KR101880360B1 - 고-유화안정도를 발휘하는 경피전달용 회합형 나노에멀젼 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매우 안정된 나노스케일의 수중유(oil-in-water) 에멀젼계에 관한 것으로서, 구체적으로는 양친매성 블록 공중합체인 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL]과 유수 계면에서 기계적으로 강한 박막을 제공하기 위한 레시틴(lecithin)을 공동조립하여 상 전이 방법으로 제조한 피부 친화적이고 경피 전달 효과가 우수한 인력적 나노스케일의 수중유 회합형 에멀젼에 관한 것이다.

Description

고-유화안정도를 발휘하는 경피전달용 회합형 나노에멀젼{EXTREMELY STABLE ASSOCIATIVE NANOSCALE EMULSIONS FOR EXCELLENT TRANSDERMAL DELIVERY}

본 발명은 매우 안정된 나노스케일의 수중유(oil-in-water) 에멀젼계에 관한 것으로서, 구체적으로는 양친매성 블록 공중합체인 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL]과 유수 계면에서 기계적으로 강한 박막을 제공하기 위한 레시틴(lecithin)을 공동 조립하여 상전이 방법으로 제조한 피부 친화적이고 경피전달 효과가 우수한 회합형 수중유 나노에멀젼에 관한 것이다.

에멀젼은 액적에 반발력을 부여함으로써 안정화되는데, 일반적으로 반데르발스 및 브릿징 접착(bridging adhesion)과 같은 인력을 압도하는 전기 이중층 반발 및 입체 반발을 이용하여 이루어진다. 다중 상호작용의 조합은 종종 에멀젼의 안정화 메커니즘에 관련된다. 지배적인 상호작용력에 따라, 에멀젼 액적은 반발적 또는 인력적으로 상호작용하여 눈에 띄는 복잡한 유동성을 나타낸다. 상기 에멀젼 액적들은 기본적으로 점탄성의 유체 거동을 나타내며, 이는 액적 부피분율, 액적 크기 및 계면의 기계적 특성에 의해 측정된다. 예를 들어, 반발적 에멀젼의 액적은 압축될 시에 무질서한 탄성 고체를 형성할 수 있는 단거리 반발을 통해서만 상호작용한다. 액적 부피분율이 랜덤 조밀 패킹 밀도(random closely packing density, φ _RCP )에 가까울 시에, 각각의 액적은 주변 액적에 의해 형성된 케이지에 둘러싸인다. 상기 케이지 효과로 인해, 액적의 흐름은 제한되고, 그럼으로써 약한 탄성을 나타내게 된다. φ _RCP 이상에서 상기 액적은 변형된다. 액적들 간의 상호작용 포텐셜 내에서 추가적인 인력적 우물(well)이 반발적 에멀젼의 조성 변화 또는 감손 인력(depletion attraction) 유도에 의해 생겨날 수 있다. 반발적 에멀젼과는 달리, 상기 인력적 에멀젼은 φ _RCP 이하에서도 탄성 유체 거동을 나타낸다. 상기 탄성 유체 거동은 적용된 전단 응력을 견디는 응집 및 젤형 구조의 형성으로부터 발생한다. 결과적으로, 인력적 에멀젼은 반발적 에멀젼에 완전히 필적하는 뚜렷하게 상이한 흐름 및 항복 거동(yielding behavior)을 나타낸다.

에멀젼이 수백 나노미터 스케일로 크기가 감소될 때, 에멀젼의 탄성계수(G')는 액적 크기에 반비례하므로 상기 수백 나노미터 스케일의 에멀젼은 마이크로 스케일의 에멀젼보다 더 강력한 탄성을 나타낸다. 따라서, 나노에멀젼은 장기간 저장 안정성을 가질 수 있을 뿐만 아니라 특이한 광학적, 유변학적 특성을 나타낸다. 이러한 이점에도 불구하고, 나노에멀젼은 주로 열역학적 불안정성으로 인해 불가피하게 불안정화된다. 작은 계면활성제가 계면에서 빠르게 흡착 및 탈착을 번갈아하는 동안에 계면은 역동적으로 변동을 거듭하기 때문에, 이러한 불안정성은 유-수 계면이 작은 계면활성제 분자의 조립에 의해 안정화될 시에 가속화된다.

한편, 나노에멀젼의 제조방법 관련 연구로는 [T G Mason, J N Wilking, K Meleson, C B Chang and S M Graves, Nanoemulsions: formation, structure, and physical properties, Journal of Physics: Condensed Matter 18 (2006) R635-666] 및 [Shi, C.; Zhang, L.; Xie, L.; Lu, X.; Liu, Q. X.; Mantilla, C. A.; van den Berg, F. G. A.; Zeng, H. B. Langmuir 2016, 32, (10), 2302-2310]이 있다. 특히, 수중유형 나노에멀젼 제조방법에 관한 선행특허로는 본 발명자의 대한민국 등록특허 제10-1638688호가 있으나, 상기 특허에는 나노에멀젼의 경피 전달 관련 언급이 없었고, 본 발명 대비 나노에멀젼의 안정성에 한계가 있었다. 본 발명은 안정성이 크게 향상되고 우수한 경피 전달력을 갖는 회합형 수중유 나노에멀젼을 제조하는데 큰 의의가 있다. 또한, 수중유형 나노에멀젼의 제조방법 관련하여 일본공개특허 제2008-142588호가 있으나 제조방법적 차이와 더불어 계면의 안정성을 향상시키는데 한계가 있었다.

이와 같은 본질적인 문제를 해결하기 위해, 계면은 높은 흡착 에너지뿐만 아니라 기계적 응력에 대한 오랜 완화 시간을 갖는 양친매성 물질로 설계되어야 한다.

이에, 본 발명은 중합체성 유화제를 도입하여 에멀젼계의 점탄성을 증가시키고, 에멀젼의 안정성을 크게 강화시키는 것을 목적으로 한다.

