KR101886974B1

KR101886974B1 - 감마선 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법

Info

Publication number: KR101886974B1
Application number: KR1020170119345A
Authority: KR
Inventors: 안동현; 김꽃봉우리; 정슬아
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-08-08
Also published as: KR20170115979A

Abstract

본 발명은 감마선 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법은 방사선 및 열 처리를 통하여 어류 내 히스타민을 생성하는 대표적 미생물인 모가넬라 모르가니(M. morganii) 또는 포토박테륨 포스포레움(P. phosphoreum)의 생육 억제 및 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용 시 알러지성 식중독을 예방할 수 있는 효과가 있다.

Description

감마선 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법{The inhibition method of histidine decarboxylase by treatment of gamma irradiation and heat}

본 발명은 감마선 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법에 관한 것이다.

21세기 경제 성장에 발맞추어 소비자들의 소득 수준이 향상됨에 따라 식품은 단지 생명을 유지하기 위한 에너지원이 아니라, 삶을 풍요롭게 즐길 수 있는 수단으로써 건강을 중요시 하는 웰빙 식품이 주목 받고 있다. 그 중 수산물은 단백질, 무기질, 비타민 D, E 및 필수 지방산 등 영양성분 뿐만 아니라, 생리기능성 성분도 풍부하게 함유되어있다. 그 중, 고등어는 난류성 회유성 어종으로 전갱이, 정어리, 꽁치와 함께 4대 등푸른 생선으로 불린다. 고등어는 우리나라 연근해 어업의 주요 어종으로 특히, 남해안에 많이 분포하며 식탁에 흔히 먹을 수 있는 식품으로 가식부 중 단백질이 약 20.2%로 높으며, 지질 함량이 약 10.4%로 다른 어종에 비하여 월등히 높으며, 특히 EPA 및 DHA와 같은 n-3 지방산의 비율이 약 36.1%로 풍부하여 고혈압, 심장질환, 혈전증 등의 성인병 예방효과 및 뇌 활동 촉진, 치매 예방 등의 효과가 있다. 또한 비타민 B2, D 및 E가 풍부하여 피로회복 및 항산화 작용을 지니고 있다.

그러나, 고등어(Scomber japonicus)는 훌륭한 단백질원 식품이지만, 근육 내에 비단백태 질소가 다량 함유되어 있는데, 특히 유리 히스티딘 함량이 유리 아미노산 조성 중 약 47%로 가장 많은 비율을 차지하고 있다. 고등어육 내에 존재한 유리 히스티딘은 미생물에 의해 생성된 효소인 히스티딘 디카복시라아제의 탈탄산 작용으로 인해 히스타민으로 전환된다. 히스타민은 인체 내에서도 생성되어져, 생리작용 및 신경전달 물질로써 역할을 하지만, 어류를 어획하고 난후, 부적절한 처리 및 가공공정 과정에서 미생물에 오염되어 생성된 히스타민을 소비자가 섭취했을 때 히스타민 및 스콤브로이드 어류 독(Histamine 또는 scombroid fish poisoning)을 일으키는 가장 직접적인 원인물질로 여겨지고 있다.

히스타민 어류 독의 증상으로는 후추 맛이나 금속 맛이 나며, 공통적인 증상으로 입이 저리거나 침 넘기기가 어렵고, 갈증을 느끼게 된다. 또한 두통, 설사, 구토, 복통이 수반되며, 알러지 증상과 같은 홍조와 두드러기 등이 발생한다. 히스타민 어류 독을 유발시키는 생선 내의 히스타민 수치는 200 ppm으로, 종종 500 ppm 이상일 때 발병하는 것으로 보고되고 있다.

고등어 내에서 히스타민을 생성하는 미생물은 그람 음성균으로, 피리독살-5-인산염(pyridoxal-5'-phosphate)을 보조인자로 필요하는 히스티딘 디카복시라아제를 생성하며, 모가넬라 모가니(Morganella morganii)는 가장 강력한 히스타민 생성균 중에 하나로 널리 알려져 있으며, 포토박테륨 포스포레움(Photobacterium phosphoreum)은 가장 대표적인 저온성 및 호염성 균으로 해양환경에 잘 적응하여 생선에 흔히 오염된다. 히스타민 어류 독을 유발하는 생선을 취급할 때, 저온저장을 실시하지만, 포토박테륨 포스포레움(Photobacterium phosphoreum)과 같이 저온에서도 잘 생육하는 균에 의해 히스티딘 디카복시라아제를 분비하여 히스타민이 생성될 수 있다.

