KR101886018B1 - 은이온 방출 및 재담침이 가능한 중기공 실리카 나노입자 함유 아크릴 레진 - Google Patents

Abstract

본 발명은 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자(Ag-MSNs)의 제작 방법 및 이를 함유하는 아크릴 레진의 항균 활성을 확인할 수 있으며, 은 설파다이아진(AgSD)를 재담침으로 인한 지속적인 은 방출 및 장기적 항균 효과에 관한 것이다.

Description

은이온 방출 및 재담침이 가능한 중기공 실리카 나노입자 함유 아크릴 레진{Acrylic resin comprising mesoporous silica nanoparticle capable of releasing and reloading silver ions}

본 발명은 장기간 항균 효과를 나타내는 중기공 실리카 나노입자를 함유하는 아크릴 레진에 관한 것으로, 구체적으로는 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자를 함유하는 아크릴 레진은 지속적으로 은이온을 방출하여 항균 효과를 나타내며, 또한, 은 설파다이아진을 재담침함으로써 장기적인 항균효과를 나타낼 수 있다.

아크릴 레진은 아크릴산이나 메타아크릴산 등의 에스테르로부터 중합한 합성수지의 총칭이다. 대표적인 것으로 메타크릴산메틸(methyl methacrylate, MMA)의 중합체로서 일반적으로는 유기유리의 하나로 알려져 있다. 아세톤, 사이안산, 메탄올을 원료로 하는, 투명성이 좋은 플라스틱으로서 빛 특히, 자외선을 유리보다 쉽게 통과시킨다. 유리 이상의 투명도를 가지며 성형가공이 쉽고, 보통 유리에 비하여 무게는 약 반이며, 각종 강도·굳기·내열성이 작고 경도가 낮아 흠집이 생기기 쉽고 먼지가 붙기 쉬워 결점이 있으나, 물, 산 및 알칼리에 강한 물질이다. 항공기, 자동차의 방풍유리, 또는 티탄백을 혼입한 흰색 조명기구 커버, 건축재료 등 여러 방면에 걸쳐 쓰이고 있으며, 제조가 용이하고 적절한 기계적 성질 및 상대적으로 경제적인 가격으로 인해 착탈식 또는 이식형 기구 (예: 의치상 레진 및 안면 보철)의 치과/의료 분야에서 70년이상 생체 적합 물질로 사용되어 왔다(Dent Mater 2013;29:1091-7., Clin Oral Implants Res 2014;25:359-65., Materials Science and Engineering: C 2015;48:188-96.).

그러나, 이 물질은 항균 및 기계적 특성이 불량하여 치과/의료 수복(restoration) 실패를 유발할 수 있다. 이를 극복하기 위해 사용된 가장 최근의 접근 방법 중 하나로서, 나노 입자, 나노 섬유 또는 나노 튜브의 형태로 나노 첨가제를 적용하는 것이다(Trends Biotechnol 2015;33:621-36., J Nanomater 2015;2015:11.).

클로르헥시딘(chlorhexidine), 테트라사이클린(tetracycline) 및 암포테리신 B(amphotericin B) 뿐만 아니라 은 나노 입자(silver(Ag) nanoparticles)와 같은 항균 약제는 아크릴 레진에 직접적으로 통합되어 항균효과를 가지게 된다. 그러나, 이러한 물질들은 아크릴 레진의 기계적 특성을 감소시키고, 은이온의 버스트 방출 때문에, 장기간의 항균 효과를 나타낼 수 없다(J Dent 2014;42:180-4.).

한편, 중기공 실리카 나노입자(Mesoporous Silica Nanocarriers, MSNs)는 높은 표면적, 높은 기공의 부피 및 나노스케일의 형태학적 특징으로 인한 담침 능력, 여러 생체 분자들의 전달 뿐만 아니라, 우수한 생체 적합성, 높은 안정성, 좋은 내구성 및 저렴한 가격 등의 치과용 첨가제로서의 여러 이점을 가진다(ACS Appl Mater Interfaces 2014;6:2201-8.). 이와 같이, MSNs은 잠재적인 나노 첨가제 또는 나노 캐리어로서 주목 받고 있다. 따라서, MSNs은 물질의 기계적/물리적 특성을 개선하고, 항균제를 제공함으로써 아크릴 레진 매트릭스의 유용한 구성요소일 수 있다. 담침된 약물을 방출 한 후 재담침 할 수 있는 능력과 함께, MSNs은 임상적 유용성에 있어서 필수적인 구강을 포함한 이식 조직에서 지속적인 항균 효과를 나타낼 수 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 장기적 항균 활성을 나타낼 수 있는 아크릴 레진을 제작하고자 예의 노력한 결과, 은 설파다이아진이 담침된 MSNs(Ag-MSNs)을 아크릴 레진에 통합시키고, 상기 아크릴 레진을 사용한 이후에도 은 설파다이아진을 재담침하여 지속적인 항균 효과를 유도할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 은 설파다이아진(silver sulfadiazine, AgSD)이 담침된 중기공 실리카 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자(Ag-MSNs)를 포함하는 아크릴 레진을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진을 포함하는 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 은 설파다이아진(silver sulfadiazine, AgSD)이 담침된 중기공 실리카 나노입자를 제공한다.

