KR101901983B1 - 다층 고분자막 금나노입자, 그 제조방법, 및 그의 용도 - Google Patents

다층 고분자막 금나노입자, 그 제조방법, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 양상은
금 나노입자; 및
상기 금 나노입자 표면상에 BIBB (Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 개시제로 하고 DAMA (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하는 표면개시고분자리빙중합 (SI-ATRP) 반응에 의해 형성된 고분자막을 포함하는 고분자막 금 나노입자, 그 고분자막 금 나노입자 및 항암제를 포함하는 복합체, 그 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물, 및 이들의 제조방법을 제공한다.

Description

다층 고분자막 금나노입자, 그 제조방법, 및 그의 용도{Gold nanoparticles with multi-layers of polymer, a process for the preparation thereof, and a use thereof}
본 발명은 약물 전달용 금 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유전자를 포함한 음이온성 항암제를 보다 효율적으로 부착할 수 있고, 암세포에 대한 세포내 유입 효율이 증가된 약물 전달용 금 나노입자, 그 금 나노입자 및 항암제를 포함하는 복합체, 그 제조방법, 및 그 용도에 관한 것이다.
금 나노입자는 나노입자 표면에 치료용 유전자를 포함한 약물을 부착함으로써 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 그러나, 금 나노입자 표면에 약물을 부착 시 나노입자의 제한적인 표면적 때문에 약물 부착 효율이 현저하게 낮아 문제가 된다. 이를 극복하기 위하여 금 나노입자를 표면 개질한 다음 약물 전달체로서 사용하는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
비특허문헌 1은 옥탄디올-기능화 금 나노입자의 표면에 N,N,N-트리메틸(11-머캅토운데실)암모늄 클로라이드를 금-황반응을 통해 결합시켜 최종적으로 표면이 4급 아민으로 수식된 금 나노입자를 개시하고 있으며, 그 금 나노입자의 표면에 음이온성 DNA를 부착시킴으로써 치료용 유전자 전달용으로서 사용하는 것을 개시한다.
그러나, 이와 같이 금 나노입자 표면에 양이온성 고분자를 수식한 뒤, 유전자를 부착하는 방법은 금 나노입자 표면에 유전자를 직접 부착시키는 방법에 비해 결합 효율이 높지만 마찬가지로 금 나노입자의 제한적 표면적 때문에 유전자의 부착량을 증가시키는데 한계가 있다.
1. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 7626-7629
본 발명의 목적은 약물의 부착 효율 및 암세포에 대한 세포내 유입 효율이 높은 약물 전달용 금 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 금 나노입자 및 항암제의 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 금 나노입자 및 항암제의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 금 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 금 나노입자 및 약물의 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
금 나노입자; 및
상기 금 나노입자 표면상에 BIBB (Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 개시제로 하고 DAMA (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하는 표면개시고분자리빙중합 (SI-ATRP) 반응에 의해 형성된 고분자막을 포함하는 고분자막 금 나노입자를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 고분자막 금 나노입자의 고분자막에 항암제가 부착된, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은 상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은
BIBB를 개시제로 하고 DAMA 및 HEMA를 단량체로 하여 표면개시고분자리빙중합(SI-ATRP) 반응에 의해 고분자막을 금 나노입자 표면상에 형성시키는 고분자막 형성 단계를 포함하고,
상기 고분자막의 형성 단계를 1 회 이상 수행하는 것인, 상기 고분자막 금 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양상은
상기 고분자막 금 나노입자 및 음이온성 항암제를 반응시키는 단계를 포함하는, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 양상에 따른 고분자막 금 나노입자는 고분자막, 특히 다층 고분자막을 통해 음이온성 항암제를 효율적이고 안정적으로 부착하여 복합체를 형성할 수 있고, 상기 복합체는 생체 내에 투여 시 암 세포에 효율적으로 유입될 수 있으며 유입된 후 환원적 환경 하에서 다층 고분자막이 붕괴되어 음이온성 항암제가 유리되어 암세포에 작용할 수 있다. 따라서, 상기 고분자막 금 나노입자는 음이온성 항암제, 특히 항암 유전자의 약물전달체로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 다층 고분자막 금 나노입자를 금 나노입자로부터 제조하는 반응의 모식도이다.
도 2는 c-myc siRNA 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 형성 및 상기 복합체가 암세포에 엔도사이토시스에 의해 유입된 후 암세포에 c-myc siRNA를 전달하여 항암 효과가 나타나는 예상 기전의 모식도이다.
도 3a는 실시예 1에서 제조된 다층 고분자막 금 나노입자의 EF-TEM이미지 (A) 및 MALDI-TOF MS 분석을 통해 분자량을 측정한 결과를 나타낸 그래프(B)이다.
도 3b는 실시예 1에서 제조된 다층 고분자막 금 나노입자의 표면 플라즈몬 공명변화를 UV-Vis spectrophotometer를 이용해 모니터링한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 실시예 1에서 제조된 다층 고분자막 금 나노입자를 10mM DL-DTT로 24시간동안 처리하기 전 및 후의 표면에 고정화된 고분자에 대한 FT-IR 그래프이다.
도 4a는 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자를 10mM DL-DTT로 처리한 다음 유전자 방출 전후의 모양 변화에 대한 TEM(A) 및 ESI-TEM(B) 이미지를 촬영한 사진이다.
도 4b는 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 10mM DL-DTT 처리에 의한 유전자 방출 전후 아가로오스 겔 (1.2%, w/v) 전기영동 결과이다.
도 4c는 siRNA 부착-다층 고분자막 금 나노입자를 RNase존재 하에서 배양 후 siRNA에 대한 전기영동 결과이다.
도 5a는 FTIC-siRNA 부착-다층 고분자막 금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 CLSM 이미지를 촬영한 사진이다.
