KR101900258B1 - 효소처리 로얄젤리 제조방법 및 효소처리 로얄젤리 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로얄젤리를 단백분해효소로 처리하여 효소처리물을 얻는 효소처리단계를 포함하고, 상기 단백분해효소는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 엔도형 단백분해효소를 포함하는 효소처리 로얄젤리 제조방법과 그 제조방법에 의해 제조된 효소처리 로얄젤리를 제공한다. 본 발명에 의해, 항산화능과 같은 기능성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 항산화능과 같은 기능성이 우수하다. 또한, 본 발명에 의해, 안식각, 인습성, 및 용해성과 같은 제제화를 위한 물성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 제제화를 위한 물성이 우수하다.
Description
본 발명은 효소처리 로얄젤리 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 활성을 나타내는 효소처리 로얄젤리를 용이하게 제조할 수 있는 로얄젤리 제조방법 및 그를 이용하여 제조한 로얄젤리에 관한 것이다.
로얄젤리는 꿀과 화분을 일벌들이 소화 흡수한 뒤 인두부를 경유해서 만들어진 물질로 봉군 내 어린 유충 및 여왕벌 유충의 먹이로 사용된다. 로얄젤리는 신맛이 강하고 향이 있는 하얀 젤리 모양을 하고 있으며, 단백질이 풍부하고 특이 지방산 10-hydroxy-2-decenoic acid(10-HDA)을 포함하는 것 외에 비타민 및 판토텐산 등이 함유되어 있다.
특히, 10-HDA는 면역활성 등을 나타내는 것으로 알려져 있다(대한민국 특허 공개공보 제10-2016-0042538호 참조).
이와 같은 로얄젤리를 보다 효과적으로 사용하기 위해서는, 로얄젤리의 기능성을 향상시키고, 제품화에 유리한 물성을 확보할 필요가 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 하나의 과제는 기능성이 우수한 효소처리 로얄젤리 제조방법을 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 하나의 과제는 기능성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 효소처리 로얄젤리 제조방법은 로얄젤리를 단백분해효소로 처리하여 효소처리물을 얻는 효소처리단계를 포함하고, 상기 단백분해효소는 엔도및엑소형 단백분해효소, 엑소형 단백분해효소, 및 엔도형 단백분해효소를 포함한다.
상기 엔도및엑소형 단백분해효소는 진균성(fungal) 엔도및엑소형 단백분해효소이고, 상기 엑소형 단백분해효소는 진균성 엑소형 단백분해효소이며, 상기 엔도형 단백분해효소는 세균성(bacterial) 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소 또는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소일 수 있다.
상기 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소는 진균에서 유래된 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소일 수 있다.
상기 진균은 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)일 수 있다.
상기 진균성 엑소형 단백분해효소는 루신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 메탈로엔도펩티다아제(metalloendopeptidase) 또는 세린프로테아제(serineprotease) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 메탈로엔도펩티다아제는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 세린프로테아제는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
상기 메탈로엔도펩티다아제는 바실로라이신(bacillolysin)일 수 있다.
상기 세린프로테아제는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 진균성 엑소형 단백분해효소는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 중에서 선택된 하나 이상으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 중성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 단백분해효소는 1 내지 10중량부일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 단백분해효소는 3중량부일 수 있다.
상기 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소 100중량부에 대하여, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소 100중량부이고, 상기 진균성 엑소형 단백분해효소 100중량부일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어질 수 있다.
상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 500 내지 1000중량부일 수 있다.
상기 용매는 물일 수 있다.
상기 처리는 상기 로얄젤리를 상기 단백분해효소와 가압조건 0.5 내지 1 atm에서 접촉시키는 접촉단계를 포함할 수 있다.
상기 접촉은 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 실시하는 것일 수 있다.
상기 접촉은 4차처리온도 섭씨 55도에서 처리하는 4차 처리단계를 더 포함하여 실시하는 것일 수 있다.
상기 효소처리물은 상기 단백분해효소가 불활성화된 불활성화효소처리물일 수 있다.
상기 불활성화는 가열처리에 의한 것일 수 있다.
