내지 9, 바람직하게는 7 내지 8)의 재설정에 의해, 바람직하게는 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 이온을 첨가한다면, 다이데카머 및 멀티데카머의 불균질 혼합물로 재회합될 수 있음이 밝혀졌다. 천연 KLH와 같은 헤모시아닌을 해리하기 위한 가장 바람직한 구체예는 다음과 같다: 헤모시아닌을 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 이온을 포함하는 중성 pH의 안정화 버퍼, 바람직하게는 pH 7 내지 8의 TRIS/HCL을 포함하는 버퍼에서 안정화한다. 이 버퍼에서, 헤모시아닌은 변성 없이 여전히 천연 형태로 있다. 8 내지 10, 바람직하게는 9 내지 10의 범위에 있는 알칼리성 버퍼를 첨가한다. 가장 바람직하게는, 온도는 10℃ 이하, 가장 바람직하게는 5℃ 이하, 특히 2 내지 8 ℃이다. 바람직한 알칼리성 버퍼는 글리신(glycine) 및 NaOH를 포함한다. 다른 바람직한 버퍼는 TRIS/HCl 버퍼 pH 8.9, TRIS/HCl 버퍼 pH 8.9 플러스 EDTA, 인산나트륨(Sodium phosphate) 버퍼 pH 8.0, 탄산암묘늄(Ammonium carbonate) 버퍼 pH 8.0, 탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate) 버퍼 pH 10.1, 탄산수소나트륨 버퍼 pH 9.5, NaCl 및/또는 EDTA가 버퍼에 첨가될 수 있다. 전형적인 버퍼 농도는 1 - 100 mM, 바람직하게는 2 - 50 mM, 더욱 바람직하게는 10-20 mM이다. EDTA가 첨가되는 경우, 그것은 버퍼 농도와 비교하여 1/10 내지 1/2의 농도에서 사용된다. 만약 첨가된다면, EDTA에 대한 동일한 농도가 NaCl에 대해 고려된다. 버퍼는 EDTA 및/또는 NaCl을 포함할 수 있다.

그렇게 얻은 서브유닛의 용액 (또는 이뮤노시아닌 용액)은 알칼리성 pH (8 내지 10, 바람직하게는 9 내지 10)에서 유지되고, 1개월 이상, 2개월 이상, 가장 바람직하게는 3개월 이상 동안, 10℃ 이하, 더욱 바람직하게는 2 내지 8℃에서 저장될 수 있다.

서브유닛, 예를 들어 이뮤노시아닌은, 바이러스 오염으로부터 자유로울 수 있다. 나노여과는 단백질 용액으로부터 다양한 바이러스를 효과적으로 제거하는 것으로 이전에 나타났다. 그러나, 본 발명자들은 KLH 이소머(isomer)의 거대한 크기 및 응집 거동 때문에, 나노여과는 천연 형태의 KLH에 대해 적용될 수 없음을 발견하였다. 천연 KLH의 분자량의 8 백만 달톤 이상으로부터 500,000 달톤 이하의 분자량으로의 이동, 전형적으로 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)의 대략 400,000 달톤의 균일한 분자량으로의 이동은, 그러나, 본 발명자에 의해 실현되는 바이러스 제거를 위한 기초를 제공하였다. 나노여과는 상업적으로 이용가능한 나노필터로 만들어질 수 있다. 전형적으로, 이러한 필터는 15-35 nm, 더욱 바람직하게는 20-25 nm의 기공 크기를 가진다. 이러한 필터는 필터 캡슐, 예를 들어 플라노바(Planova) 필터 캡슐로서 상업적으로 이용가능하다. 일 구체예에서, 이러한 나노필터는 일회용 유닛(unit)이다. 나노필터는 좁은 기공 분포를 갖는 자연 친수성 구리암모늄(cuprammonium) 재생 셀룰로오스로 구성된 저 단백질 결합 중공-섬유 미세다공성 멤브레인을 이용할 수 있다. 0.001 m² 내지 4 m², 바람직하게는 0.01 m² 내지 0.3 m²의 넓은 범위의 유효 표면이 적용될 수 있다.

본 발명자들은 상업적 나노여과의 전형적 조건하에 헤모시아닌 서브유닛 (이뮤노시아닌)에 나노여과를 적용하는 것은 별로 효과적이지 않다는 것을 밝혔다. 전형적으로, 단백질은 용액의 단백질 현탁액을 사용하고, 0.01 내지 10 ml/분, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 ml/분의 일정한 유속으로 용액의 단백질 현탁액을 필터로 펌핑하여, 나노필터 표면이 흐름 방향에 수직이 되도록 함에 의하여 나노여과된다. 이러한 접근은 바이러스 제거에 효과적이다. 불행하게도, KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)의 큰 분자량 때문에, 바이러스 필터는 바이러스뿐만 아니라, 많은 양의 단백질도 보유한다. 필터 표면에 수직인 흐름을 갖는 고전적인 바이러스 여과는 또한 "데드-엔드 여과(dead-end filtration)"로 알려져 있다. 본 발명자들은 데드-엔드 여과는 이뮤노시아닌, 또는 헤모시아닌 서브유닛에서 바이러스 제거에 바람직하지 않음을 밝혔다. 헤모시아닌은, 해리 후에도, 단백질의 심각한 손실 없이는 나노여과될 수 없다. 실시예 2는 "데드-엔드 여과"를 하기에서 후술되는 본 발명의 여과의 바람직한 방식과 비교한다. 데드-엔드 여과는 40% 이상, 60% 이상, 또는 심지어 80% 이상의 단백질의 손실을 초래한다.

따라서, 개선되고 수정된 바이러스 여과 접근법의 제공에 대한 필요가 있었다. 본 발명자들은 상술된 바와 동일한 나노필터가 새롭고 수정된 방식으로 다루어질 필요가 있다는 것을 밝혔다: 단백질 현탁액 또는 용액은 멤브레인 표면에 평행인 흐름으로 펌핑될 필요가 있다. 유속은 0.01 내지 100 ml/분, 바람직하게는 0.1 내지 100 ml/분, 더욱 바람직하게는 1 내지 70 ml/분일 수 있다. 단백질 용액 또는 현탁액에 적용되는 압력은 0.1 MPa 미만, 바람직하게는 10 kPa 미만이다. 단백질 용액 또는 현탁액은, 바람직하게는 반복된 방식으로, 더욱 바람직하게는, 헤모시아닌 서브유닛을 함유하는 더 많은 단백질 용액 또는 현탁액의 첨가 하에, 멤브레인 표면으로 펌핑되거나 흘러서, 원료 흐름을 포함하는 사이클이 확립된다. 나노여과는 바람직하게는 알칼리성 버퍼, 가장 바람직하게는 해리에 사용된 알칼리성 버퍼에서 일어난다. 필터 상으로 흐르는 출발 물질은 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/ml, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 1 mg/ml, 가장 바람직하게는 0.3 내지 7 mg/ml의 농도 범위에 있다. 여과 후 단백질 수율은 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 93% 이상이다.

본 발명자들은 나노필터의 멤브레인 표면에 평행인 흐름 방향을 갖는 "크로스-플로우(Cross-flow)" 여과로 명명된 나노여과 접근법으로, 거의 정량적인 단백질 정제가 가능하다는 것을 확립했다. 따라서, 이 여과는 상업적으로 관련된 헤모시아닌 서브유닛 또는 이뮤노시아닌의 생산에 적합하다.

본 발명자들은 또한 바이러스 부하가 충분히 감소될 수 있음을 확립했다. 본 발명의 방법, 바람직하게는 크로스-플로우 여과로, 바이러스의 적어도 99.9%가 단백질 재료로부터 제거된다. 소위 로그 감소 인자는 바이러스 제거에 대한 척도이다. 로그 감소 인자 (log reduction factor: LRF)는 최초 단백질 용액 제제, 즉 단백질 또는 단백질 현탁액으로부터 제거된 바이러스의 양이며, 로그 눈금 (dec log scale)으로 표현된다. LRF가 1이면 90%의 바이러스가 제거되고, 10%가 보유됨을 의미한다. LRF가 2이면 99%의 바이러스가 제거되고, 1%가 보유됨을 의미한다. LRF가 3이면 99.9%의 바이러스가 제거되고, 0.01%가 보유됨을 의미한다. 본 발명의 크로스-플로우 여과로, 적어도 2 이상의 LRF, 더욱 바람직하게는 3 이상의 LRF가 얻어진다. 더욱 바람직하게는, 4 이상의 LRF가 얻어진다.

개념의 증명은 실시예 3 (크로스-플로우 여과에 대한 타당성 조사)에 나타난다. 이 실험에서, 0.12 m²의 필터 표면을 갖는 20 nm 플라노바(Planova) 필터가 이용되었다. 유속은 50 ml/분이었다. 10,620의 전체 바이러스 부하 (단백질 조성의 0.5%)가 첨가되었다. 시험 목적을 위해 이용되는 바이러스는 가장 작은 바이러스 중 하나인 PPV (20 nm의 지름)였다. 97% 이상의 단백질 수율이 달성되었다 (4,814.9 g의 사전-여과와 비교하여 정제된 단백질 4,662.4 g). LRF는 3.14 +/- 0.32였다.

