KR101871593B1 - HIF-1α의 메틸화를 표적으로 하는 혈관신생억제제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본원은 HIF1-α단백질과 SET7/9 메틸트랜스퍼라아제 또는 LSD1 디메틸라아제의 상호작용을 표적으로하는 혈관신생억제제를 스크리닝하는 방법을 개시하며, 본원에 따른 방법에 의해 스크리닝된 물질은 항암제로서 유용하게 개발될 수 있다.

Description

HIF-1α의 메틸화를 표적으로 하는 혈관신생억제제 스크리닝 방법 {Method of screening anti-angiogenesis agent targeting methylation of HIF-1α}

본 발명은 HIF-1α 메틸화를 표적으로 하는 혈관신생억제제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

저산소-유도 인자-1(hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)는 저산소 관련 반응을 매개하고 혈관신생성, 침투 및 대사에 관련된 유전자의 발현을 조절한다. HIF-1는 이종성 이중의 전사인사로 산소 조절되는 α 소단위(HIF-1α 또는 HIF-2α) 및 컨슈티튜티브하게 발현되는 β 소단위(HIF-1β)로 구성되어 있다. HIF-1α/β 헤테로다이머는 정상산소 조건에서는 불안정하고, HIF-1α는 저산소 환경에서는 안정화된다.

HIF-1α는 내피세포의 마스터 조절인자인 VEGF를 직접적으로 조절함으로써 병리생리학적인 혈관생성에서 중요한 역할을 한다. 마우스에서 HIF-1α 기능이 획득되면 VEGF, 미세혈관 밀도, 육종 성장 및 혈관형성 발현을 증가시키고, 마우스에서 HIF-1α 기능이 손실되면 육종 성장 및 혈관형성을 억제한다(Ravi, R. et al. Regulation of tumor angiogenesis by p53-induced degradation of hypoxia-inducible factor 1alpha. Gene. Dev. 14, 34-44 (2000); Stoeltzing, O. et al. Role of hypoxia-inducible factor 1alpha in gastric cancer cell growth, angiogenesis, 및 vessel maturation. J. Natl. Cancer Inst. 96, 946-956 (2004)).

한국공개특허 공개번호 제10-2015-0018457호는 "프롤릴 히드록실라아제 저해제 또는 히스톤 탈아세틸라아제 저해제, 및 항생제를 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물"에 관한 것으로, 프롤릴 히드록실라아제 저해제를 이용하여 HIF-1α를 안정화시켜 암치료를 하는 방법이 공개되어있다.

한국공개특허 공개번호 제1492435호는 "HIF-1α siRNA를 유효성분으로 함유하는 TSLP에 의해 매개되는 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물"에 관한 것으로, siRNA를 이용하여 HIF-1α의 활성을 억제함으로써 HIF-1α 관련 질환의 치료를 목적으로 하고 있다.

그러나 HIF-1α의 여러 전사 후 변형 중에서, HIF-1α 메틸화의 기전 및 생리적인 역할은 잘 밝혀져 있지 않으며 상기 기전의 규명 및 이를 근거로 한 혈관신생억제제의 개발이 필요하다.

본 발명은 신규한 HIF-1α 메틸화의 기전을 표적으로 하는 혈관형성억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

한 양태에서 본원은 HIF1-α단백질의 메틸화 조절을 통한 혈관신생억제제 스크리닝 방법을 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 HIF1-α단백질 및 SET7/9 단백질을 제공하는 단계; 상기 HIF1-α단백질 및 SET7/9 단백질의 복합체에 상기 SET7/9을 활성화시킬 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 SET7/9의 활성화는 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 메틸화로 측정되고; 상기 32번째 잔기에서의 메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우, 상기 32번 잔기에 메틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

다른 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 HIF1-α단백질은 서열번호 1의 서열을 기준으로 30번째 잔기가 알지닌에서 글루타민 또는 이와 화학적으로 동등한 잔기 예를 들면 곁가지에 아마이드 기를 갖는 아스파라진으로 치환된 것이 사용될 수 있다. 특정 암에서 상기 30번째 잔기에서 돌연변이가 발생하고, 본원에서는 이 경우, 32번째 잔기에서의 메틸화가 감소하는 것을 규명하였다.

또 다른 구현예에서 HIF1-α단백질 및 LSD1 (Lysin Specific demethylase 1) 단백질을 제공하는 단계로, 상기 HIF1-α단백질은 서열번호 1을 기준으로 32번째 라이신 잔기에 메틸화가 되어 있으며, 상기 HIF1-α단백질 및 LSD1 단백질 복합체에 상기 LSD1의 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 LSD1의 활성화는 상기 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 탈메틸화로 측정되고, 상기 32번째 잔기에서의 탈메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 탈메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질 물질로 처리된 경우, 상기 32번째 잔기의 탈메틸화가 감소된 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 동물의 형태로 발현될 수 있으며, 단백질의 발현을 위해 이를 코딩하는 유전자를 세포 또는 동물에 전달하는 것을 포함한다.

본원에 따른 스크리닝 방법으로 선별된 물질은 혈관신생과 관련된 다양한 질환 예를 들면 망막증, 암, 특히 암의 전이를 억제, 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 스크리닝 방법은 기존에 알려진 HIF1-α단백질의 하이드록실화 및 HIF1-α단백질의 VHL에의 결합과는 독립적인, 즉 비의존적인 방법이다. 기존에 HIF-1a의 조절기전으로 하이드록실화를 이용한 약물개발은 진행되었지만, 본원에 따른 새로운 기전에 기반한 약물의 개발은, 기존의 약물에 반응하지 않는 암이나, 기존에 개발된 약물과 함께 칵테일 요법에 적용되어, HIF-1a에 의존적인 다양한 암을 보다 효과적으로 치료하는데 유용하게 사용될 것이다.