또한, 우수한 피부 친화성뿐만 아니라 작은 에멀젼 액적의 높은 확산성으로 인해 약물 분자의 경피 전달을 현저히 향상시키는 회합형 에멀젼 젤 유체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 일 측면은, 개시 용해 온도(T_m)가 83.9℃이고, 융해 열(H_m)이 236.5 J/g인 회합형 나노에멀젼을 제공한다.

본원의 다른 측면은, ¹H NMR 스펙트럼의 298 K 내지 348 K 구간에서 T ₂ 이완시간을 측정한 결과, 1.18 ppm 내지 1.43 ppm 피크의 T ₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 2.05 ms/K 이고, 1.44 ppm 내지 1.73 ppm 피크의 T ₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 1.98 ms/K 이고, 2.08 ppm 내지 2.52 ppm 피크의 T ₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 2.00 ms/K 인 회합형 나노에멀젼을 제공한다.

본원의 또 다른 측면은, 나노에멀젼 액적의 유효 반지름(effective radius, R _eff )과 광산란으로 측정한 수력학적 반지름(hydrodynamic radius, R)의 차가 평균 7.5 nm인 회합형 나노에멀젼을 제공한다.

본원의 또 다른 측면은, 본원에 의해 제조된 회합형 나노에멀젼과 생리활성분자를 추가로 포함하는 회합형 나노에멀젼 함유 경피 전달체를 제공한다.

본원의 또 다른 측면은, 본원에 의해 제조된 회합형 나노에멀젼을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 회합형 나노에멀젼은 높은 구조적 안정성을 가지며, 피부에 친화적인 인력뿐만 아니라 에멀젼 액적의 높은 확산성으로 인해 약 분자의 경피 전달을 현저하게 향상시킬 수 있다.

도 1a는 상 전이 유화에 의해 형성된 O/W 회합형 나노에멀젼의 제조를 위한 모식도; 도 1b는 레시틴 및 PEO-b-PCL로 안정화된 회합형 나노에멀젼 액적의 크기 분포를 그래픽으로 도시한 그래프; 도 1c는 레시틴으로 안정화된 회합형 나노에멀젼 액적의 투과전자현미경(TEM) 이미지; 및 도 1d는 레시틴이 포함되지 않은 순수 에멀젼 액적의 투과전자현미경(TEM) 이미지이다.
도 2a 및 2b는 동결융해 사이클에 따른 에멀젼의 외관을 나타내는 이미지로서, 도 2a는 PEO-b-PCL 에멀젼을 나타내고, 도 2b는 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)로 안정화된 회합형 나노에멀젼을 나타내며, 도 2c는 동결융해 사이클에 따른 평균 액적 크기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3a는 혼합된 미셀(17 wt% 레시틴과 PEO-b-PCL)의 ¹H NMR 스펙트럼; 도 3b는 혼입된 레시틴 농도의 함수로써 미셀 코어의 T ₂ 결과; 도 3c는 T ₂ 이완시간의 온도 의존성(혼합 미셀 대비 PEO-b-PCL 미셀)을 나타내는 그래프; 및 도 3d는 도 3c의 피팅 결과를 나타낸다.
도 4는 농축된 에멀젼의 저장계수 및 손실계수를 나타내는 그래프로서, 도 4a는 PEO-b-PCL 단독으로 안정화된 에멀젼의 저장계수 및 손실계수를 나타내고, 도 4b는 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)로 안정화된 회합형 나노에멀젼의 저장계수 및 손실계수를 나타낸다.
도 5는 레티놀 함유 에멀젼의 생체 내(in vivo) 경피 전달을 나타내는 그래프로서, 각각 도 5a는 PG/에탄올 처리; 도 5b는 PEO-b-PCL 단독; 및 도 5c는 PEO-b-PCL/레시틴으로 안정화된 나노에멀젼의 경피 전달 정도를 나타내는 그래프이며, 도 5d는 실온에서 2시간 동안 8 ㎛ 깊이까지 전달된 레티놀의 축적량을 나타내는 그래프이다.
도 6은 레티놀 함유 에멀젼의 경피 전달을 확인하기 위한 라만 스펙트럼으로서, 각각 도 6a는 레티놀의 라만 스펙트럼이고, 도 6b는 PEO-b-PCL/레시틴으로 안정화된 회합형 나노에멀젼의 피부 깊이에 따른 라만 스펙트럼이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할　수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수　있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고　할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더　포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지　않는다.

이하, 본원의 실시예를 상세히 설명하였으나, 본원이 이에 한정되는 것은 아니다.

다가(multivalent) 상호작용 및 낮은 임계 미셀 농도를 갖는 중합체성 유화제는, 작은 계면활성제에 대한 대안으로 제시되어 왔다. 기본적으로, 중합체성 유화제는 에멀젼 계면에 용이하게 흡착하여 자기 조립 구조를 형성하는데, 낮은 전단 속도에서도 에멀젼 점도를 향상시킨다. 농축된 에멀젼의 경우, 젤형 또는 액정형 유체까지도 형성할 가능성이 높으며, 액적 표면의 기계적 특성을 바꿀 수도 있다. 이러한 이유로, 중합체성 유화제의 도입은 에멀젼계의 점탄성을 증가시키고, 에멀젼의 안정성을 크게 강화시킨다.

높은 구조적 안정성뿐만 아니라 우수한 피부 친화력을 갖는 향상된 에멀젼을 설계하는 것은 경피 전달을 위한 운반체로서 에멀젼을 사용하는데 있어 가장 중요한 요소가 된다. 본 발명에서는 매우 안정된 나노스케일의 수중유(oil-in-water) 에멀젼계를 제안하며, 여기서 양친매성 블록 공중합체인, 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL]은 유수 계면에서 기계적으로 강한 박막을 제공하기 위해 레시틴(lecithin)과 공동조립된다. 본 발명에 사용된 PEO-b-PCL의 화학식 1 및 레시틴의 화학식 2는 각각 하기와 같다:

[화학식 1]

[화학식 2]

.