도 5b는 A549세포내로 유입된 FTIC-siRNA 부착-다층 고분자막 금 나노입자를 ICP-OES 분석에 의해 측정한 정량적 분석 결과를 나타낸 그래프 및 표이다.
도 6a는 c-myc siRNA부착-금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 TUNEL 어세이를 수행한 결과를 촬영한 사진이고;
도 6b는 상기 TUNEL 어세이를 수행한 후 유동세포계수법(flow cytometry)을 통한 TUNEL-양성세포 분포도이며;
도 6c는 c-myc siRNA부착-금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 TRIzol 시약을 이용해 RNA를 추출, cDNA를 합성하고, Real-time PCR을 통해 c-myc 발현 억제 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7의 (A) 및 (B)는 PBS, c-myc siRNA, 및 c-myc siRNA 부착- L3@AuNP의 세 가지 샘플을 고형암 동물 모델에게 정맥 주사한 후 일주일 간격으로 총 4회 정맥주사 하고, 총 28일동안 종양의 크기(A) 및 동물의 무게변화(B)를 모니터링한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7의 (C)는 28일째 상기 고형암 동물 모델의 고형암 이미지이며, 도 7의 (D)는 상기 고형암 동물 모델의 고형암에서의 c-myc 발현을 정량한 결과를 그래프이다.
도 8의 (A)는 Alexa fluor 647-siRNA 부착-금 나노입자를 정맥주사한 동물모델의 주사 6시간과 24시간 후의 금 나노입자 분포에 대한 형광 이미지이고, 도 8의 (B)는 간(1), 폐(2), 심장(3), 비장(4), 신장(5), 및 암(6)에 대한 ex vivo 형광 이미지이다.
도 9는 Alexa fluor 647-siRNA 부착-금 나노입자를 정맥주사한 동물모델의 암조직에 대한 TUNEL 면역염색 이미지이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명자들은 유전자를 포함한 음이온성 항암제를 보다 효율적으로 부착할 수 있고, 암세포에 대한 세포내 유입 효율이 증가된 약물 전달용 금 나노입자를 연구하였으며, 그 결과 금 나노입자의 표면상에 BIBB (Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 개시제로 하고 DAMA (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하는 표면개시고분자리빙중합 (SI-ATRP) 반응에 의해 고분자막을 형성시킬 경우 상기 고분자막에 음이온성 항암제를 보다 효율적으로 부착할 수 있으며, 항암제 부착-금 나노입자가 암세포 내에 용이하게 유입될 수 있고, 암세포 내에 유입 시 내 환원조건에서 고분자막이 붕괴되어 음이온성 항암제가 암세포에 작용할 수 있다는 것을 밝혀냈다. 또한, SI-ATRP 반응을 2회 이상 수행하여 다층 고분자막을 형성할 경우 양이온성 표면이 증가하여 음이온성 항암제의 부착 효율이 더욱 증가하고 암세포내 흡수 효율 또한 더욱 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명은 일 양상에 있어서,
금 나노입자 (AuNP); 및
상기 금 나노입자 표면상에 BIBB (Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 개시제로 하고 DAMA (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하는 표면개시고분자리빙중합 (SI-ATRP) 반응에 의해 형성된 고분자막을 포함하는 고분자막 금 나노입자를 제공한다.
상기 고분자막 금 나노입자는, 상기 SI-ATRP 반응이 2 회 이상 수행되어 복수의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자일 수 있다.
본 명세서에서 "고분자막 금 나노입자"는 SI-ATRP 반응이 1 회 이상 수행되어 1개 이상의 고분자막을 갖는 고분자막 금 나노입자를 의미하며, 2개 이상의 고분자막을 갖는 금 나노입자를 포함하는 것으로 해석되며, 특히 2개 이상의 고분자막을 갖는 것을 "다층 고분자막 금 나노입자"로서 명명한다.
상기 다층 고분자막 금 나노입자는, 상기 SI-ATRP 반응이 2 내지 5회 수행되어 금 나노입자 표면에 2 내지 5개의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자일 수 있다. 상기 SI-ATRP 반응이 5회 초과되어 상기 다층 고분자막 금나노입자의 고분자막이 5 개를 초과할 경우 나노입자의 크기가 너무 커져 암세포에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)가 이루어지지 않을 수 있어 암세포에 용이하게 유입되지 않을 우려가 있다.
일 구체예에서, 상기 다층 고분자막 금 나노입자는 SI-ATRP 반응이 2 내지 3회 수행되어 금 나노입자 표면에 2 내지 3개의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자이다.
상기 다층 고분자막 금 나노입자를 금 나노입자로부터 제조하는 반응의 모식도를 도 1에 나타내었으며, 이에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선 금 나노입자에 디설파이드 개시제인 BIBB(Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 반응시켜 황(thiol)-금(gold) 친화성에 의해 BIBB를 금 나노입자 표면에 고정시키는 1차 개시반응을 수행한다.
1차 개시반응이 완료된 후, 양이온성 기능기를 갖는 단량체인 DAMA(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)와 중성 단량체인 HEMA(2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하여 금 나노입자 표면으로부터 고분자 중합을 진행하여 1차 고분자막을 형성시키는 1차 SI-ATRP반응을 완료한다. 1차 고분자막에는 DAMA와 HEMA가 무작위로 분산되어 있는 형태를 갖는다.
1차 SI-ATRP 반응이 완료되면, 추가적으로 동일한 방식으로 2차 SI-ATRP 반응을 수행할 수 있다. 2차 SI-ATRP 반응의 개시(2차 개시)를 위해 BIBB를 처리함으로써 1차 고분자막에 무작위로 분산되어 있는 HEMA의 수산기와 BIBB의 (2개의 브롬기 중 하나의) 브롬기가 결합하고, 나머지 하나의 브롬기를 시작으로 DAMA 및 HEMA를 단량체로 하여 고분자 중합을 진행하는 2차 ATRP가 진행될 수 있다. 2차 SI-ATRP 후에는 2차 고분자막이 형성된다.