구체적으로는, 먼저, 중기공 실리카 나노입자를 합성한 후, 상기 나노입자에 은 설파다이아진을 담침함으로써 Ag-MSNs을 제작한다. 더욱 구체적으로는, 상기 합성은 계면활성제인 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)와 NaOH의 용해액에 실리카 전구체인 TEOS(tetraethyorthosilicate)를 첨가하여 sol-gel 반응을 유도한 다음, 원심분리하여 건조 및 가열 처리하는 과정을 통해 MSNs을 합성할 수 있다. 상기 합성된 MSNs을 은 설파다이아진(AgSD) 용액 중에 분산시키고 교반함으로써 AgSD가 MSNs의 기공 내에 담침할 수 있게 되며, 이를 원심분리하여 건조하는 과정을 통해 AgSD가 담침된 MSNs, 즉, Ag-MSNs을 제작할 수 있다.

본 발명의 용어, "중기공 실리카 나노입자(mesoporous silica nanoparticle, MSNs)"는 실리카의 메조다공성(중기공) 형태를 나타내면서 구조 내에 매우 균일한 기공 사이즈 및 배열을 가지는 것을 의미하며, 특히 직경이 나노 수준인 것을 의미한다. 일반적으로 나노 다공성 물질은 그 기공의 크기에 따라 마이크로포러스(microporous, 2 nm 이하), 메조포러스(mesoporous, 2~50 nm) 및 매크로포러스(macroporous, 50 nm 이상)로 분류될 수 있다. 메조포러스(중기공) 물질은 상대적으로 넓은 표면적과 활물질 담지에 적합한 크기의 기공을 가지고 있어 다른 다공성 물질에 비해 다양한 분야로의 응용 가능성이 매우 높다. 본 발명에 있어서, 상기 MSNs의 중기공 사이즈는, 상기의 정의에 따라 2 내지 50 nm의 크기일 수 있고, 구체적으로는 2 내지 10 nm일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 2.5 내지 5 nm, 가장 구체적으로는 3 내지 4 nm일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 중기공의 사이즈를 가지는 실리카 나노입자의 입경 사이즈는, 구체적으로는 50 내지 100 nm일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 80 내지 90 nm의 일정한 사이즈의 입경 사이즈를 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 일정한 기공 사이즈 및 기공 부피를 가지는, 모양이 일정한 구형의 중기공 실리카 나노입자(MSNs)를 합성하고, 은 설파다이아진(AgSD)을 담침한 Ag-MSNs를 제작하였다(실시예 1).

본 발명의 용어, "은 설파다이아진(silver sulfadiazine, AgSD)"은 설파다이아진의 은 유도체로서 많은 그람 양성, 음성 세균 및 효모에 대해서 살균작용을 나타내며, 하기 화학식 1의 구조를 가진다. 본 발명에서는 상기 은 설파다이아진을 중기공 실리카 나노입자에 직접 담침함으로써 항균 활성을 가지는 나노 사이즈의 운반체를 제작할 수 있다. 상기 은 설파다이아진의 중기공 실리카 나노입자 내 함량은, 구체적으로는, 중기공 실리카 나노입자 100 중량 대비 20 내지 50 중량, 더욱 구체적으로는 40 내지 45 중량의 함량으로 담침될 수 있다.

[화학식 1]

본 발명의 용어, "담침(charged)"은 액체 안에 물질을 담그는 것을 의미하며, 본 발명에서는 은 설파다이아진 용액 중에 중기공 실리카 나노입자를 풀어 교반함으로써, 실리카 나노입자의 기공을 은 설파다이아진이 채우는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Ag-MSNs과 AgSD가 담침되지 않은 MSNs을 비교한 결과, 표면적, 기공 부피 및 기공 사이즈가 감소함을 확인하였다. 또한, 열무게 분석을 통해 중기공 실리카 나노입자에 담침된 은 설파다이아진의 양을 측정할 수 있었다(도 1 및 2).