특히, 계면에서 중합체-지질 유화제를 효과적으로 조립하는데 상 전이 방법(phase inversion composition method)이 적용되고, 이후 프로브-형 초음파처리가 에멀젼의 액적 크기를 나노미터 길이의 스케일로 줄이는데 사용된다. PEO-b-PCL 및 레시틴의 상호작용은 분자 패킹을 더욱 견고하고 강하게 해주어서, ~200%로 계면의 기계적 강도를 강화하는데, 이는 T ₂ 이완분석으로 확인 가능하다. 또한, 본 발명에서는 현탁액 유변학 연구로부터 레시틴과 PEO-b-PCL의 혼성화가 오일의 폭넓은 부피분율에 걸쳐 액적-액적 인력을 발생시켜서 어떠한 응집 또는 상 분리 없이 젤형 에멀젼 유체를 생성한다는 것을 확인하였다. 결과적으로, 본 발명에 따른 에멀젼이 피부에 친화적인 인력뿐만 아니라 에멀젼 액적의 높은 확산성으로 인해 약 분자의 경피 전달을 현저하게 향상시킬 수 있다는 것을 증명하였다.

[실시예]

재료

폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) 공중합체 [PEO-b-PCL]는 ACT(한국)에서 입수하였으며, PCL 대 PEO의 측정 몰비는 1.07:1이었고, 평균 분자량은 PDI 1.37인 10.4 kDa였다. 사용된 레시틴은 상업적으로 입수가능한 Lipoid P75-3(PC 함량: 70%, Lipoid Kosmetik AG, 독일)이었으며, 유채씨유는 Natural Solution(한국)으로부터 제공받았다. 레티놀은 BASF(Retinol 50C, 독일)로부터 Tween 20(중량 1:1)과 혼합된 형태를 구입하였다. 테트라하이드로푸란[THF] (>98%, TCI, 일본)은 제거가능 용매로서 사용되었다. 프로필렌 글리콜 및 에탄올은 Sigma Aldrich(미국)로부터 구입하였고, 염화나트륨은 Samchun pure chemical Co., Ltd.(한국)으로부터 구입하였다. 모든 실험에, 탈이온화 이중 증류수가 사용되었다.

회합형 나노에멀젼의 제조

PEO-b-PCL 및 레시틴 6 w/v%, 유채씨유 20 w/v%을 45℃에서 완전히 용해시켰다. 이후, 탈이온수(DI수) 80 vol%을 오일상에 적하하여 첨가하였다. 상기 과정에서, 낮은 부피의 물에 형성된 유-중-수(W/O) 에멀젼은 물을 첨가함으로써 수-중-유(O/W)로 용이하게 변환되었다. THF는 40℃에서 증발에 의해 시스템에서 완전히 제거되었다. 최종적으로 프로브-형 초음파처리(VCX130, Sonic & Materials Inc., 미국)를 통해 나노스케일 에멀젼이 생성되었다. 상기 조건하에서 추가의 크기 감소가 관찰되지 않음에 따라, 초음파처리 시간은 60% 진폭에서 5분으로 설정되었다. 초음파처리 중에는 에멀젼 콘테이너를 온도-조절 욕조에 담궜다. 상기 온도는 25℃로 설정되었다. 상기 설정은 초음파처리 중에 과열을 방지할 수 있다. 크기 분포는 25℃에서 제타 전위 & 입자 크기 분석기(ELS-Z, Otsuka electronics, 일본)를 이용하여 동적광산란(DLS)을 측정하였다. 다중 산란 효과를 피하기 위해, 모든 샘플은 액적 크기 측정 전에 DI 수를 사용하여 희석되었다. 0.3 이하의 다분산지수를 가지고, 250 nm 내지 300 nm의 수력학적 크기 범위를 가진 회합형 나노에멀젼 액적이 수득되었다. 에멀젼 액적의 모폴로지는 120 kV 으로 작동하는 투과전자현미경(TEM, Energy-Filtering Transmission Electron Microscope, LIBRA 120, Carl Zeiss, 독일)으로 분석되었다. TEM 관찰 전에, 모든 시험 샘플은 1 wt%의 우라닐 아세테이트을 사용하여 음으로 염색하였다.

상 전이 거동 분석

상 전이 거동에서 레시틴의 효과를 시험하기 위해 전도도 측정을 수행하였다. 이를 위해, 상 전이 중에 에멀젼계의 연속상에서 전도도 변화를 관찰하였으며, 레시틴의 농도는 0 w/v% 내지 1 w/v%로 변화시켰다. 이때, PEO-b-PCL 및 레시틴의 전체 농도는 6 w/v%로 설정하였으며, 유채씨유의 농도는 20 w/v%였다. 상 전이는 PEO-b-PCL과 혼입된 레시틴이 증가함에 따라 낮은 부피분율의 물에서 일어났다. 전체 전도도 값이 매우 낮았던 이유로, 액상(aqueous phase)에 10 mM의 NaCl을 함유하는 에멀젼의 전도도 측정을 수행하였다. 결과적으로, 상 전이점은 레시틴 농도에 관계없이 약 0.2였다. 이것은 레시틴이 이들의 양쪽성이온(zwitterion)으로 인해 상 전이 거동에 영향을 준다는 것을 보여준다. 에멀젼 샘플의 전도도는 실온에서 전도도 모듈(856 Module, Metrohm, 스위스)로 측정되었다.

에멀젼의 안정성 평가

동결융해 사이클로 에멀젼의 안정성을 측정하였다. 이를 위해, PEO-b-PCL 및 레시틴으로 안정화된 에멀젼을 준비하였으며, 여기서 레시틴은 전체 6 w/v%를 위해 상이한 농도(0, 9, 17, 및 100 wt%)로 혼입되었다. 7 ml의 에멀젼 샘플이 각각의 유리튜브(내부 직경 1 cm, 높이 10 cm)에 넣어졌다. 에멀젼이 들어있는 유리튜브는 냉동고에서 12시간 동안 -20℃에서 동결된 후 4시간 동안 실온에서 해동되었다. 각각의 동결융해 사이클에서, 액적 크기 변화는 DLS 기법으로 측정되었으며, 스냅사진은 디지털카메라(STC-GEC83A, Sentech, 일본)를 이용했다.