얻은 여과물은 치료 목적 (이뮤노시아닌 준비)을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 천연 헤모시아닌을 해리하여 서브유닛을 얻는 단계 및 그렇게 얻은 서브유닛을 15 내지 35 nm의 기공 크기를 갖는 필터를 통해 나노여과하는 단계를 포함하는 이뮤노시아닌을 제조하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 바람직하게는, 여과는 크로스-플로우 여과이다. 더욱 바람직하게는, 얻은 단백질의 양은 이뮤노시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛의 60% 이상, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 93% 이상이다.

또 다른 구체예에서, 이뮤노시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛은 나노여과 후 재회합되어 "합성" 헤모시아닌, 바람직하게는 "합성" KLH를 얻는다. 재회합은 중성 pH 값을 재설정하여 실시된다. 단백질 현탁액 또는 단백질 용액은 pH를 6 내지 9, 바람직하게는 7 내지 8의 범위로 이동시키는 것에 의해 다이데카머 또는 멀티데카머의 불균질 혼합물로 재회합된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 재회합은 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 이온의 첨가에 의해 실시된다. 더욱 바람직하게는, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ 이온의 양은 각각 0,5 M 이하이다. 더욱 바람직하게는, 0.05 - 0.1 M TRIS/HCl 버퍼 pH 7.4와 같은 버퍼가 이용되고, 선택적으로 0.05 M 내지 0.2 M의 MgCl₂, 및/또는 0.05 M 내지 0.2 M의 CaCl₂, 및/또는 0.15 M 내지 0.3 M의 NaCl이 함께 이용된다. 다른 버퍼는 글리신/NaOH pH 7.4, 또는 인산나트륨, pH 7.4이다.

따라서, 일 구체예에서 본 발명은 천연 KLH를 해리하여 서브유닛을 얻는 단계, 그렇게 얻은 서브유닛을 15 내지 35 nm의 기공 크기를 갖는 필터를 사용하여 나노여과하는 단계 및 나노여과 후 얻은 서브유닛을 재회합하여 합성 헤모시아닌 또는 합성 KLH를 얻는 단계를 포함하는 합성 KLH 또는 합성 헤모시아닌을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 여과는 크로스-플로우 여과, 더욱 바람직하게는 상술한 크로스-플로우 여과이다. 전형적으로, 얻어진 단백질의 양은 천연 KLH의 양당 60% 이상이다. 더욱 바람직하게는, 수득된 것(합성 KLH 또는 합성 헤모시아닌)은 천연 KLH의 양당 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 또는 93%이다.

제3 양상에서 본 발명은 제1 및/또는 제2 양상의 방법에 의해 얻은 혈림프, 본 발명의 제2 양상의 방법에 의해 얻은 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛을 제공한다. 이 양상은 자연적으로 발생하는 비율에서 헤모시아닌의 서브유닛의 혼합물인 이뮤노시아닌의 제공을 포함한다.

제4 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 제3 양상의 혈림프, 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛이 제공된다.

이 양상은 또한 제3 양상의 혈림프, 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다

상기 약학적 조성물 또는 약제는 예를 들어 암, 바람직하게는 방광암의 치료, 또는 면역자극제 또는 담체로서 사용하기 위한 것이다.

제5 양상에 따르면 헤모시아닌 서브유닛이 제공되고, 이는 제2 양상에 따라 제조된 헤모시아닌의 선택적 해리의 결과이다.

본 발명의 제1 양상에서는, 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)와 같은 연체동물로부터 저 내독소(low endotoxin) / 저 바이오버든(low bioburden) 혈림프 혈청을 상업적인 양으로 제조하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 본 발명은 연체동물, 바람직하게는 키홀 림펫(keyhole limpet)으로부터 유래된 약학적 등급의 출발 물질의 제조 방법에 관한 것이다. 혈림프 혈청의 저 내독소/저 바이오버든 품질은 특정 격리 절차를 자연 또는 양식 자원 유래 림펫(limpets)에 적용하는 것에 의하여 달성된다. 격리 수족관 시스템(Quarantine Aquaria System)의 독점 설계는 생물학적 오염 즉, 박테리아, 내독소 및 바이러스의 상당한 감소를 초래한다.

본 발명의 제1 양상의 한 핵심은 격리 수족관 시스템에서 연체동물의 처리이다. 동물은 특정 온도 조건에 유지되거나 및/또는 격리 수족관은 원심분리 단백질 스키머(skimmer) 및/또는 하나 이상의 바이오필터와 같은 단백질 제거를 위한 수단을 포함한다.

바람직하게는, 인공 바닷물이 수족관에 사용되고, 더욱 바람직하게는, 인공 바닷물의 빠른 순환을 이용하여 연체동물을 처리한다. 수족관에서 흐름은 바다에서 서핑 존(surf zone)을 모방할 수 있다. 생물학적 오염물은 광범위한 거품 일기(foaming) 및/또는 격리 물의 바이오-여과(bio-filtration)에 의해 제거될 수 있다.

제1 양상의 수족관 시스템은 생물학적 오염물의 감소를 초래한다. 그것은 배설물을 효과적으로 제거하고 그것에 의하여 박테리아 및 박테리아 내독소의 제거를 초래한다. 수족관 내 처리 동안, 동물은 바람직하게는 먹이를 주지 않고, 이것은 다시 유기 성분의 함량을 최소화하며, 오염의 감소를 초래한다.

바닷물의 전도도, pH-값 및 산화환원 전위는 바람직하게는 영구적으로 제어되고 측정된다.

키홀 림펫의 자연 환경에서 수온은 10 내지 20 ℃, 바람직하게는 12 - 16 ℃이다; 그러므로 수족관 내 물의 냉각(cooling)이 필요하다. 이 목적을 위해 열 교환기가 저장조에 위치할 수 있다. 수온은 통(basin) 내 온도 센서에 의해 모니터링되어, 설정된 온도 목표 (14 ℃±2 ℃)로 냉각 유닛을 제어한다.

수족관 내 물은 바람직하게는 인공 바닷물, 즉 전도도 및 pH, 및 바람직하게는 산화환원 전위 및 더욱 바람직하게는 또한 바닷물과 유사한 염 함량이 제어된 물이다. 예를 들어, 전도도 값은 46-52 ms/cm이고, pH는 7.5-8.5이다. 일 구체예에서, 밀도는 1.020 내지 1.030 범위일 수 있다. 100 초과의 산화환원 환위가 바람직하다.

천공을 위한 동물의 방출은 수족관 내에서 1일, 바람직하게는 2일, 더욱 바람직하게는 3일, 더욱 바람직하게는 4일, 더욱 바람직하게는 5일, 더욱 바람직하게는 6일, 더욱 바람직하게는 7일, 더욱 바람직하게는 10일, 가장 바람직하게는 13일의 동물 홀딩(holding)이 필요하다.

본 발명의 사내 동물 격리 절차는 바이오-버든의 감소에 도움을 준다. 예를 들어, 동물 대장균 함량은 격리 조건 하에 배양하여 감소될 수 있다.

격리 하에, 동물은 저온 마취(cold narcosis) 하에서 페달 혈동(pedal blood sinus)에 천공된다.

본 발명의 제2 양상의 두 번째 핵심은, 따라서, 연체동물을 천공하기 위한 절차이다. 천공 ("혈림프 추출") 전에, 연체동물은 수족관으로부터 제거되고, 시각적으로 검사될 수 있고, 바람직하게는 세척되고, 그리고 클린 룸(clean room) 시설로 옮겨진다.

동물은 바람직하게는 클린 룸 시설로 옮겨지고, 이곳에서 동물을 염 농도가 동물 혈청과 등장성인 독점 염화나트륨(Proprietary Sodium Chloride) 용액인 혈림프 등장액 (hemolymph isotonic solution: HIS)을 사용하여 씻는다.

동물의 무게를 측정하고, 미리 설정된 천공대(puncture rack)에 놓는다.

이 작업 동안, 바람직하게는 특히 장 시스템에 내부 부상을 일으키지 않도록 주의하여야 하는데, 그 두 가지 이유는: 첫 번째로 대변으로 제품의 오염을 피하기 위함이고, 두 번째로 동물의 죽음을 피하기 위함이다. 대변으로 오염된 혈림프 혈청에 의해 나타나는 바와 같이, 장에 우연한 상해가 발생하면, 재료는 폐기된다.

소독 후, 요추 캐뉼라(lumbal cannula)를 포함하는 발바닥 뒷부분의 3분의 1에서 바늘로 천공을 만들 수 있다. 캐뉼라의 입구는 발 근육에 달라붙을 수 있고, 페달 동(pedal sinus)에 도달할 때까지 더 밀어넣을 수 있다. 구강 동(buccal sinus) 또는 심정맥 동(cardiac sinus)은 바람직하게는 천공되지 않는다.

일 구체예에서, 혈액 추출의 완료 하에, 멸균된 등장액을, 바람직하게는 캐뉼라를 통해, 주입하고, 그리고 누설된 액체를 검사하여 혈동(blood sinus)이 도달했는지를 결정하며, 이것은 청색 유체에 의해 표시된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 10 내지 60 ml, 더욱 바람직하게는 30 - 50 ml 또는 동물의 체중의 10 - 20 %, 바람직하게는 12- 15%의 혈림프가 멸균된 원심분리 튜브에서 수집된다.

일 구체예에서, 회수된 혈림프는 HIS 용액에 의해 대체된다.

혈림프는 바람직하게는 2 내지 8℃에서 냉장되고, 모아질 수 있다.