상기 가열처리는 15 내지 30분간, 섭씨 70 내지 90도로 상기 단백분해효소를 가열하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어지고, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 500 내지 1000중량부이며, 상기 불활성화는 가열처리에 의한 것으로, 상기 가열처리는 15 내지 30분간, 섭씨 70 내지 90도로 상기 단백분해효소를 가열하여 이루어지는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 1000중량부이고, 상기 불활성화는 가열처리에 의한 것으로, 상기 가열처리는 15분간 섭씨 90도로 상기 단백분해효소를 가열처리하여 이루어지는 것이거나, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 500중량부이고, 상기 불활성화는 가열처리에 의한 것으로, 상기 가열처리는 30분간 섭씨 70도로 상기 단백분해효소를 가열처리하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 처리는 용매 중에서 이루어지며, 상기 제조방법은 상기 효소처리물을 후처리하는 후처리단계를 더 포함하고, 상기 후처리단계는 상기 효소처리물을 농축하여 농축물을 얻는 농축단계; 및 상기 농축물을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 동결건조단계를 포함할 수 있다.
상기 용매는 물일 수 있다.
상기 농축은 감압농축일 수 있다.
상기 감압농축은 섭씨 40 내지 65도에서, 보다 바람직하게는 섭씨 47 내지 65도에서 실시하는 것일 수 있다.
상기 감압농축은 100 내지 300 mbar, 바람직하게는 110 내지 300 mbar, 보다 바람직하게는 300 mbar의 압력으로 실시하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 1000중량부이고, 상기 감압농축은 섭씨 60도에서, 110mbar의 압력으로 실시하는 것이거나, 상기 로얄젤리 100중량부에 대하여 상기 용매는 500중량부이고, 상기 감압농축은 섭씨 47도에서, 300mbar의 압력으로 실시하는 것일 수 있다.
상기 효소처리 로얄젤리는 항산화 활성을 갖는 효소처리 로얄젤리인 효소처리일 수 있다.
또한, 본 발명의 효소처리 로얄젤리는 본 발명의 효소처리 로얄젤리 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
본 발명에 의해, 항산화능과 같은 기능성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 효과적으로 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 항산화능과 같은 기능성이 우수하다. 또한, 본 발명에 의해, 안식각, 인습성, 및 용해성과 같은 제제화를 위한 물성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 제제화를 위한 물성이 우수하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예를 설명하기 위한 순서도이다.
도 2는 인습성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 인습성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다. 또한, "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
이하, 실시예 및 실험예에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다. 이하의 실험결과에 대해서는 필요시, 평균과 표준편차를 구하였고, 통계적인 유의성을 검정하였다.
도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법, 효소처리 로얄젤리 각각에 대해 보다 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법을 설명하기 위한 순서도이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법은 로얄젤리를 단백분해효소(protease 또는 peptidase)로 처리하여 효소처리물을 얻는 효소처리단계를 포함하여 이루어진다. 이 때, 단백분해효소는 엔도및엑소형 단백분해효소, 엑소형 단백분해효소, 및 엔도형 단백분해효소, 보다 바람직하게는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 엔도형 단백분해효소를 포함하여 이루어진다. 이와 같은 조합에 의해 후술하는 바와 같이, 항산화 활성 등이 우수한 효소처리 로얄젤리를 얻을 수 있게 된다. 따라서, 효소처리 로얄젤리는 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다. 효소처리를 위한 로얄젤리와 단백분해효소는 도 1에 도시된 바와 같이 원료를 준비하는 준비단계를 통해 준비될 수 있으며, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 이 때, 엔도및엑소형 단백분해효소는 엔도펩티다제와 엑소펩티다제 활성을 모두 갖는 단백분해효소로, 엔도펩티다제와 엑소펩티다제가 혼합되거나 컴플렉스 상태일 수 있다. 이와 달리, 엑소형 단백분해효소는 엑소펩티다제 활성만을 나타내는 것이고, 엔도형 단백분해효소는 엔도펩티다제 활성만을 나타내는 것이다.
보다 바람직하게는, 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소 또는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소 중에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 상기 세균성 엔도형 단백분해효소는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소일 수 있다.
진균성 엔도및엑소형 단백분해효소는 예를 들어, 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소일 수 있으며, 시판예는 Probeef 2000P, Sumizyme FP-G 등일 수 있다. 아미노펩티다아제와 카르복시펩티다아제 혼합효소는 진균에서 유래된 것일 수 있으며, 이와 같은 진균은 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)일 수 있다. 시판예는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 아미노펩티다아제(aminopeptidase)와 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase) 혼합효소를 포함한다.
또한, 진균성 엑소형 단백분해효소는 예를 들어, 루신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)일 수 있으며, 시판예는 Prozyme 2000P 등일 수 있다. 루신아미노펩티다아제는 진균에서 유래된 것일 수 있으며, 이와 같은 진균은 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)일 수 있다. 시판예는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 유래된 루신아미노펩티다아제(leucyl aminopeptidase)를 포함한다.