상기 2차 SI-ATRP 반응이 완료되면, 추가적으로 동일한 방식으로 3차 SI-ATRP 반응을 수행함으로써 3차 고분자막을 형성시킬 수 있다.
상기 1차 고분자막, 2차 고분자막, 및 3차 고분자막은 모두 BIBB를 개시제로 하여 BIBB가 결합된 다음에 형성되므로, BIBB 구조 내에 존재하는 디설피드 결합(disulfide bond)에 의해 금 나노입자 또는 기형성된 고분자막에 결합된 형태이다. 따라서, 상기 고분자막이 형성된 다층 고분자막 금 나노입자는 세포 내 유입 시 세포 내 환원조건에서 고분자막을 결합시키는 디설피드 결합이 절단되어 고분자 층들이 붕괴될 수 있는 구조이다.
상기 설명한 바와 같은 순차적인 SI-ATRP 반응에 의해 고분자막을 증식시킬 수 있다.
상기 고분자막 금 나노입자는 SI-ATRP 반응 횟수가 증가함에 따라 고분자 층의 두께가 증가하고, 모양 또한 수지상으로 변화할 수 있으며(실시예 1, 도 3a 참조), ATRP의 회수가 증가함에 따라 전체 나노입자의 크기가 증가되는 것으로 나타났다 (실시예 1, 도 3b 참조). 또한, 상기 고분자막 금 나노입자는 환원 조건에서 고분자막이 붕괴되는 것으로 나타났다 (실시예 1, 도 3c 및 도 4a 참조).
상기 고분자막 금 나노입자는 고분자막이 DAMA의 3급 아민에 의해 양이온성을 나타내므로 음이온성 약물을 정전기적 결합에 의해 부착시킬 수 있으며, 따라서 음이온성 약물에 대한 약물전달체로서 사용될 수 있다. 특히, 나노입자는 EPR (enhanced permeation and retention) 효과에 의해 암 조직에 대한 타겟팅될 수 있으므로, 상기 고분자막 금 나노입자는 항암제를 부착시켜 항암제를 선택적으로 암 조직에 전달하는 약물전달체로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 일 양상에 있어서, 상기 고분자막 금 나노입자의 고분자막에 항암제가 부착된, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 제공한다.
상기 항암제는 상기 고분자막 금 나노입자의 양이온성 고분자막에 부착될 수 있는 임의의 음이온성의 약물일 수 있다. 상기 항암제는 음이온성 화학요법제 또는 항암 유전자일 수 있다.
본 명세서에서는, 상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 "항암제 부착-금 나노입자"또는 "항암제 부착-고분자막 금 나노입자" 와 같은 방식으로 표현하기도 한다.
상기 항암 유전자는 항암 작용을 할 수 있는 임의의 유전자를 포함하며, 예를 들어 siRNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 플라스미드 DNA 등이 있다.
상기 항암유전자는 발암 유전자에 대한 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 발암 유전자로서 공지된 임의의 유전자의 siRNA가 이용될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 항암 유전자는 c-myc 유전자에 대한 siRNA이다. c-myc는 대표적 발암 유전자로 알려져 있으며, 인간 8번 염색체에 존재하는 c-myc 유전자가 14번 염색체로 전좌되어 과잉발현 후 혈액암의 일종인 버킷림프종이 발생한다고 알려져 있으며, 특히 대장암. 유방암, 폐암 등에서 myc 유전자의 대량증폭이 발견되는 것으로 알려져 있다. 따라서, c-myc 유전자에 대한 siRNA가 부착된 고분자막 금 나노입자의 복합체(siRNA 부착-금 나노입자)는 버킷림프종, 대장암, 유방암, 또는 폐암 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
상기 음이온성 화학요법제는 음이온성을 띄어 상기 고분자막 금나노입자에 부착될 수 있는 임의의 화학요법제일 수 있다.
상기 고분자막 금 나노입자의 고분자막에 항암제가 부착된, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체는 표면의 고분자막의 양전하로 인해 생체 내에서의 암세포와의 상호작용에 의해 암세포에 엔도사이토시스에 의해 유입될 수 있다. 상기 항암제로서 c-myc siRNA 및 고분자막 금 나노입자의 복합체가 암세포에 엔도사이토시스에 의해 유입된 후 암세포에 c-myc siRNA를 전달하여 항암 효과가 나타나는 예상 기전의 모식도를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, c-myc의 siRNA가 정전기적 인력에 의해 부착된 고분자막 금 나노입자의 복합체는 생체에 투여 시 표면의 양전하로 인해 종양세포에 세포내 흡수에 의해 유입되며, 종양 세포 내에서는 세포내 환원조건 하에서 금 나노입자 상의 1개 이상의 고분자막이 붕괴되어 c-myc의 siRNA가 유리되어 c-myc의 siRNA가 c-myc mRNA와 결합하여 c-myc mRNA가 분열되어 종양세포가 사멸하는 것으로 예상된다.
일 구체예에서, 상기 고분자막 금 나노입자는 ATRP 횟수가 증가함에 따라 금 나노입자의 양전하정도가 비례하여 증가하는 것으로 확인되었으며, 표면에 중합되는 고분자의 양도 점차적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 고분자 층의 수가 증가함에 따라 고분자의 양 및 양전하도가 증가하기 때문에 강한 정전기적 인력이 발생하여, 금 나노입자로의 siRNA 부착 효율이 향상되는 것으로 확인되었다 (실시예 2 및 표 1 참조).
또한, 고분자막이 3개인 금 나노입자인 L3@AuNP는 유전자가 금 나노입자에 강하게 결합되어 있기 때문에, 전기영동에 의해 유전자가 분리되지 않는 반면, 고분자막이 1개인 L1@AuNP에는 유전자가 약하게 결합되어 분리되는 현상이 관찰되었다. 또한, DTT 처리 후에는, 고분자 층 붕괴에 의해 거의 모든 유전자가 다층 고분자막 금 나노입자로부터 분리됨을 확인하였다 (실시예 2 및 도 4b 참조).