따라서, 이와 같은 문제점으로 인해 고등어 내 히스타민 생성을 억제하기 위한 가장 근본적인 방법으로 히스티딘 디카복시라아제를 생성하는 미생물의 생육을 억제함으로써 효소를 분비하지 못하게 하여 히스타민 생성을 억제하는 것이다. 그러나 미생물이 추후 고등어 내에 생육하지 않더라도, 이미 히스티딘 디카복시라아제를 분비하여 존재하면, 독립적으로 계속 히스타민이 생성됨으로 효소의 작용을 억제하는 방법이 필요하나 아직까지 그 연구가 미미한 실정이다.

한국등록특허 제10-1390478호

이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 어류 내에서 식중독을 유발하는 히스타민 생성에 관여하는 부패 세균 또는 부패 세균이 생성하는 히스티딘 디카복시라아제 억제 방법을 찾기 위해 다양한 노력을 기울이던 중 감마선 및 열 처리를 통하여 히스티딘 디카복시라아제 활성이 억제됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 감마선 또는 열처리를 통한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 감마선 또는 열처리를 통한 어류 내 식중독 억제 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감마선 또는 열처리를 통한 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감마선 처리는 0.1 내지 13 kGy의 양으로 조사하는 것을 특징으로 하고, 열처리는 60 ~ 140℃의 온도에서 5 ~ 30분간 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 감마선 또는 열처리를 통한 어류 내 식중독 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 히스타민 생성에 관여하는 모가넬라 모르가니(M.morganii) 또는 포토박테륨 포스포레움(P. phosphoreum) 균주의 생성을 저해 또는 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 방법은 방사선 및 열 처리를 통하여 어류 내 히스타민을 생성하는 대표적 미생물인 모가넬라 모르가니(M. morganii) 또는 포토박테륨 포스포레움(P. phosphoreum)의 생육 억제 및 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용 시 알러지성 식중독을 예방할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 감마선 처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제의 SDS-PAGE 단백질 패턴 변화를 확인한 결과이다(A: M. morganii 유래 히스티딘 디카복시라아제, B: P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제. 1라인: 단백질 마커, 2라인: 무처리, 3라인: 3 kGy, 4라인: 5 kGy, 5라인: 7 kGy, 6라인: 10 kGy).
도 2는 감마선 처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제의 Native-PAGE 단백질 패턴 변화를 확인한 결과이다(A: M. morganii 유래 히스티딘 디카복시라아제, B: P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제. 1라인: 무처리, 2라인: 3 kGy, 3라인: 5 kGy, 4라인: 7 kGy, 5라인: 10 kGy).
도 3은 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제의 SDS-PAGE 단백질 패턴 변화를 확인한 결과이다(A: M. morganii 유래 히스티딘 디카복시라아제, B: P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제. 1라인: 단백질 마커, 2라인: 무처리, 3라인: 65℃ 30분 처리, 4라인: 80℃ 10분 처리, 5라인: 100℃ 10분 처리, 6라인: 121℃ 10분 처리).
도 4는 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제의 Native-PAGE 단백질 패턴 변화를 확인한 결과이다(A: M. morganii 유래 히스티딘 디카복시라아제, B: P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제. 1라인: 무처리. 2라인: 65℃ 30분 처리, 3라인: 80℃ 10분 처리, 4라인: 100℃ 10분 처리, 5라인: 121℃ 10분 처리).

본 발명은 알러지성 식중독을 일으키는 원인 물질인 히스타민의 생성 억제 방법에 관한 것으로, 히스타민 생성균인 모가넬라 모르가니(M. morganii) 및 포토박테륨 포스포레움(P. phosphoreum)의 감마선 조사에 의한 생육 억제, 미생물이 생산하는 히스티딘 디카복시라아제의 활성 및 단백질 변화에 의한 히스타민 생성 억제에 관한 것이다.