본 발명의 다른 양태는, 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자(Ag-MSNs)를 함유하는 아크릴 레진을 제공한다.

상기 '은 설파다이아진', '담침' 및 '중기공 실리카 나노입자'는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "아크릴 레진(acrylic resin)"은 아크릴산이나 메타아크릴산 등의 에스테르로부터 중합한 합성수지를 의미하며, 투명성이 좋은 플라스틱으로서 빛 특히 자외선을 유리보다 쉽게 통과시킨다. 아세톤, 사이안산, 메탄올이 주성분인 액상의 MMA(Methyl Methacrylate)와 액상의 MMA를 고체화시킨 PMMA(PolyMethylMethacrylate)가 아크릴의 주원료로 사용할 수 있다. 아크릴 레진의 제조방식은 MMA 중합과 PMMA 압출, 크게 두 가지 방식으로 구분할 수 있는데 PMMA로 만든 아크릴 시트 자체를 PMMA라고도 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 아크릴 레진은 구체적으로는, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)를 의미할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PMMA는 은 이온을 담침하여 방출할 수 있으며, 이는 폴리우레탄(Polyurethane), 폴리아미드(polyamide), 폴리에스테르(polyesther), 폴리프로필렌(polyprophylene), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL), 폴리락트산(Polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid, PGA) 및 폴리락타이드글리콜라이드(polylactic-glycolic acid, PLGA) 등과 같은 고분자에도 적용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 Ag-MSNs을 아크릴 레진에 함유하는 방법으로써, 초음파를 통해 Ag-MSNs를 액상의 MMA(Methyl Methacrylate)안으로 분산시키고, 상기 Ag-MSNs가 분산된 MMA 액체와 아크릴 레진 분말을 혼합하여 중합하였다.

본 발명에서는 MSNs을 함유하는 아크릴 레진과 Ag-MSNs를 함유하는 아크릴 레진과의 비교 실험을 위해, 상기와 같은 방법으로 MSNs 함유 아크릴 레진을 별도로 제작하였다(실시예 2 참조). 상기 Ag-MSNs 또는 MSNs은 아크릴 레진 분말 대비 여러 중량%로 혼합하여 중합할 수 있으며, 구체적으로는, 0.1 내지 10 중량%를 함유할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 0.5 내지 5 중량%를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, AgSD의 수용성 시스템에 있어서 낮은 용해성으로 인해, 상기 Ag-MSNs를 함유하는 아크릴 레진은 은 이온이 약 30일 동안 지속적으로 방출될 수 있으며, 은 이온이 거의 방출된 이후에는, 은 설파다이아진을 사용한 Ag-MSNs를 함유하는 아크릴 레진에 직접 재담침할 수 있다. 상기 용어, "재담침(Recharing)"은 은 이온이 거의 방출된 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진에 은 설파다이아진을 재충전하는 것을 의미한다. 이를 위해, 본 발명에서는 이미 사용한 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진의 디스크 시료와, 은 설파다이아진 분말을 에탄올에 초음파로 분산시킨 은 설파다이아진 분산액을 같이 배양하였다. 그런 다음, 상기 디스크 시료에 약하게 흡착된 은 설파다이아진을 물/에탄올로 세척하여 제거하고 건조함으로써, 은 설파다이아진이 재담침 된 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진의 디스크 시료를 수득할 수 있었다(실시예 7 참조).

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Ag-MSNs 함유량에 따른 아크릴 레진의 기계적 특성을 알아보았다. 0.5 내지 5 중량%를 함유하는 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진은 모든 경우에서 표면 경도가 유의적으로 증가하였고, 함유량이 증가함에 따라 표면 스크래치가 증가하였다. 또한, 2.5 및 5 중량%를 함유하는 경우에는 표면 에너지가 유의하게 증가함을 확인하였다(도 5).