또한, 고분자막 금 나노입자를 고농도의 RNase로 처리하여, 부착되어 있는 siRNA의 결합 안정성을 확인한 결과, 고분자막의 층수가 증가할수록 siRNA의 안정성 유지도가 향상되는 것으로 확인되었다(시험예 2 및 도 4c 참조).
일 구체예에서, 상기 고분자막의 층수가 증가함에 따라 금 나노입자 표면의 높은 양전하로 인해 암세포에 대한 유입 효율이 증가하는 것으로 나타났다 (시험예 및, 도 5a 및 5b 참조). 그러나, 과도하게 층수가 증가할 경우 나노입자의 크기가 너무 커져서 암세포에 의한 엔도사이토시스가 원활하게 이루어지지 않을 우려가 있다.
일 구체예에서, 상기 고분자막 금 나노입자는 항암 유전자가 부착되지 않은 경우에도 고분자막의 층수가 증가함에 따라 금 나노입자의 독성이 다소 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 고분자막의 층수가 증가할수록 나노입자 표면에 강한 양전하가 형성되기 때문인 것으로 여겨지며, 고분자막에 의한 양전하가 세포막과의 상호작용을 증가시키기는 하지만, 너무 강할 경우 세포에 손상을 야기할 수 있기 때문이다. 또한, 항암 유전자 (c-myc siRNA) 부착-다층 고분자막 금 나노입자는 항암유전자가 부착되지 않은 경우에 비해 세포 사멸 효과가 크게 증가하는 것으로 나타났고, 고분자막의 층수가 증가할수록 세포 사멸 효과가 우수한 것으로 나타났으며, 이는 고분자막의 층수가 증가할수록 항암 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 세포내 유입 효율이 높기 때문인 것으로 보인다 (시험예 4 및 도 6a 내지 6c 참조).
따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 고분자막 금 나노입자는 항암제의 부착 효율, 항암제가 부착된 복합체의 결합 안정성, 상기 복합체의 세포 내로의 유입 효율의 측면을 고려할 때, 2개층 이상의 고분자막을 가질 수 있으며, 구체적으로는 2 내지 5개 층의 고분자막, 보다 구체적으로 2 내지 3개 층의 고분자막을 가질 수 있다.
실제로 폐암 마우스 모델에게 본 발명의 일 구체예에 따른 항암 유전자 c-myc siRNA부착-금 나노입자를 투여하고 총 28일동안 종양의 크기 및 동물의 무게변화를 모니터링 한 결과, 고형암 크기 억제 효과가 우수하였으며, 동물 모델의 평균 몸무게의 변화가 크지 않아 항암 유전자 부착-금 나노입자(c-myc siRNA 부착-L3@AuNP)는 독성이 크지 않은 것으로 나타났다. 또한, 28일째 고형암을 수거, 고형암 내 c-myc 발현을 정량한 결과, 현저하게 낮은 c-myc 발현을 나타내어 항암 유전자 부착-금 나노입자에 의해 전달된 c-myc siRNA 에 의해 c-myc 발현이 억제되어 고형암 성장이 억제된 것으로 확인되었다(시험예 5 및 도 7, 8 참조). 또한, 혈관주사 24시간 후, siRNA 부착-L3@AuNP가 암 조직에 집중적으로 축적되는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 고분자막 금 나노입자가 암조직에 대한 선택성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 고분자막 금 나노입자의 고분자막에 항암제가 부착된, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체는 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암 치료용 약학 조성물은 나노입자 자체의 EPR 효과에 의해 암세포에 타겟팅 될 수 있으며, 금 나노입자 상에 형성된 고분자막으로 인해 항암제를 보다 효율적으로 부착시킬 수 있고, 암세포에 보다 효율적으로 유입되어 항암제 효과를 더욱 증진시킬 수 있다.
상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물의 투여량은 구체적인 항암제의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 항암제의 종류에 따라 통상적인 임상실험을 통해 당해 기술분야의 전문가가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 항암제로서 c-myc의 siRNA를 사용할 경우, 1-1000 mg/kg의 투여량으로 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 인종, 성별, 연령, 암의 진행 정도 등에 따라 전문가의 판단에 따라 적절히 가감할 수 있다.
상기 약학 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약학 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 하기 문헌을 참조하면 알 수 있다(Dr. H.P. Fiedler "Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete" [Encyclopaedia of auxiliaries for pharmacy, cosmetics and related fields]).
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서,
BIBB를 개시제로 하고 DAMA 및 HEMA를 단량체로 하여 표면개시고분자리빙중합(SI-ATRP) 반응에 의해 고분자막을 금 나노입자 표면상에 형성시키는 고분자막 형성 단계를 포함하고,
상기 고분자막의 형성 단계를 1 회 이상 수행하는 것인, 상기 고분자막 금 나노입자의 제조방법을 제공한다.
본 양상에 따른 상기 고분자막 금 나노입자의 제조방법의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 상기 고분자막 금 나노입자에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
상기 HEMA의 단량체의 반응 비율은 전체 단량체에 대해 약 10 내지 50 몰%, 보다 구체적으로는 약 20 내지 30몰%일 수 있다. HEMA의 단량체의 반응 비율이 높을수록 양이온성 단량체의 비율이 줄어 양이온성이 낮아지는 결과를 초래할 수 있으며, 반면 HEMA의 단량체의 반응 비율이 낮게 되면 추후 반복하여 수행할 수 있는 SI-ATRP 반응을 위한 히드록시기가 감소되어 SI-ATRP 반응이 어려워질 수도 있다.