¹ H NMR을 이용한 막 유동성 분석

PEO-b-PCL, 레시틴 및 D2O으로 구성된 미셀의 구조 조직의 특성 분석을 위해 ¹H NMR 기법이 적용되었다. 미셀의 코어부는 O/W 계면에서 막의 조성과 동일하다. ¹H NMR 분석을 위한 미셀 샘플은 PEO-b-PCL, 레시틴 및 D2O로 구성된 혼합 용액에 프로브-형 초음파 처리를 적용하여 제조되었다. PEO-b-PCL에 대한 레시틴의 비율은 0, 9, 17, 23 및 29 wt%였다. DLS 측정으로부터 얻은 미셀의 평균 유체역학적 직경은 71±14 nm였다.

현탁액 유변학(레올로지) 분석

시간, 변형 및 주파수에 따른 농축된 에멀젼의 저장계수 및 손실계수를 측정하기 위해 선형 진동 유변학 실험이 수행되었다. 회전증발기에서 샘플을 농축한 후에, 유변학 실험을 수행하기 위한 오일의 상이한 부피분율, φ_오일이 얻어졌다. 저온에서 24시간 동안 샘플의 물을 증발시키기 전후의 중량 차를 산출하여 부피분율을 계산하였다. 측정은 25 nm-직경의 원추-판 기하학적 구조를 사용한 유량계(Anton Paar Physica MCR 501)로 25℃에서 수행하였다. 샘플 환경은 용매 트랩으로 조절하였다. 부피분율 0.5에서 상기 샘플은 형상을 고정하는 밀도있는 페이스트이지만, 충분한 응력이 적용되면 유동적일 수 있다. 레시틴이 혼입 및 혼입되지 않은 두 개의 나노에멀젼 샘플에 각각 600초, 900초 동안 2500 s^-1, 3500 s^-1의 일정 전단 속도 흐름을 부여함으로써 각각의 측정 전에 사전-전단(pre-shear)이 적용되었다. 0.5 이하의 부피분율에서 샘플은, 임의의 적용된 응력에서 흐를 수 있는, 자연상태에서 대부분 점성이 있었다.

생체 내 경피 전달 실험

프로필렌 글리콜/에탄올(1/1), PEO-b-PCL만으로 안정화된 나노에멀젼 20 vol% 및 레시틴/PEO-b-PCL(1/5)으로 안정화된 회합형 나노에멀젼 20 vol%에 0.3 w/v%의 레티놀을 각각 포함하는 세 개의 샘플을 제조하였다. 상기 에멀젼 샘플을 피부에 적용한 30분 후에 측정을 시작하였다. 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)에 의해 안정화된 에멀젼으로 처리한 후에 피부 표면으로부터 24 ㎛ 이하까지 2 ㎛ 마다 라만 스펙트럼을 수집하였다. 샘플 적용 30분 후에 피부의 레티놀 함량을 즉시 측정하였으며, 0.5, 1, 2시간 후에도 측정을 진행하였다.

생체 내 경피 전달 분석

공초점 라만 분광계(Model 3510 SCA, River Diagnostics, Rotterdam, 네덜란드)를 이용하여 피부 표면 아래의 상이한 깊이에서의 라만 스펙트럼을 수득하였다. 라만 핑거프린트 스펙트럼(400-2200 cm^-1)은 피부 표면으로부터 수직으로 24 ㎛ 깊이까지 2 ㎛ 간격으로 기록되었다. 각각의 스펙트럼에 있어서, 노출 시간은 5초로 하였으며, 측정 후에 레이져는 같은 부위 내 다른 피부 영역으로 위치시켜 측정을 반복하였다. 전처리, 0, 0.5, 1, 2시간 후에 각각의 처리 부위를 위해 10개의 스캔을 수집했다. 수집된 데이터는 분석 반응을 위해 SkinTools v2.0(River Diagnostics, Rotterdam, 네덜란드)의 내장형 소프트웨어(Skin Tools® software)를 통해 검정(calibration)되고 계산되었다. 본 실시예에서는 레티놀이 전달되는 모델 분자로서 사용되었으며, 1594 cm^-1에서 라만 대역 스펙트럼을 갖는다. 레티놀의 함량은 물리적인 효과를 보완하기 위해 임의 단위(A.U.)에 따라 케라틴의 함량 대비 상대적 강도로 계산되었다. 따라서 수득된 값은 케라틴 양에 상대적인 레티놀의 함량을 의미한다.

중합체성 유화제를 사용하는 대부분의 경우에 에멀젼 액적(drop)은 입체 반발에 의해 안정화된다. 따라서, φ _RCP 이하에서는 젤형 유체를 형성할 수 없게 된다. 에멀젼 젤상(gel phase)을 생성하기 위해, 인력적 상호작용을 유도하는 추가적인 양친매성 물질이 필수적으로 혼입된다. 상기 첨가제는, 액적들 간에 인력은 나타나게 하는 반면 에멀젼 안정성에는 영향을 미치지 않아야만 한다. 이를 위해, 정전기 및 쌍극자-쌍극자 상호작용을 이용함으로써 다른 양친매성 물질과 상호작용할 수 있는, 레시틴의 사용이 고려될 수 있다. 사실, 혼합(hybrid) 약물 담체 및 인공 세포막과 같은 다양한 자기 조립 초분자 구조의 제작을 위한 양친매성 분자 빌딩 블록으로 이들이 넓게 활용되는 것이 가능하다. 예를 들어, 양이온성 양친매성 바이오폴리머와 하전된 인지질의 제어된 정전기 상호작용은 나노운반체(nanovehicle)를 생성한다. 레시틴 분자의 극성 또는 쌍극자를 조정하는 것은 또한 분자간 쌍극자-쌍극자 상호작용을 향상시킨다. 게다가, 레시틴의 말단 메틸기는 국소장(local field) 또는 지질쇄(lipid chain) 패킹 밀도를 통해 레시틴 단층(monolayer)의 표면 포텐셜에 간접적으로 기여한다. 따라서, 이러한 해석으로 판단하건대, 지질 및 중합체성 유화제로 이루어진 잘 설계된 계면 막이 있는 매우 안정한 회합형 나노에멀젼이 제조된 것을 고려하면, 고농축된 에멀젼 조건 하에서나 강한 외부 물리적 응력이 존재할 시에 액적-대-액적 상호작용이 어떻게 액적의 어떠한 구조 붕괴 또는 분해 가능성 없이 에멀젼 유체 거동에 영향을 미치는지를 명확하게 이해할 수 있다.