또한, 세균성 엔도형 단백분해효소는 예를 들어, 메탈로엔도펩티다아제(metalloendopeptidase) 또는 세린프로테아제(serineprotease)일 수 있다. 메탈로엔도펩티다아제는 예를 들어, 바실로라이신(bacillolysin)일 수 있으며, 시판예는 Alphalase NP 등일 수 있다. 또한, 세린프로테아제(serinprotease)는 예를 들어, 서브틸리신(subtilisin)일 수 있으며, 시판예는 Foodpro alkaline protease 등일 수 있다. 이와 같은 메탈로엔도펩티다아제는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소의 일 종일 수 있다. 또한, 세린프로테아제는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소의 일 종일 수 있다.
세균은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)일 수 있다.
즉, 세균성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 것일 수 있다.
보다 바람직하게는, 세균성 중성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로부터 유래된 것(예, 바실로라이신)일 수 있다.
또한, 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 유래된 것(예, 서브틸리신)일 수 있다.
이 때, '로부터 유래된'은 '배양액으로부터 얻어진'을 포함하는 의미이다.
로얄젤리 100중량부에 대하여 단백분해효소는 1 내지 10중량부일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3중량부일 수 있다. 이와 같은 범위 미만에서 효소활성이 불충분할 염려가 있고, 초과시 효소량대비분해율이 감소할 염려가 있다. 이 때, 로얄젤리 100중량부에 대하여 단백분해효소 3중량부는 중량기준으로 로얄젤리 100에 대하여, 단백분해효소 3의 비율임을 의미한다. 이하, '중량부' 역시 이와 동일한 방식으로 해석될 수 있다.
또한, 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소 100중량부에 대하여, 세균성 엔도형 단백분해효소는 100중량부이고, 진균성 엑소형 단백분해효소는 100중량부일 수 있다.
단백분해효소로 처리시, 처리는 용매 중에서 이루어질 수 있으며, 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매는 500 내지 1000중량부일 수 있다. 이 때, 용매는 물일 수 있다. 이와 같이, 로얄젤리의 양에 따라 용매의 비율을 달리할 수 있다. 즉, 상대적으로 다량의 로얄젤리에는 용매의 비율을 낮추고, 상대적으로 소량의 로얄젤리에는 용매의 비율을 높일 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 다량인 로얄젤리에는 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매는 500중량부일 수 있고, 상대적으로 소량인 로얄젤리에는 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매는 1000중량부일 수 있다. 이와 같이, 상대적으로 소량인 로얄젤리에는 상대적으로 높은 비율의 용매를 첨가하여 단백분해효소가 로얄젤리와 충분히 접촉되도록 할 수 있다. 또한, 상대적으로 다량인 로얄젤리에는 상대적으로 낮은 비율의 용매를 첨가하여도 절대적인 용매량 면에서 단백분해효소가 로얄젤리와 접촉하기에 충분하게 된다. 로얄젤리에 대한 용매의 비율을 줄임으로써, 처리장치의 규모를 줄일 수 있고, 에너지 소모 역시 줄일 수 있게 된다.
또한, 로얄젤리 단백분해효소 처리는 로얄젤리를 단백분해효소와 가압조건 0.5 내지 1atm, 보다 바람직하게는 0.5atm에서 접촉시키는 접촉단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 범위 미만이나 초과시 유리아미노산함량이 불충분하거나 항산화 활성이 불충분할 염려가 있다.
이와 같은 접촉은 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 실시하는 것일 수 있다. 또한, 이와 같은 접촉은 4차처리온도 섭씨 55도에서 처리하는 4차 처리단계를 더 포함하여 실시하는 것일 수 있다. 1차 처리단계 이후 2차 처리단계를 실시하고, 2차 처리단계 이후 3차 처리단계를 실시한다. 4차처리단계는 3차 처리단계 이후 실시한다.
보다 바람직하게는, 1차처리온도는 섭씨 55도이고, 2차처리온도는 섭씨 45도이며, 3차처리온도는 섭씨 50도일 수 있다.
이 때, 1차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하고, 상기 2차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하며, 상기 3차 처리는 1 내지 5시간, 보다 바람직하게는 3시간 동안 실시하는 것일 수 있다.