동물은 바람직하게는 뒤로 옮겨지고, 세척되고, 사내 회복 수족관 탱크로 복귀된다. 동물은 1 내지 4일 동안 모니터링될 수 있고, 그들의 자연으로 되돌려질 수 있다. 이 방법은 연체동물을 살아 있는 상태로 바다로 되돌려 보내질 수 있게 한다.

제1 양상의 세 번째 핵심에 따르면, 얻어진 혈액은 정제될 수 있고, 0.2 μm 멤브레인 여과에 의해 멸균될 수 있다.

모으기(pooling) 전에, 혈림프 분획은 단일 샘플에 대해 수행된 IPC (in process control: 공정 제어 중)의 규격에 상응해야 한다. 저온 혈림프 분획은 멸균된 폐기가능 병에 모으고, 거품나는 것(frothing)을 피하면서, 잘 혼합한다.

본 발명의 제2 양상에서 메가투라 크레눌라(Megathura crenulata)와 같은 연체동물 유래 저 내독소 / 저 바이오-버든 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛을 상업적인 양으로 제조하는 방법이 제공된다.

바람직하게는, 상기 방법은 생물학적으로 안전한, 바이러스 없는 분자 표준화된 헤모시아닌, 예를 들어 KLH, 또는 헤모시아닌 서브유닛, 예를 들어 KLH 서브유닛을 상업적인 양으로 제공할 수 있다.

상기 방법은, 바람직하게는 직접 크로마토그래피를 통한, 더욱 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피를 통한, 혈림프 혈청으로부터 헤모시아닌의 분리를 포함한다.

상기 방법은 바람직하게는 헤모시아닌을 헤모시아닌 서브유닛으로 해리하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 또한 헤모시아닌 서브유닛을 정제하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 바람직하게는 또한 나노여과하는 단계를 포함한다. 이 단계에서 바이러스는 헤모시아닌 서브유닛으로부터 분리될 수 있는데, 즉 이 단계는 잠재적 바이러스 오염을 제거하기 위하여 수행된다.

상기 방법은 바람직하게는 또한 서브유닛으로부터 헤모시아닌을 재회합하는 단계를 포함한다.

해양 연체동물의 기원의 혈림프 혈청은 헤모시아닌 및 다른 혈청 성분 외에도, 높은 수준의 염화나트륨 및 다른 미네랄들을 함유한다. 혈림프 혈청의 전도도는 높은 염 함량을 기초로 평균 50 ms/cm 정도이다. 헤모시아닌, 예를 들어 KLH의 정량적 결합을 달성하기 위해서, 전도도는 20 mS/cm 미만으로 감소되어야 한다.

상기 설명한 바와 같이 전도도를 감소시키기 위하여 혈림프 혈청은 겔 여과, 전기 투석, 정용여과 또는 희석과 같은 적절한 방법에 의해 부분적으로 탈염될 수 있다. 염의 제거는 다른 혈청 성분 즉 단백질 및 탄수화물의 침전을 초래한다. 침전물은 저속 원심분리, 심층 여과 또는 멤브레인 여과 (0.8 u. 0.45 μm)에 의해 제거될 수 있다.

이어서, 콜로이드성 용해된 고 분자량 KLH는 크로마토그래피 절차, 즉 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있고, 그 다음 서브유닛의 해리 및 정제를 할 수 있다.

천연 헤모시아닌, 예를 들어 KLH를 해리하는 두 개의 바람직한 방법이 가능하다: 인 시투(in situ)에서 이온 교환 포획 컬럼에서 해리 또는 정용여과에 의한 해리.

수득한 헤모시아닌 서브유닛은 추가적인 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 정제되고, 최종적으로 겔 여과에 의해 폴리싱(polishing)될 수 있다.

일 구체예에서 천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제된다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합된 다음, 컬럼상에서 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)으로 알칼리성(pH 7 내지 10, 바람직하게는 8,6 내지 9,6) 버퍼에서 해리된다. 이뮤노시아닌은 염 기울기 용리로 컬럼으로부터 회수된다. 결과로 얻은 이뮤노시아닌 용액은 정용여과 / 한외여과에 의해탈염되고, 농축된다. 농축된 이뮤노시아닌 용액은 그 다음 추가적인 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 정제될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제된다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합된 다음, 염 기울기 용리의 방법으로 컬럼에서 회수된다. 결과로 얻은 헤모시아닌 용액은 정용여과, 투석 또는 한외여과의 방법으로 알칼리성 (pH 7 내지 10, 바람직하게는 8,6 내지 9,6) 버퍼에서 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)으로 탈염, 농축, 및 해리된다. 최종적으로 이뮤노시아닌 용액은 농축되고 추가적인 이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제된다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합된 다음, 염 기울기 용리의 방법에 의해 컬럼에서 회수된다. 결과로 얻은 헤모시아닌 용액의 헤모시아닌은 초원심분리의 방법으로 분리된다. 이어서, 결과로 얻은 헤모시아닌 펠렛은 알칼리성 (pH 7 내지 10, 바람직하게는 8,6 내지 9,6) 버퍼에서 용해되고 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)으로 해리된다. 최종적으로 이뮤노시아닌 용액은 농축되고, 추가적으로 이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행할 수 있다.

헤모시아닌의 해리를 달성하기 위하여, 일반적으로, 헤모시아닌을 해리 버퍼 (pH 8 내지 10, 바람직하게는 8,6 내지 9,6, 바람직하게는 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺가 결여됨)에 용해시킬 수 있다. 이것은 알칼리성 조건을 발생시키고, 이는 천연 헤모시아닌 분자가 서브유닛으로 해리되는 것을 초래한다.

이뮤노시아닌 용액은 농축될 수 있다. 최종 정제 (폴리싱), 예를 들어 겔 여과에 의한 정제 전에, 이뮤노시아닌 용액은 20 mg/mL (± 2.5 mg/mL)의 단백질 함량으로, 예를 들어 한외여과에 의해 농축될 수 있다. 이 목적을 위해, 스테인리스강 한외여과 유닛에 장착된 저 단백질 결합 폴리술폰 또는 폴리에테르 술폰 멤브레인 (분리 한계: 30,000 달톤; 필터 영역: ≥ 700 cm²)이 바람직하게 사용된다. 한외여과 후, 농축된 이뮤노시아닌 용액은, 예를 들어 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과된다.

농축된 이뮤노시아닌 용액은 그 다음, 예를 들어 겔 여과 컬럼을 통한 중압 액체 크로마토그래피(middle pressure liquid chromatography)에 의해 정제될 수 있다.

바람직한 컬럼은 Superose^® 6 (제조 등급; 고도로 가교된 다공성 아가로스 비드로 구성됨); 비드 크기 20-40 μm, 분획 범위 5,000-5,000,000 Da이다. 용리액으로서 용리 버퍼 (pH 8-10, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺가 결여됨)가 사용될 수 있다. 농축된 이뮤노시아닌 용액은 무균 조건하에 컬럼에 로딩될 수 있다. 분자량 400,000에서 주 이뮤노시아닌 피크(peak)가 수집되었다. 이뮤노시아닌 분획은 바람직하게는 +2-8℃로 즉시 냉각되고, 예를 들어 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과된다.

KLH와 같은 천연 헤모시아닌의 기원 때문에 인간 병원균에 의한 바이러스 위험이 존재한다. 생물학적 안전을 보장하기 위하여 생물학적 공정의 하류 공정은 잠재적인 바이러스 오염의 불활성화 또는 제거를 위한 단계를 포함한다. 이용가능한 불활성화 방법을 KLH에 대해 시험하였고, KLH 제조에 대한 손상 효과 때문에 헤모시아닌에 대해 적절하지 않음을 발견하였다.

본 발명에 따르면 나노여과는 정제된 헤모시아닌 서브유닛, 예를 들어 KLH 서브유닛을 얻기 위하여, 즉 잠재적인 바이러스 오염의 제거를 위하여 바람직하게 사용된다.

이 단계에서 적절한 바이러스 필터 멤브레인으로서, 헤모시아닌 서브 유닛, 예를 들어 KLH 서브유닛의 함량 및 생화학, 화학 및 물리학적 특징에 영향을 주지 않는 것이 선택될 수 있다. 미여과 및 여과된 헤모시아닌 서브유닛은 서브유닛이 기능적으로 손상되지 않았음을 보여주기 위하여 비교 연구에서 비교된다. 바이러스 검증 연구(Virus Validation Study)는 서로 다른 크기를 갖는 모델 바이러스의 제거에 대한 헤모시아닌 서브유닛의 바이러스 여과의 효과를 보여주기 위하여 수행될 수 있다.

생물학적 자원으로부터 유래된 약학적 단백질의 안전성을 증명하기 위하여 그러한 제품의 제조업자는 제조 과정 동안 병원성 바이러스의 효과적인 불활성화 및/또는 제거를 증명해야 한다. 일반적으로, 이것은 관련된 및/또는 모델 바이러스를 가지고 제조 공정의 다운-스케일된 버전을 고의적으로 스파이킹하는(deliberate spiking) 방식으로 수행한다.