본 발명의 또 다른 양태는, 은 설파다이아진 담침 중기공 실리카 나노입자를 함유하는 아크릴 레진을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

상기 '은 설파다이아진', '담침', '중기공 실리카 나노입자' 및 '아크릴 레진'은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 있어서, 은 설파다이아진 담침 중기공 실리카 나노입자(Ag-MSNs)를 함유하는 아크릴 레진은 은 이온을 방출함으로써 항균 활성 나타낼 수 있으며, 칸디다 속(Candida sp .) 및 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp .)을 사용하여 이를 확인하였다. 구체적으로는, 구강 미생물의 하나인 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis)를 증식시키고, MSNs 함유 아크릴 레진 및 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진의 각 디스크 시료에 각각 접종한 후, 적절한 배양배지에서 배양하였다. 상기 디스크 시료에 흡착되지 않은 미생물은 제거하고, 12-웰 플레이트에 배양 배지와 함께 넣어 추가로 배양하고, 10% PrestoBlue를 각 웰에 첨가하여 배양하였다. 상기 배양액을 96-웰 플레이트에 옮겨 마이크로플레이트 리더기를 통해 흡광도를 측정함으로써, 항균 활성을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Ag-MSNs 함유량에 따른 아크릴 레진의 항균 활성 및 특성을 알아보기 위해, 0.5 내지 5 중량%의 Ag-MSNs이 함유된 아크릴 레진을 각각 준비하여 실험하였다. 0.5, 1, 2.5, 5 중량% Ag-MSNs를 함유한 아크릴 레진에서의 칸디다 알비칸스(C. albicans) 및 1, 2.5, 5 중량% Ag-MSNs를 함유한 아크릴 레진에서의 스트렙토코커스 오랄리스(S. oralis)에 대한 항흡착 효과를 관찰함으로써, Ag-MSNs 함유 아크릴 레진의 항균 활성을 확인하였다(도 4의 A 및 B).

본 발명의 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진은 구체적으로 1일 내지 28일 동안의 지속적인 은 이온 방출 및 은 설파다이아진의 재담침을 통한 장기적인 항균 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 28일 이상 항균 효과가 지속될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MSNs 함유 아크릴 레진 및 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진의 디스크 시료에 칸디다 알비칸스를 접종하여 YM 배지에서 28일동안 배양하였다. 5 중량% MSN 함유 아크릴 레진의 경우 배양 후 3일 동안 항 흡착 효과를 나타낸 반면, 5 중량% Ag-MSN 함유 아크릴 레진의 경우는 이보다 현저히 우수한, 배양 후 14일 동안 유의적이고 지속적인 항 흡착 효과를 나타냈다(도 6의 A). 또한, 도 6의 A에서 사용한 5 중량% Ag-MSN 함유 아크릴 레진에 은 설파다이아진을 재담침하고, 그 이후 28일 동안 재배양하는 중에 방출되는 은 이온 및 항균 활성을 확인하였다. 그 결과, 은 이온은 28일간 지속적으로 방출되었고, 칸디다 알비칸스에 대한 항균 활성은 배양 후 7일 동안 유의적인 항흡착 활성을 나타냄으로써 확인하였다.

본 발명의 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진은 기존의 아크릴 레진에 비해 기계적 특성이 개선될 수 있으며, 은 설파다이아진(AgSD)의 재담침으로 인한 지속적인 은 방출 및 이를 통한 연장된 항균 효과를 통해, 항균성 치과 재료로서 이용할 수 있다.

도 1은 나노입자 특성을 나타내는 그림이다. A 및 B는 MSNs 및 Ag-MSNs의 나노입자 크기와 중기공 구조의 투과전자현미경 사진이며, C는 Ag-MSNs의 EDS(에너지 분석법) 결과이며, D는 Ag-MSNs의 X-선 회절 분광법 결과를 나타낸다.
도 2의 A는 Ag-MSN의 TGA thermogram을 나타내고, B는 MSN과 Ag-MSN의 N₂ 흡착 등온선을 나타내며, C는 MSN 대비 Ag-MSN의 NLDFT 기공 크기 분포를 나타낸다.
도 3의 A 및 B는 각각 Ag-MSNs 함유량에 따른 아크릴 레진의 3 점 굴곡 및 경도 시험을 나타내는 그림이다(*P<0.05).
도 4는 아크릴 레진에 합침된 Ag-MSN의 항균 효과를 나타내는 그림이다(*P<0.05 vs control(0%), # P<0.05; Ag-MSNs과 MSNs 차이).
도 5는 Ag-MSN이 함침된 아크릴 레진의 표면 특성을 나타내는 그림이다(*P<0.05 vs control, # P<0.05).
도 6은 불멸화된 인간 구강 각질 형성 세포(IHOKs)에 대해 세포독성을 보이지 않는 Ag-MSN이 함침된 아크릴 레진의 재담침가능한 장기 항균 효과를 나타내는 그림이다(*P<0.05 vs 0% counterpart, # P<0.05 vs 5% MSN counterpart).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 은 설파다이아진이 담침된 중기공 나노 입자( Ag - MSNs )의 제조