히스타민은 인체 내에서 mast cell, enterochromaffin-like cell 및 뉴론에서 널리 분포되어 있으며, 생리작용 및 신경전달물질로서의 역할을 한다. 그러나 미생물에 의해 부패된 어류에서 생성된 히스타민을 다량 섭취 시 알러지성 식중독을 일으키는 가장 직접적인 원인물질로 여겨지고 있다. 히스타민은 히스티딘이 E. coli, Morganella morganii, Klebsiella pneumonia, Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes 및 Vibrio alginolyticus 등과 같은 부패세균이 생성하는 히스티딘 디카복시라아제에 의해 탈탄산 작용으로 생성된다.

따라서 히스타민 생성의 원인 물질인 부패세균 또는 부패 세균이 생성하는 히스티딘 디카복시라아제를 제어하여 안정성을 확보하는 것이 매우 중요하다. 히스타민 생성 억제에 관한 연구는 항신료 첨가로 히스티딘 디카복시라아제 활성 억제 및 히스타민 분해균에 대한 연구가 대부분이며 매우 미흡한 실정이다.

한편, 열처리는 식품 가공 기술 중 하나로 식품의 저장 수명 연장 및 품질을 향상시키지만 영양소의 파괴 및 활성물질의 손실 등의 문제점이 발생되고 있으며, 최근 다양한 소재에 대하여 열처리 시 생리활성의 증가에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

감마선 처리는 비가열처리 기술로 적절한 선량의 감마선 조사는 제품 고유의 물리, 화학적 특성을 유지하면서도 유해한 미생물에 대하여 살균효과를 나타낸다. 또한, 식품의 영양 및 관능학적 변화를 최소화할 수 있는 장점이 있어 식품의 안전한 저장 및 유통을 위한 효과적인 기술로서 주목받고 있다.

최근 감마선을 조사하여 기능성 소재의 추출 수율, 멜라닌 생성 억제, 항산화 및 항균 등의 생리활성 변화에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 열처리 및 감마선 조사에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나 히스타민 생성 억제에 대한 연구는 진행된 바 없다.

이에 본 발명자들은 감마선 처리 및 열처리를 통하여 히스타민 생성에 관여하는 부패 미생물의 생육을 억제할 수 있는지를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 감마선을 조사 후 균주를 채취하여 멸균한 phosphate buffered saline 용액(pH 7.4)으로 10배 희석법으로 희석하였다. 이 때 M. morganii의 경우 Trypticase Soy Agar(TSA, Difo, NJ, USA) 배지를 사용하여 37℃에서 12시간 배양한 뒤 생성되는 colony수를 측정하였으며 P. phosphoreum의 경우 Marine Agar(MA, Difo, NJ, USA) 배지를 사용하여 25℃에서 42시간 배양한 뒤 생성되는 콜로니수를 측정한 결과, M. morganii의 경우 0 kGy에서 1.11×10⁵ CFU/mL, P. phosphoreum의 경우 0 kGy에서 6.50×10⁵ CF U/mL으로 측정되었으며, 감마선 조사 시 균의 생육이 억제됨을 알 수 있었다(표 1 참조).

본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 열처리를 한 뒤 M. morganii 및 P. phosphoreum의 생육을 알아본 결과, 비가열 처리구는 M. morganii의 경우 1.76×10⁷CFU/mL, P. phosphoreum의 경우 3.79×10⁶CFU/mL이였으나 65 ~ 121℃의 온도로 가열 처리한 군에서는 모든 균의 생육이 억제되었음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

또한 본 발명자들은 감마선 처리 및 열처리를 통하여 히스티딘 디카복시라아제 활성이 억제되는지 확인하기 위하여 다양한 선량(0, 3, 5, 7, 10, 13 kGy)으로 감마선을 조사하여 M. morganii 및 P. phosphoreum 의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 확인한 결과, 10 kGy의 양으로 조사할 때까지는 조사선량이 증가할수록 M. morganii 및 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제 활성이 저해되었으나, 13 kGy 조사 시에는 10 kGy의 양으로 조사하였을 때보다 히스티딘 디카복시라아제의 효소활성이 다소 증가하였음을 알 수 있었다(표 3 참조).