본 발명에 따르면, 적어도 뮤린 류케미아 바이러스(Murine Leukemia Virus), 슈도라비에스 바이러스(Pseudorabies Virus), 레오 바이러스 유형 3(Reo Virus Type 3) 및 돼지 파르보바이러스(Porcine Parvovirus)의 제거가 나노여과에 의해 수행된다. 제거를 시험하기 위하여, 정해진 역가로 시험 샘플에 바이러스를 스파이킹한 다음, 나노여과를 실시할 것이다. 샘플은 스파이킹된, 사전여과된 시험 샘플뿐만 아니라 나노여과물로부터 회수될 것이고, 종료점(endpoint) 적정에 의해 그리고 총량 분석(bulk analysis)에 의해 각각 바이러스를 모니터링할 수 있다.

바이러스의 제거는 바람직하게는 바이러스 역가를 50%, 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80, 더욱 바람직하게는 90, 더욱 바람직하게는 99%, 가장 바람직하게는 99,9% 감소시키기 위하여 수행된다.

헤모시아닌 제품의 잠재적인 오염물을 나타내는 관련 바이러스는 다음과 같다:

모델 바이러스	분류	게놈	구조	크기/ nm	안정성	지시 세포주
A형 간염바이러스 (HAV)	피코르나 바이러스과 (Picornaviridae)	ssRNA	외피 비보유 (non-enveloped)	25-30	중간 내지 높음	FRhK-4
소비루스성 설사병 바이러스 (BVDV)	플라비바이러스 (Flavivirus)	ssRNA	외피 보유 (enveloped)	40-60	낮음	MDBK
돼지 파르보바이러스 (PPV)	파르보바이러스과 (Parvoviridae)	ssDNA	외피 비보유 (non-enveloped)	18-24	매우 높음	PK13
유인원 바이러스 40 (SV40)	파포바바이러스과 (Papovaviridae)	dsDNA	외피 비보유 (non-enveloped)	40-50	높음	Vero

A형 간염바이러스 (Hepatitis A Virus: HAV ) - 외피 비보유(non-enveloped), 작은 (25-30nm), 단일-가닥 RNA 바이러스 (ATCC VR-1402), 이화학 불활성화에 대한 중간 내지 높은 내성을 가짐. A형 간염은 EMCV 및 폴리오바이러스(Poliovirus)도 포함하는 피코르나 바이러스과에 속한다. 이 바이러스는 인간 혈액 및 혈장의 잠재적인 오염물이고, 그러므로 가능하면 연구에서 사용되어야 한다. 그러나, 혈액 및 혈장 제품 내 이 바이러스에 대한 중화 항체가 존재한다는 것은 이의 용도가 이 문제가 발생하지 않는 상황에 제한된다는 것을 의미한다.

돼지 파르보바이러스 (Porcine Parvovirus : PPV) - 외피 비보유(unenveloped), 작은 (~18-25nm), 단일-가닥 DNA 바이러스 (Octapharma AG, Frankfurt, Germany에 의해 제공됨), 이화학 불활성화에 대한 높은 내성을 가짐. 이것은 그러므로 하류 공정 시스템의 클리어런스(clearance) 및 감소 능력에 대한 엄격한 시험을 제공한다. 인간 파르보바이러스 B19 바이러스는 인간 혈장에서 높은 역가로 존재할 수 있고, 그러므로 PPV는 인간 혈장 유래 제품의 검증에 B19에 대한 모델로서 사용될 수 있다. 쥣과 미세 바이러스(Murine Minute virus)와 같은 파르보바이러스와의 재조합 제품 오염 발생에 대한 보고도 있으며, PPV는 이 분류의 바이러스에 대한 모델로서 사용될 수 있다.

소비루스 설사병 바이러스(Bovine Viral Diarrhoea Virus: BVDV ) - 외피 보유(enveloped), 중간-크기(~40-60nm), 단일-가닥 RNA 바이러스 (ATCC VR-534), 이화학 불활성화에 대한 중간 내성을 가짐. BVDV는 C형 간염 및 G형 간염 바이러스도 포함하는 플라비바이러스과에 속한다. BVDV는 그러므로 특히 인간 혈액에서 유래된 제품에서 C형 간염 또는 G형 간염이 우려되는 경우 및 예를 들어 소 유래 물질을 사용하는 경우에 다른 플라비바이러스 및 토가바이러스(Togavirus) 오염물에 대한 적합한 모델 바이러스이다.

유인원 바이러스40 (Simian Virus40 : SV4O ) - 외피 비보유(unenveloped), 작은 (~40nm), 이중-가닥 DNA 바이러스 (ATCC VR-305), 이화학 불활성화에 대한 높은 내성을 가짐. SV40은 하류 공정 및 바이러스를 제거/불활성화하는 그것의 능력의 엄격한 시험을 제공한다. 이 바이러스는 출발 물질에 오염물로서 존재할 수 있는 다른 내성 외피 비보유 바이러스에 대한 모델로 작용하고, 파필로마(papilloma) 및 폴리오마(polyoma) 바이러스 오염물에 대한 모델이다.

본 발명에서, 적어도 HAV, BVDV, 및 SV40이 제거되고, 바람직하게는 각각의 바이러스에 대해 LRF가 2, 3, 4, 5 또는 6 이상이다. PPV는 2, 3 또는 4 이상의 LRF로 제거될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 헤모시아닌 또는 이뮤노시아닌으로부터 다음의 바이러스가 또한 제거된다: 쥣과 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus: MuLV), 수도라비에스 바이러스(Pseudorabies Virus: PRV) 및 레오바이러스 유형 III(reovirus type III: Reo III). 이러한 바이러스들도 각각의 바이러스에 대해 적어도 2 또는 3의 LRFs로 제거된다.

바이러스 여과된 헤모시아닌 서브유닛의 안정화는 동결건조(lyophilisation)의 방법으로 수행될 수 있다. 단백질 용액 (특히 고 분자량 단백질)은 일반적으로 장기간 안정하지 않다. 저장 동안 활성의 손실과 함께 단백질 침전이 일어난다. 안정화 버퍼 시스템에서 또는 냉장 조건 하에 약학적 용도를 위한 적용가능한 용액에서의 저장은 의약품에 요구되는 안정성 (2-3 년)을 만족시키는 KLH 제제를 초래하지 않았다. 완전한 생물학적 활성의 보유 하에 고 분자량 단백질의 동결건조는 부형제(excipients)의 적절한 혼합물과 함께로서만 가능하다. 본 발명에 따르면, 단백질 안정화제, 예를 들어 락토스, 만니톨, 수크로스 등이 사용될 수 있다. 이러한 안정화제들은 정제된 이뮤노시아닌 용액에 100 - 700 mg/ml의 농도를 갖고 각각의 단백질 1 mg당 0.1 ml 내지 1.0 ml의 부피를 갖는 용액으로서 첨가될 수 있다.

동결건조된 KLH 서브유닛은 그들의 완전한 생물학적 활성 및 분자의 무손상에 대해 입증되었다.

바이러스 여과된 헤모시아닌 서브유닛의 안정화는 탈염(desalination)의 방법으로도 수행될 수 있다. 사용으로서, 물을 이용한 정용여과에 의한 탈염을 통해서, 염이 없는 고 농축된 (20 mg/ml) 헤모시아닌 서브유닛 수용액이 냉장 조건하에서 예측 밖의 장기간 안정성을 갖게 한다 (1 - 2 년). 무염 헤모시아닌 서브유닛 용액은 접합 백신의 제조를 위한 이상적인 담체이다.

탈염의 수단 및 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 전형적으로 탈염은 반복 여과 공정에서 여과물의 전도도가 10 μS/cm 이상이거나 잔류물의 전도도가 150 μS/cm 이상이면 수행된다.

무염 헤모시아닌 서브유닛은 그들의 완전한 생물학적 활성 및 분자 무손상에 대해 입증되었다.

헤모시아닌 서브유닛은 천연 헤모시아닌 ("이뮤노시아닌")에 존재하는 양으로 혼합물로서 사용될 수 있고, 또는 단일 서브유닛이 분리되어 분리된 채로 사용될 수 있다.

"합성(synthetic)" 헤모시아닌을 얻기 위하여, 서브유닛의 재회합, 즉 바이러스 여과된 KLH 서브유닛의 재접힙(refolding)이 수행되어야 한다.

헤모시아닌 올리고머, 예를 들어 KLH 다이데카머의 크기 (대략 35 nm)는 거대 바이러스의 동일한 크기에 위치하고 있다. 천연 KLH에 대해 설명된 분리 및 정제 방법 (이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과)은 동물 자원으로부터 유래된 생물학적 산물의 바이러스학적 안전에 대한 확립된 가이드라인에 따라 잠재적인 바이러스 오염에 요구되는 감소 인자를 초래하지 않는다. 헤모시아닌(hemocanin) 서브유닛으로의 해리는 KLH의 경우에 대략 400,000 달톤으로 사이즈를 감소시키고, 단백질이 나노여과에 접근 가능하게 만든다. 재접힘은 버퍼 교환과 함께, 예를 들어 재회합 조건 (pH 7-8, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺) 하에 정용여과 또는 투석에 의해 수행된다. 재회합된 헤모시아닌은 겔 여과에 의해 추가적으로 정제될 수 있다.

재회합을 달성하기 위하여 재회합 버퍼를 헤모시아닌 서브유닛의 혼합물에 첨가한다.