실시예 1-1: 중기공 나노 입자( MSNs ) 합성

5.5 mmol의 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB, Sigma-Aldrich)를 증류수 960 ml와 2 M NaOH 7 ml 혼합액에 넣어 80℃에서 용해시키고, 67 mmol의 테트라에틸오르소실리케이트(TEOS, Sigma-Aldrich)를 첨가한 혼합액을 80℃에서 2시간 동안 강하게 교반하였다. 상기 혼용액을 8000 rpm에서 3분간 원심분리하여 합성된 MSNs를 분리하고, 물/에탄올 용액을 사용하여 재분산/원심분리 과정을 3번 반복하여 세척한 다음, 마지막으로 70℃에서 밤새 건조시켰다. 계면활성제 CTAB를 제거하기 위해, 수득한 MSNs을 공기가 통하는 조건에서 5시간동안 550℃에서 가열 처리하였다.

실시예 1-2: 은 설파다이아진 ( AgSD ) 담침

은 설파다이아진(AgSD)을 MSNs 안으로 담침함으로써 AgSD-담침 MSNs(Ag-MSNs)을 수득하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1-1에서 합성한 MSNs을 AgSD 용액 중에 1 mg/ml 농도로 분산시킨 후 (산성화된 아세톤-에탄올 혼합물 (1:1) 중의 1 mg/mL AgSD 용액), 6시간 동안 교반하였다. 실시예 1-1과 같은 방법으로, AgSD 용액으로부터 분리하여 수득한 Ag-MSNs을 물/에탄올로 여러 번 세척한 다음, 마지막으로 50℃에서 밤새 건조시켰다. 상기 시료의 입자 사이즈, 형태 및 원소 조성은 에너지분석법(EDS, Oxford, Abingdon, UK)을 이용하여 투과전자현미경 (TEM; 7100, JEOL, Peabody, MA, USA)을 통해 조사하였다. 기공 부피 및 기공 사이즈는 비-국소 밀도 함수 이론법(non-local density functional theory method)에 근거한 자동분석기(Quadrasorb SI, Quantachrome Instruments Ltd., Boynton Beach, FL, USA)를 사용하여 -196.15℃에서의 N₂ 흡착-탈착 측정으로부터 분석하였다. 비표면적은 Brunauer-Emmett-Teller (BET)법에 따라 계산하였다. MSNs에 담침된 AgSD의 양은 질소가 통하는 조건에서 5℃/min의 속도로 600℃까지 가열하면서 열중량분석기(Thermo Plus Evo II, Rigaku, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 고해상도 투과전자현미경을 사용하여 조사한 MSN 및 Ag-MSNs의 입경은 약 85.2±7.7 nm로 유사하였으나, MSNs이 전형적인 중기공 구조를 가진 반면, Ag-MSN은 MSN에 비해 약간 변형된 중기공의 형태는 나타내었다(도 1의 A 및 B). 또한, Ag, S 및 N의 피크를 EDS 및 XRD 분석을 통해 확인함으로써 AgSD가 담침되었음을 확인하였다(도 1의 C 및 D).

도 2에 나타난 결과는, Ag-MSNs에 담침된 AgSD의 양을 열무게 분석(thermogravimetric analysis)을 사용하여 측정한 것이다. AgSD가 담침 된 MSNs은 600℃까지 온도가 상승하는 동안 약 28.2 중량%의 손실을 보여 약 70 중량%의 순수한 설파다이아진이 담침되었다. 이에 근거하여, 상기 담침된 AgSD의 양은 1 g의 Ag-MSN 당 431 mg의 AgSD를 포함함을 알 수 있었다. MSNs 및 Ag-MSNs의 N₂ 흡착-탈착 측정 비교를 통해, MSNs 대비 Ag-MSNs의 표면면적은 832.4±22.1에서 392.6±13.5 m²/g로 감소하였고, 기공 부피는 0.52±0.09에서 0.43±0.08 cm³/g로 줄었으며, 기공의 사이즈도 3.54±0.41에서 3.50±0.31 nm로 약간 감소하였음을 확인하였다(도 2).