본 발명에서 도입한 극도로 안정한 수중유(O/W) 회합형 나노에멀젼계는 양친매성 블록 공중합체, 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL]이 계면에서 레시틴과 공동조립되고 밀접하게 패킹된 점탄성 중합체/레시틴 혼성 막을 형성한다. PEO-b-PCL과 레시틴의 계면 혼성화가 쌍극자-쌍극자 상호작용으로 인한 오일 액적의 표면에 인력을 제공하여 회합형 나노에멀젼 젤 유체를 유도하는 것이 본 발명에서 접근하는 본질이다. 본 발명에 의해 개발된 신규 결합(회합형) 나노에멀젼 유체는 오일 액적의 넓은 부피분율에 걸쳐서 전형적 젤형 유동학적 특성을 나타낸다. 이런 이유로, 중합체-안정화된 에멀젼계 내 레시틴의 이용이 에멀젼 액적의 내부 계면 및 소수성 영역에서 PEO-b-PCL의 구조 체제에 대한 제어를 가능하게 하여, 결국 기계적으로 강한 계면 막을 생성한다는 것을 밝혀냈다. 회합형 나노에멀젼 액적의 인력적 유체 거동은 오일 액적의 부피분율에 걸쳐서 진동 측정을 이용하여 현탁액 유동학 연구를 수행함으로써 실험적으로 입증했다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 상 전이조성법 및 프로브-형 초음파처리가 순차적으로 적용되어 회합형 나노에멀젼이 제조되었다. 기존 연구에서, 상 전이 과정이 유-수 계면에서 고분자량 중합체를 조립하기 위한 충분한 시간을 제공하여 양친매성 블록 공중합체로 안정화된 에멀젼을 생성하는데 매우 효과적이라는 것이 증명된 바 있다.

우선, 도 1a에 도시한 바와 같이, 상 전이 방법을 통해 유채씨유(rapeseed oil), 물, PEO-b-PCL 및 레시틴으로 이루어진 O/W 회합형 에멀젼을 생성한다. 상기 상 전이는 오일상(용매, 중합체 및 레시틴) 내로 물을 적하하여 추가함으로써 유중수(W/O)에서 수중유로 바뀌었고, 이는 연속상의 전도도 변화를 관찰하여 확인하였다. 특히, 물을 서서히 첨가하여 유화 중에 계면에서 흡착되기 위한 블록 공중합체에 충분한 시간을 제공했다. 이러한 과정은 고압 에너지 유화법으로만 수득된 에멀젼계에 비하여 에멀젼의 안정성을 향상시켰다. 상기 상 전이 후에, 액적의 평균 반지름은 마이크로미터 스케일 내에 있었는데, 이는 중합체 이완 시간이 상 전이 시간보다 훨씬 더 길다는 사실로 설명되었다. 따라서, 에멀젼을 나노스케일 크기로 줄이기 위해 프로브-형 초음파처리(probe-type sonication)가 적용되었다. 제대로 미세화된 나노 액적은 250 nm 내지 300 nm 범위로 형성되었으며, 도 1b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이 DLS 및 TEM 분석으로 확인되었다. 도 1b는 에멀젼 액적(오일= 20 vol%. 레시틴/PEO-b-PCL= 1/5 w/w)의 크기 분포를 그래픽으로 도시한 그래프이며, 도 1c 및 도 1d는 레시틴의 포함 여부에 따른 에멀젼의 TEM 이미지이다. 레시틴이 포함된 회합형 나노에멀젼 액적의 TEM 이미지(도 1c)는 PEO-b-PCL만으로 안정화시킨 나노에멀젼의 TEM 이미지(도 1d)와 구별되었다. 이때 레시틴/PEO-b-PCL의 전체 농도는 6 w/v%였으며, 스케일바는 300 nm로 하였다.

동결 과정에서, 에멀젼 액적은 얼음 결정들 사이에서 부분적으로 동결되지 않은 좁은 수성 채널에 갇히고, 계면 막은 더욱 붕괴되는 경향이 있어 상기 에멀젼 액적은 응집된다. 따라서, 계면 막의 상이한 조성에 따른 나노에멀젼의 구조적 분산 안정성을 신뢰있게 평가하기 위하여 반복적인 동결융해(freeze-thawing) 공정이 실시된다. 본 발명에서는 레시틴 대 PEO-b-PCL을 0 내지 100 wt%의 상이한 비율로 다양하게 하여 반복적인 동결융해 공정을 실시하였다.