본원에서 규명된 HIF-1α의 특정 잔기에서의 메틸화 및 탈메틸화에 관여하는 단백질 및 기전을 이용한 혈관신생억제제 스크리닝 방법은 암의 성장과 전이를 막을 수 있는 물질의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 SET7/9에 의해서 HIF-1α의 K32에 메틸화가 일어나는 것을 나타낸 것이다. (a) HIF-1α의 잠재적SET7/9 표적 사이트가 있음을 밝혔다. (b) Mass분석으로 통해서 HIF-1α K32 사이트에서 메틸화가 일어나는 것을 확인하였다. (c) co-IP를 통해서 HIF-1α와 SET7/9이 상호작용 함을 확인하였다. MG132를 친 상황과 안친 상황에서 비교하였다. (d) HIF-1α WT과 K32A, SET7/9 WT과 SET7/9효소 활성이 없는 H297A를 가지고 인 비트로 메틸화 실험을 수행하였다. (e) HeLa세포에서 메틸화된 라이신을 인지하는 항체를 이용해서 HIF-1α의 메틸화를 확인하였다. SET7/9 WT과 H297A가 발현하는 상황에서 확인하였다. (f) WT MEF와 Set7/9 ^-/- MEF에서 MG132를 처리 한 상황과 처리 안한 상황에서 HIF-1α의 메틸화를 확인하였다. (g) HIF-1α 항체로 면역침강을 수행한 뒤 HIF-1α-me항체로 면역블랏을 하였다. (h) HeLa 세포주에서 핵과 세포질을 분리하였다. 그리고 HIF-1α-me 항체로 HIF-1α 메틸화를 확인하였다. 저산소 환경에 정해진 시간만큼 인큐베이션하고, MG132를 친 상황과 안 친 상황에서 비교하였다. 라민(Lamin) A/C를 핵 마커로, 튜불린(tubulin)을 세포질 마커로 사용하였다. (i) HeLa 세포주에 HIF-1α WT과 K32A를 과발현시켰다. MG132를 친 상황과 안친 상황에서 저산소 환경에 정해진 시간만큼 인큐베이션 한 뒤, Flag 항체(빨강)로 염색하였다. 핵은 DAPI(파랑)로 염색하였다.
도 2는 LSD1에 의한 HIF-1α의 탈메틸화가 HIF-1α의 안정성을 증가시키다는 것을 나타낸 것이다. (a) 저산소 환경에서 Flag M2 아가로스 비드를 이용하여 HEK293T 세포로부터 HIF-1α와 상호작용하는 단백질을 정제하였다. 상호작용하는 단백질들을 SDS-PAGE한 뒤, LC-MS/MS로 분석하였다. (b) MG132를 친 상황과 안친 상황에서 HIF-1α와 LSD1를 공동-면역침강시켰다. (c,d) 정해진 시간만큼 저산소 환경을 처리한 뒤, WT MEF로부터 얻은 핵 용해물(lysate)에서 LSD1과 HIF-1α의 단백질 발현양을 확인하고(c), 또한 LSD1 mRNA 확인(d)하였다. (e) Lsd1 ^+/- MEF와 Lsd1 ^-/- MEF를 저산소 환경을 6시간 처리한 뒤, 핵 용해물을 얻어서 HIF-1α 단백질 양을 확인하였다. (f) Lsd1 ^-/- MEF에 LSD1 WT과 LSD1 효소 활성이 없는 K661A를 다시 발현시킨 세포주에서 HIF-1α의 단백질 양을 확인하였다. (g) Lsd1 ^+/- MEF에 파르길린(pargyline)을 12시간 동안 처리한 뒤, 저산소 환경에 6시간 동안 인큐베이션 하고, 핵에 있는 HIF-1α의 발현양을 확인하였다. (i) HeLa 세포주에서 특정 항체로 면역형광 실험을 수행하였다. 세포는 MG132를 처리한 상황과 처리하지 않은 상황 각각 저산소 환경에 6시간동안 인큐베이션한 뒤 실험하였다. (j) HeLa 세포에서 면역블랏 실험을 수행하였다. (k) HeLa세포주를 저산소 환경에 6시간동안 인큐베이션 한 뒤, CHX (20mg/ml)를 정해진 시간만큼 처리하고 면역블랏실험으로 HIF-1α 단백질을 확인하였다. (l) 표시된 plasmid를 transfection한 HeLa 세포로부터 얻은 용해물을 Ni^{2 +}-NTA비드로 정제하였다. HIF-1α의 유비퀴틴화를 HIF-1α 항체로 확인하였다. (m) MG132가 처린 된 상황에서 DMOG을 처리한 상황과 처리 하지 않은 상황에서 HIF-1α WT, K32A, P2A, P2A/K32A의 히드록실화를 확인하였다. (n) MG132가 처리되고 Flag-HIF-1α WT, K32A, P2A, P2A/K32A가 과발현된 상황에서 Flag 항체로 침전시키고, HIF-1α-me 항체로 면역블랏을 수행하였다. (o) HIF-1α WT과 K32A, P2A가 과발현된 상황에서 SET7/9에 의한 유비퀴틴화를 확인하였다. 유비퀴틴화 실험은 (l)처럼 수행하였다.
도 3은 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐에서 에리스로포이어틴(erythropoietin)을 발현이 증가되어 혈액학적으로 비정상적 표현형을 보인다는 것을 나타낸 것이다. (a) Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐를 만드는 과정을 나타낸 것이다. 부위-특이적 변이(Site-directed mutagenesis)를 통해서 라이신을 알라닌으로 대체하고 이때 AfeI사이트가 생기도록 하였다. (b) WT, Hif1a ^+/KA , 및 Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 유전형을 분석하였다. Hif1a ^{KA /KA} 염색체는 AfeI에 의해 잘렸다. (c) WT, Hif1a ^+/KA , 및 Hif1a ^{KA /KA} MEF에서 HIF-1α의 메틸화를 확인하였다. (d) 7일 동안 PBS 또는 DMOG를 처리하고 쥐의 표현형을 관찰하였다. 왼쪽 : 발바닥과 코, 중간: 비장, 오른쪽: 복강 (e) 7일동안 PBS 또는 DMOG을 처리한 쥐의 폐와 지라에서 HIF-1α의 발현을 확인하였다. (f) WT쥐와 Hif1a ^KA/KA 쥐에서 혈액학적 지표를 비교해 보았다. RBC: 적혈구, Hb: 헤모글로빈, Hct: 적혈구 용적 (g) WT과 Hif1a ^{KA /KA} MEF에서 Vegf-a, Glut-1, Epo mRNA양을 확인하였다. 왼쪽은 저산소 환경에 정해진 시간만큼 인큐베이션 한 뒤 비교하고, 오른쪽은 DMOG을 처리하고 비교하였다. (h) WT과 Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 폐에서 Vegf-a, Glut-1, Epo mRNA양을 확인하였다. 왼쪽은 저산소 환경에서 14일 키운 뒤 비교하고, 오른쪽은 DMOG을 7일 동안 처리하고 비교하였다.
도 4는 Hif1a ^{KA /KA} MEF에서 세포 이동, 콜로니 형성, 종양 성장 모두 증가됨을 나타낸 것이다. (a) WT과 Hif1a ^{KA /KA} MEF를 표시된 시간만큼 저산소 환경에 인큐베이션 한 뒤, HIF-1α 단백질 양을 확인하였다. (b) WT과 Hif1a ^{KA /KA} MEF를 6시간 동안 저산소환경에 인큐베이션 한 뒤, CHX를 처리하고 HIF-1α 단백질의 반감기를 측정하였다. (c) 쥐를 10% 산소 농도에 14일 동안 키운 뒤, 쥐의 폐에서 면역블랏 실험을 수행하였다. (d) MEF에 SET7/9과 LSD1을 과발현시킨 뒤, Scratch-cell motility 실험을 수행하였다. 표시된 시간 동안 저산소 환경에서 인큐베이션하였다. (e) WT과 Hif1a ^KA/KA MEF를 사용하여 transwell cell migration 실험을 수행하였다. 일반 산소농도 환경 또는 12시간 동안 저산소 환경에서 실험하였다. (f) WT과 Hif1a ^{KA /KA} MEF를 가지고 anchorage independent 세포 성장 실험을 수행하였다. (g) HIF-1α shRNA가 지속적으로 발현하는 MDA-MB-231 유방암 세포주에 HIF-1α WT과 K32A를 다시 넣어준 뒤 xenograft 실험을 수행하였다.
도 5는 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐에서 망막 혈관 생성이 촉진됨을 나타낸 것이다. (a-d) 태어난지 5일 된 WT와 Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 생리학적 망막 혈관 생성을 나타낸 것이다. (a) 5일 된 쥐의 망막 전체를 고정하여 CD31과 HIF-1α 항체로 염색한 것이다. (b-d) 혈관 반경 길이, 혈관 밀도, HIF-1α 염색 정도 등을 비교하였다. (e-j) WT 과 Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 OIR 모델에서 질병학적 망막 혈관생성을 나타낸 것이다. (e) 태어난지 17일 된 OIR 모델 쥐의 망막 전체를 고정하여 CD31 항체로 염색하였다. (f,g) 혈관이 생성되지 않은 부분과 새로 혈관이 생성된 부분을 WT쥐와 Hif1a ^KA/KA 쥐에서 비교하였다. (h) 17일 된 OIR 모델 쥐의 망막을 isolectin B4 (iB4)와 VEGF HIF-1α 항체로 염색하였다. (i,j) HIF-1α와 VEGF의 염색정도를 비교하였다.
도 6은 HIF-1α K32의 변형이 종양의 성장과 혈관 생성을 촉진함을 나타낸 것이다. (a-l) 종양세포를 이식한지 18일 후에 적출해서 조직학적 분석을 수행하였다. (a) WT과 Hif1a ^{KA /KA} 쥐에서 종양 성장 곡선을 나타낸 것이다. (b) 종양의 무게 비교를 나타낸 것이다. (c) 종양을 section한 뒤, H&E 염색을 수행하였다. 검은 점선은 종양내의 괴사된 부분을 의미한다. (d) 종양 내의 괴사 정도를 비교하였다. (e, f) 종양 내부와 종양 주변의 CD31로 염색된 혈관을 비교하였다. 흰색 점선은 종양의 경계를 의미한다. (g, h) 종양 내의 저산소 환경인 부분을 비교한 것이다. (i,j) 종양 중심의 Ki67로 염색된 증식하는 세포들을 비교한 것이다. (k, l) 종양 중심에서 caspase3 항체로 염색된 세포사멸이 일어나는 세포를 비교한 것이다.
도 7은 인간 암에서의 HIF-1α 메틸화의 중요성을 나타낸 것이다. (a) 다양한 암 환자와 암 세포주에서 알려진 HIF-1α의 mutation들을 나타낸 것이다. (b, c) SET7/9에 의한 HIF-1α의 메틸화와 그에 의한 안정성 조절을 확인하였다. (d) HIF-1α WT, K32A, 암환자에서 알려진 HIF-1α 돌연변이 등에서 인 비트로 메틸화 실험을 수행하였다. (e) Hif1α^-/- MEF에 HIF-1α WT과 그 밖에 표시된 mutant들을 과발현시킨 뒤, transwell cell migration 실험을 수행하였다. (f) 일반 산소 농도 환경에서 세포질에서는 히드록실화에 의해 HIF-1α가 분해되지만, SET7/9에 의한 HIF-1α 메틸화는 핵 안에서 히드록실화와는 독립적으로 이루어진다는 것을 나타낸 것이다.

본원은 HIF-1α이 특정 잔기에서 SET7/9 메틸트랜스퍼라아제에 의해 메틸화되지 않거나, 리신-특이적 디메틸라아제(Lysin-specific demethylase)에 의하여 탈메틸화가 되면 HIF-1α 안정화가 증가되고, 이러한 HIF-1α 안정화에 의해 혈관생성이 증가된다는 발견에 근거한 것이다.

구체적으로 본원에서는 특히 핵 내에서 HIF-1α가 SET7/9 메틸트랜스퍼라아제와 상호작용/결합하여 SET7/9에 의해 상기 HIF-1α의 32번째 잔기 위치에 메틸화가 이루어지면 HIF-1α의 안정성이 감소되어 분해되고, 반면 HIF-1α은 또한 리신-특이적 디메틸라아제 1와 상호작용/결합에 의해 상기 위치에서 탈메틸화되어 HIF-1α의 안정성이 증가되고 이러한 현상은 암의 발생으로 이어지는 것을 규명하였다.

본원에서 규명한 HIF-1α의 메틸화는, 세포질내에서 HIF-1α의 안정화에 기여하는 프롤린 잔기에서의 하이드록실화와는 독립적인 것이며, 장기간의 저산소 조건에서 핵내로 이동하여 여기에서 메틸화에 의해 안정성이 조절된다 (예를 들면 도 7f의 도식적으로 표시된 기전 참고). 특히 메틸화-결핍 Hif1a ^KA/KA 대립유전자를 가진 녹아웃 마우스에서는 메틸화로 인해 안정성이 증가된 HIF-1α로 인해 망막의 혈관 신생(retinal angiogenesis)과 종양 혈관화(tumour vascularization)가 증가한 것으로 나타났다.

또한 인간의 암에서 발생하는 HIF-1α의 32번 잔기 (서열번호 1의 서열을 기준으로 하며, 잔기의 위치를 명확하게 표시하기 위한 것으로 상기 서열에 한정되는 것은 아님)에서의 메틸화가 28번 위치와 30번 위치에서의 돌연변이 (S28Y, R30Q)와 관련되어 있음을 규명하였다. 구체적으로 28, 30번 잔기에 돌연변이가 발생한 경우 32번의 메틸화에 영향을 미치며 32번 잔기에서 SET7/9에 의한 메틸화 또는 LSD1에 의한 탈메틸화를 억제한다.