고 분자량 KLH는 재회합 조건, pH 7-8, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺으로의 버퍼 교환 및, 바람직하게는 농축 단계에 의해, 농축된 이뮤노시아닌 용액으로부터 제조된다. 둘 모두 명목 분리(nominal separation) 한계가 50,000 Da인 폴리술폰(polysulfone) 멤브레인을 사용하여 한 단계 이상의 일련의 한외여과 단계에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 추가적인 구체예는 다음과 같다:

1. 하기 단계를 포함하는 연체동물로부터 혈림프 혈청을 제조하는 방법:

a) 저온 마취(cold narcosis) 하에 연체동물의 페달 혈동(pedal blood sinus)을 천공(puncturing)하는 단계.

2. 구체예 1에 있어서, 연체동물은 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)인 것인 방법.

3. 구체예 1 또는 2 중 어느 하나에 있어서, 천공하는 단계 전에 연체동물은 특정 격리 조건하에 유지되고, 유기 사료가 공급되지 않거나 및/또는 수족관 시스템 내 물이 생물학적 오염물질을 제거하는 것에 의하여 정제되는 것인 방법.

4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 천공하는 단계에서 얻은 혈액은 0.2 μm 멤브레인 여과에 의해 멸균하는 것인 방법.

5. 하기의 단계를 포함하는 천연 헤모시아닌 또는 이의 서브유닛의 혼합물을 분리하는 방법:

a) 구체예 1 내지 4 중 어느 하나를 수행하여 얻은 혈림프 혈청을 제공하는 단계,

b) 직접 크로마토그래피를 사용하여 혈림프 혈청으로부터 헤모시아닌을 분리하는 단계.

6. 구체예 5에 있어서, 상기 직접 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피인 것인 방법.

7. 구체예 5 또는 6 중 어느 하나에 있어서, 헤모시아닌을 헤모시아닌 올리고머의 서브유닛으로 해리하는 단계, KLH 서브유닛을 정제하는 단계 및 선택적으로 서브유닛을 헤모시아닌의 올리고머 형태로 재회합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

8. 구체예 7에 있어서, 상기 정제는 잠재적인 생물학적 오염을 제거하기 위하여 나노여과를 사용하여 수행되는 것인 방법.

9. 구체예 7 또는 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 재회합은 정용여과 단계 또는 겔 여과 단계에서 일어나는 것인 방법.

10. 구체예 5 내지 9 중 어느 하나의 방법에 있어서 헤모시아닌은 장기 보관을 위해 안정화 퍼퍼(puffer) 시스템과 혼합되는 것인 방법.

11. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 의해 얻은 혈림프, 구체예 5 내지 10 중 어느 하나에 의해 얻은 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛의 혼합물.

12. 약제로서, 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 의해 얻은 혈림프, 구체예 5 내지 10 중 어느 하나에 의해 얻은 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛의 혼합물.

14. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 의해 얻은 혈림프, 구체예 5 내지 10 중 어느 하나에 의해 얻은 헤모시아닌 또는 헤모시아닌 서브유닛의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물.

15. 암, 바람직하게는 방광암의 치료, 또는 면역자극제 또는 담체로서 사용하기 위한, 구체예 11의 혈림프 또는 구체예 12의 헤모시아닌.

16. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법 및 구체예 5 내지 10 중 어느 하나의 방법을 수행하는 단계 및 선택적으로 그렇게 얻은 재회합된 헤모시아닌을 해리하는 단계를 포함하는 하나 이상의 헤모시아닌 서브유닛을 제공하는 방법.

17. 구체예 16의 방법에 의해 얻은 하나 이상의 헤모시아닌 서브유닛.

18. 구체예 17의 하나 이상의 헤모시아닌 서브유닛을 포함하는 약제. 구체예 17의 하나 이상의 헤모시아닌 서브유닛은 암의 치료 또는 면역자극제로서 사용하기 위한 것일 수 있다.

19. 단백질 제제로부터 바이러스를 제거하기 위한 크로스-플로우 여과(cross-flow filtration)의 용도.

20. 구체예 19에 있어서, 상기 단백질 제제는 100,000 내지 1,000,000 달톤의 단백질을 포함하는 것인 용도.

21. 구체예 19 및 20에 있어서, 크로스-플로우 여과는 15 내지 35 nm의 기공 크기의 필터를 사용하는 것인 용도.

실시예

실시예 1: 메가투라 크레눌라타 ( Megathura Crenulata )의 격리

2002년 2월에 캘리포니아 칼스배드의 우리의 시설에서 생산 활동을 시작한 이후, 우리는 다양한 시기에 13개 배치의 동물을 수집하였다. 수집 사이트 ID는 남부 캘리포니아 어업 차트 (Southern California Fisheries Chart: SCFC)에 정의된 구역 번호이다.

배치(batch) MC-001 내지 MC-013의 동물 수집 동안 캘리포니아의 날씨 조건은 특이하지 않았다. 그러나, 가장 최근 배치의 동물, MC-014를 수집하는 동안, 캘리포니아는 동물 수집 이전에 비정상적인 우기 조건을 겪었으나, 동물 수집 날에는 비가 내리지 않았다.

우리의 시설에서 우리가 활동을 시작한 이래로 시험 방법의 통합이 진화하여 왔음이 지적될 수 있다. 동물, 독성 물질, DDT 및 PCB 시험에 대한 분변계 대장균 시험은 로트(lot)# MC-002로 시작하였다. pH 및 전도도 시험은 모든 로트에 대해 수행되었고, 질산염(nitrate), 아질산염(nitrite) 및 암모니아(ammonia) 시험은 로트# MC-006의 바닷물 샘플에 대해 시작하였다.

바닷물의 pH 및 전도도는 각각 8.0 내지 8.3의 범위 및 45.0 내지 52.4의 범위를 가졌다. 질산염, 아질산염, 암모니아 함량은 각각 0 내지 80 ppm, 0 내지 0.25 ppm 및 0.25 내지 1.0 ppm의 범위였고, 이 범위의 최고치는 로트 MC-014에 대한 값에 상응하며, 이것은 전술한 바와 같이 폭우 직후에 수집된 것이었다. 바닷물 샘플의 분변계 대장균은 MC-002 내지 MC-013에서 수집된 샘플에 대해 2 MPN/100 mL 미만이었고, 가장 최근 로트 MC-014에 대해 29, 11 및 49 MPN이었는데 이는 각각 3가지 물 샘플 "0", "50" 및 "100"에 상응하였다.

DDT 및 PCB 시험 결과는 각각의 검정의 검출 한계 이하임을 나타낸다. 이것은 동물이 수집된 수집 사이트 718 및 719에서 문제가 되지 않는 것으로 보인다.

동물 분변계 대장균 데이터는 분변계 대장균이 로트# MC-002 내지 MC-013에 대해 일반적으로 18 미만이고, 최대 20 MPN/100 그램이었지만, MC-014에 대해 값이 매우 높아서, 3,500 MPN/100 그램이었음을 시사한다. 주변 바닷물 내 분변계 대장균과 함께 이러한 결과는 이들 동물이 분변계 대장균을 모으는 경향이 있음을 시사한다.

동물에서 분변계 대장균에 대한 실험실 결과를 받은 즉시, 우리는 2005년 1월 19일에 동물의 샘플을 우리의 격리 탱크에서 보내기로 결정하였고, 탱크 Q1에서 3마리의 동물, 탱크 Q2에서 3마리를 채집하였다. 이 동물들은 2005년 1월 6일에 우리의 탱크로 받았고, 그러므로 시험 이전에 우리의 탱크 물에 13일 동안 있었다. 우리는 우리의 제조 일정에 포함시킨 격리 절차가 동물 분변계 대장균 함량을 감소시키는 데 효과가 있는지를 결정하기 위해 이 시험을 시작하였다. 시험 레포트의 복사본이 첨부문서로서 우리의 레포트에 첨부되었다. 그 결과는 동물 분변계 대장균이 18 MPN/100 그램 미만이라는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 매우 고무적이며, 가동중인 절차가 로트 MC-014와 함께 존재할 경우 동물 분변계 대장균 함량을 감소시키는 데 효과적임을 시사한다.

동물 및 바닷물에 관련된 데이터의 분석은 다음을 시사한다:

바닷물의 pH 및 전도도는 자연의 바닷물 조건에 대한 정보를 제공하고, 사내에서 제조된 인공 바닷물과 비교하기 위해 유용할 것이다. 우리는 현재 7.5 내지 8.5 및 전도도 46-52 ms/cm의 인공 바닷물 사양을 가진다. 이러한 사양은 자연 바닷물에 대한 범위와 잘 일치할 것으로 보인다.

수집 사이트에서 바닷물에 대한 독소 스크리닝은 받은 동물의 첫 번째 세 로트, 즉 MC-001 부터 MC-004에 대한 외부 동물 건강 검사관으로서 사용된 Merkel & Associates의 Dr. Robert Mooney의 조언에 기초하여 시작하였다. 현재까지의 결과는 DDT 및 PCB는 림펫(limpet)이 수집되어 방출되는 지역에서는 문제가 되지 않음을 시사하였다.

사내 동물 격리 절차는 동물 대장균 함량을 감소시키는 데 도움이 되는 것으로 보이고, 매우 유용한 절차이다. 현재, 제조를 위한 동물 방출은 격리 시작으로부터 최소 7일이 필요하고, MC-014에 대한 동물 분변계 대장균 데이터는 우리의 탱크에서 13일 동안의 동물 홀딩 후 동물에 대해 얻어졌다. 격리 기간 및 분변계 대장균의 감소에 대한 더욱 체계적인 조사를 시작하여, 현재 설정된 사양인 7일이 충분한지 여부를 결정할 필요가 있을 수 있다. 그러한 연구는 MC-014의 경우와 같이 높은 대장균을 갖는 물에서 동물을 수집한 후 시작되어야 한다.