동결융해 안정성은 -20℃에서 12시간 동안 등온 저장하고 추가로 융해한 후에 액적 크기, 오일분리 현상 및 중력분리(gravitational separation) 정도를 측정하여 평가되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 겉보기 및 액적 크기의 변화에서 뚜렷한 차이점이 관찰되었다. 도 2a는 PEO-b-PCL를 단독으로 사용하여 안정화된 에멀젼의 동결융해 사이클을 적용한 후의 외관으로서, 화살표는 동결융해 후에 용리된 오일을 나타낸다. 반면, 레시틴/PEO-b-PCL로 안정화된 회합형 나노에멀젼(도 2b)에는 용리 현상이 나타나지 않았다. 100 wt% PEO-b-PCL에 의해 안정화된 나노에멀젼에서는, 평균 액적 크기의 급격한 변화가 없음에도 불구하고 2차 동결융해 사이클부터 자유 오일층(free oil layer)이 에멀젼의 상부에서 관찰되었다. 이것은 동결융해 공정이 액적의 응집보다 계면 막의 파열을 유도했다는 것을 의미한다. 반면에, 모든 에멀젼에 있어서, 중합체 막 내로 레시틴을 혼입하는 것은 액적 크기가 초기 액적 크기보다 약 10% 내지 약 20% 더 크다 하더라도 오일의 용리뿐만 아니라 액적 크기의 증가를 방지한다. 도 2c는 동결융해 사이클에 따른 평균 액적 크기의 변화를 나타내는 그래프로서, 레시틴의 농도는 PEO-b-PCL 질량 대비 변화하였으며, 각각 0 wt% (■), 9 wt% (●), 17 wt% (▲), 100 wt% (▼) 및 오일 = 20 vol%로 하였고, 레시틴/PEO-b-PCL의 전체 농도는 6 w/v%로 하였다. 개선된 계면 특성은 상이한 조성으로 제조된 미셀(micelle) 샘플로 수행된 DSC 분석으로 또한 확인되었다. 레시틴 및 PEO-b-PCL로 혼합된 미셀(mixed micelle)의 열용량이 단일 조성인 레시틴 또는 PEO-b-PCL의 단일 조성 중 하나에 비하여 현저히 증가하였음이 나타났으며, 이는 미셀의 열분석 결과를 통해 확인 가능하다(표 1). 상기 결과는 레시틴 및 PEO-b-PCL의 상호작용이 동결 및 열과 같은 아주 거친 스트레스 상태를 견디기 위한 기계적 포텐셜을 부여한다는 것을 제시한다. 또한, 본 발명에서는 중합체 막의 패킹 밀도가 PEO-b-PCL 내로 레시틴을 혼입하는 것으로 제어될 수 있다는 가설을 세웠다.

PEO-b-PCL로 혼입된 레시틴 비율에 따른 패킹 밀도를 조사하기 위하여 NMR 기술을 도입하였다. 상기 NMR 분광법은 원자 해상도의 미셀의 구조적 및 동적 정보를 나타내는데 성공적으로 사용되어 진다. 미셀의 물리적 특성은 화학변위, T ₁ / T ₂ 이완시간, J-결합 및 핵 오버하우저 효과(nuclear overhauser effect)와 같은 몇 가지 NMR 파라미터를 숙고하여 반영한다. 본 발명에서는, 혼합된 미셀들(레시틴과 PEO-b-PCL) 및 중합체성 미셀(PEO-b-PCL 단독) 간의 국소 유연성 또는 안정성의 차이점에 중점을 둔 몇 가지 T ₂ 분석을 수행하였다. NMR 분석에 있어서, 모든 샘플은 미셀 형태로 제조되었으며, 미셀 코어의 소수성 부분은 에멀젼의 계면 막 중 하나와 동일하게 했다. 도 3a는 혼합된 미셀(레시틴 17 wt% 혼입)의 1D 양성자 스펙트럼을 나타낸다. 미셀의 일반적인 스펙트럼 특징인, 몇몇 폭넓은 신호가 4.5 ppm 내지 1.0 ppm에서 감지되었으며, 이는 PEO-b-PCL의 소수성 부분으로부터 주로 유래되었다. 레시틴의 스펙트럼 특징은 폭넓은 미셀 신호에 덮여졌고, 상대적으로 낮은 분자 농도이기 때문에 명확하게 감지될 수 없었다. 도 3b는 혼입된 레시틴 농도의 함수로서 미셀 코어의 T ₂ 분석을 나타낸다(a: 1.18 ppm - 1.43 ppm, b: 1.44 ppm - 1.73 ppm, c: 2.08 ppm - 2.52 ppm). 17 wt%까지 레시틴 함량을 증가시킴으로써, 미셀 코어의 T ₂ 이완시간이 제한된 국소 유연성으로 인해 감소되었다. 이러한 경향은 레시틴이 중합체 체인 중간에서 견고하게 패킹되었음을 분명하게 의미하였다. 그러나, 이완 특성은 레시틴 함량이 17 wt% 이상이 된 후에 오히려 약간 증가되었다. 이러한 거동이 (i) 너무 많은 레시틴 함량은 제한된 소수성 공간으로 인해 미셀의 국소 구조를 줄이거나 (ii) 레시틴이 미셀 코어 내부에 혼입되기보다 서로 응집되었음(혼합된 미셀의 실제 레시틴 함량은 기대치보다 낮았음)을 무리 없이 설명했다. 또한, 혼합된 미셀의 향상된 물리적 안정성은 T ₂ 분석(도 3c 및 3d)의 온도 의존성(298 K - 348 K)에서도 관찰되었다. 도 3c는 (C) 혼합 미셀 대비 PEO-b-PCL 미셀의 T ₂ 이완시간에 따른 온도 의존성을 나타내며, 도 3d는 도 3c에 따른 피팅 결과를 나타낸 그래프이다. 구체적으로 설명하면 온도변화에 따른 T ₂ 이완시간 정도는 도 3d에서 기울기를 나타낸다. 기울기 정도를 비교하면 미셀의 열에 대한 이완정도를 물리적 안정성으로 표현할 수 있다. 즉, T ₂ 경향(기울기)는 온도 변화의 결과에 따른 미셀의 구조 변형 정도를 나타내기 때문에, 레시틴 혼입된 미셀의 더 높은 열안정성이 상응하여 확인되었다.