또한, 4차처리는 총 처리시간 24시간에서 1차, 2차, 및 3차 처리시간을 뺀 나머지 시간 동안 실시하는 것일 수 있다.
이와 같은 온도 조건의 범위 미만이나 초과시 유리아미노산함량이 불충분하거나 항산화 활성이 불충분할 염려가 있다.
효소처리물은 단백분해효소가 불활성된 불활성화효소처리물일 수 도 있다. 즉, 과잉의 단백분해효소를 가열 등의 방법에 의해 불활성화시킨 상태일 수 있는 것이다. 불활성화는 가열에 의할 수 있으며, 가열은 예를 들어, 바람직하게는 섭씨 70 내지 90도에서 실시할 수 있다. 또한, 가열시간은 바람직하게는 15 내지 30분일 수 있다. 즉, 불활성화는 15 내지 30분간, 섭씨 70 내지 90도로 가열처리하여 이루어지는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매 1000중량부일 때, 15분간 섭씨 90도로 가열할 수 있다. 또한, 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매 500중량부일 때, 30분간 섭씨 70도로 가열할 수 있다. 이와 같이, 로얄젤리에 대한 용매의 비율에 따라 가열 조건을 달리할 수 있다. 용매의 비율이 클 경우 보다 높은 온도에서 단시간 처리하고, 용매의 비율이 작을 경우 보다 낮은 온도에서 장시간 처리하여 효소를 불활성화할 수 있다. 또한, 상대적으로 낮은 온도에서 불활성화되는 경우, 탄화현상 또는 열변성 등도 보다 효과적으로 방지될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이 후처리단계를 더 포함할 수 있다. 후처리단계는 효소처리물을 후처리하는 단계로, 효소처리물은 용매(예, 물 등) 중에서 처리된 것일 수 있다. 후처리단계는 효소처리물을 가열건조, 분무건조, 동결건조하거나, 농축후가열건조, 농축후분무건조, 농축후동결건조할 수 있다. 농축후동결건조의 경우, 구체적으로 농축단계; 및 동결건조단계를 포함할 수 있다.
농축단계는 효소처리물을 농축하여 농축물을 얻는 단계로, 농축은 감압농축 등일 수 있다. 감압농축은 예를 들어, 섭씨 40 내지 65도에서 실시하는 것일 수 있다. 또한, 감압농축은 100 내지 300 mbar, 바람직하게는 110 내지 300 mbar의 압력에서 실시하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는, 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매 1000중량부일 때, 섭씨 60도에서, 110mbar의 압력으로 실시할 수 있다. 또한, 로얄젤리 100중량부에 대하여 용매 500중량부일 때, 섭씨 47도에서, 300mbar의 압력으로 실시할 수 있다. 이와 같이, 로얄젤리에 대한 용매의 비율에 따라 감압농축 조건을 달리할 수 있다. 용매의 비율이 작을 경우 보다 낮은 온도와 상대적으로 고압에서 처리하여 농축할 수 있다. 이와 같이, 상대적으로 낮은 온도와 고압인 조건은 그보다 높은 온도와 저압 조건의 유지를 위해 소모되는 에너지에 비해 에너지 소모가 적으므로, 보다 더 바람직할 수 있다. 또한, 상대적으로 낮은 온도에서 농축됨에 따라 탄화현상 또는 열변성 등도 보다 효과적으로 방지될 수 있다.
동결건조단계는 농축물을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 단계로, 동결건조기 등으로 실시할 수 있다. 동결건조는 예를 들어, 동결건조기로 특정 조건(선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)에서 실시할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법에 의해 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리가 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법, 및 효소처리 로얄젤리에서 언급된 내용은 서로 모순되지 않는 한 동일성 범위에서 서로 동일하게 적용된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 효소처리 로얄젤리 제조방법 및 효소처리 로얄젤리에 관하여, 이하의 실시예 및 실험예에서 보다 상세히 설명한다.
<효소처리 로얄젤리 제조 I> 실시예 1 내지 2, 비교예 1 내지 3
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 1000중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 실시예 1의 경우는 동결건조 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 단백분해효소 3중량부인 예이다. 그 후, 섭씨 55도에서 24시간 동안 혼합하여 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하였다. 열처리 종료 후, 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여 분말화하였다. 이와 같은 방법으로, 실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 3의 로얄젤리 분말을 제조하였다.