실시예 2: 아크릴 레진으로의 MSNs 또는 Ag - MSNs의 통합

가열 중합함으로써 담침되는 은 설파다이아진에 열적 손상을 일으키는 것을 피하기 위해 화학적으로 활성화된 아크릴 레진 제품 (Orthocryl resin, Dentaurum, Ispringen, Germany; lot numbers: 452986B for powder and 450128 for liquid)을 사용하였다. Ag-MSNs는 아크릴 레진 분말 대비 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 중량%의 양으로 준비하고, 상기 함량의 Ag-MSNs을 초음파 (Wise clean, Daehan Science, Seoul, Korea)를 통해 MMA(Methyl Methacrylate) 액체안으로 분산시킨 후, 아크릴 레진 분말을 상기 액체와 1.2:1의 중량비율로 혼합하였다. 40℃ 및 2.2 bar에서 30분 동안 중합한 후 (MultiCure, Vertex, ZEIST, Netherlands), 기계적 시험을 하기 위해 경화 블록 (4 x 15 x 20 mm)을 잘라서 막대 형태의 시료 (1.4 x 3.0 x 18 mm)를 제작하여, 2400 grit SiC paper까지 폴리싱하였다. 디스크 시료(=11.5 mm, d=1.5 mm)는 항균 시험을 위해 제작하였으며, 800grit SiC paper까지 폴리싱하였다. 모든 시료는 Person EO50 시스템(Person medical, Gunpo-si, Gyeonggi-do, Korea)을 사용하였고, 에틸렌 옥사이드(EO) 가스로 멸균하였다.

실시예 3: Ag - MSNs 함유 아크릴 레진의 특성 분석

표면의 특성 및 조성은 3 kV에서의 주사전자현미경 (SEM, Sigma 500, ZEISS, Jena, Germany) 및 15 kV에서의 에너지분석법(EDS, Ultradry, Thermo fisher, Waltham, MA, USA)을 통해 분석하였다. yeast-malt (YM) 배지 (Difco, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) (2 ml)에 담긴 상기 실시예 2에서 제작한 디스크 시료로부터의 은 이온의 방출은 배지를 교환한 후, 유도 결합 플라즈마 원자 방출 분광계(ICP-AES, Optima 4300 DV, PerkinElmer, n=3)를 이용하여 정해진 시간 (1, 3, 및 24 h; 2, 4, 7, 14, 및 28 일)에 분석하였다. 표면에너지(Phoenix 300, SEO, Suwonsi, Gyunggido, Korea)는 Owens-Wendt 방법에 따라 결정하였고, 거칠기는(Ra, SJ-400, Mitutoyo, Japan) 4.0-mm 스캔(n=5)으로 0.5 mm/s 속도로 측정하였다.

실시예 4: 기계적 특성 분석

상기 실시예 2에서 제작한 막대 시료는 스팬 길이 14 mm에서 500 N 로드 셀을 가지는 Instron 5966 기계(MA, USA)상에서 3점 굴곡 시험을 위해 배치하였다. 굴곡 강도 및 탄성 계수는 1.0 mm/min (n=10)의 크로스헤드 속도로 측정하였고, 비커스 경도(HM-221, Mitutoyo, Tokyo, Japan)는 300 gf（2.94N）로 30초 동안 각 시료의 각기 5개의 지점에서 측정하여, 이들 값의 평균을 구하였다（n = 5）.

도 3에 나타난 바와 같이, 아크릴 레진 분말 대비 0.5, 1, 2.5, 또는 5 중량%의 Ag-MSN이 담침된 아크릴 레진 시료 중, 0.5 중량% 담침 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진에서만 굴곡 탄성에 있어서 유의적 증가를 나타내었다. 또한, 굴곡 탄성율은 1, 2.5, 또는 5 중량%의 Ag-MSN 아크릴 레진에서 유의적 증가를 나타내었고, 표면 경도는 모든 함량의 Ag-MSN 아크릴 레진에서 유의적 증가를 나타냄을 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, Ag-MSNs의 SEM 사진은 Ag-MSN 담침 함량의 증가에 따라, 아크릴 레진 표면의 스크래치가 증가함을 나타냈다(도 5의 A 내지 E). EDS 결과를 통해 Ag, N, Si, C, O 및 PT의 피크를 확인하였으며(도 5의 F), 맵핑 결과는 Si 및 Ag가 표면에 잘 분포되어 있음을 나타내었다(도 5의 G 내지 I). 표면 거칠기는 5 중량% MSNs 아크릴 레진에서만 유의적으로 증가하였고, 표면 에너지는 2.5 및 5 중량%의 MSNs 또는 Ag-MSNs 아크릴 레진에서 유의하게 증가하였다(도 5의 J 및 K). 배양 시간이 증가함에 따라 28일 동안 방출된 은 이온의 누적은 약 10 ppm까지 증가했다(도 5의 L).