따라서, 히스타민 생성균인 M. morganii 및 P. phosphoreum 의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있는 최적 감마선 조사 조건은 10 kGy임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 다양한 온도(65 내지 140℃)로 열처리하여 M. morganii 및 P. phosphoreum 의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 확인한 결과, 121℃의 온도까지는 온도가 증가할수록 M. morganii 및 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제 활성이 저해되었으나, 140℃에서는 121℃에서보다 히스티딘 디카복시라아제 활성이 오히려 증가하였음을 알 수 있었다(표 4 참조).

따라서, 히스타민 생성균인 M. morganii 및 P. phosphoreum의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있는 최적 열처리 조건은 121℃의 온도에서 10분간 처리할 때임을 확인할 수 있었다.

본 발명에서는 감마선 및 열처리를 통하여 알러지성 식중독을 일으키는 히스타민 생성을 억제할 수 있음을 실험적으로 확인하였으며, 따라서 본 발명은 감마선 또는 열처리를 통한 어류 내 식중독 억제 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 감마선 또는 열처리를 통한 어류 내 식중독 억제 방법은 감마선 처리 후 열처리를 가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 '어류'는 고등어, 대구, 산천어, 가자미, 연어, 빙어, 돗돔, 산천어 및 홍어로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 가장 바람직하게는 고등어일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

시험 균주

본 발명에서 사용된 균주는 가장 대표적인 히스타민 생성균으로 Morganella morganii IFO 3848을 한국미생물보존센터(KCCM, Korea)에서 분양받았으며, 대표적인 저온성 히스타민 생성균인 Photobacterium phosphoreum IFO 13896을 미생물자원센터(KCTC, Korea)에서 분양 받아 실험에 사용하였다.

<실시예 2>

조효소액 제조방법

본 발명자들은 히스타민 생성균으로부터 히스티딘 디카복시라아제 조효소액을 추출하기 위해 M. morganii 및 P. phosphoreum 균주를 105-106 CFU/mL되도록 하여 0.5% L-히스티딘 모노하이드로콜로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate)를 첨가한 Trypticase Soy Broth(TSB, Difo, NJ, USA) 및 Marine Broth(MB, Difo, NJ, USA)배지에 접종하여 각각 35℃에서 12시간, 25℃에서 42시간 배양하였다.

균 배양액을 12,000×g로 30분간 원심분리하여 균체를 수집하였다. 수집된 균체에 buffer A(0.1 potassium phosphate buffer, 0.1 mM dithiothreitol, 1%(v/v) polyethylene glycol no. 300, pH 6.5)로 세척 한 후, 실험에 사용하였다. 세척한 세포를 1:4 비율의 buffer A로 현탁 시킨 후, time 20분, pulse 20, ample 55%의 조건으로 초음파 처리(VCX 130, Sonics & Materials, Newtown, USA)하여 세포를 파괴시킨 후, 12,000 ×g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하였다. 침전물은 다시 1:3 비율로 buffer A를 가하여 한번 더 초음파 처리하고 원심분리 한 상층액을 앞의 상층액과 혼합하여 20,000 ×g에서 30분간 다시 한번 원심 분리하였고 잔사는 폐기하였다.

<실시예 3>

감마선 조사

한국원자력연구원 정읍 첨단방사선연구소에 있는 감마선 조사시설(IR-79, MDS Nordion International Ltd, Ontario, Canada)에서 선원 11.1 pBq, Co-60을 실온에서 시간당 일정 선량률로 조효소액에 각각 3, 5, 7, 10, 13 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 조사하였다. 감마선 조사한 시료는 4℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

<실시예 4>

열 처리

워터 배스(PCWB-2, Lab Partner Co., Guri, Korea)를 이용하여 65℃에서 30분, 80℃에서 10분, 100℃에서 10분, 가압멸균기(DW-AC C 920, D.W. Industries, Busan, Korea)에서 온도 121℃, 게이지압 1.1 kg/cm²에서 10분, 온도 140℃, 게이지압 1.1 kg/cm²에서 10분간 열처리한 후 급냉하였다. 이를 4℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.