[표 1]
표 1의 단백분해효소는 (주)비전바이오켐(대한민국)에서 구입한 것으로, PB는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소에 해당하는 probeef 2000P를 나타내고, ANP는 세균성 중성 엔도형 단백분해효소에 해당하는 Alphalase NP를 나타내고, PR은 진균성 엑소형 단백분해효소에 해당하는 Prozyme 2000P를 나타내며, FP는 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소에 해당하는 Foodpro Alkaline protease를 나타낸다.
<실험예 1> 실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4
실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4의 로얄젤리에 대하여, 총 유리아미노산 등을 후술하는 방법으로 측정하였다. 비교예 4는 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD)을 사용하였다.
<총 유리아미노산 측정법>
총 유리아미노산 측정법은 시료 1g에 증류수9mL을 첨가하여 섭씨 100도 워터배쓰에서 1시간 동안 가열처리한 후 원심분리(12000rpm, 10분)하여 상등액을 취하고 0.2마이크로미터 시린지 필터(PTFE, hydrophilic, adventech)로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 표준물질 제조는 아미노산 17종에 대한 표준원액(Cat #012506H, 0.25uM/mL, Pikering)을 0.1N HCl로 각각 1/2, 1/4, 1/8배로 희석하여 각각의 표준원액 및 표준용액을 동량 주입하여 표준곡선을 작성하였다. HPLC 분석(Dionex ultimate 3000)은 Cation ionexchange 컬럼을 이용하여 다음과 같은 조건으로 분석을 진행하였다(표 2).
[표 2]
<DPPH 항산화 활성 소거능(%) 측정법>
시료의 DPPH 라디칼 소거능 측정은 Quang et al.(2003)의 방법을 이용하여 실시하였다. 이 방법은 항산화활성을 측정하기 위한 방법으로, 화학적으로 안정화된 프리라디칼을 갖는 수용성 물질인 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)는 517nm 부근에서 최대 흡광도를 가지며, 전자를 받으면 흡광도가 감소하여 다시 산화되기 어려워지는 특성을 활용한 방법이다. 시료는 10mg을 칭량하여 메탄올 1mL에 용해시켜 준비한다(10mg/mL). 에탄올에 용해시킨 0.4mM DPPH 용액 0.1mL와 준비된 시료 0.1mL를 암소에서 30분간 반응시킨 후 520nm에서 흡광도를 측정한다. 소거능은 대조구의 흡광도에서 시료의 흡광도를 뺀 값을 대조구의 흡광도로 나누어 %값으로 표기한다.
실시예 1, 2 및 비교예 1 내지 4의 로얄젤리에 대한 실험 결과 중 일부를 표 3에 나타내었다.
[표 3]
표 3에서와 같이, 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 세균성 엔도형 단백분해효소, 및 진균성 엑소형 단백분해효소로 효소처리한 경우, 효소처리하지 않은 경우나 세균성 엔도형 단백분해효소와 진균성 엑소형 단백분해효소로 효소처리한 경우, 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소와 세균성 엔도형 단백분해효소로 효소처리한 경우에 비해 총 유리아미노산 함량이 큰 폭으로 증가하고, 항산화 활성도 우수함을 알 수 있다. 특히, 실시예 1과 같이, 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소를 함께 처리한 경우, 보다 더 우수함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 항산화 활성 등이 높은 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있음을 알 수 있다.
<효소처리 로얄젤리 제조 Ⅱ> 실시예 3 내지 18
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 1000중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 실시예 1에 해당하는 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 발효조(KF2500, (주)코바이오텍)에서 표 4에 기재된 가압조건과 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하여 단백분해효소를 실활시켰다. 열처리 종료 후, 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여 분말화하였다. 이와 같은 방법으로, 실시예 3 내지 18의 로얄젤리 분말을 제조하였다.
[표 4]
표에서 온도조건 55-45-50은 섭씨 55도에서 3시간 1차처리 후, 섭씨 45도에서 3시간 2차처리 후, 섭씨 50도에서 3시간 3차처리 후, 섭씨 55도에서 15시간 4차처리하는 온도조건을 나타내고, 온도조건 58-50-55는 섭씨 58도에서 3시간 1차처리 후, 섭씨 50도에서 3시간 2차처리 후, 섭씨 55도에서 3시간 3차처리 후, 섭씨 55도에서 15시간 4차처리하는 온도조건을 나타내고, 온도조건 60-55-60은 섭씨 60도에서 3시간 1차처리 후, 섭씨 55도에서 3시간 2차처리 후, 섭씨 60도에서 3시간 3차처리 후, 섭씨 55도에서 15시간 4차처리하는 온도조건을 나타내며, 온도조건 55는 섭씨 55도에서 24시간 처리하는 온도조건을 나타낸다. 표에서 가압조건은 추가로 가한 압력조건을 의미한다. 예를 들어, 가압조건 0atm은 대기압상태에서 추가로 압력을 가하지 않은 것을 의미하고, 가압조건 0.5atm은 대기압상태에서 추가로 0.5atm의 압력을 가한 것을 의미한다.