상기 제조방법의 일 구체예에에 따른, 상기 다층 고분자막 금 나노입자를 금 나노입자로부터 제조하는 반응의 모식도는 도 1에 나타낸 바와 같다. 구체적인 반응 조건은 당해 기술분야의 통상적인 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 있어서,
상기 고분자막 금 나노입자 및 음이온성 항암제를 반응시키는 단계를 포함하는, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 양상에 따른 상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법의 상세는 상기 본 발명의 일 양상에 따른 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
상기 고분자막 금 나노입자 및 음이온성 항암제를 반응시키는 단계에 의해 상기 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체가 형성되는 일 구체예의 기전이 모식도는 도 2의 상부에 나타내었다. 도 2에 따르면, 상기 고분자막 금 나노입자는 고분자 막에 의해 양이온성을 나타내므로 단지 음이온성 항암제와의 반응 만으로 정전기적 인력에 의해 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체가 형성될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[약어에 대한 설명]
SI-ATRP : 표면 개시 고분자 리빙 중합
BIBB : Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide
DAMA : 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate
HEMA : 2-hydroxyethyl methacrylate
Bpy : 2,2'-bipyridyl
DLS: Dynamic Light Scattering
EF-TEM : Energy-filtering-transmission electron microscopy
ICP-OES : Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy
FT-IR : Fourier transform infrared spectroscopy
MALDI-TOF MS : Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectroscopy
PBS : phosphate buffer saline
DL- DTT : DL-Dithiothreitol
TEM : Transmission Electron Microscope
ESI-TEM : Electron Spectroscopy Imaging TEM
TdT 효소 : Terminal deoxynucleotidyl transferase
BrdUTP : 5-bromo-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate
L1@AuNP : 1층 고분자막 금나노입자
L2@AuNP : 2층 고분자막 금나노입자
L3@AuNP : 3층 고분자막 금나노입자
DAB 용액 : 3,3'-Diaminobenzidine 용액
실시예 1: 금 나노입자의 제작 및 다층 고분자막 금 나노입자의 제작
금 나노입자 (직경 18nm)를 제작하기 위해 1mM HAuCl4 용액 (100ml)을 80도로 가열하고, 38.8mM Trisodium citrate 용액 (5ml)을 첨가하여 10분동안 교반하였다. 상온에서 식혀 반응을 종료하였다.
SI-ATPR를 위해 개시제인 BIBB를 금 나노입자 분산액에 첨가하여 24시간동안 반응시켰다 (금 나노입자 표면의 금 원소 : 개시제 = 1:5 몰비). 반응 후, 여러 번의 원심분리와 수세과정을 통해 반응하지 않은 개시제들을 제거해주었다. 금 나노입자의 표면으로부터 고분자 중합을 위해 단량체인 DAMA와 HEMA (DAMA : HEMA = 4:1 몰비), 촉매인 CuBr과 Bpy를 개시제가 표면에 고정된 금 나노입자 분산액 (DMF/DW/이소프로판올 (1/4/2, v/v/v) 혼합액에 분산)에 첨가한 후, 상온에서 3시간동안 반응시켜 (금 나노입자: 단량체: CuBr: Bpy = 1: 100: 1: 2 몰비), 1층 금 나노입자(L1@AuNP)를 제작하였다.
상기 1차 SI-ATRP 후, 2차 SI-ATPR을 동일하게 수행하여 2층 금 나노입자(L1@AuNP)를 제조하였다. 또한, 2차 SI-ATPR 후 3차 SI-ATPR를 동일하게 수행하여 3층 금 나노입자 (L3@AuNP)를 제작하였다.
시험예 1: 다층 고분자막 금 나노입자의 규명
상기 실시예 1에서 제조된 다층 고분자막 금 나노입자에 대해 크기와 제타전위를 DLS(dynamic light scattering)를 이용해 측정하였다. 모든 샘플들은 30초씩 3회 측정하였으며, 평균 직경과 표준편차를 기록하였다.
금 나노입자의 모양은 EF-TEM을 이용해 관찰하였고, 금 나노입자의 분자량은 MALDI-TOF MS 분석을 통해 측정하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다 (스케일 바=100nm).
금 나노입자의 표면 플라즈몬 공명변화는 UV-Vis spectrophotometer를 이용해 모니터링하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
금 나노입자 표면에 고정화된 고분자의 양은 ICP-OES를 통해 정량하였다(미도시). 또한, 금 나노입자 표면에 고정화된 고분자를 FT-IR을 통해 정성분석하였으며, 금 나노입자를 10mM DL-DTT를 24시간동안 처리한 후 FT-IR을 통해 정성분석하였으며, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.
도 3a의 (A)에 따르면, 금 나노입자의 직경은 약 18nm 이며, ATRP 후 표면에 고분자 층이 관찰되는 것으로 확인되었다. 1차 ATRP를 진행한 금 나노입자인 1층 고분자막 금나노입자(L1@AuNP)의 표면은 고분자 층의 두께가 균일하며, 고분자가 매우 빽빽하게 고정화된 것으로 나타났다. 이에 반해 L2@AuNP 및 L3@AuNP는 고분자 층의 두께가 균일하지 않고, 랜덤하게 표출되어 있는 형태를 나타내었다.
이러한 데이터에 따르면, 본 발명에 따른 고분자막 금 나노입자는 ATRP 횟수가 증가함에 따라 고분자 층의 두께가 증가하고, 모양 또한 수지상으로 변화한다는 것을 알 수 있다.