본 발명에서는 레시틴 혼입으로부터 발생하는, 에멀젼의 유변학에서의 인력적 상호작용의 영향을 또한 조사하였다. 유동성 측정은 주파수 ω= 1 rad/s, 변형 진폭 γ = 0.5 %에서 PEO-b-PCL만으로 안정화된 나노에멀젼 및 PEO-b-PCL/레시틴(w/w = 5/1)으로 안정화된 회합형 나노에멀젼 두 종류로 수행되었다. 상기 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이 두 가지 에멀젼의 저장계수(storage moduli) 및 손실계수(loss moduli)가 분산상 부피분율에 의존한다는 것을 의미한다. 그러나, 두 가지 에멀젼의 탄성은 부피분율이 증가함에 따라 상이한 거동을 나타냈다. 도 4의 G'(■)는 농축된 에멀젼의 저장계수이고, G"(□)는 농축된 에멀젼의 손실계수를 나타내며 도 4a는 PEO-b-PCL 단독으로 안정화된 에멀젼의 저장계수 및 손실계수, 도 4b는 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)로 안정화된 에멀젼의 저장계수 및 손실계수를 나타낸다. 모든 에멀젼에 있어서, PEO-b-PCL의 농도는 5 w/v%로 설정되었으며, 주파수 ω= 1 rad/s 및 변형률 진폭 γ = 0.5 %를 측정 조건으로 하였다. 레시틴이 포함되지 않은 에멀젼 샘플(도 4a)의 경우, 약 0.5의 부피분율에서 유체-형 내지 고체-형의 전이를 관찰했다. 상기 결과는 저농도에서는 입자가 다른 입자의 존재를 느끼지 않고 서로 자유롭게 통과하지만, 입자들이 서로를 느끼기 시작하는 어느 점에서 이들은 표면장력으로 인해 압축되고 에너지가 계면에 저장되는, 반발적 에멀젼을 연상시킨다. 상기 전이는 다분산계에서 0.58인 랜덤 밀접 패킹에 상응하는 부피분율의 강체구(hard sphere)에서 발생한다. 더 낮은 부피분율에서 이러한 전이를 볼 수 있다는 사실은 유효 반지름(effective radius, R _eff )이 광산란으로 특징화된 수력학적 반지름(hydrodynamic radius, R)보다 조금 클 수도 있다는 것을 의미한다. R과 R _eff 의 차이는 약 7.5 nm이며, 이는 하기 간단한 식으로 구해질 수 있다(여기서, R은 나노에멀젼 액적의 수력학적 반지름이고, R _eff 는 유효 반지름이며, N은 총 액적의 수이고, V_tot는 에멀젼의 총 부피이다).

7.5nm는 정전기적 반발과 다른 배제 체적을 포함할 수 있다. 반면에, 레시틴이 포함된 회합형 나노에멀젼 샘플(도 4b)은 인력적 에멀젼으로 거동했다. 인력은, 젤을 만들고 ~10^-4의 낮은 부피분율에서 걸러낼 수 있도록 서로를 달라붙게 했다. 상기 여과는 랜덤 밀접한 패킹 하에서 탄력성을 증가시켰다. 매우 높은 부피분율에서, 탄성을 야기하는 메커니즘은 인력적 및 반발적 에멀젼 모두가 동일해야 하므로, 그래프 곡선은 서로 겹쳐져야 한다. 상기 결과는 레시틴에 의해 야기된 계면의 인력이 액적들 사이에서 연결된 네트워크를 갖는 젤-형 구조를 초래하여, 전단응력에 대한 기계적 저항성을 향상시킨다는 것을 설명한다.

상기 결과에서 확인된 바와 같이, 계면에서 레시틴의 혼입은 액적들 간의 인력적 상호작용뿐만 아니라 계면에서 흡착된 블록 공중합체의 견고한 패킹을 부여하여, 에멀젼의 안정성을 현저하게 개선시킨다. 또한, 레시틴은 그 조성이 인체의 체질과 잘 부합함에 따라, 지질이 풍부한 도메인의 교란을 통해 소수성 분자의 효과적인 경피 수송을 야기하기 때문에, 보통의 유화제와 비교하여 우수한 생체적합성 및 피부 안전성을 제공한다. 이러한 장점 덕분에, 본 발명에서 제조된 회합형 나노에멀젼이 경피 전달의 운반체로서 응용에 특히 적합할 수 있다고 예상하였다. (생리)활성분자인, 레티놀의 생체 내(in vivo) 인간 피부 침투에 투과 증진제로서 이들의 효과는 공초점 라만 분광법을 이용하여 평가되었다. 이를 위해, 프로필렌 글리콜(PG)/에탄올(EtOH) 처리, PEO-b-PCL 단독 및 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)로 안정화된 나노에멀젼의 세 가지 샘플이 각각 제조되었다. 모든 샘플들에 있어서, 피부 표면으로부터 24 ㎛ 까지 매 2 ㎛에서 값들을 합산하고 그 값을 측정하였으며, 이에 따른 각질층에서 레티놀의 깊이 신호 강도 프로필을 도 5에 나타냈다. 도 5는 레티놀 함유 에멀젼의 생체 내(in vivo) 경피 전달을 나타내는 그래프로서, 각각 도 5a는 프로필렌 글리콜(PG)/에탄올(EtOH) 처리, 도 5b는 PEO-b-PCL 단독 및 도 5c는 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)로 안정화된 나노에멀젼의 경피 전달 정도를 나타내는 그래프이며, 도 5d는 실온에서 2시간 동안 8 ㎛ 깊이까지 전달된 레티놀의 축적량을 나타내는 그래프이다. 이때, 도 5c의 레시틴/PEO-b-PCL의 총 농도는 6 w/v%였으며, 도 5a의 프로필렌 PG/에탄올(=1/1 v/v)이 대조군으로 사용되었다. 시험 샘플에서 레티놀의 농도는 0.3 w/v%으로 하였다. 레티놀의 신호 강도값은 대상 내부로 깊이 갈수록 더욱 약해져 약 15 ㎛ 깊이에서는 수평이 되는 것으로 나타났다. 전체 깊이에 있어서, PEO-b-PCL 및 레시틴(=5/1 w/w)으로 안정화된 회합형 나노에멀젼에서 레티놀 신호 강도값은 다른 샘플들인 레티놀 용액 및 PEO-b-PCL만으로 안정화된 나노에멀젼의 약 두 배였다. 이러한 침투 특성은 레시틴의 속성에 의해 설명될 수 있다. 이것은, 지질이 더 잘 투과할 수 있는 패킹을 초래하면서, 레시틴이 혼입된 회합형 나노에멀젼이 각질층 내 세포 간 지질과 접촉할 수 있기 때문이다. 피부의 8 ㎛ 깊이까지 전달된 생리활성물질의 측정 시간별 축적량을 측정한 결과(도 5d)에서는 레티놀과 같은 생리활성분자의 총 함량이 화학증진효과 대비 최소 150% 이상으로 나타났으며, 여기서 상기 화학증진효과는 PG/EtOH 처리 및 PEO-b-PCL만으로 안정화된 나노에멀젼을 사용하였을 때 나타나는 경피 전달 효과로 이는 레티놀 축적량으로 측정된다. 도 6의 피부 깊이에 따른 라만 스펙트럼을 통해서도 레시틴/PEO-b-PCL(=1/5 w/w)에 의해 안정화된 회합하여 나노에멀젼의 향상된 경피 전달력을 확인할 수 있다.