<실시예 5>

균수 변화 측정

<5-1> 감마선 조사에 의한 균수 변화 측정

본 발명자들은 감마선 조사에 의한 균수 변화를 측정하기 위하여 상기 실시예 3과 같이 감마선을 조사 후 균주를 채취하여 멸균한 phosphate buffered saline 용액(pH 7.4)으로 10배 희석법으로 희석하였다. 이 때 M. morganii의 경우 Trypticase Soy Agar(TSA, Difo, NJ, USA) 배지를 사용하여 37℃에서 12시간 배양한 뒤 생성되는 colony수를 측정하였으며 P. phosphoreum의 경우 Marine Agar(MA, Difo, NJ, USA) 배지를 사용하여 25℃에서 42시간 배양한 뒤 생성되는 콜로니수를 측정하였다.

그 결과, M. morganii의 경우 0 kGy에서 1.11×10⁵ CFU/mL, P. phosphoreum의 경우 0 kGy에서 6.50×10⁵ CFU/mL으로 측정되었으며, 감마선 조사 시 균의 생육이 억제됨을 알 수 있었다(표 1 참조).

<5-2> 열처리에 의한 균수 변화 측정

본 발명자들은 열처리에 의한 균수 변화를 측정하기 위하여 실시예 4와 같이 열처리를 한 뒤 M. morganii 및 P. phosphoreum의 생육을 알아본 결과, 비가열 처리구는 M. morganii의 경우 1.76×10⁷ CFU/mL, P. phosphoreum의 경우 3.79×106 CFU/mL이였으나 65 ~ 121℃의 온도로 가열 처리한 군에서는 모든 균의 생육이 억제되었음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

<실시예 6>

히스티딘 디카복시라아제 활성 측정

히스티딘 디카복시라아제 활성 측정은 37℃에서 기질인 히스티딘이 히스타민으로 방출되는 정도를 측정함으로써 확인하였다. Buffer A 1 mL과 증류수 0.1 mL을 시험관에 취하여 37℃에서 5분간 배양한 후, 조효소액 0.1 mL를 가하여 다시 5분간 배양하였다, 200 mM L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate)를 0.2 mL을 첨가한 후 37℃에서 15분간 반응시켜 히스타민을 생성시켰다. 반응을 정지시키기 위하여 94-95℃에서 5분간 가열처리한 후 얼음물에 급속 냉각하였다. 생성된 히스타민 정량을 위하여 histamarinen assay kit(Kikkoman Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 UV/visible spectrophotometer(GENESYS 10UV, Rochester, NY, USA)로 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<6-1> 감마선 조사에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 측정

감마선 조사에 의한 M. morganii 및 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제의 활성을 측정한 결과, 0 kGy 비조사군에서 14,955.25 U/mL의 효소 활성을 가졌으며, 3 kGy 조사 시 2,074.27 U/mL로 활성이 감소하여, 0 kGy보다 86.13% 저해되었다. 5, 7, 10 및 13 kGy 조사 시에는 1,075.55, 486.56, 435.34 및 489.24 U/mL으로 나타나, 감마선을 10 kGy의 양으로 조사할 때까지는 조사선량이 증가할 수록 M. morganii 유래 히스티딘 디카복시라아제의 효소 활성이 저해되었으나 13 kGy 조사 시에는 10 kGy의 양으로 조사하였을 때보다 히스티딘 디카복시라아제의 효소 활성이 증가하였음을 알 수 있었다(표 3 참조).

또한, 감마선 조사에 의한 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제의 경우 0 kGy 히스티딘 디카복시라아제에서 1,344.44 U/mL의 효소 활성을 가졌으며, 3 kGy 조사 시 0 kGy 히스티딘 디카복시라아제보다 44.76% 저해된 742.64 U/mL의 효소 활성을 가졌다. 5, 7, 10 및 13 kGy 조사 시에는 268.89, 204.87, 115.24 및 198.98 U/mL으로 나타나, 감마선을 10 kGy의 양으로 조사할 때까지는 조사선량이 증가할 수록 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제의 효소 활성이 저해되었으나 13 kGy 조사 시에는 10 kGy의 양으로 조사하였을 때보다 히스티딘 디카복시라아제의 효소 활성이 증가하였음을 알 수 있었다(표 3 참조).