또한 본원에서는 망막이나 암 등과 같이 질환의 진행에 혈관신생이 동반되는 경우 32번 잔기에서의 메틸화 또는 탈메틸화 조절을 통해 HIF-1α의 분해를 촉진하여 상기와 같은 질환의 혈관생성을 억제할 수 있다. 따라서 HIF-1α 32번 잔기의 메틸화를 조절하는 물질은 혈관신생을 억제할 수 있으므로, 본원에서 규명된 기전을 이용하여 혈관신생 억제제를 스크리닝하는 것이 가능하다.

이에 한 양태에서 본원은 본원에서 규명된 메틸화 잔기를 포함하는 HIF-1α단백질 및 SET7/9 메틸트랜스퍼라아제, 또는 HIF-1α단백질 및 LSD1 디메틸라아제를 표적으로 하는 혈관신생억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은, HIF1-α단백질 및 SET7/9 단백질을 제공하는 단계로, 상기 HIF1-α단백질 및 SET7/9 단백질의 복합체에 상기 SET7/9을 활성화시킬 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 SET7/9의 활성화는 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 메틸화로 측정되고, 상기 32번째 잔기에서의 메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우, 상기 32번 잔기에 메틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 방법에 사용되는 HIF-1α 단백질은 30번 잔기가 야생형인 알지닌에서 글루타민 또는 이와 화학적으로 동등한 아미노산, 예를 들면 같은 아마이드 잔기를 갖는 아스파라진으로 치환된 것이 사용될 수 있으며, 글루타민으로의 치환은 특정 암에서 발견된다.

본원에서는 R30Q 돌연변이의 경우에는 SET7/9에 의해 32번째의 잔기에서의 메틸화가 저해되어, 메틸화 정도가 야생형과 비교하여 낮아지는 것을 규명하였다 (도 7의 d 참조). 따라서 상기 돌연변이를 이용하여 이러한 억제된 메틸화를 다시 되돌리는 약물은 상기 돌연변이를 갖는 암환자에게 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법을 이용하여 규명된 물질은 32번째 잔기의 메틸화를 증가시키고, 결국 HIF1-α 단백질을 안정화시켜, 혈관신생억제제로서 발생 및 진행이 이와 연관되어 있는 다양한 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본원에서는 또한 리신-특이적 디메틸라아제 1와 HIF-1α의 상호작용/결합에 의해 상기 위치에서 탈메틸화되면 HIF-1α의 안정성이 증가되고, 농도가 증가하여 암이 발생하는 것을 규명하였다.

따라서 다른 양태에서, 본원은 LSD1 (Lysin Specific demethylase 1) 단백질에 의해 HIF1-α단백질의 탈메틸화를 억제시키는 기전에 근거한 혈관신생억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 상기 방법은 HIF1-α단백질 및 LSD1 (Lysin Specific demethylase 1) 단백질을 제공하는 단계로, 상기 HIF1-α단백질은 서열번호 1을 기준으로 32번째 라이신 잔기에 메틸화가 되어 있으며, 상기 HIF1-α단백질 및 LSD1 단백질 복합체에 상기 LSD1의 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 LSD1의 활성화는 상기 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 탈메틸화로 측정되고, 상기 32번째 잔기에서의 탈메틸화를 검출하는 단계; 및 상기 탈메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질 물질로 처리된 경우, 상기 32번째 잔기의 탈메틸화가 감소된 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

상술한 바와 같이, 30번째 잔기의 돌연변이는 SET7/9에 의한 메틸화를 억제하고, 이 경우, LSD1도 HIF1-α단백질에 결합한다는 본원의 결과(도 2의 a, h)를 근거로, 탈메틸화도 억제할 것으로 판단되고, 따라서 상기 방법에서 HIF1-α 단백질에서 30번째 잔기가 글루타민 또는 야생형이 아닌 다른 잔기, 특히 글루타민과 동등한 화학적 성질을 갖는 아미노산, 예를 들면 아스파라진으로 치환된 것이 사용될 수 있다.

LSD1는 메틸화된 HIF1-α 단백질을 탈메틸화시키고 결국 상기 단백질을 안정화시켜 혈관신생을 촉진시켜 암의 발생을 촉진하기 때문에, 본원에서 규명된 잔기에서 HIF1-α 단백질의 탈메틸화를 억제하는 물질은 혈관신생억제제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본원에서 상기 ‘HIF1-α(hypoxia-inducible factor-1)’은 저산소 관련 반응을 매개하는 이종성 이중의 전사인사로, 산소 농도에 따라 조절되는 α 소단위(HIF-1α 또는 HIF-2α) 및 항상 발현되는 β 소단위(HIF-1β)로 구성되어 있으며, HIF-1α는 저산소 환경에서는 안정화된다. HIF-1α는 내피세포의 마스터 조절인자인 VEGF를 직접적으로 조절함으로써 병리생리학적으로 혈관을 생성시킨다.

HIF-1α의 안정성 조절은 저산소 환경에 적응하기 위한 중요한 스텝이다. 정상 산소 조건에서는 HIF-1α는 프로릴 하이드록실라아제 도메인(prolyl hydroxylase domain; PHD)-포함 단백질 1/2/3에 의해 하이드록실화(hydroxylation)되고, 이렇게 하이드록실화된 HIF-1α를 본 히펠-린다우(von Hippel-Lindau; VHL) 종양 억제 단백질이 인지하여 큘린2(cullin2) E3 리가아제 복합체에 의해 분해된다. 반면에 저산소 환경에서는 PHD는 보조인자로 산소를 사용하고, PHD의 효소적 활성은 감소한다. 따라서, HIF-1α 하이드록실화는 감소되고, HIF-1α의 안정화를 가져온다. 하이드록실화 이외에 수모화(SUMOylation), 아세틸화 및 인산화를 포함하는 다른 전사후 변형이 HIF-1α 기능을 조절하는 것으로 알려졌다. SENP1이 HIF-1α를 탈수모화(desumoylation)하고 HIF-1α와 VHL 사이의 상호작용을 억제하여 안정화된다. p38에 의한 HIF-1α의 인산화는 국소빈혈에서 VHL로의 결합을 억제하여 안정화에 기여한다. 이와 대조적으로 HIF-1α 아세틸화는 VHL-매개 HIF-1α의 유비퀴틴화를 유도하는 것으로 나타났다.

본원의 HIF-1α 메틸화는 상기 HIF1-α단백질 조절을 위한 하이드록실화 및 VHL에의 결합과는 독립적인 새로운 조절 기전이다. 본원에 따른 새로운 기전에 기반한 약물의 개발은, 기존의 약물에 반응하지 않는 암이나, 기존에 개발된 약물과 함께 칵테일 요법에 적용되어, HIF-1α에 의존적인 다양한 암을 보다 효과적으로 치료하는데 유용하게 사용될 것이다.

본원에 따른 HIF1-α 또는 단백질 서열은 본원에 따른 효과를 달성하는 한 다양한 형태 및 유래의 것이 사용될 수 있다. 일 구현예에서는 포유류, 특히 인간 유래의 HIF1-α 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체가 사용되며, 그 단백질 및 핵산 서열은 각각 서열번호 1 또는 2로 표시될 수 있으며, 또는 각각 NP_001521.1 및 NM_001530.3로 공지되어 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 서열번호 1의 HIF1-α 단백질 서열이 사용된다. 또한 상술한 바와 같이 본원에서는 서열번호 1의 서열을 기준으로 30번째 잔기가 글루타민 또는 야생형이 아닌 다른 잔기, 특히 글루타민과 동등한 화학적 성질을 갖는 아미노산, 예를 들면 아스파라진으로 치환된 것이 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 SET7/9 단백질(유전자명칭: SETD7 (geneID: 80854))은 는 SET 도메인-포함 메틸트랜스퍼라아제로서, 히스톤 H3K4 및 DNA 메틸트랜스퍼라아제 1(DNMT1), E2F1, 및 STAT3를 포함하는 비-히스톤 단백질에 작용한다. DNMT1 및 E2F1의 SET7/9-의존성 메틸화는 이들 단백질의 안정성을 조절한다. SET7/9 단백질 및 핵산서열은 각각 NP_085151.1 및 NM_030648.3로 공지되어 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 LSD1(Lysin-specific demethylase 1) 단백질 (유전자 명칭: KDM1A (geneID: 23028))은 KDM1A 라고도 하는 플라빈-의존성 모노아민 옥시다아제로서, 모노- 및 다이-메틸화된 리신, 특히 히스톤 3, 리신 4 및 9(H3K4 및 H3K9)를 탈메틸화 시킬 수 있다. LSD1 는 인 비보 및 인 비트로에서 안드로겐 수용체와 상호작용을 하고 안드로겐 수용체-의존성 전사를 촉진한다(30). LSD1은 안드로겐 유전자 조절의 맥락에서 기질을 H3K4me1/2에서 H3K9me1/2로 전환시킬 수 있다고 알려져 있다. 히스톤 디메틸라아제로서의 역할이외에, LSD1는 p53 및 DNMT1과 같은 비-히스톤 단백질도 탈메틸화한다. LSD1은 탈메틸화에 의해 p53의 종양 억제 활성을 조절한다. LSD1는 Dnmt1의 탈메틸화를 조절함으로써 배아 줄기세포에서 글로벌 DNA의 메틸화에서 필수적인 역할을 수행한다. LSD1 단백질 및 핵산 서열은 각각 NP_055828.2 및 NM_015013.3로 공지되어 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 단백질은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 상기 개시된 서열을 참고하여 PCR 방법(Saiki et al., Science, 230: 1350-1354, 1985; Saiki et al., Science, 239: 487-491, 1988)을 이용하여 제조될 수 있다.

본원에 따른 방법의 단백질은 본원에 따른 효과를 달성하는 한 전장 또는 잘린 형태의 것인 단편 모두 포함되며, 특히 SET7/9 및 LSD1과의 상호작용에 필요한 영역 및 메틸화 잔기를 포함한다.