실시예 2: 혈림프 혈청으로부터 천연 헤모시아닌의 직접 크로마토그래피 분리

해양 연체동물의 기원을 기초로 한 혈림프 혈청은, 헤모시아닌 및 다른 혈청 성분 외에도, 높은 수준의 염화나트륨 및 다른 미네랄들을 함유한다. 평균 전도도는 50 ms/cm 정도이다. 이러한 현재 조건 하에서는 KLH는 이온 교환 수지에 결합될 수 없다. KLH의 정량적 결합을 달성하기 위해서 전도도는 20 mS/cm 미만으로 감소되어야 한다.

상기 설명된 바와 같이 전도도를 감소시키기 위하여 혈림프 혈청은 겔 여과, 전기투석, 정용여과 또는 희석과 같은 적절한 방법에 의해 부분적으로 탈염된다. 염의 제거는 다른 혈청 성분 즉 단백질 및 탄수화물의 침전을 이끈다. 침전은 저속 원심분리, 심층 여과 또는 멤브레인 여과 (0.8 u. 0.45μm)에 의해 제거된다.

이어서 콜로이드성 용해된 고분자량 KLH를 크로마토그래피 절차 즉, IEX 크로마토그래피에 의해 분리한 후, 서브유닛의 해리 및 정제를 한다.

헤모시아닌의 해리

방법 1:

천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제한다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합시킨 다음, 컬럼에서 알칼리성 (pH 9.6) 버퍼에서 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)으로 해리한다. 이뮤노시아닌은 염 기울기 용리의 방법으로 컬럼에서 회수한다. 결과로 얻은 이뮤노시아닌 용액은 정용여과 / 한외여과에 의해 탈염하고 농축한다. 농축된 이뮤노시아닌 용액은 그 후 추가적인 IEX 크로마토그래피 단계에 의해 정제될 수 있다.

방법 2:

천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제한다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합시킨 다음, 염 기울기 용리의 방법으로 컬럼에서 회수한다. 결과로 얻은 헤모시아닌 용액은 정용여과, 투석 또는 한외여과의 방법으로 알칼리성 (pH 9.6) 버퍼에서 KLH 서브유닛 (이뮤노시아닌)으로 탈염하고, 농축하고, 해리시킨다. 최종적으로 이뮤노시아닌 용액을 농축하고 추가적인 IEX 크로마토그래피 단계로 정제한다.

방법 1 / 방법 2에서 얻은 헤모시아닌은 해리 버퍼 (pH 9.6, Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이없음)에 용해시킨다. 이것은 알칼리성 조건을 창출하고, 이는 천연 헤모시아닌 분자가 이의 서브유닛으로 해리되게 한다. 이러한 서브유닛의 엔티티(entity)는 이뮤노시아닌으로 불린다.

방법 3:

천연의, 산소-결합 헤모시아닌 단백질을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 혈림프로부터 정제한다. 헤모시아닌은 음이온 교환체에 결합시킨 다음, 염 기울기 용리의 방법에 의해 컬럼에서 회수한다. 결과로 얻은 헤모시아닌 용액의 헤모시아닌을 초원심분리의 방법으로 분리한다. 얻어진 펠렛은 해리 버퍼에 용해시킨다. 최종적으로, 이뮤노시아닌 용액을 농축시키고, 추가적으로 IEX 크로마토그래피 단계로 정제될 수 있다.

이뮤노시아닌 용액의 농축

겔 여과에 의한 최종 정제 (폴리싱) 전에, 이뮤노시아닌 용액을 한외여과에 의해 20 mg/mL (± 2.5 mg/mL)의 단백질 함량으로 농축시킨다. 이 목적을 위해, 스테인리스강 한외여과 유닛에 장착된 저 단백질 결합 폴리술폰(polysulfone) 또는 폴리에테르 술폰(polyether sulfone) 멤브레인 (분리 한계: 30,000 달톤; 필터 영역: ≥ 700 cm²)을 사용한다.

한외 여과 후, 농축된 이뮤노시아닌 용액은 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과한다.

정제 ( 폴리싱 )

농축된 이뮤노시아닌 용액은 최종적으로 겔 여과 컬럼을 통한 중압 액체 크로마토그래피에 의해 정제한다.

실시예 3: 정제된 KLH 서브유닛의 나노여과 ( 이뮤노시아닌 )

천연 KLH의 기원 때문에 인간 병원균에 의한 바이러스 위험이 존재한다. 생물학적 안전을 보장하기 위하여 생물학적 공정의 하류 공정은 잠재적인 바이러스 오염의 불활성화 또는 제거를 위한 단계를 포함해야 한다. 상업적으로 이용가능한 불활성화 방법을 KLH에 대해 시험하였고, KLH 제조 (pH 감소, 열 처리)에 대한 손상 효과 때문에 적절하지 않음을 발견하였다.

나노여과는 이전에 단백질 조성물로부터 다양한 바이러스를 효과적으로 제거하는 것으로 나타났다. 그러나, 나노여과는 헤모시아닌 또는 천연 KLH에 유용하지 않은 것으로 밝혀졌는데, 천연 KLH의 분자량이 8 백만 달톤 이상이기 때문이다. 필터는 바이러스를 단백질로부터 구별할 수 없는데, 즉 단백질은 너무 커서 전형적인 바이러스 필터 (15 내지 35 nm의 기공 크기)의 멤브레인을 통과할 수 없다. KLH 서브유닛의 대략 400,000 달톤의 분자량으로 감소가 영향을 받았다. 서로 다른 기공 크기를 갖는 여러 바이러스 필터를 다운 스케일된 공정에서 시험하였다.

참고예 : 데드 엔드 (Dead End) - 여과 프로토콜, KLH 서브유닛의 바이러스 여과

캘리포니아 씨 달팽이(California see snail)의 혈액에서 얻은 대략 5 mg / ml의 농도의 대략 400 KD의 단백질을 2.0 바(bar)의 일정한 압력으로 데드-엔드 방식에서 플라노바(Planova) 20N, 0.001 m²를 통해 여과하였다. 유속은 0.4 ml/분이었다. 단백질 제제는 글리신(glycine) / NaOH 버퍼에서 pH 9.6에 있었다. 1 g의 출발물질이 적용되었다. 데드-엔드 여과로, 0.5 mg/ml의 농도의 단백질 0.1 g을 얻었고, 즉 단백질 수율은 10%이었다. 또한, 단백질의 시작량 또는 단백질의 농도를 10배 이상 감소시켜도 다른 결과를 초래하지 않았다. 또한, 압력의 감소 또는 크기의 증가는 단백질 수율의 변화를 초래하지 않았다.

작동예 : 크로스- 플로우 여과 프로토콜; KLH 서브유닛의 바이러스 여과

캘리포니아 씨 달팽이(California see snail)의 혈액에서 얻은 대략 0.45 mg/ml의 농도의 대략 400 KD의 단백질을 0.16 바(bar)의 일정한 압력으로 크로스-플로우 방식에서 플라노바(Planova) 20N, 0.12 m²를 통해 여과하였다. 제제는 글리신 및 NaOH의 버퍼에서 pH 9.6에 있었다. 출발물질의 양은 0.45 mg/ml 농도의 5,000 g이었다. 나노여과 후 얻은 단백질 양은 0.42 mg/ml 농도의 4,688 g이었다. 이것은 93%의 수율이다.

이 실시예는 데드-엔드 여과와 대조적으로, 크로스-플로우 여과는 헤모시아닌 단백질이 이의 서브유닛으로 해리될 때 정량적 양의 여과를 가능하게 한다는 것을 입증한다. 알려진 가장 작은 바이러스를 제거하기에 충분한 15 내지 35 nm의 기공 크기의 나노필터가 사용될 수 있다.

실시예 4: 개념의 증명: 타당성 연구

이 실시예는 알려진 가장 작은 바이러스의 지름의 작은 바이러스의 제거에 대한 크로스-플로우 여과의 적합성을 증명한다. 이 실시예에서, PPV가 시험되었다. PPV는 20 nm의 지름을 가지고, 이 바이러스는 단백질당 0.5%의 농도로 스파이킹했다. 이뮤노시아닌은, KLH 서브유닛의 대략 400,000 달톤의 균일한 분자량의 단백질인데, 0.5% PPV와 함께 스파이킹하였다. 사전여과된 총 바이러스 부하는 10,620이었다. 바이러스 스파이킹 후 단백질 양은 4,814.9 g이었다. 나노여과는 플라노바(Planova) 20N 나노필터, 0.12 m² 크로스-플로우 방식에서 수행하였다. 선택된 유속은 0.28 바(bar)의 일정한 압력으로 50 mm/분이었다. 4,662.4 g 단백질이 여과물에 보유되었다. PPV에 대한 LRF는 3.14 +/- 0.32였다. 따라서, 99.9% 이상의 바이러스 제거와 함께 단백질 양은 93% 이상이었다.

이 실시예는 크로스-플로우 여과가 90% 이상의 수율을 갖는 상업적으로 관련된 규모로 무 바이러스 형태로 KLH 또는 KLH 서브유닛의 제조에 적합함을 보여준다.