도 3a의 (B)에 따르면, 다층 고분자막 금 나노입자 표면에 중합된 고분자의 분자량를 측정하기 위해 MALDI-TOF를 진행한 결과, 700-1500Da 사이에서 나오는 시그널들은 개시제 (Mw 704.7)와 개시제와 결합된 고분자 사슬이 이온화되는 과정에서 단편화 된 부분에서 검출되었다고 예상되기 때문에, 표면에 고정화 된 고분자의 주된 시그널은 1700-7000Da 사이에서 넓게 분포된 부분이라고 여겨졌다. ATRP 횟수가 증가됨에 따라 1700-7000Da 사이의 시그널이 더 강해졌으며, L3@AuNP는 3150Da를 기준으로 시그널이 집중되는 양상을 나타내었는데, 이는 ATRP 횟수가 증가하면서 표면에 고정화되는 고분자 사슬의 분자량이 커져 분자량 분포도 점차 커지는 결과를 나타낸 것으로 보여진다.
도 3b에 따르면, 금 나노입자 (직경 18nm)의 최대 흡광값은 527nm로, ATRP 횟수가 증가함에 따라 541nm까지 이동하며, 피크가 약간 넓어지는 현상이 관찰되었다. 이는 ATRP의 회수가 증가함에 따라 전체 나노입자의 크기가 증가되었기 때문인 것으로 보여진다.
도 3c에 따르면, 금 나노입자의 표면에 고정된 고분자를 FT-IR로 정성분석한 결과, L3@AuNP에서는 DAMA에서 유래된 특정 피크들이 관찰되었다. 반면, DTT 처리 후, 고분자에서 유래되는 피크들이 사라졌으며 이는 DTT에 의해 고분자막 간의 디설피드 결합이 절단되어 금 나노입자 표면에서 떨어져 나갔음을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 금 나노입자 표면의 다층 고분자막은 세포 내 환원조건에서 성공적으로 붕괴될 것으로 예상된다.
실시예 2: 다층 고분자막 금 나노입자에 유전자 부착
상기 실시예 1에서 제조된 다층 고분자막 금 나노입자 (22.2g)과 siRNA (15g)을 PBS (pH 7.4, 500l)에서 12시간동안 반응시켰다. 반응 후, 원심분리를 통해 부착되지 않은 siRNA를 수거하고, 260nm에서 흡광을 측정하여 정량한 결과를 토대로 부착효율을 계산하였다. 유전자 부착 전과 부착 후의 금 나노입자의 크기 및 제타전위를 DLS를 통해 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112016041797986-pat00001
또한, 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 유전자 방출 양상을 측정하기 위해 10mM DL-DTT를 24시간동안 처리하였다. 각 유전자 부착-금 나노입자의 siRNA의 방출율을 측정하였으며, 그 결과를 표 1에 함께 나타내었다. 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 10mM DL-DTT 처리에 의한 유전자 방출 전후의 모양 변화는 TEM과 ESI-TEM을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다 (금: 분홍, 인산기: 스카이블루, 스케일 바 = 100nm).
또한, 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 10mM DL-DTT 처리에 의한 유전자 방출 전후 아가로오스 겔 (1.2%, w/v) 전기영동을 진행하였다. 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 10mM DL-DTT 처리 전 후의 아가로오스 겔 전기영동 결과를 도 4b에 나타내었다.
상기 표 1의 결과에 따르면, ATRP 횟수가 증가함에 따라 고분자막의 층수 및 고분자 사슬의 길이가 길어져 나노입자의 전체직경이 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 시트레이트로 환원시켜 금 나노입자를 제작 했기 때문에 금 나노입자 표면은 음전하를 띄는 반면, 1차 ATRP만으로 표면이 높은 양전하로 치환되며 ATRP 횟수가 증가함에 따라 금 나노입자의 양전하정도가 비례하여 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, ATRP 횟수가 증가함에 따라 표면에 중합되는 고분자의 양도 점차적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 고분자막의 층수가 증가함에 따라 고분자의 양 및 양전하도가 증가하기 때문에 강한 정전기적 인력이 발생하여, 금 나노입자로의 siRNA 부착 효율이 향상되는 것으로 확인되었다. siRNA 부착에 의해 나노입자의 전체적 크기가 증가하였으며, 제타전위는 약간 감소하였다. 또한, DTT를 처리하여 고분자 층이 붕괴됨에 따라 siRNA가 방출되는 것으로 확인되었다.
도 4a에 따르면, 다층 고분자막 나노입자의 표면에 고정화 되어 있던 고분자막이 붕괴되어 사라졌으며, 동시에 유전자도 다층 고분자막 금 나노입자로 부터 방출되는 것으로 확인되었다. 또한, 도 4b에 따르면, 유전자 부착 후 L3@AuNP는 유전자가 금 나노입자에 강하게 결합되어 있기 때문에, 전기영동에 의해 유전자가 분리되지 않는 반면, L1@AuNP에는 유전자가 약하게 결합되어 분리되는 현상이 관찰되었다. 또한, DTT 처리 후에는, 고분자 층 붕괴에 의해 거의 모든 유전자가 다층 고분자막 금 나노입자로부터 분리됨을 확인하였다.
시험예 2: 유전자 부착-금 나노입자와 부착된 유전자의 안정성 실험
금 나노입자에 부착된 유전자의 안정성을 확인하기 위해 RNase (200g/ml)를 포함하는 PBS에 실시예 3에서 제작된 유전자 부착-금 나노입자를 첨가한 후, 37도에서 72시간동안 배양하였다. 헤파린 소듐염 (10mg/ml)을 30분동안 처리하여, 고분자 층과 결합되어 있는 siRNA를 분리한 후, 전기영동을 통해 siRNA의 안정성을 측정하였다. 그 결과를 도 4c에 나타내었다.
도 4c는 siRNA 부착-다층 고분자막 금 나노입자를 RNase존재 하에서 배양 후 siRNA에 대한 전기영동 결과이다. 도 4c에 따르면, 고농도의 RNase를 처리하여, 다층 고분자막 금 나노입자에 부착되어 있는 siRNA의 안정성을 확인한 결과, 고분자막의 층수가 증가할수록 siRNA의 안정성 유지도가 향상되는 것으로 확인되었다.