본원에 포함되는 단백질은 동일한 숙주, 예를 들면 인간에서 유래된 것이라도 특정 개인, 지역, 환경 등에 따라 서열변이가 있을 수 있으며, 이러한 것은 물론 일부 서열이 변형(결실, 치환, 부가)되었으나, 기능적으로 동등한 변이체가 모두 본 발명에 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법의 단백질 또는 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함하는 경우, 예를 들면 상기 벡터를 공지된 방법에 따라 세포배양 시스템에서 적절한 세포에 트렌스펙션하여 발현시킨 후 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위해 담체에 결합된 형태의 단백질 또는 아미노산 잔기와 융합된 형태의 것을 포함하는 것이다.

단백질의 메틸화 여부 분석을 위한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 질량분광 분석기 (Mass spectrometer), 메틸화된 잔기를 특이적으로 인식하는, 항체와 같은 물질을 이용한, 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 조직 면역 염색, 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 들 수 있다.

본원에 따른 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 동물, 특히 포유동물, 특히 마우스의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이로 제한하는 것은 아니다, 단백질의 발현을 위해 유전자 전달이 용이한 HEK-293T (human embryonic kidney cell line), 유전자 전달 및 저산소 노출시 반응성이 우수한 HeLa (human cervical cancer cell), 유방암이 진행될 때, HIF-1α가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 유방암 세포주, 예를 들면 MDA-MB231가 사용될 수 있다.

상기 방법에 사용되는 검출시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 전자는 항원-항체반응, 상기 메틸화 또는 탈메틸화된 단백질에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 메틸화 또는 탈메틸화된 단백질과 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분광분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 메틸화 또는 탈메틸화된 단백질과 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다. 상술한 검출/분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 대조군 시료의 시그널과 대조를 수행함으로써, 단백질 메틸화 여부를 검출할 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 상술한 표적 단백질의 메틸화 및/또는 탈메틸화를 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

상기 시험물질은 생물학적 특징의 관점에서는 HIF-1α의 상호 결합을 강하게 할 수 있는 물질 또는 SET7/9의 메틸화작용에 중요한 SET 영역의 활성을 증가시키는 물질, 또는 SET7/9에 의한 메틸화에 중요한 역할을 하는 메틸 공여자인 S-adenosylmethionine을 기질에 보다 높은 효율로 전달할 수 있는 물질이다. 아울서 LSD1가 사용되는 경우에는 아민옥시데이즈 계열의 탈메틸화 효소이기 때문에, 아민옥시다제 억제 효과를 나타내거나, 기질과의 결합을 억제하는 물질, FAD (flavin adenine dinucleotide) 의존적인 효소이므로 FAD를 억제하는 효과를 가질 수 있을 것이다.

후보물질은 상기 시험물질과 처리된 세포와 상기 시험물질과 처리되지 않은 대조군 세포에서 상기 HIF-1α의 메틸화여부을 비교하여, 상기 시험물질과 처리된 세포에서 상기 HIF-1α의 메틸화가 상기 대조군의 HIF-1α의 메틸화와 비교하여 증가한 경우 이를 혈관신생억제제 후보물질로 선별할 수 있다.

또한 후보물질은 LSD1를 표적으로 사용한 경우 탈메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질 물질로 처리된 경우, 상기 잔기 중 하나 이상의 잔기의 탈메틸화가 감소된 경우 이를 혈관신생억제제 후보물질로 선별할 수 있다.

본원 방법에 의해 선별된 혈관신생억제제는 HIF-1α를 메틸화 또는 메틸화를 증가시킴으로써 HIF-1α를 분해시켜 혈관이 형성되는 것을 방지한다. 상기와 같은 혈관신생억제제는 혈관신생이 수반되는 다양한 질환 예를 들면 고형 종양이나 망막증, 만성관절 류마티스 또는 죽상 동맥경화증 등과 같은 혈관신생병 예방 및 치료에 유효하다. 구체적으로 혈관형성(vasculogenesis) 및 병적인 혈관신생(angiogenesis)과 관련된 분자 기전의 규명으로 인해 질환은 다음과 같이 두 종류 즉 혈관신생 치료로 인해 손상된 조직이 치유될 수 있는 질환(동맥경화, 심근경색, 사지허혈 등)과 혈관신생 치료로 인해 질환자체가 치료되거나 질환의 진행이 늦추어 질 수 있는 질환 예를 들면 망막증, 악성 및 양성 혈관신생성 종양, 악성종양의 전이 등)(Timar J et al., Pathol Oncol Res. 2001;7(2):85-94). 따라서 본원에 따른 혈관신생억제제는 상기 질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본원의 상기 방법은 시험관에서 상기 단백질을 혼합하여 복합체를 형성하여 수행할 수 있거나, 또는 상기 단백질을 발현하는 유전자를 세포, 특히 진핵세포에 전달이입하여, 또는 상기 세포를 포유동물에 이식하여 수행될 수 있다.

본 방법에서 사용되는 세포의 종류 및 시험물질의 양 및 종류 등은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 실험결과 시험물질과 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질의 존재 하에서 상기 단백질 메틸화를 시키는 물질을 후보 물질로 선별한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실험방법

세포배양

MEF (Mouse embryonic fibroblast), HEK293T, HeLa 세포주는 10% 소혈청과 페니실린, 스트렙토마이신(Streptomycin)이 들어간 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 배양하였다. 세포주들은 모두 마이코플라즈마 오염 테스트를 하였다.

항체

HIF-1α (NB100-132, Novus; 10006421, Cayman; MAB 1536, R&D systems); HIF-2α (NB100-122, Novus); Xpress (R910-25, Invitrogen); FLAG (F3165, Sigma); methyl-Lys (ab23366, Abcam); anti-CD31 (clone 2H8, MAB1398Z, Millipore); anti-HA (MMS-101R, Covance); VEGF (AF493NA, R&D system); EPO (sc-7956), Brn3b (sc-6026,)는 Santa Cruz회사에서 제작; LSD1 (#2139), hydroxyl-HIF-1α (#3434), Caspase3 (#9661), Ki-67 (#9027), SET7/9 항체(#2813)는 Cell Signalling에서 제작하였다. HIF-1α K32 메틸화 항체는 Abfrontier회사에서 제작하였다.

동물

8-10주된 수컷C57BL/6J쥐를 실험에 사용하였다. 쥐는 표시된 시간만큼 10% 산소 농도의 챔버에서 키웠다. DMOG처리를 위해서 phosphate 버퍼 0.1ml에 DMOG 2mg을 녹인뒤 복강 주사를 하였다. 모든 실험 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul National University)에서 승인받았다.

Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐 제작

HIF-1α의 32번 라이신을 알라닌으로 치환하기 위해서 NheI 사이트를 HIF-1α의 2번째 엑손(exon)에 FRT가 양쪽에 있는 Puro 저항 유전자 카세트와 함께 삽입하였다. 라이신을 알라닌으로 변형시키면서 AfeI사이트가 생기도록 하였다. 만들어진 표적 벡터를 전기천공(electroporation)방법으로 쥐의 ES cell에 주입하였다. Hif-1α 유전자에서 상동 재조합(homologous recombination)이 일어난 ES cell을 골라서 Cre 재조합효소(recombinase)를 이용하여 puro 저항 유전자 카세트를 없앴다. Hif1α^{KA /+} ES 세포 클론들을 쥐의 배반포에 주입하여 돌연변이체 염색체를 갖는 키메라(chimeric) 쥐를 얻었다. 7세대 동안 역교배를 진행하였고, 꼬리 DNA에서 대립형질 유전자 특정 프라이머를 이용하여 PCR를 한 뒤 AfeI 제한효소로 잘라서 쥐의 유전형을 확인하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다.

Forward: 5’-GTAGGTGGGAAGGTATTGATG-3’

Reverse: 5’-AGAACTCACCG GCATCCAGAAG-3’

정량적 RT- PCR

mRNA의 양을 측정하기 위해서 ABI Prism 7500 system과 YBR Green (Enzynomics)를 사용하였다. 프라이머는 증폭되었을 때 90-200bp의 특정 mRNA 조각이 되도록 제작하였고, melting curve 분석을 통해서 적당한 프라이머인지 확인하였다. PCR 조건은 95℃ (15분) 뒤에, 95℃ (30초), 60℃ (30초), and 72℃ (30초).의 과정을 40회 반복하도록 하였다. mRNA양은 ΔΔCt방법으로 계산하였고, β-액틴을 통해서 양을 보정하였다. 모든 반응은 3번 반복하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다.

Vegf-a Forward: 5’-TGATGGAAGACTAGACAAAGTTCA-3’

Vegf-a Reverse: 5’-TTTTCCACCAGTTCCA ACTTGA-3’

Glut1 Forward: 5’-AGAGGTGTCACCTACAGCTC-3’

Glut1 Reverse: 5’- AA CAGGATACACTGTAGCAG-3’

Epo Forward: 5’-gctggcttagccctctcac-3’

Epo Reverse: 5’-ctgtccgctcctagcatgt-3’

Lsd1 Forward: 5’-CGGCATCTACAAG AGGATAAAACC-3’

Lsd1 Reverse: 5’-CGCCAAGATCAGCTACATAGTTTC-3’

Hif-1α Forward: 5’-CAGAGCAGGAAAGAGAGTCATAGAAC-3’

Hif-1α Reverse: 5’-TTTCGCTTCCTCTGAGCATTC-3’

유비퀴틴화 실험

HeLa 세포에 Hismax-유비퀴틴과 함께 DNA 플라스미드를 트랜스펙션 했다. 트랜스펙션한지 48시간 뒤에 MG132 (10 mg/ml)를 6시간 동안 처리했다. 그 뒤 buffer A (6 M guanidium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 0.01M Tris-HCl[pH8.0], 5mM 이미다졸 및 10mMb-mercaptoethanol)로 세포를 깨고, Ni^{2 +}-NTA비드와 함께 상온에서 4시간 동안 인큐베이션 시켰다. 비드를 buffer A, buffer B (8 M urea, 0.1 M Na₂PO₄/NaH₂PO₄, 0.01M Tris-Cl[pH8.0], 및 10mM β-mercaptoethanol), buffer C (8 M urea, 0.1 M Na₂PO₄/NaH₂PO₄, 0.01M Tris-Cl[pH6.3], 및 10mM β-mercaptoethanol) 순으로 씻어준 뒤 비드에 붙어 있는 단백질들을 buffer D (200 mM imidazole, 0.15 M Tris-Cl [pH 6.7], 30% glycerol, 0.72 M ₂-mercaptoethanol, 및 5% SDS)로 추출해 냈다. 그리고 면역블랏으로 분석하였다.