실시예 5: 탈염을 통한 정제된 KLH 서브유닛의 안정화

원리

KLH BULK LIQUID 무염(salt-free)은 정제된 이뮤노시아닌으로부터 탈염 및 농축에 의해 제조된다. 둘 모두 30,000 Da의 명목 분리 한계를 갖는 폴리술폰 멤브레인을 사용하여 일련의 한외여과 단계에 의해 달성된다.

탈염 배치의 준비

탈염 공정 동안 배치-투-배치(batch-to-batch) 변이를 최소화하기 위하여, 정제된 이뮤노시아닌 용액을 한외여과에 의해 10 mg/ml 내지 40 mg/ml (± 2 mg/ml)의 이뮤노시아닌 함량으로 농축한다. 이 목적을 위해, 스테인리스강 한외여과 유닛에 장착된 저 단백질 결합 폴리술론 또는 폴리에테르 술폰 멤브레인 (분리 한계: 30,000 Da)를 사용한다. 사용 전에, 멤브레인은 알칼리성 해리 버퍼로 +2-8℃에서 재순환에 의해 컨디셔닝(conditioning)한다. 흐름은 연동 펌프에 의해 달성하였다. 최종적으로, 컨디셔닝은 공정 중의 제어 pH 및 박테리아 내독소에 의해 시험된다. 농축 공정을 시작하기 전에, 한외여과 유닛의 온전성(integrity)을 체크한다.

농축

이뮤노시아닌 용액은 이제 한외여과 유닛으로 옮기고, +2-8 ℃에서 재순환한다. 농축은 얻어진 한외여과물의 무게를 재면서 제어한다. 한외여과 유닛의 최대 유입 압력은 1 바(bar), 바람직하게는 0.5 바(bar)를 초과하면 안된다. 이뮤노시아닌 용액은 계산된 양의 여과물이 수집될 때까지 재순환시킨다. 최종적으로, 농축물은 공정 중 제어 pH 값, 삼투압, 전도도, 이뮤노시아닌 함량에 의해 시험된다.

탈염

농축된 이뮤노시아닌 용액 (= 농축된 탈염 배치)는 각각의 한회여과 사이클에서 주입용 물로 1 + 1로 희석하거나 또는 그 대신에 일정 부피 세척 절차를 이용하는 주입용 물을 첨가하여 탈염한다. 탈염 공정은 한외여과물, 농축된 탈염 배치의 무게를 재는 것과 여과물 및 탈염 배치의 전도도를 시험하는 것에 의해 제어된다.

한외여과물의 전도도가 10 μS/cm 미만에 도달하거나, 농축된 탈염 배치의 전도도가 150 μS/cm 미만인 경우, 탈염 공정은 종료되고, KLH BULK LIQUID 무염의 최종 배치를 준비하기 위하여 탈염 배치의 이뮤노시아닌 함량을 결정한다.

KLH BULK LIQUID 무염의 최종 배치의 준비

KLH BULK LIQUID 무염의 최종 배치는 이뮤노시아닌 농축물로부터 20 mg/ml의 이뮤노시아닌 함량으로 희석에 의해 준비한다. 이 목적을 위해, 여과된 이뮤노시아닌 농축물은 무게를 잰다. 주입용 물의 필요한 양은 정확하게 무게를 재고 여과된 이뮤노시아닌 농축물에 천천히 첨가한다. 용액은 부드럽게 혼합하고, 공정 중 제어를 위한 샘플은 pH 값, 밀도, 삼투압, 전도도, 이뮤노시아닌 함량이 제거된다.

방출된 용액은 최종적으로 0.22 μm 멤브레인 필터를 통한 여과에 의해 직접적으로 투입 가방으로 멸균된다.

그들은 +2-8 ℃에서 저장된다.

여과 동안, 품질 제어를 위한 샘플이 제거된다.

실시예 6: 바이러스 여과된 KLH 서브유닛의 재접힘 및 최종 정제.

원리

고 분자량 KLH는 농축된 이뮤노시아닌 용액으로부터 정용여과 (재회합 조건, pH 7 - 8, Ca⁺⁺, Mg⁺⁺으로의 버퍼 교환) 및 농축에 의해 제조한다. 둘 모두, 예를 들어 50,000 Da의 명목 분리 한계를 갖는 폴리술폰 멤브레인을 사용하여 일련의 한외여과 단계에 의해 달성된다.

정제된 이뮤노시아닌 용액의 농축

재회합 조건을 최적화하기 위하여, 정제된 이뮤노시아닌 용액을 20 mg/mL (± 2 mg/mL)의 이뮤노시아닌 함량으로 한외여과에 의해 농축시킨다. 이 목적을 위해, 스테인리스강 한외여과 유닛에 장착된 저 단백질 결합 폴리술폰 또는 폴리에테르 술폰 멤브레인 (분리 한계: 30,000 Da)을 사용한다. 사용 전에, 멤브레인은 다음과같은 용리 버퍼로 컨디셔닝 한다. 한외여과 시스템은 먼저 +2-8 ℃의 온도에서 용리 버퍼로 헹구고, 여과물 배출구는 닫는다. 흐름은 연동 펌프에 의해 달성한다. 최종적으로, 용리 버퍼는 시스템으로부터 완전히 제거한다. 샘플은 공정 중 제어 pH, 박테리아 내독소를 위해서 잔류물 쪽에서 제거한다. 농축 공정을 시작하기 전에, 한외여과 유닛의 온전성(integrity)을 체크한다.

이뮤노시아닌 용액은 이제 한외여과 유닛의 잔류물 백으로 옮긴다. 재순환을 시작하고, 한외여과물은 계량 비퍼에 수집한다. 온도는 +2-8 ℃로 유지한다. 컨디셔닝 동안, 한외여과 유닛의 최대 유입 압력은 1 바(bar)를 초과해서는 안된다. 이뮤노시아닌 용액은 한외여과물의 계산된 양이 수집될 때까지 재순환시킨다. 여과물 출구가 닫혀있는 동안 잔류물을 혼합하고, 샘플은 공정 중 제어 pH 값, 삼투압, 전도도, 이뮤노시아닌 함량을 위해서 제거한다.

재회합

KLH 서브유닛을 재접힘시키기 위하여 스테인리스강 한외여과 유닛에 장착된 저 단백질 결합 폴리술폰 또는 폴리에테르 술폰 멤브레인 (분리 한계: 50,000 Da)을 갖는 제2 한외여과 시스템을 사용한다. 사용 전에, 멤브레인은 다음과 같은 재회합 버퍼로 컨디셔닝한다. 한외여과 시스템은 먼저 +2-8 ℃의 온도에서 재회합 버퍼로 헹구고, 여과물 출구는 닫는다. 흐름은 연동 펌프에 의해 달성한다. 최종적으로, 재회합 버퍼는 시스템으로부터 완전히 제거한다. 샘플은 공정 중 제어 pH, 박테리아 내독소를 위해서 잔류물 쪽에서 제거한다. 재회합 공정을 시작하기 전에, 한외여과 유닛의 온전성(integrity)을 체크한다.

재회합을 위해 한외여과 시스템은 여과물 출구가 닫혀있는 동안 재회합 버퍼 (농축된 이뮤노시아닌 용액의 2배 내지 10배 부피)로 재순환한다. 농축된 이뮤노시아닌 용액은 재순환된 재회합 버퍼에 천천히 주입한다. 전체 재회합 공정 동안 온도는 +2-8 ℃의 온도로 유지한다. 농축된 이뮤노시아닌 용액의 완전한 주입 후 재회합 배치는 일정 부피 세척 절차를 적용한 재회합 버퍼의 2배 내지 10배에 대해 정용여과한다. 최종적으로 배치는 20 mg/ml의 KLH 함량으로 농축한다.

재회합 후, 농축된 KLH 용액은, 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 여과한다.

겔 여과에 의한 재접힘 KLH의 정제

농축된 KLH 용액은 겔 여과 컬럼을 통한 중압 액체 크로마토그래피에 의해 최종적으로 정제한다.

생물학적 활성 및 효능 - 천연 KLH와의 비교가능성

천연 KLH 및 본 발명의 방법에 따라 재회합 후 얻은 합성 KLH를 비교하였다. 합성 KLH 및 천연 KLH는 CD-분광기를 통해 비교하였다. CD-분광기에서 밴드는 동일하였다.

SDS PAGE에서 단백질 밴드는 합성 및 천연 KLH를 비교하였을 때 동일하였다. 합성 KLH에서, 단백질 단편은 발견되지 않았다.

2-차원 면역전기영동 또한 수행하여 합성 및 천연 KLH를 비교하였다. 항-KLH1 및 항-KLH 혈청을 사용하였다. 면역전기영동 패턴은, 천연 및 합성, 둘 모두 KLH에 대해 동일하였다. 두 가지 침전 최대치 (KLH1 및 KLH2에 대해 각각 하나씩)가 천연 및 합성 KLH 모두에 대해 발생한다.

천연 및 합성, KLH 모두의 전자현미경 조사는 전형적인 데카머, 다이데카머, 및 트리데카머를 보여준다.

천연 PAGE 및 밀도 시험은 합성 및 천연 KLH 모두 전형적인 단백질 밴드를 포함함을 나타낸다. KLH1과 KLH2의 비율은 합성 및 천연 KLH 모두에 대해 0.9 내지 1.0 사이에서 얻어졌다.