<실험예 2> 실시예 3 내지 18
실시예 3 내지 18의 로얄젤리에 대하여, 총 유리아미노산 등을 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과 중 일부를 표 5, 표 6에 나타내었다. 표에는 실시예를 가압조건과 온도조건으로 식별되도록 나타내었다.
[표 5]
[표 6]
표 5 및 표 6에서와 같이, 실시예 3 내지 18 모두 항산화 활성 등을 나타냄을 알 수 있으며, 특히 실시예 7, 8, 11, 12에 해당하는 로얄젤리의 총 아미노산 함량, 항산화 활성이 다른 경우에 비해 특히 우수함을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 가압조건 0.5 내지 1atm에서 총 아미노산 함량이 높은 효소처리로얄젤리를 제조할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 효소처리하는 경우, 로얄젤리의 총 아미노산 함량, 항산화 활성이 다른 경우에 비해 특히 우수함을 알 수 있다.
또한, 실시예 7과 비교예 4에 대하여 10-HDA 함량을 아래 방법으로 측정하였다.
<10-HDA 함량 측정법>
로얄젤리의 지표성분 10-HDA함량 측정법은 시료(비교예 4 또는 실시예 7) 1g에 증류수 50mL 첨가하여 섭씨 50도에서 1시간 동안 반응시킨 후 메탄올 350mL을 넣은 후 30분간 초음파추출하고, 다시 100mL의 메탄올을 추가하여 원심분리(12000rpm, 10분)하여 상등액을 0.2um 시린지 필터{PTFE(Polytetrafluoroethylene), 하이드로포빅, adventech}로 여과하여 시험용액으로 사용하였다. 10-HDA 표준품을 1000ug/ml농도로 메탄올에 각각 100, 10, 1ug/ml이 되도록 희석하여 각각의 표준용액을 동량 주입하여 표준곡선을 작성하였으며, HPLC 분석(Dionex ultimate 3000)은 Zorbax extend C18칼럼을 이용하였으며, 다음과 같은 조건으로 분석 진행하였다(표 7).
[표 7]
실시예 7과 비교예 4에 대하여 측정한 10-HDA 함량은 다음 표 8과 같다.
[표 8]
이와 같은 결과로부터, 본 발명의 방법에 의해 제조된 효소처리로얄젤리의 경우 유효성분은 그대로 유지함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 의해 로얄젤리의 유효성분은 그대로 유지하면서도, 항산화 활성, 개선된 제제화물성 등을 달성하는 것이 가능하다.
<효소처리 로얄젤리 제조 Ⅲ> 실시예 19 내지 22
<실시예 19> 동결건조 분말 형태의 효소처리 로얄젤리 제조
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 1000중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 실시예 1에 해당하는 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 표 4의 실시예 7에 기재된 가압조건과 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 열처리물을 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여 동결건조 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다.
<실시예 20> 분무건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리 제조
열처리 후 열처리물을 동결건조기로 동결건조하여 동결건조 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하는 대신, 열처리 후 열처리물을 분무건조기(SD-1000, EYELA)로 분무건조(조건: 열풍입구온도 125℃, 열풍출구온도 100℃)한 것을 제외하고, 실시예 19와 동일하게 실시하여, 분무건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다.
<실시예 21> 농축후동결건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리 제조
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 1000중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 실시예 1에 해당하는 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 표 4의 실시예 7에 기재된 가압조건과 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 열처리물을 농축탱크에 넣고 60±5℃에서 110mbar로 감압농축한 후, 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여, 농축후동결건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다.
<실시예 22> 농축후분무건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리 제조
1kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 1000중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 실시예 1에 해당하는 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 표 4의 실시예 7에 기재된 가압조건과 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 90도에서 15분간 열처리하였다. 열처리 후 열처리물을 농축탱크에 넣고 60±5℃에서 110mbar로 감압농축한 후 분무건조기(SD-1000, EYELA)로 분무건조(조건: 열풍입구온도 125℃, 열풍출구온도 100℃)하여, 농축후분무건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다.