요약하면, 본 발명에서는 계면에서 탄력있는 PEO-b-PCL/레시틴 박막을 형성하여 극도로 안정한 O/W 회합형 나노에멀젼을 제조하는 전략을 제시한다. 계면에서 PEO-b-PCL의 패킹 밀도는 혼입되는 레시틴의 농도 조절을 통해 최적화될 수 있는데, 이는 인접하는 레시틴 분자의 쌍극자-쌍극자 인력에 의한 추가적인 인력적 상호작용 때문이다. 에멀젼의 유동성 측정은 레시틴에 의해 야기되는 계면 인력을 반영하는 것에 또한 부합한다. 레시틴이 포함되지 않은 에멀젼은, 패킹 분율 이상에서 액적들이 압축되고 에너지를 저장하기 시작하여 탄성 반응을 보이는 반면에, 랜덤 밀접 패킹 하에서는 점성 반응이 우세적이다. 이러한 거동은 반발적 에멀젼의 반응을 따른다. 레시틴의 첨가는 액적이 인력을 갖는데 필요한 낮은 부피분율에서 고체 반응을 나타내면서 입자 상호작용을 완전히 개질하고, 젤을 여과함으로써 식별될 수 있다. 인력적 나노에멀젼의 이러한 계면 특성으로 인해, 이들은 압축 조건하에서도 상당히 개선된 콜로이드 안정성을 나타냈다. 또한, 활성분자의 인간 피부 침투를 위한 우수한 경피 전달 성능을 보였다. 이러한 연구 결과들은 인력적 상호작용을 통하여 밀접하게 패킹된 점탄성 막이 있는 계면을 갖는 블록 공중합체 기반 나노에멀젼의 설계에서 생체원천성 지질의 우수한 포텐셜을 뒷받침한다. 따라서, 본 발명에서는 상기 인력이 있고 안정한 회합형 나노에멀젼이 약물 전달에 있어서 폭넓은 응용의 유용성을 갖기를 기대한다.

Claims (9)

1. 유채씨유를 포함하는 유상 및
   유상과 수상의 계면에 위치한 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL] 및 레시틴을 포함하는 수중유(O/W) 회합형 나노에멀젼에 있어서,
   상기 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL] 의 분자량은 10.4KDa이고,
   상기 폴리(에틸렌 옥사이드)-블록-폴리(ε-카프로락톤) [PEO-b-PCL] 및 레시틴의 전체 농도는 6 w/v%이며,
   상기 나노 에멀젼의 액적의 크기가 250~300nm이고, 액적의 크기의 다분산 지수가 0.3 이하이며 개시 융해온도(T_m)가 83.9℃이고, 융해 열(H_m)이 236.5 J/g이며,
   ¹H NMR 스펙트럼의 298 K 내지 348 K 구간에서 T₂ 이완시간을 측정한 결과,
   1.18 ppm 내지 1.43 ppm 피크의 T₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 2.05 ms/K 이고,
   1.44 ppm 내지 1.73 ppm 피크의 T₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 1.98 ms/K 이며,
   2.08 ppm 내지 2.52 ppm 피크의 T₂ 이완시간 변화 직선의 기울기가 2.00 ms/K 이고,
   나노에멀젼 액적의 유효 반지름(effective radius, R_eff)과 광산란으로 측정한 수력학적 반지름(hydrodynamic radius, R)의 차가 평균 7.5 nm인, 수중유(O/W) 회합형 나노에멀젼.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항의 수중유(O/W) 회합형 나노에멀젼과 생리활성분자를 추가로 포함하는, 경피 전달체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 생리활성분자는 세라마이드， 글루코실 세라마이드， 레티놀, 레티놀 유도체， 레티닐아세테이트， 레티닐팔미테이트， 토코페롤， 토코페릴아세테이트， 토코페릴리놀레이트, 토코페릴니코티네이트, 에피갈로카테킨갈레이트， 알파리포산， 리놀레익산, 코엔자임 Q10， 레스베라톨, 히알루론산， 식물 추출 에센셜 오일 또는 이들의 유도체 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 경피 전달체.
8. 제6항에 있어서,
   피부의 8 ㎛ 깊이까지 전달된 상기 생리활성분자의 측정 시간별 축적량을 측정한 결과, 상기 생리활성분자의 총 함량이 화학증진효과 대비 최소 150% 이상인, 경피 전달체.
9. 제1항의 수중유(O/W) 회합형 나노에멀젼을 포함하는, 화장료 조성물.

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