시험예 3: 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 세포 내 유입율
인간 폐암 세포인 A549세포를 12-웰 플레이트에 1x105 세포/웰로 24시간 배양한 후, 여기에 실시예 3과 동일한 방식으로 FTIC-siRNA를 부착한 금 나노입자를 처리하여 3시간 동안 트랜스펙션(transfection)을 진행하였다. 세포를 1% 포름알데하이드로 고정 후, 공초점 레이저스캐닝 현미경 (CLSM)를 통해 세포 내 유입을 관찰하였다. 세포 내 유입된 금 나노입자를 정량하기 위해 세포를 왕수에 완전히 녹여 ICP-OES 분석을 진행하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5a는 FTIC-siRNA 부착-금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 공초점 레이저스캐닝 현미경 (CLSM) 이미지를 촬영한 사진이이며(A549 세포 내로 유입된 FTIC-siRNA(녹색), 스케일 바 = 50νm), 도 5b는 A549세포내로 유입된 FTIC-siRNA 부착-금 나노입자를 ICP-OES 분석에 의해 측정한 정량적 분석 결과를 나타낸 그래프 및 표이다.
상기 도 5에 나타난 바와 같이, A549 암세포에 유전자 부착-금 나노입자를 처리한 후, 세포 내 유입 효율을 측정한 결과, 고분자막 층수가 증가할수록 높은 siRNA 세포 내 유입 효율을 갖는 것으로 나타났다. 이는 고분자 막의 층수가 증가함에 따라 siRNA의 부착 효율이 높아질 뿐만 아니라 나노입자 표면의 높은 양전하로 인해 암세포와의 상호작용이 증가된 것이라고 여겨진다.
시험예 4: 항암 유전자 부착-금 나노입자의 세포 사멸능력 평가
별도로, 세포 내 유입 및 그에 따른 세포 사멸 효과를 확인하기 위해 c-myc siRNA를 부착한 금 나노입자를 상기 시험예 2의 방법과 동일한 방법으로 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 세포의 생사 판별을 위해 MTT 어세이와 TUNEL 어세이를 수행하였으며, TRIzol 시약을 이용해 RNA를 추출, cDNA를 합성하고, Real-time PCR을 통해 c-myc 발현 억제 정도를 측정하였다.
MTT실험을 위해, A549 세포를 12-well plate에 1x105 cells/well로 24시간 배양하고, 여기에 c-myc siRNA 부착-금 나노입자를 다양한 농도로 3시간 동안 처리하였다. 24시간 추가 배양 후, MTT 용액 (5mg/ml 10l)를 3시간 동안 처리하고, 생성된 포르마잔 결정(formazan crystal)을 DMSO에 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
TUNEL 어세이를 위해 A549 세포를 6-well plate에 5x105 cells/well로 24시간 배양한 후, 금 나노입자를 3시간 동안 처리, 24시간 추가 배양 후, 1% 포름알데하이드를 이용해 세포를 고정하고, 70% 에탄올 용액을 처리했다. TdT 효소와 BrdUTP을 포함하는 DNA-라벨링 용액을 처리한 후, 60분동안 반응시켰다. Alexa Fluor 488-labeled anti-BrdU 항체를 처리하고, 상온에서 30분동안 반응시켰다. 염색된 세포는 유동세포계수법과 CLSM을 통해 정성 및 정량 분석을 진행하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6a는 c-myc siRNA부착-금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 TUNEL 어세이를 수행한 결과를 촬영한 사진이고(TUNEL 양성세포는 녹색이고, 세포핵은 적색임, 스케일바 = 100 um), 도 6b는 TUNEL 어세이를 수행한 후 유동세포계수법(flow cytometry)을 통한 TUNEL-양성세포 분포도이며, 도 6c는 c-myc siRNA부착-금 나노입자를 인간 폐암 세포인 A549세포에 트랜스펙션 시킨 후 TRIzol 시약을 이용해 RNA를 추출, cDNA를 합성하고, Real-time PCR을 통해 c-myc 발현 억제 정도를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6에 따르면, 항암 유전자가 부착되지 않은 경우에도 고분자막의 층수가 증가함에 따라 금 나노입자의 독성이 다소 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 고분자막의 층수가 증가할수록 나노입자 표면에 강한 양전하가 형성되기 때문인 것으로 여겨진다. 왜냐하면, 고분자막에 의한 양전하가 세포막과의 상호작용을 증가시키기는 하지만, 너무 강할 경우 세포에 손상을 야기할 수 있기 때문이다.
또한, 항암 유전자 (c-myc siRNA) 부착-다층 고분자막 금 나노입자는 항암유전자가 부착되지 않은 경우에 비해 세포 사멸 효과가 크게 증가하는 것으로 나타났으며, 고분자막의 층수가 증가할수록 세포 사멸 효과가 우수한 것으로 나타났다. 이는 c-myc 유전자 발현이 c-myc siRNA에 의해 현저하게 감소됨에 따라 효과적인 세포 사멸 유도되는 것이며, 고분자막의 층수가 증가할수록 항암 유전자 부착-다층 고분자막 금 나노입자의 세포내유입 효율이 높기 때문인 것으로 보인다.
시험예 5 : 항암 유전자 부착-금 나노입자의 in vivo 항암효과 평가
1x107세포/동물 농도의 A549 인간 폐암세포를 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 대퇴부에 주사하여 이종이식 고형암 동물 모델을 제작했다. 종양의 크기가 40-50mm3/종양에 이르렀을 때, PBS, c-myc siRNA, c-myc siRNA 부착-L3@AuNP의 세가지 샘플을 정맥 주사하였다. 일주일 간격으로 총 4회 정맥주사 하였으며, 총 28일동안 종양의 크기 및 동물의 무게변화를 모니터링 하였다.