소프트 한천배지 군집 형성 분석(Soft agar colony formation assay)

MEF를 3T3 방식으로 죽지 않게 만들었다. Anchorage에 의존하지 않고 자라는 MEF를 분석하기 위해서 soft agar에서 콜로니가 생성되는 것을 확인하였다. 10⁵개의 세포를 5% CO₂ 인큐베이터에서 5주 동안 0.4% noble agar (Sigma, A5431) 위에서 DMEM과 10% FBS 미디어에 키웠다.

OIR 쥐 모델 제작

새로 태어난 7일 된 쥐를 엄마 쥐와 함께 75% 산소농도의 챔버(ProOx Model 110, BioSpherix, NY)에서 5일 동안 놔둔 뒤, 일반 산소 농도로 돌아와 5일 동안 방치하였다. 17일째 되는 날에 쥐들의 망막을 얻었다. 쥐는 ARVO 스테이트먼트(ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)에 따라 다루었다.

망막 혈관 생성의 조직학적 분석

망막은 이소렉틴(isolectin) B4 (L2140, Sigma)와 하나 이상의 항체와 함께 밤새 인큐베이션 했다. 사용한 항체는 다음과 같다. 햄스터 anti-CD31 단일클론 항체(monoclonal antibody), 토끼 anti-HIF-1α 다클론 항체(polyclonal antibody), 염소 anti-VEGF 다클론 항체, 또는 염소 anti-Brn3b 다클론 항체. 몇 번 씻어준 뒤 FITC가 붙어 있는 스트렙타비딘(streptavidin, BD Pharmingen회사) 또는 FITC가 붙어 있는 햄스터 IgG (Jackson ImmunoResearch회사), Cy3가 붙어 있는 염소 IgG, Cy3, Cy5가 붙어 있는 토끼 IgG 등과 함께 4시간 동안 상온에서 인큐베이션 해줬다. 대조 실험을 위해서 항체가 없거나 또는 면역반응이 일어나기 전 혈청(serum)을 사용하였다. 전체 또는 일부(section)를 고정한 뒤 염색한 망막을 보기 위해서 자이스(Zeiss) LSM 510 또는 780 공초점 현미경을 사용하였다. 망막의 형태측정 분석은 ImageJ 소프트웨어 (http://rsb.info.nih.gov/ij)와LSM Image Browser (Carl Zeiss)를 이용하여 이루어졌다. 혈관의 반경 길이는 네 부분의 망막에서 시신경 머리 부분부터 주변 혈관 앞까지 가장 짧은 길이를 측정하였다. 전체 망막의 혈관 밀도는 전체 망막의 면적에서 CD31+에 의해 염색된 혈관 밀도로 나누어준 것을 퍼센티지로 표현하였다. OIR실험에서 NVT와 혈관이 생성되지 않은 부분은 어도비 포토샵 소프트웨어의 라쏘 도구(Lasso tool of Adobe Photoshop software)를 이용하여 측정하였다. 혈관이 생성되지 않은 부분의 HIF-1α의 염색 정도는Image J software를 이용해서 측정하였다.

종양 모델 및 조직학적 분석

쥐 LLC세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구매하였다. 종양을 생성하기 위해서 LLC cell에 풀어져 있는 용액을 쥐의 등의 양 옆에 주입하였다. 종양의 부피는 2일마다 칼리퍼를 이용하여 측정하였다. 종양 부피는 0.5×A×B²공식 (A: 종양의 가장 긴 반경, B: 종양의 수직 높이)을 이용하였다. 종양을 이식한지 18일 뒤에 쥐를 마취시키고 종양을 적출했다. 그리고 절단하여 조직 분석을 하였다. 50mm로 동결 절단한 종양 조직을 햄스터 anti-CD31, anti-Ki67, 또는 anti-카스파타제(caspase) 3 항체와 함께 밤새 인큐베이션 시켰다. 몇번 씻는 과정을 거친 뒤, Cy3 또는 FITC가 붙어 있는 항-햄스터 IgG나 Cy3가 붙어 있는 항-토끼 IgG와 함께 2시간 인큐베이션 시켰다. 그리고 나서 샘플을 고정시키고 LSM510 공초점 현미경(Carl Zeiss 회사)를 이용하여 현미경 사진을 얻었다. 혈관의 밀도, 저산소 부분, apoptosis 부분, 괴사 부분은 Image-J software를 이용하여 측정하였다. Ki67+ 세포는 직접 세서 평균을 계산하였다. 종양의 저산소 부분을 분석하기 위해서 하이폭시프로브(Hypoxyprobe)^-1(60mg/kg, Natural Pharma International)를 혈관주사를 통해서 주입한 뒤 1시간이 지난 뒤 고정시켰다. 그 뒤 종양을 얻어서 FITC가 붙어 있는 항-하이폭시프로브 항체로 염색하여 분석했다.

이종이식 분석( Xenograft assay)

shHIF-1α가 지속적으로 발현하는 세포에 shRNA에 저항하는 HIF-1α WT과 HIF-1α K32A를 다시 넣어줬다. 종양이 형성되기 위해서 매트리겔(matrigel, BD Biosciences 회사)을 세포 부피와 같은 양을 섞어 준 뒤 5주된 면역반응이 억제된 암컷 쥐의 왼쪽 피하에는 HIF-1α WT이 발현하는 세포주를, 오른쪽 피하에는 HIF-1α K32A가 발현하는 세포주를 주입하였다. 종양의 크기는 주마다 측정하였다. 종양을 주입한 뒤 4주 후에 실험을 마치고, 종양을 들어내어 무게를 측정하였다. 종양의 부피는 1/2 x 길이² x 너비로 계산하였다.

인 비트로 메틸화 및 탈메틸화 분석

인 비트로 메틸화 실험은 GST-HIF-1α와 GST-SET7/9 단백질을 버퍼 (50 mM Tris-HCl [pH 8.5], 20 mM KCl, 10 mM MgCl₂,10mM b-mercaptoethanol, and 250 mM sucrose)와 1 μCi of ³H-SAM을 섞어 주고 30℃에서 밤새 반응시켜서 이루어졌다. In vitro 탈메틸화 실험을 위해서 GST-HIF-1α의 메틸화 실험을 수행하였다. 이후 메틸화가 일어난 HIF-1α가 붙어 있는 비드를 버퍼 (50 mM NaH₂PO₄[pH8.0], 10mM Tris-HCl[pH8.0], 500mM NaCl, and 0.5% TritonX-100)로 씻어서 비드에 붙어 있는 SET7/9을 제거해 주었다. 이후 His-LSD1과 함께 버퍼 (50 mM Tris-HCl [pH 8.5], 50 mM KCl, 5 mM MgCl₂,5% glycerol,and 0.5mM PMSF)에 넣어서 반응시켜주었다. 37도씨에서 밤새 반응시킨 뒤에 반응버퍼를 제거하고 2X 샘플링버퍼를 넣어주었다. 이후 10분 동안 끓이고 나서 SDS-PAGE를 달리고 autoradiography로 확인하였다.

면역침전 분석법

인 비보 면역침전을 위해서 HeLa 세포를 정해진 시간 동안 저산소 챔버에 넣고, 6시간 동안 5μM MG132를 처리한 뒤 잡았다. 세포는 1mL의 EBC200 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl 0.5% NP-40) 깬 뒤 15분 동안 13000rpm으로 다운시켜서 총 900ml의 세포 용해물(lysate)를 얻었다. 상기 용해물을 정해진 항체와 함께 4도씨에서 밤새 인큐베이션을 한 뒤, 단백질 G, 단백질 A 세파로스 비드와 IP150(25 mM TrisHCl pH 7.8, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 150 mM NaCl and 0.1% NP-40)를 50%씩 섞어 2시간 동안 인큐베이션 해주었다. 그 뒤 IP150으로 5번 씻어준 뒤 SDS-PAGE와 면역블랏으로 확인하였다. 면역블랏에 사용한 항체는 PBS-T용액에 3% BSA가 녹아져 있는 버퍼에 녹여서 사용하였다.

HIF - 1α 결합 단백질 정제

Flag-HIF-1α를 발현하는 HEK293T 세포의 추출물로부터 HIF-1α 결합 단백질을 정제하였다. 대조군으로 빈 벡터를 발현하는 HEK293T 세포주의 lysate를 사용하였다. HIF-1α 결합 단백질을 Flag-M2 agarose 비드를 이용하여 침전시켰다. Lysate와 비드를 4도씨에서 밤새 인큐베이션 한 뒤, BC150 버퍼(20 mM Tris-HCl [pH 7.9], 15% Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF, 0.05% Nonidet P40, and 150 mM KCl)로 3번, BC300 버퍼(20 mM Tris-HCl [pH 7.9], 15% Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF, 0.05% Nonidet P40, and 300 mM KCl)로 2번, IP150 버퍼로 2번 TBS버퍼 (50 mM Tris-HCl [pH 7.4], and 150 mM NaCl)로 3번 비드를 씻어 주었다. 그 뒤 Flag 펩타이드 (0.1mg/ml)로 HIF-1α 결합 단백질을 추출하였다. SDS-PAGE를 한 뒤, LC-MS/MS로 분석하였다.