실시예 7: 음이온-교환 크로마토그래피

헤모시아닌의 분리, 정제 및 인 시투(in situ) 해리를 위해 음이온 교환 크로마토그래피를 선택하였고, 이는 ~ pH 6의 등전점(isoelectric point: pI) 및 pH 7 초과에서의 음전하 때문이다.

소수성 상호작용 분리는 이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography: IEX)에 사용된 것과 다른 조건을 적용하기 때문에 수반된다. 이 분리에서, 높은 이온 강도를 갖는 버퍼, 일반적으로 황산암모늄(ammonium sulfate)은 컬럼에 초기에 적용한다. 버퍼 내 염은 샘플 용질의 용매화를 감소시키므로 용매화가 감소함에 따라, 노출될 소수성 영역이 매질에 의해 흡착된다.

낮은 염 농도를 갖는 헤모시아닌 용액을 사용한 첫 번째 일련의 결합 연구에서 컬럼 (베드(bed) 부피 대략 20 - 50 ml)뿐만 아니라 다른 HIC 컬럼 내에 채워진 서로 다른 강하고 약한 음이온 교환 매체(media)가 결합 능력에 대해 증명되었다.

강하고 약한 음이온 교환 매체는 특이적 결합 특성 및 선택성 때문에 선택되었다:

관류 크로마토그래피를 위한 Poros® 50 미크론(micron) 매체 (HQ - 강한 음이온 교환체, 작용기: 4가화 폴리에틸렌이민(quaternized polyethyleneimine); PI - 약한 음이온 교환체, 작용기: 4가화 폴리에틸렌이민; D - 약한 음이온 교환체, 작용기: 디메틸 아미노 알킬기 DEAE).

Poros® 50 미크론 매체는 용량 또는 분해능을 손상시키지 않으면서 높은 유속을 가능하게 하는 강력한 화학적 안정성, 50 μm의 입자 크기, 및 큰 기공 구조 (대략 6000 Å)때문에 사용되었다.

90 μm 및 34 μm의 입자 크기를 갖는 Q-Sepharose FF 및 HP (강한 음이온 교환체)도 대안적으로 시험되었다. 작용기는 4가 암모늄(quarternary ammonium)으로 존재한다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 시험은 사용할 준비가 된 미리패킹된(prepacked) 컬럼을 포함하는 HiTrap HIC 선별 키트를 사용하여 수행되었다 (HiTrap HIC 페닐 FF 고 서브(high sub) 1 ml, HiTrap HIC 페닐 FF 저 서브(low sub) 1 ml, HiTrap HIC 부틸 FF 1 ml 및 HiTrap HIC 옥틸 FF 1 ml).

요약하면 소수성 상호작용 크로마토그래피 매체로 헤모시아닌의 결합이 거의 없거나 또는 단지 미미한 결합이 얻어질 수 있었다. Q-Sepharose FF 및 HP와 Poros® 매체의 약한 음이온 교환체(PI 및 D)는 중간 약간 미만의 결합을 나타냈다. 겔 ml 당 대략 20 mg KLH의 가장 높은 결합 능력은 Poros® 50 미크론 HQ 매체로 증명되었다.

얻은 결과에 기초하여 출발 물질인 혈림프 혈청으로부터 직접 KLH를 정제하기 위한 개발 작업이 계속되었다.

해양 연체동물로부터의 기원에 기초한 혈림프 혈청은 헤모시아닌 및 기타 혈청 성분 외에도 높은 수준의 염화나트륨 및 기타 미네랄을 함유한다. 평균 전도도는 약 50 mS/cm이다. 이러한 현재 조건하에서 KLH는 선택된 Poros® 50 HQ 매체에 결합될 수 없다.

KLH의 정량적 결합을 달성하기 위하여 혈림프 혈청은 TRIS/HCl 버퍼 (pH 7.4, CaCl₂, MgCl₂ 및 NaCl를 포함), 즉 IEX희석(IEXdilution) 버퍼로 희석하였다. 희석 동안 발생된 침전은 사전여과(prefiltration) 단계에 의해 제거하였다.

4 희석 시리즈를 시험하여 KLH에 대한 Poros® 50 HQ 매체의 결합 능력을 측정하였다 (대략 25 mS/cm, 20 mS/cm, 15 mS/cm 및 10 mS/cm로 희석된 혈림프 혈청). 시험은 Poros® 50 HQ 컬럼 (대략 50 ml 겔)에서 수행되었다. KLH의 용리는 대략 27 mS/cm에서 시작하였다.

유속 샘플: 5 ml/분

유속 용리: 10 ml/분

용리 구배: 0.15 내지 0.65 M 염화나트륨, TRIS/HCl 버퍼 (pH 7.4, CaCl₂, MgCl₂ 및 NaCl를 포함).

결합 연구는 KLH의 정량적 결합을 달성하기 위해 혈림프 혈청이 20 mS/cm 미만으로 희석되어야 함을 보여주었다.

그 다음 대략 19 mS/cm로 희석된 혈림프 혈청으로 추가 시험을 수행하여 샘플 공급 속도에 중독된(addicted) KLH 결합을 최적화하였다. 상술한 조건하에서 4가지 샘플 흐름 (4.0 ml/분, 4.6 ml/분, 5.2 ml/분 및 8.0 ml/분)을 시험하였다. 얻은 결과는 공급 속도 및 음이온 교환 매체의 결합 능력 사이의 상관관계를 증명하였다. 4.0 ml/분의 가장 낮은 유속 (대략 50 cm/h의 직선 유속에 해당)에서 겔 1 ml당 대략 23 mg KLH가 결합되었고, 8.0 ml/분의 가장 높은 유속 (대략 100 cm/h의 직선 유속에 해당)에서도 겔 1 ml당 대략 17 mg KLH의 결합이 달성되어 우수하였다. KLH의 브레이크 쓰루(break through)는 280 및 340 nm에서 UV 검출에 의해 모니터링하였다. 그 후 효과적이고 경제적인 분리 및 정제 공정으로 인한 크로마토그래피 파라미터를 최적화하기 위해 실험실 규모에서뿐만 아니라 스케일 업(scale up)하는 동안 추가적인 실험들을 개시하였다.

또한 인 시투(in situ) 해리를 상술된 크로마토그래피 파라미터를 적용하여 Poros® 50 HQ 컬럼에 포획된 KLH에 대해 시험하였다. TRIS/HCl 버퍼 (pH 7.4, CaCl₂, MgCl₂ 및 NaCl를 포함)로 첫 번째 세척 단계 후에 글리신(NaOH 버퍼 (pH 9.6, NaCl, EDTA 포함)로 버퍼 교환을 수행하였다. 해리 조건하에 컬럼의 세척 동안 KLH의 브레이크 쓰루는 관찰되지 않았다.

KLH 서브유닛 분획물의 용리는 용리 구배 0.075 내지 0.575 M 염화나트륨, 글리신/NaOH 버퍼 (pH 9.6, NaCl, EDTA 포함)를 사용하여 달성되었다.

해리도는 분석용 MPLC/SEC (FPLC®; 분리 컬럼: Superose® 6 HR 10/30, 분자량 분리 범위 5 × 103 - 5 × 106 Da) 및 천연 PAGE의 방법으로 결정하였다. 서브유닛 분획물의 측정은 KLH 서브유닛으로의 거의 정량적인 해리가 컬럼에서 달성되었음을 보여주었다. KLH 서브유닛의 농도 때문에 (대략 20 mg/ml) 여과된 분획물 (0.22 μm 멤브레인 필터)은 다른 추가적인 공정 없이 겔 여과에 의한 추가적인 정제를 위해 사용되었다.

연구 프로그램의 끝에서, 이온 교환 크로마토그래피가 선택된 방법이었다.

Claims

삭제
a) 해양 연체동물로부터 유래된 헤모시아닌 제제를 제공하는 단계;
b) a)에서 제공된 제제의 전도도를 희석 버퍼의 첨가에 의해 30 mS/cm 내지 10 mS/cm의 값으로 감소시키는 단계;
c) 단계 b)에서 얻은 희석된 헤모시아닌 제제를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 첨가하는 단계;
d) 상기 컬럼을 버퍼로 세척하여 헤모시아닌을 정제하는 단계; 및
e) 제2 버퍼의 첨가에 의해 상기 컬럼으로부터 헤모시아닌 또는 이뮤노시아닌을 용리하는 단계를 포함하는 헤모시아닌 또는 이뮤노시아닌을 분리 및/또는 정제하는 방법.
청구항 2에 있어서, 정제를 위한 버퍼는 pH 7 내지 8의 버퍼인 것인 방법.
청구항 2 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 헤모시아닌이 용리되고, 여기에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이온을 포함하는 pH 7 내지 8의 버퍼가 사용되는 것인 방법.
청구항 2 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 이뮤노시아닌이 용리되고, 여기에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺이온이 없는 pH 9 내지 10의 버퍼가 사용되는 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 매트릭스 물질을 포함하고, 상기 매트릭스 물질은 30 ㎛ 이상의 입자 크기의 입자를 포함하는 음이온 교환 매트릭스인 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 음이온 교환 매트릭스는 3,000 내지 8,000 옹스트롬의 기공 크기의 기공을 포함하는 것인 방법.
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