실시예 5: 항균 활성 분석

칸디다 알비칸스 (Candida albicans, ATCC 10231, USA) 및 스트렙토코커스 오랄리스(Streptococcus oralis, ATCC 9811)는 제조사 프로토콜에 따라 증식시키고, 성장 로그 단계의 미생물 농도 6x10⁷/ml의 100 ㎕를 상기 실시예 2에서 제작한 디스크 시료의 표면에 접종하였다. 상기 디스크 시료에 상기 2종의 미생물이 흡착되도록 5% CO₂, 37℃에서 1시간 배양하고, 흡착되지 않은 미생물은 PBS로 3번 세척하여 제거하였다. 각 웰에 적절한 배양배지를 2 ml씩 첨가한 12-웰 플레이트의 칸디다 알비칸스 및 스트렙토코커스 오랄리스를 12시간 또는 3시간씩 배양한 후, 10% PrestoBlue (Molecular Probes, USA)를 각 웰에 첨가하고, 상기 플레이트를 추가로 1.5시간 배양하였다. 상기 배양액(100 ㎕)을 96-웰 플레이트에 옮기고 마이크로플레이트 리더기 (BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 및 600 nm에서 흡광도를 읽었다. 570 nm에서의 상기 흡광도 값은 각 웰에 대한 600 nm에서의 흡광도 값으로 정규화하였고, 부착된 미생물을 정량화하기 위해 사용하였다. PrestoBlue 분석법에 의해 결정된 표준화된 흡광도와 미생물 수와의 상관 관계를 확인하기 위해, 연속 콜로니 형성 계수 단위 (로그 단위로서의 CFU)를 사용하여 선형 상관관계 (R²= 0.98)를 나타내는 추세선을 작성하였다. 3시간 배양한 미생물로부터 Prestoblue의 결과를 확인하기 위해, 4%의 파라포름알데하이드로 10분간 고정한 후 2종의 아크릴 레진에 부착한 칸디다 알비칸스를 SEM(Sigma 500)으로 촬영하였다. 또한, 살아 있거나 죽은 상태의 부착한 칸디다 알비칸스를 확인하기 위해, live/dead yeast viability kit (ThermoFisher scientific, Waltham, MA, USA)를 실시하고, 이미지는 공초점주사현미경(LSM 510, Zeiss, Switzerland)으로 가시화하였다. 살아 있거나 죽은 세포는 각각 녹색 및 빨간 색으로 시각화하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 칸디다 알비칸스 및 스트렙토코커스 오랄리스를 이용한 항흡착 효과를 확인한 결과, 1, 2.5, 5 중량% Ag-MSNs 함유 시료에서의 스트렙토코커스 오랄리스에 대한 항흡착 및 0.5, 1, 2.5, 5 중량% Ag-MSNs 함유 시료에서의 칸디다 알비칸스에 대한 항흡착 활성이 관찰되었다(도 4의 A 및 B). 2.5 및 5 중량% MSNs 함유 아크릴 레진의 경우, 칸디다 알비칸스의 흡착이 감소한 반면, 스트렙토코커스 오랄리스는 5 중량% MSNs 아크릴 레진의 경우에서만 감소하였다. SEM 및 컨포칼 사진을 통해, 모든 함량의 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진에 대한 칸디다 알비칸스의 흡착은 0 중량%(아크릴 레진) 및 5 중량% MSNs 아크릴 레진에 비해 덜 흡착함을 나타냈다(도 4의 C 내지 N).