28일째 되는 날, 종양을 수거하고, 종양조직으로부터 RNA을 추출한 후, real-time PCR을 통해 종양 내 c-myc 발현을 정량 분석하였다. 또한, 수거한 종양 조직을 파라핀 블럭으로 제조하여, 면역염색을 진행하였다. 탈수 및 재수화한 조직에 TUNEL 반응 혼합물을 60분동안 처리하였다. 3회 수세 후, 컨버터-POD 용액을 30분동안 처리하고, DAB 용액을 10분동안 처리하여 발색을 진행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 (A) 및 (B)는 PBS, c-myc siRNA, 및 c-myc siRNA 부착-L3@AuNP의 세 가지 샘플을 고형암 동물 모델에게 정맥 주사한 후 일주일 간격으로 총 4회 정맥주사 하고, 총 28일동안 종양의 크기(A) 및 동물의 무게변화(B)를 모니터링한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 7의 (C)는 28일째 고형암 동물 모델의 고형암 이미지이며, 도 7의 (D)는 고형암 동물 모델의 고형암에서의 c-myc 발현을 정량한 결과를 그래프이다.
별도로, 금 나노입자의 조직 별 분포를 확인하기 위해 Alexa Fluor 647로 표지 된 siRNA를 L3@AuNP에 부착한 후, 정맥 주사하여 IVIS를 통해 6시간과 24시간 째 금 나노입자의 분포를 형광 이미징하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 (A)는 Alexa fluor 647-siRNA 부착-금 나노입자를 정맥주사한 동물모델의 주사 6시간과 24시간 후의 금 나노입자 분포에 대한 형광 이미징 사진이고, 도 8의 (B)는 간(1), 폐(2), 심장(3), 비장(4), 신장(5), 및 암(6)에 대한 ex vivo 형광 이미지 사진이다.
도 9는 Alexa fluor 647-siRNA 부착-금 나노입자를 정맥주사한 동물모델의 28일째 암조직에 대한 TUNEL 면역염색 이미지이다(사멸 세포 (갈색), 핵염색 (파랑). 스케일 바=100νm).
도 8에 따르면, 인간 폐암세포 이종이식 누드 마우스 암모델에 항암유전자 부착-금 나노입자를 혈관주사로 주입한 결과, 대조군으로 PBS만 주입한 그룹은 고형암의 크기가 28일동안 꾸준히 증가한 반면, c-myc siRNA 및 c-myc siRNA 부착-L3@AuNP는 효과적으로 고형암 크기 증가를 억제시켰으며, 특히 c-myc siRNA 부착-L3@AuNP의 고형암 크기 억제 효과가 가장 우수하였다. 또한, 동물 모델의 평균 몸무게의 변화가 크지 않은 것으로 미뤄 볼 때, 항암 유전자 부착-금 나노입자(c-myc siRNA 부착-L3@AuNP)는 독성이 크지 않은 것으로 여겨졌다.
또한, 28일 째, 고형암을 수거, 고형암 내 c-myc 발현을 정량한 결과, 항암유전자 부착-금 나노입자를 주사한 그룹에서 현저하게 낮은 c-myc 발현을 나타내었다. 따라서, 항암 유전자 부착-금 나노입자에 의해 전달된 c-myc siRNA 에 의해 c-myc 발현이 억제되어 고형암 성장이 억제된 것으로 확인되었다.
또한, 도 8 및 9에 따르면, 혈관주사 24시간 후, siRNA 부착-L3@AuNP가 암 조직에 집중적으로 축적됨되는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 고분자막 금 나노입자가 암조직에 대한 선택성이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (18)

  1. 금 나노입자; 및
    상기 금 나노입자 표면상에 BIBB (Bis[2-(2-bromo isobutyryloxy) undecyl] disulfide)를 개시제로 하고 DAMA (2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) 및 HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)를 단량체로 하는 표면개시고분자리빙중합 (SI-ATRP) 반응에 의해 형성된 고분자막을 포함하는 고분자막 금 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 표면개시고분자리빙중합(SI-ATRP) 반응이 2 회 이상 수행되어 복수의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 표면개시고분자리빙중합반응은 2 내지 5회 수행되어 금 나노입자 표면에 2 내지 5개의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 표면개시고분자리빙중합반응은 2 내지 3회 수행되어 금 나노입자 표면에 2 내지 3개의 고분자막이 형성된 것인 다층 고분자막 금 나노입자.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 고분자막 금 나노입자의 고분자막에 항암제가 부착된, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 항암제는 음이온성 화학요법제 또는 항암 유전자인 것인 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 발암 유전자에 대한 siRNA인 것인 금 나노입자의 복합체.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 c-myc 유전자에 대한 siRNA인 것인 금 나노입자의 복합체.
  9. 제 5 항에 따른 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 항암제는 음이온성 화학요법제 또는 항암 유전자인 것인 암 치료용 약학 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 발암 유전자에 대한 siRNA인 것인 암 치료용 약학 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 c-myc 유전자에 대한 siRNA인 것인 암 치료용 약학 조성물.
  13. 제 9 항에 있어서, 주사제인 것인 암 치료용 약학 조성물.
  14. BIBB를 개시제로 하고 DAMA 및 HEMA를 단량체로 하여 표면개시고분자리빙중합(SI-ATRP) 반응에 의해 고분자막을 금 나노입자 표면상에 형성시키는 고분자막 형성 단계를 포함하고,
    상기 고분자막의 형성 단계를 1 회 이상 수행하는 것인, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 고분자막 금 나노입자의 제조방법.
  15. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 고분자막 금 나노입자 및 음이온성 항암제를 반응시키는 단계를 포함하는, 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 항암제는 음이온성 화학요법제 또는 항암 유전자인 것인 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 발암 유전자에 대한 siRNA인 것인 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 항암 유전자는 c-myc 유전자에 대한 siRNA인 것인 항암제 및 고분자막 금 나노입자의 복합체의 제조방법.
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