<실험예 3> 실시예 19 내지 22 및 비교예 4
실시예 19 내지 22 및 비교예 4의 로얄젤리에 대하여, 안식각, 인습성, 및 용해성을 측정하였다.
<안식각 측정>
분말의 유동성을 평가하기 위해 완전 평면인 기준판 위의 일정한 높이에 고정된 깔대기를 통해 시료(실시예 19, 20, 21, 22 또는 비교예 4)를 일정 부피로 통과시켜 얻어진 원뿔의 안식각을 측정하였다. 측정된 안식각을 표 9에 나타내었다.
[표 9]
표에서와 같이, 실시예 21, 22와 같이, 농축처리한 경우의 안식각이 더 작은 것으로 나타났고, 농축후동결건조한 실시예 21의 경우 안식각이 보다 더 작은 것으로 나타났다. 안식각이 작을수록 유동성은 큰 것을 의미하므로, 농축후동결건조한 경우 유동성 면에서 보다 우수함을 알 수 있다. 이와 같이 유동성이 개선됨으로 인해, 과립제, 하드캡슐제, 정제 등의 제형화 효율이 보다 더 증대될 수 있다.
<인습성 측정>
시료(실시예 19, 20, 21, 22 또는 비교예 4)를 HDPE 플라스틱 용기에 취하여 섭씨 40도에서 습도 78% 환경에서 0일, 2주, 4주, 8주 동안 보관 후 각 시료의 수분량을 측정하는 기기(칼 피셔 분석법, 795KFT Tirino)를 통해 수분량(%) 변화를 측정하였다. 수분량(%) 변화는 도 2에 나타내었다.
도 2는 실시예 19 내지 22 및 비교예 4의 인습성 측정 결과를 나타낸 그래프로, 도시된 바와 같이, 실시예 21, 22와 같이, 농축처리한 경우의 수분함유 증가율이 상대적으로 적게 나타났고, 농축후동결건조한 실시예 21의 경우 증가율이 가장 적게 나타났다. 따라서, 농축후동결건조한 경우 흡습성 면에서 보다 우수함을 알 수 있다. 흡습성이 낮아, 타정 등 제제화시 제형화 효율이 보다 더 증대될 수 있다.
<용해도 측정>
정제수 100g을 교반기(LMS-1003, (주)대한랩테크)에 넣은 후, 200rpm으로 섭씨 25도에서 교반하면서, 시료(실시예 19, 20, 21, 22 또는 비교예 4) 1g을 넣고 완전 용해되는 시간을 측정하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었다.
[표 10]
표에서와 같이, 실시예 21, 22와 같이, 농축처리한 경우의 용해성이 더 큰 것으로 나타났고, 농축후동결건조한 실시예 21의 경우 용해성이 보다 더 큰 것으로 나타났다. 용해성이 클수록 복용성 면에서 우수하고, 제제화시에도 용이하게 용해될 수 있어, 액제 등의 제형화 효율이 보다 더 증대될 수 있다.
이와 같은 결과로부터, 본 발명에 의해, 항산화능과 같은 기능성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 항산화능과 같은 기능성이 우수함을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 의해, 안식각, 인습성, 및 용해성과 같은 제제화를 위한 물성이 우수한 효소처리 로얄젤리를 제조할 수 있으며, 본 발명에 의한 효소처리 로얄젤리는 제제화를 위한 물성이 우수함 역시 알 수 있다.
<효소처리 로얄젤리 제조 Ⅳ> 실시예 23
<실시예 23> 효소처리 로얄젤리 대량제조
80kg의 동결건조 로얄젤리 분말(10-HDA 5.0% 이상; ZHEJIANG JIANGSHAN BEE ENTERPRISE CO., LTD) 100중량부에 대하여 정제수 500중량부를 가하여 혼합한 후, 표 1의 실시예 1에 해당하는 단백분해효소를 함께 혼합하였다. 이 때, 원료인 동결건조 로얄젤리 분말은 실시예 1의 로얄젤리의 80배에 해당하는 양이었다. 표 1에 기재된 각각의 단백분해효소는 로얄젤리 분말 100중량부에 대하여 각각 1중량부의 함량이 되도록 하였다. 그 후, 표 4의 실시예 7에 기재된 가압조건과 온도조건에서 반응시킨 후, 섭씨 70도에서 30분간 열처리하였다. 열처리 후 열처리물을 농축탱크에 넣고 47±5℃에서 300mbar로 감압농축한 후, 동결건조기(PVTE300KL, (주)일신랩, 대한민국)로 동결건조(조건: 선반온도 -40℃ 이하, 트랩냉동 -65℃ 이하, 진공도 250mTorr, 건조온도 23℃)하여, 농축후동결건조한 분말 형태의 효소처리 로얄젤리를 제조하였다. 그 과정에서 탄화현상 등은 일어나지 않고, 과잉의 효소 역시 효과적으로 불활성화된 효소처리 로얄젤리가 제조됨을 확인하였다.