면역형광 분석법

HeLa 세포주를 폴리 디 리신(poly D lysine)으로 코팅된 커버슬립에서 키웠다. 면역형광 실험을 위해서 세포를 PBS로 두번 씻어주고, 2% 포름알데히드로 30분동안 고정시켰다. 그리고 나서 세포를 0.1% triton-X 100 이 녹아져 있는 PBS로 2번 씻어줬다. 항체의 침투를 위하여 세포를 0.5% triton-X 100 녹아져 있는 PBS에 5분동안 인큐베이션 시킨 뒤, 블로킹 용액 (5 % BSA in 0.1% PBS-T)으로 블로킹 시켜줬다. 그리고 나서 일차(primary) 항체를 블로킹 용액에 넣어서 세포와 인큐베이션 시켰다. 이 후, 0.1% PBS-T용액으로 4번 씻어준 뒤 이차(secondary) 항체와 함께 인큐베이션 시켰다. 이후 다시 0.1% PBS-T용액으로 씻어 준 뒤, 벡타쉴드(vectashield)(H-1000)로 고정하고, 현미경으로 사진을 얻었다.

통계분석

GraphPad Prism software를 이용하여, 그룹의 차이를 보기 위해서 Student t-test를 ,조건 차이와 그룹 차이를 각각 보기 위해서 one-way ANOVA를, 그리고 그룹 차이와 조건 차이를 같이 보기 위해서 two-way ANOVA를 수행하여 데이터를 분석하였다. ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^***p<0.001.

실시예 1. 핵 내에서 나타나는 SET7 /9 메틸화 효소에 의해 일어나는 HIF - 1α 메틸화

HIF-1α의 유비퀴틴화, 수모화, 아세틸화, 히드록실화 등이 HIF-1α의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀져 있음에도 불구하고 HIF-1α의 메틸화는 아직 밝혀지지 않았다. 단백질의 메틸화는 메틸화 효소에 의해 일어나기 때문에, HIF-1α가 특정 메틸화 효소에 의해 메틸화 될 수 있는 알려진 아미노산 서열을 갖고 있는지 확인하였다. 32번째 라이신 잔기 근처에서, SET7/9 메틸화 효소가 메틸화 시킬 수 있는 특정 서열인 ‘[K/R]-[S/T/A]-K(메틸화가 일어나는 라이신)’ 이 있다는 것을 발견했다(도 1a). 액체 크로마토그래피 매스 분석 (LC-MS/MS analysis)을 통해서 HIF-1α가 32번째 라이신에서 메틸화가 일어나는 것을 확인하였다 (도 1b). 26S 프로테아좀 억제제인 MG132가 있는 상황과 없는 상황에서 모두 HIF-1α와 SET7/9이 세포 내에서 상호작용을 한다는 것을 확인해 보았다.(도 1c). 일반적인 산소 농도에서 세포 내 HIF-1α는 MG132를 처리 했을 때만 발견할 수 있기 때문에, MG132를 처리한 상황에서 HIF-1α와 SET7/9의 상호작용을 확인하였다.

본 발명자는 세포 밖에서 정제된 GST-SET7/9을 효소로 하고 GST-HIF-1α를 기질로 하여 메틸화 실험을 수행하였다. 실험 결과, HIF-1α WT은 정상적으로 메틸화가 일어나는 것을 볼 수 있으나, 메틸화가 일어날 것이라고 예상되는 32번째 라이신을 알라닌으로 바꾼 HIF-1α는 메틸화가 일어나지 않는 것을 확인하였다 (도 1d). SET7/9이 HIF-1α를 메틸화 시킬 때 SET7/9의 효소 활성이 중요한지 확인하기 위해서 효소 활성이 있는 SET7/9 WT 과 효소 활성이 없는 SET7/9 H297A를 가지고 실험한 결과, SET7/9 WT 이 들어갔을 때만 HIF-1α의 메틸화가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1e). 이를 통해 HIF-1α가 메틸화가 일어날 때, SET7/9의 메틸화 효소 활성이 필요하다는 것을 알 수 있었다. HIF-1α K32의 메틸화를 인지하는 항체를 제작하였고, 점 블랏(dot blot) 분석을 통하여 이 항체가 메틸화가 되어 있는 HIF-1α 펩타이드를 특정적으로 인식한다는 것을 확인하였다. 쥐의 배아섬유아세포 (Mouse embryonic fibroblast, MEF)에서 HIF-1α의 메틸화를 확인했을 때, MG132를 처리한 상황에서, SET7/9이 없는 MEF에서는 HIF-1α의 메틸화가 보이지 않고 WT MEF에서만 HIF-1α의 메틸화를 관찰할 수 있었다.

다음으로 HIF-1α의 메틸화가 언제 어디서 일어나는지를 확인하였다. HIF-1α의 메틸화는 MG132를 처리하여 26S 프로테아좀을 억제하였을 때, 일반 산소 농도에서 관찰되었고, 저산소 환경이 지속될수록 HIF-1α의 메틸화가 줄어드는 것을 관찰하였다(도 1g). 그런데 저산소 환경이 지속되면 HIF-1α의 메틸화가 회복되는 것을 관찰할 수 있었다. 본 발명자는 HIF-1α의 메틸화가 어디서 일어나는지 알고 싶어서 핵과 세포질로 나누어서 HIF-1α의 메틸화를 확인한 결과, 핵에서만 HIF-1α의 메틸화가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1h). 우리는 HIF-1α의 메틸화가 HIF-1α의 위치에 영향을 주는지 확인한 결과, 메틸화가 일어나는 HIF-1α WT과 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α K32A 모두 핵 안에서만 발견되는 것을 확인하였다. 이 실험 결과들을 통해서 SET7/9에 의해 일어나는 HIF-1α의 메틸화는 세포질이 아닌 핵 안에서만 일어나는 것을 알게 되었다.

실시예 2. LSD1에 의한 HIF - 1α의 탈메틸화에 의한 HIF - 1α 단백질의 안정성 증가확인

HIF-1α의 메틸화의 기능을 알기 위해서 HIF-1α와 상호작용하는 단백질 중 메틸화나 탈메틸화에 관련된 단백질이 있는지 복합체 정제를 통해서 찾아보았다. LC-MS/MS분석 결과 LSD1 탈메틸화 효소가 HIF-1α와 상호작용하는 것을 밝혔다 (도 2a). 공동-면역침전 실험을 통해서 세포내에서 MG132를 처리했을 때, 저산소 상황에서 실제로 상호작용하는 것을 확인하였다(도 2b). 또한 LSD1의 단백질 발현이 저산소 환경에서 늘어나는 것을 확인하였다. LSD1 mRNA 역시 확인한 결과, 저산소 환경에서 살짝 증가하는 것을 확인하였다(도 2d).

LSD1이 결손되어있는 MEF에서 HIF-1α의 단백질 발현이 현저하게 줄어들어 있는 것을 확인하였다(도 2e). 본 발명자는 상기 현상이 LSD1의 탈메틸화 효소활성과 관련이 있는지 알아보기 위해서 LSD1 결손되어있는 Lsd1 ^-/- MEF에 LSD1 WT과 LSD1의 효소활성이 없는 LSD1 K661A를 넣어주고 HIF-1α 단백질 발현양을 확인하였다. 확인한 결과, LSD1 WT을 넣어줬을 때는, 저산소 환경에서 HIF-1α의 발현이 잘 증가했지만, LSD1 K661A를 넣어줬을 때는 HIF-1α의 발현 증가가 잘 보이지 않았다(도 2f). 또한 LSD1의 효소활성 억제제인 파르길린(pargyline)을 처리했을 때도 HIF-1α의 불안정화가 일어나는 것을 확인하였다 (도 2g). HIF-1α가 SET7/9에 의해서 메틸화가 일어나기 때문에 본 발명자는 HIF-1α의 메틸화가 LSD1에 의해서 탈메틸화 되는지 확인해보았다. 실제로 LSD1에 의해서 HIF-1α의 탈메틸화가 일어나는 것을 인 비보와 인 비트로에서 확인하였다(도 2h). 그런데 LSD1의 효소활성은 HIF-1α와 LSD1의 상호작용에 영향을 주지는 않았다. 그리고 HIF-1α와 LSD1는 LSD1의 N말단에서 직접적으로 붙는 것으로 확인하였다. 또한 SET7/9 메틸화 효소를 과발현시켰을 때와 시키지 않았을 때 LSD1과 HIF-1α의 상호작용을 확인한 결과 차이가 없음을 확인하였다. 이를 통해 HIF-1α의 메틸화 상태가 LSD1과 HIF-1α의 상호작용에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 예상한 바와 같이, LSD1이 결손되어 있는 MEF에서는 HIF-1α 표적 유전자의 전사가 감소해 있고, SET7/9이 결손되어 있는 MEF에서는 HIF-1α 표적유전자의 전사가 증가되어 있는 것을 확인하였다.

메틸화에 의한 HIF-1α의 안정화를 좀 더 확인하기 위해서 MG132가 없는 상황과 처리한 상황에서 면역형광실험을 수행하였다. SET7/9이 같이 들어갔을 때, 저산소 환경에서 HIF-1α의 발현이 줄어들어 있는 것을 확인하였다. 하지만 효소활성이 없는 SET7/9을 넣어주었을 때는 HIF-1α의 발현이 줄어들지 않았다 (도 2i). 또한 MG132를 처리한 상황에서는 SET7/9이 같이 발현하더라도 HIF-1α의 발현이 줄어들지 않았다. 면역블랏을 통해서 확인했을 때도 SET7/9이 과발현할 때는 HIF-1α의 발현이 줄어들고 LSD1이 함께 과발현 할 때는 HIF-1α의 발현이 줄어드는 효과가 없어지는 것을 볼 수 있었다. 하지만 효소활성이 없는 LSD1이 같이 발현할 때는 여전히 SET7/9에 의한 HIF-1α의 발현 감소가 나타났다 (도 2j). 단백질 합성 억제제인 싸이클로헥사미드(CHX)를 처리하고 HIF-1α 단백질의 반감기를 살펴본 결과, SET7/9을 과발현 했을 때는 HIF-1α의 반감기가 줄어든 반면 LSD1을 과발현 했을 때는 HIF-1α의 반감기가 증가한 것을 볼 수 있었다 (도 2k). 26S 프로테아좀에 의한 HIF-1α 단백질 분해에 대해 살펴보기 위해서 MG132를 처리한 채로 SET7/9과 LSD1에 의한 HIF-1α의 유비퀴틴화의 변화를 살펴보았다. 실제로 SET7/9은 HIF-1α의 유비퀴틴화를 증가시켰고, LSD1은 감소시켰다.