따라서, 상기 결과로 히스타민 생성균인 M. morganii 및 P. phosphoreum의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있는 최적 감마선 조사 조건은 10 kGy임을 확인할 수 있었다.

<6-2> 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 측정

M. morganii 및 P. phosphoreum으로부터 히스티딘 디카복시라아제 조효소액를 얻은 후, 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제(HDC)의 저해 활성을 측정하였다.

그 결과, M. morganii 유래 HDC의 활성은 비가열 처리구는 24,596 U/mL이었으나, 65℃/30분 열처리 시에 2,189 U/mL로 활성이 감소하여, 비가열 처리구보다 91% 저해되었다. 80℃/10분, 100℃/10분, 121℃/10분 및 140℃/10분 처리 시에는 2,125, 1,856, 1,229 및 1,923.60 U/mL으로 65℃와 80℃ 처리구 사이에는 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 100℃ 이상 처리시 유의적으로 활성이 더 감소하는 것으로 나타났으나, 140℃에서는 121℃에서보다 HDC의 활성이 오히려 증가하였음을 알 수 있었다(표 4 참조).

또한, P. phosphoreum 유래 HDC 활성은 비가열 처리구는 2,010 U/mL이며 65℃에서 30분 처리 시 비가열 처리구에 비하여 89% 정도 감소하여 204 U/mL의 활성을 가졌으며, 80℃/10분, 100℃/10분, 121℃/10분 및 140℃/10분 처리 시 각각 166, 153, 51 및 102 U/mL의 효소활성을 나타내었다. M. morganii 및 P. phosphoreum 유래 히스티딘 디카복시라아제 활성 모두 열처리 시 효소의 활성이 저해되는 것을 알 수 있었으며(표 4 참조), 히스타민 생성균인 M. morganii 및 P. phosphoreum의 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제할 수 있는 최적 열처리 조건은 121℃의 온도에서 10분간 처리할 때임을 알 수 있었다.

<6-3> 감마선 조사 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 활성 측정

본 발명자들은 상기 실시예 <6-1> 및 <6-2>의 결과로 감마선 조사 또는 열처리에 의하여 알러지성 식중독을 일으키는 원인물질인 히스타민의 생성이 억제된다는 사실을 확인하였으며, 이들을 동시에 처리하였을 때 히스티딘 디카복시라아제 활성이 더욱 억제되는 지를 확인하기 위하여 감마선을 먼저 처리한 후 열처리하여 동시 처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제(HDC)의 저해 활성을 측정하였다.

그 결과, M. morganii 의 감마선만 처리한 군에서의 HDC의 활성은 435.34 U/mL으로 나타났고, 열처리 군에서의 HDC의 활성은 1,229.20 U/mL으로 나타났으며, 감마선과 열처리를 모두 처리한 군에서의 HDC의 활성은 251.52 U/mL으로 나타났음을 알 수 있었다. 또한, P. phosphoreum의 감마선만 처리한 군에서의 HDC의 활성은 115.24 U/mL으로 나타났고, 열처리 군에서의 HDC의 활성은 51.22 U/mL으로 나타났으며, 감마선과 열처리를 모두 처리한 군에서의 HDC의 활성은 38.11 U/mL으로 나타났음을 알 수 있었다(표 5 참조).

따라서, 상기의 결과로 감마선 처리 또는 열처리를 단독으로 수행하였을 때 보다 감마선 처리 및 열처리를 모두 수행하였을 때 알러지성 식중독을 일으키는 원인물질인 히스타민의 생성이 더욱 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

감마선 조사 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 조효소액의 단백질 변화 확인

본 발명자들은 감마선 조사 및 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 조효소액의 단백질 변화를 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 Native-PAGE를 실시하였다.

먼저, 15% separating gel과 4.5% stacking gel로 구성된 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel)의 실시를 위하여, 시료와 sample buffer(16 mM tris-HCl; pH 8.0, 6.2 mM EDTA, 31% glycerol, 3.1% SDS) 및 2-mercaptoethanol을 혼합한 후 2분 동안 가열하였다. 그 후 BPB 용액(0.1% bromophenol blue, 50% glycerol)을 가한 후 냉동보관하며 실험에 사용하였다. Loading한 후의 gel은 CBB 용액(50% methanol, 10% acetic acid, 0.1% coomassie brilliant blue R-250)으로 1시간 동안 염색하고, 탈색액(5% methanol, 7% acetic acid)을 이용하여 탈색하였다. 표준분자량 마커로는 protein marker(New England BioLabs, MA, USA)를 사용하였다.