<실험예 4> 실시예 21, 실시예 23
실시예 23의 효소처리 로얄젤리가 실시예 21과 동일하게 효소가 비활성화되었는지 여부를 확인하기 위해, 실험을 실시하였다.
스킴밀크 배지{스킴밀크(DIFCO, USA) 3%, 아가 1.5% 함유}에 동일 크기의 페이퍼디스크(paper disc) 2매를 올리고 섭씨 121도에서 멸균한 후, 실시예 21과 실시예 23의 효소처리 로얄젤리 각각 1g을 10ml 정제수에 녹인 용액을 마이크로피펫으로 각각의 페이퍼디스크에 50uL씩 떨어뜨리고, 섭씨 35±2도에서 24시간 반응시켰다. 그 결과, 각각의 페이퍼디스크 주변에 투명한 고리형태를 발견할 수 없었다.
투명한 고리형태는 단백분해효소가 활성상태일 때, 스킴밀크 배지에서 섭씨 35±2도에서 12~24시간 반응시킬 경우 발생하는 것으로, 이와 같은 고리형태가 발생하지 않는 것으로부터, 실시예 21, 23 모두 단백분해효소가 비활성되었음을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과로부터, 효소처리 로얄젤리 대량제조시에도, 로얄젤리에 대한 용매 비율과 불활성화 조건, 감압농축 조건 등을 본 발명에서와 같이 하여, 탄화현상 등은 일어나지 않고, 효소 불활성화도 효과적으로 달성됨을 알 수 있다. 더욱이, 대량제조시 소량제조에 비해, 로얄젤리 대비 사용되는 용매의 비율을 줄일 수 있어, 상대적으로 효소불활성화나 농축에 소모되는 에너지를 덜 소모할 수 있다는 장점도 가짐을 알 수 있다.
Claims (10)
- 로얄젤리를 단백분해효소로 처리하여 효소처리물을 얻는 효소처리단계를 포함하고,
상기 효소처리물을 후처리하는 후처리단계를 더 포함하며,
상기 단백분해효소는 진균성 엔도및엑소형 단백분해효소, 진균성 엑소형 단백분해효소, 및 세균성 알칼리성 엔도형 단백분해효소를 포함하고,
상기 엔도및엑소형 단백분해효소는 엔도펩티다제와 엑소펩티다제가 혼합된 상태이고,
상기 처리는 용매 중에서 이루어지고,
상기 처리는 상기 로얄젤리를 상기 단백분해효소와 가압조건 0.5 내지 1 atm에서 접촉시키는 접촉단계를 포함하고,
상기 접촉은 1차처리온도 섭씨 55 내지 58도에서 1 내지 5시간 처리하는 1차 처리단계, 2차처리온도 섭씨 45 내지 50도에서 1 내지 5시간 처리하는 2차 처리단계, 및 3차처리온도 섭씨 50 내지 55도에서 1 내지 5시간 처리하는 3차 처리단계를 포함하여 실시하는 것이며,
상기 후처리단계는
상기 효소처리물을 농축하여 농축물을 얻는 농축단계; 및
상기 농축물을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 동결건조단계를 포함하는 효소처리 로얄젤리 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 접촉은 4차처리온도 섭씨 55도에서 처리하는 4차 처리단계를 더 포함하여 실시하는 것인 효소처리 로얄젤리 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효소처리물은 상기 단백분해효소가 불활성화된 불활성화효소처리물인 효소처리 로얄젤리 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 효소처리 로얄젤리는 항산화 활성을 갖는 효소처리 로얄젤리인 효소처리 로얄젤리 제조방법.
- 제1항, 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 효소처리 로얄젤리.
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| KR20220148985A (ko) | 2021-04-29 | 2022-11-08 | (주) 바이텍 | 효소처리 로얄젤리의 제조방법, 이에 의해 제조된 효소처리 로얄젤리, 및 이를 포함하는 관절건강 개선용 조성물 |
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