HIF-1α는 일반 산소 농도일 때 세포질에서 PHD1/2/3 효소에 의해서 히드록실화가 일어나고 이로 인해 CUL2 E3 ligase 복합체에 의해서 분해된다. 저산소환경에서 PHD의 활성이 줄어들고 HIF-1α의 히드록실화 감소는 결국 HIF-1α의 안정화가 일어난다. 따라서 본 발명자는 HIF-1α의 메틸화가 히드록실화에 영향을 미치는지를 확인해 보았다. 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α K32A가 WT처럼 히드록실화가 일어나고 PHD 억제제인 DMOG에 의해서 히드록실화가 감소하는 것을 확인하였다 (도 2m). 이는 HIF-1α의 메틸화가 히드록실화와 독립적인 작용이라는 것을 말한다. 이와 평행하게 HIF-1α 히드록실화가 일어나지 않는 P2A(P402A/P564A)의 경우 HIF-1α WT처럼 정상적으로 메틸화가 일어나는 것을 확인하였다 (도 2n). 이는 HIF-1α의 히드록실화가 메틸화에 영향을 주지 않는 것을 의미한다. 우리는 HIF-1α WT과 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α K32A, 히드록실화가 일어나지 않는 HIF-1α P2A에서 유비퀴틴화를 비교해 보았다. MG132를 처리하고 SET7/9을 과발현 시켰을 때, HIF-1α WT과 HIF-1α P2A는 유비퀴틴화가 증가하는데 비해, 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α K32A는 유비퀴틴화의 증가가 보이지 않았다 (도 2o). 또한 메틸화가 일어난 HIF-1α가 동시에 히드록실화가 일어날 수 있는 것도 확인하였다. 종합해보면, 이 결과들은 저산소 환경에서 HIF-1α에 의해 일어난 메틸화가 LSD1에 의해서 탈메틸화되고 이로 인해 HIF-1α가 26S 프로테아좀에 의해 분해되는 것이 막힘을 보여준다. 그리고 이런 기작이 HIF-1α의 히드록실화 와는 독립적임을 보여준다.

실시예 3. Hif1a ^{KA /KA} knock-in mice가 혈액학적으로 비정상적인 표현형을 보임

생체 내에서 HIF-1α의 메틸화가 갖는 기능을 살펴보기 위해서 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α가 발현하는 Hif1a ^{KA /KA} knock-in mice를 제작하였다. 쥐 유전체에서 HIF-1α의 32번째 라이신 잔기를 알라닌으로 바꾸기 위해서 FRT 옆에 퓨로마이신 (puromycin)저항 유전자와 HIF-1α의 두번째 엑손을 포함하는 표적 벡터를 만들었다. 이 벡터에서 라이신을 알라닌으로 치환할 수 있도록 DNA 서열을 바꾸었다. 이때 AfeI 제한 효소에 의해서 잘릴 수 있는 서열을 갖도록 제작하였다 (도 3a). AfeI 제한효소로 자르는 것과 PCR을 통해서, Hif1a ^{KA /KA} knock-in mice가 잘 제작되었음을 확인하였다(도 3b). 만들어진 Hif1a ^{KA /KA} knock-in mice는 최소 C57BL/6 배경의 쥐로 7세대 역교배를 진행하였다. Hif1a ^{KA /KA} knock-in mice는 태어날 때부터 성체로 자랄 때까지 특이한 표현형이 나타나지 않았다. 또한 수정에도 문제가 없었고, 멘델의 유전법칙대로 자식의 유전형이 나타났다. 우선 만들어진 WT, Hif1a ^{KA /KA} knock-in hetero 쥐와 Hif1a ^{KA /KA} knock-in homo 쥐에서 MEF를 뽑아서 HIF-1α의 메틸화 상태를 확인하였다. 면역침강 실험을 통해서 확인한 결과, Hif1a ^{KA /KA} knock-in homo에서 뽑은 MEF에서 HIF-1α의 메틸화가 발견되지 않았다 (도 3c). HIF-1α와 HIF-2α의 단백질 발현양을 비교해본 결과, HIF-2α는 WT이나 Hif1a ^+/KA , HIF1a ^KA/KA 모두 큰 차이가 없었다.

HIF-1α 단백질 발현양의 증가는 에리스로포이어틴(EPO) 단백질의 증가와 관련있고, 이는 결국 적혈구 증가증(erythrocytosis)으로 이어진다. Hif1a ^{KA / KA} knock-in 쥐에서 HIF-1α 메틸화의 결손이 HIF-1α 단백질의 발현증가를 유발하여 적혈구 증가증이 나타나는지 알아보기 위해서 WT과 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐에서 DMOG(HIF-1α의 hydroxylation을 억제)을 처리하고 혈액과 관련된 표현형을 검사해보았다. 외적인 표현형을 살펴본 결과, Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐의 코부분과 발바닥, 복강이 붉어져 있는 것을 볼 수 있었고, 비장이 커져 있는 것을 확인하였다(도 3d). 그리고 HIF-1α의 단백질 양이 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐의 폐와 비장에서 WT 쥐보다 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 3e). 또한 혈액학적 지표를 비교해보았다. Hif1a ^KA/KA knock-in 쥐에서 적혈구가 확연히 증가되어 있고 헤모글로빈의 비율도 증가되어 있는 것을 확인하였다. 헤마토크릿 비율 역시 Hif1a ^{KA /KA} knock-in에서 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 3f). 게다가 Vegf-a, glut-1 그리고 Epo의 mRNA가Hif1a ^{KA /KA} MEF에서 저산소 환경일 때와 DMOG을 처리했을 때 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 3g). Vegf-a. Glut-1 그리고 Epo mRNA양이 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐의 페에서도 저산소 환경에서 14일동안 있거나 DMOG을 7일 동안 처리했을 때 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 3h). 면역블랏 분석을 통해서 Epo 단백질 양도 Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐의 폐에서 증가되어 있는 것을 확인하였다. 이를 종합해 보았을 때, Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐는 혈액학적 이상 표현형을 보이고 HIF-1α의 단백질 발현이 증가되어 있는 것을 알 수 있다.

실시예 4. Hif1a ^{KA /KA} knock- in쥐에서 세포 이동과 종양의 성장이 증가되어 있 음

저산소 환경에서 시간별대로 HIF-1α 단백질의 양을 비교했을 때, Hif1a ^{KA /KA} MEF에서 HIF-1α 단백질 양이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 4a). 싸이클로헥사미드(CHX)를 처리하여 단백질 합성을 억제한 뒤 HIF-1α 단백질의 반감기를 측정했을 때 Hif1a ^{KA /KA} MEF의 HIF-1α가 반감기가 증가되어 있음을 확인하였다(도 4b). 우리는 또한 쥐의 폐에서 HIF-1α의 단백질 양과 메틸화를 비교해 보았다. 쥐를 10% 산소 농도의 저산소 환경에서 14일 동안 키운 뒤 분석해 보았을 때, HIF-1α 단백질 양이 Hif1a ^{KA /KA} knock-in쥐의 폐에서 증가되어 있음을 확인하였고, HIF-1α의 메틸화가 저산소 환경에 노출되었을 때 WT 쥐에서 감소됨을 확인하였다 (도 4c).

SET7/9과 LSD1이 세포의 이동을 조절하는지 알아보기 위해서 SET7/9과 LSD1을 과발현시키고 보통 환경과 저산소 환경에서 세포의 이동을 분석하였다. 저산소 환경에서 SET7/9을 과발현 시켰을 때는 세포 이동이 감소하고 LSD1이 과발현 되었을 때는 세포이동이 증가됨을 확인하였다 도 4d). HIF-1α의 발현 증가는 암의 발달과 관계가 있기 때문에 Hif1a ^{KA /KA} knock-in MEF에서 세포 이동과 군집형성이 증가되어 있는지 확인해보았다. WT MEF와 비교해보았을 때, Hif1a ^{KA /KA} knock-in MEF에서 세포 이동이 증가되어 있음을 확인하였다(도 4e). 게다가 세포 군집형성 분석에서도 Hif1a ^{KA /KA} knock-in MEF가 더 잘 형성하는 것을 확인하였다(도 4f). HIF-1α 메틸화가 종양 형성을 억제하는 것을 인 비보에서 증명하기 위해서 HIF-1α를 낙다운(knockdown)한 뒤, HIF-1α WT과 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α K32A를 발현시킨 MDA-MB231 유방암 세포주를 면역이 억제된 쥐의 피하에 주입하였다. 이후 종양 형성 정도를 측정한 결과, HIF-1α K32A를 발현하는 세포주를 주입했을 때 종양 형성과 종양 부피 종양 무게가 증가되어 있음을 확인하였다 (도 4g). 따라서 메틸화가 일어나지 않는 HIF-1α를 발현시켰을 때, 종양 성장을 유도한다는 것을 알 수 있다.