또한 Native-PAGE는 10% running gel을 사용하였으며, SDS와 β-mercaptoethanol 첨가 및 가열 처리 과정을 제외하고 SDS-PAGE와 동일하게 진행하였다.

<7-1> 감마선 조사에 의한 히스티딘 디카복시라아제 변화 측정

상기와 같이 M. morganii 및 P. phosphoreum 조효소액을 3 ~ 10 kGy로 감마선 조사한 후 SDS-PAGE의 단백질 패턴 변화를 살펴보았다.

그 결과, M. morganii 조효소액을 감마선 처리 시 비조사구 처리구와 비교 하였을 때 단백질 패턴의 변화가 거의 없었으나 M. morganii의 경우 약 20 kDa부근의 band가 감마선 조사함에 따라 강도가 감소하는 경향을 보였다. P. phosphoreum의 경우에도 감마선 조사에 따른 큰 차이는 없었으나, 감마선 조사선량이 증가함에 따라 전반적인 band의 강도가 약간 감소하는 것으로 나타났다(도 1 참조).

Native-PAGE 패턴에서는 감마선 조사선량이 증가함에 따라 화살표 표시되어 있는 부근의 band의 강도가 감소하는 것으로 나타났다. SDS-PAGE 상에서는 약 43 kDa의 분자량을 가진 히스티딘 디카복시라아제(histidine decarboxylase)의 변화가 뚜렷하지 않았으며, Native-PAGE 상에서는 감마선 조사에 의한 큰 변화가 나타나지 않았다(도 2 참조). 하지만 감마선 조사에 의해 히스티딘 디카복시라아제의 활성부위의 구조가 변화하였기에 효소활성이 감소한 것으로 사료된다.

<7-2> 열처리에 의한 히스티딘 디카복시라아제 변화 측정

M. morganii 및 P. phosphoreum 조효소액을 65 ~ 121℃에서 가열처리하여 SDS-PAGE의 단백질 패턴 변화를 살펴보았다.

그 결과, M. morganii 조효소액을 가열 처리 시 65 ~ 80℃ 처리구는 비가열 처리구와 비교하였을 때 단백질 패턴의 변화가 거의 없었으나 100℃에서는 42, 34 및 20 kDa 단백질의 band 강도가 약해졌다. 특히, 121℃ 처리구에서는 단백질 밴드가 소실되거나 강도가 약해짐을 확인하였다.

P. phosphoreum 조효소액도 비가열 처리구와 비교 시 65 ~ 80℃ 처리구는 단백질 패턴의 변화가 거의 없었으나, 100℃이상의 온도에서부터 단백질 패턴의 변화가 보임을 알 수 있었다. 100℃ 처리구에서는 42 및 34 kDa band에서 강도가 약해짐을 확인하였고, 121℃ 처리구는 단백질이 소실되거나 강도가 약해졌다(도 3 참조). Native-PAGE의 단백질의 패턴변화에서는 65℃부터 단백질 패턴의 변화가 무처리구에 비해 변화가 크게 나타났으며, 100℃ 이상 처리구에서는 단백질의 소실이 크게 나타났는데, 이는 가열온도가 증가할수록 응집이 더 많이 일어났기 때문으로 사료된다(도 4 참조).

<실시예 8>

통계처리

각 실험에 대한 유의차 검정은 SAS software (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)에서 프로그램 된 general linear procedures, least square 평균값을 분산분석 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test법에 따라 분석하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

10 kGy의 감마선 조사 및 121℃의 온도에서 10분 동안의 열 처리를 통한,
모가넬라 모르가니(Morganella morganii) 및 포토박테륨 포스포레움(Photobacterium phosphoreum)으로부터 선택된 1종 이상의 균주로부터 유래된 히스티딘 디카복시라아제 활성을 억제시키는 방법.

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