실시예 6: 장기 항균 분석 및 재담침 평가

실시예 2에서 제작한 디스크 시료를 5% CO₂, 37℃의 가습 배양기에서 YM 배지안에서 28일동안 증식시켰다. 증식 후, 상기 시료를 정해진 시간에 수집하여 PBS(Welgene)로 3번 세척하고, 진공 건조기에서 건조시킨 후, EO 가스 멸균을 실시하였다. 상기 항균 시험은 상기 실시예 5에서 설명한 조건 하에서 칸디다 알비칸스를 사용하여 실시하였다(n=5). 또한, 상기에서 28일동안 사용한 Ag-MSNs 함유 아크릴 레진에 은 설파다이아진(AgSD)를 재담침하기 위해, 1 ml의 에탄올(Sigma, St. Louis, MO, USA) 당 10 mg의 AgSD 분말을 초음파 분산시켜 준비한 AgSD 용액과 0.5 내지 5 중량%의 각 디스크 시료를 1시간 동안 함께 배양하였다. 아세톤 내 아크릴 레진의 높은 화학적 분해를 피하기 위해 초기 담침과는 달리, 재담침을 할 경우에는 에탄올에서 실시하였다. 상기 재담침된 디스크 시료에 약하게 흡착된 AgSD를 제거하기 위해 물/에탄올로 세척하고 37℃ 진공챔버에서 건조시켰다. 재담침 된 AgSD의 양은 UV/vis 분광법과 최대흡광도 297 nm에서의 검량선을 사용하여 조사하였다.

상기 실험 결과는 도 6에 나타난 바와 같이, 5 중량% Ag-MSNs 아크릴 레진에 대한 칸디다 알비칸스의 항흡착 효과가 배양 후14일까지 유의함에 비해, 5 중량% MSNs 아크릴 레진의 경우에는 배양 후3일까지만 유의하였다(도 6의 A). 28일동안의 배양에 사용한 후, 은 설파다이아진을 재담침한 5 중량% Ag-MSNs을 다시 28일 배양하는 동안 방출되어 누적된 은 이온은 초기 담침에 비해 약간 적은 약 7.5 ppm임을 확인하였다(도 6의 B). 또한, 재담침 5 중량% Ag-MSNs에 대해서도 칸디다 알비칸스는 배양 후 7일 동안 유의한 항흡착 효과를 나타내었다(도 6의 C).

실시예 7: 세포 독성 평가

본 발명에서는 인간 구강 각질형성 세포로서 불멸화된 인간 구강 각질 형성 세포(IHOKs)를 선택하여 사용하였다. 세포를 접종(1 x 10⁴ 세포/ 96-웰 플레이트)한 후, 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 대기 37℃에서 배양하고, 상기 시료 추출물의 일부를 10% 소태아혈청, 페니실린(100 units/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)을 포함하는 2 X DMEM/F-12(3:1)의 일부에 첨가하였다. 24시간 배양한 후, WST assay를 450 nm 파장에서 실시하였다.

각 시료의 추출물을 이용한 각질형성 세포에 대한 세포 독성 실험 결과, 모든 함량의 시료에서 세포 독성을 나타내지 않았으며, 5 중량% Ag-MSNs 추출물을 처리한 결과, 80.5±11.3%의 세포 생존력을 나타냄을 확인하였다.

실시예 8: 통계학적 분석

상기 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준편차로 표시하였다. 통계학적 유의성은 SPSS (Version 21.0; SPSS, Chicago, IL)를 사용한 Tukey post hoc 시험과 변화량의 원-웨이 분석을 통해 평가하였다. P < 0.05의 값을 통계학적으로 유의하다고 간주하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (6)

1. 은 설파다이아진(silver sulfadiazine, AgSD)이 담침된 중기공 실리카 나노입자를 0.5 내지 5 중량%로 함유하는 항균성 치과재료용 아크릴 레진으로서, 상기 은 설파다이아진은 중기공 실리카 나노입자 100 중량 대비 20 내지 50 중량의 함량으로 담침되고, 상기 중기공 실리카 나노입자의 중기공 사이즈는 평균 3 내지 4 nm이며, 상기 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자로부터 은이 방출된 후, 은 설파다이아진을 사용한 은 설파다이아진이 담침된 중기공 실리카 나노입자를 함유하는 아크릴 레진에 직접 재담침할 수 있는 것을 특징으로 하는 아크릴 레진.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 중기공 실리카 나노입자의 입경은 50 내지 100 nm인 것인, 아크릴 레진.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 아크릴 레진은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA)인 것인, 아크릴 레진.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 아크릴 레진은 1일 내지 28일 동안 은을 방출시키는 것을 특징으로 하는, 아크릴 레진.
   
5. 제1항의 아크릴 레진을 포함하는 항균용 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 칸디다 속(Candida) 또는 스트렙토코커스 속(Streptococcus) 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 항균용 조성물.
   

Images