실시예 5. Hif1a ^{KA /KA} knock-in 쥐에서 망막 혈관 생성이 증가됨

저산소 환경에 의한 HIF-1α 안정은 혈관 생성을 증가시키는 인자를 코딩하는 몇몇개의 표적 유전자의 전사가 활성화되고 생리학적 병리학적으로 혈관생성이 증대된다. 생리학적으로 HIF-1α의 메틸화의 역할을 알아보기 위해서 생후 5일 후에 WT, Hif1a ^+/KA , Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 망막 혈과의 발달 상태를 살펴보았다. WT 쥐와 Hif1a ^{+/ KA}쥐의 망막의 혈관발달 반경과 혈관발달 밀도가 크게 차이 나지 않았다. 하지만 Hif1a ^{KA / KA} 쥐에서는 혈관발달 반경과 밀도 모두 증가되어 있음을 확인하였다 (도 5a-c). WT 쥐에 비해 Hif1a ^{KA /KA} 쥐에서 HIF-1α의 단백질 양 역시 망막의 혈관 없는 부분에서 증가되어 있음을 확인하였다 (도 5a,d). HIF-1α의 메틸화가 질병학적으로 어떤 기능을 하는지 알아보기 위해서 허혈성 망막병증과 유사한 산소 농도에 의한 망막병증 쥐 모델을 만들었다. 이 쥐에서 혈관이 없는 부분과 새로운 혈관 생성 면적을 비교해본 결과, WT쥐보다 Hif1a ^{KA / KA} 쥐가 혈관이 없는 부분은 76% 감소하였으나 새롭게 혈관이 생성된 부분은 43% 증간된 것을 확인하였다(도 5e-g). 반면에 Hif1a ^{+/ KA} 쥐는 WT과 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. Hif1a ^{KA /KA} 쥐의 망막에서는 HIF-1α와 VEGF의 발현이 WT보다 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 5h-j). 이 결과는 Hif1a ^KA/KA 쥐에서 HIF-1α가 안정화되어 있고, 이로 인해 혈관이 없는 지역에서 혈관 생성이 활발히 이루어지고 허혈의 상황에서 비정상적인 혈관 생성이 이루어지는 것을 의미한다.

실시예 6. Hif1a ^{KA / KA} 쥐에서 종양의 성장과 혈관 생성이 증가함

HIF-1α의 메틸화가 종양의 성장과 종양의 혈관 생성에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해서 루이스 폐암(Lewis Lung Carcinoma, LLC) 세포주를 WT쥐와 Hif1a ^{KA / KA} 쥐의 피부 밑에 이식하였다. 종양 세포를 이식하고 18일 뒤에 종양의 부피와 무게를 비교해 보았을 때, WT보다 Hif1a ^{KA / KA} 쥐에 이식한 종양이 부피는 24%, 무게는 26.1% 증가 한 것을 확인하였다(도 6a,b). 더불어 종양 내의 세포사멸도 WT쥐에 비해서 Hif1a ^KA/KA 쥐에서 31.7% 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 6c,d). 또한 WT쥐보다 Hif1a ^{KA / KA} 쥐에서 종양 주변 혈관과 종양 내 혈관이 각각 47.2%, 44.1% 증가되어 있는 것을 확인하였다(도 6e,f). 이는 Hif1a ^{KA / KA} 쥐에서 종양 혈관생성이 촉진되어 있다는 것을 말한다. 이런 종양 혈관 생성으로 인해 Hif1a ^{KA / KA} 쥐가 WT보다 종양 내의 저산소 상태가 감소되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(도 6g,h). 종양과 관련하여 좀 더 자세히 살펴본 결과, 세포사멸은 WT쥐와 Hif1a ^{KA / KA} 쥐가 큰 차이가 없는 반면에 종양 세포 증식은 Hif1a ^{KA / KA} 쥐에서 더 활발히 일어나는 것을 볼 수 있었다 (도 6i,j). 이런 결과들을 종합해 봤을 때, HIF-1α의 메틸화 결손은 종양 혈관 생성을 촉진 시키고 결국 종양 성장을 유도한다.

실시예 7. 인간 암에 있어서 HIF - 1α 메틸화의 생물학적 의미성

본 발명자는 HIF-1α의 메틸화와 암의 진행의 관계를 밝히기 위해서 인간 암에서 나타나는 HIF-1α의 돌연변이를 찾아보았다. 본 발명자는 암에서 나타나는 체세포 돌연변이와 관련된 데이터베이스인 COSMIC과 암 세포주에서 나타나는 돌연변이관련 데이타베이스인 CCLE를 이용해서 HIF-1α의 돌연변이를 찾아보았다. 데이터베이스에서 SET7/9에 의해 메틸화가 일어나는 HIF-1α K32의 돌연변이를 찾지는 못했지만, 인간의 암일 때 K32 근처의 S28과 R30에서 돌연변이가 자주 나타나는 것을 확인하였다 (도 7a). 예를 들어 식도암, 혈액암, 림프암 등에서 HIF-1α S28Y 돌연변이가 보고되었고, 피부암에서 R30Q 돌연변이가 보고되었다.

암에서 나타나는 돌연변이들이 HIF-1α의 메틸화에 영향을 주고 그로 인해 HIF-1α의 안정성을 조절하는지 알아보기 위해서 암에서 나타나는 다양한 돌연변이을 가지고 HIF-1α 메틸화를 확인해보았다. S14R, R17G, R18Q, R19Q 에서는 HIF-1α의 메틸화가 정상적으로 일어났으나, S28Y, R30Q에서는 K32A처럼 메틸화가 나타나지 않았다 (도 7b). 주어진 S28와 R30은 나선-고리-나선 구조(helix-loop-helix) 도메인에 있는 SET7/9 표적 서열로서, 본 발명자는 상기 S28Y와 R30Q 돌연변이가 이 SET7/9에 의한 메틸화가 일어나지 못함으로서 결국 HIF-1α의 안정화가 유도될 것이라고 가설을 세웠다. 상기 가설이 맞는지 확인하기 위해서 SET7/9에 의해서 돌연변이체들의 안정성이 변하는지 확인해보았다. 실제로 R17G, R18Q, R19Q는 SET7/9에 의해서 안정성이 줄어들었지만, S28Y 와 R30Q는 SET7/9에 의한 단백질 분해가 나타나지 않았다 (도 7c). 이와 함께, 인 비트로 메틸화 실험에서도 R17G는 메틸화가 일어나지만, R30Q와 K32A는 메틸화가 일어나지 않는 것을 확인하였다 (도 7d).

또한 본 발명자는 트랜스웰 세포 이동(Transwell cell migration) 실험을 수행하였다. HIF-1α가 없는 MEF에 각각 HIF-1α WT, K32A, R17G, R30Q를 다시 넣어준 뒤 SET7/9또는 LSD1에 의해서 세포 이동이 어떻게 변하는지 확인한 결과, WT과 R17G는 SET7/9에 의해서 세포 이동이 줄어들고 LSD1에 의해서 늘어나는 것을 관찰하였다. 하지만 K32A와 R30Q는 SET7/9이나 LSD1에 영향을 받지 않는 것을 관찰할 수 있었다 (도 7e). 이 결과들은 결국 인간 암에서 SET7/9에 의해서 일어나는 HIF-1α의 메틸화는 중요성을 갖고 있다는 것을 의미한다.

몇몇 논문에 의하면, 암에서 SET7/9가 강력한 역할을 한다고 한다. p53의 SET7/9-매개 메틸화는 아세틸화를 촉진시켜, p53 단백질 안정성을 증가시킨다. LSD1은 많은 암에서 과발현되어 있으며, 아민 옥시다아제 저해제로 LSD1을 저해하면 암 증식이 손상된다(Kashyap, V. et al. The lysine specific demethylase-1 (LSD1/KDM1A) regulates VEGF-A expression in prostate cancer. Mol. Oncol. 7, 555566 (2013) ; Lim, S. et al. Lysine-specific demethylase 1 (LSD1) is highly expressed in ER-negative breast cancers and a biomarker predicting aggressive biology. Carcinogenesis 31, 512520 (2010) ; Schulte, J. H. et al. Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorly differentiated neuroblastoma: implications for therapy. Cancer Res. 69, 20652071 (2009).). 나아가, LSD1은 전립선 및 유방암 세포에서 각각 안드로겐 수용체- 및 에스트로겐 수용체 의존성 전사를 촉진시킨다. 암에서 LSD1 과발현이 HIF-1α를 안정화시키고 종양 혈관생성을 촉진하는 본원의 데이터를 통해, LSD1이 호르몬 의존성 암 뿐만 아니라 다른 타입의 암도 어떻게 촉진시키는지 알 수 있다.

다양한 인간 암에서 유전적 변화에 의해 야기된 HIF-1α 과발현된다고 보고되어 있다. HIF-1α 과발현과 연관된 흔한 유전적 변화도 많은 빈도로 암 환자에게 일어난다. 예를 들어, 유전적 변화에 의한 VHL(Von Hippel-Lindau)의 기능상실로 인해 HIF-1α가 구성적으로 발현되고, 또한 망막 및 CNS 혈관아세포종(haemangioblastomas), 투명세포 신세포암, 갈색세포종(pheochromocytoma), 췌장 도세포 종양(pancreatic islet cell tumour) 및 망막, 췌장 및 부고환 낭선종(epididymal cysts)에 취약한 특징이 있는 유전성 가족력 암증후군인 VHL 질병이 시작된다. p53이 기능을 상실하면 암에서 HIF-1α 단백질 레벨 및 HIF-1α 전사 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method of screening anti-angiogenesis agent targeting methylation of HIF-1alpha <130> DP201606002P <150> KR 2016/0003321 <151> 2017-01-11 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 826 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(826) <223> HIF-1alpha <400> 1 Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu 1 5 10 15 Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys 20 25 30 Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His 35 40 45 Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile 50 55 60 Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile 65 70 75 80 Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu 85 90 95 Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile 100 105 110 Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr 115 120 125 Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met 130 135 140 Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu 145 150 155 160 Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr 165 170 175 Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu 180 185 190 His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro 195 200 205 Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys 210 215 220 Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys 225 230 235 240 Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp 245 250 255 Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly 260 265 270 Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr 275 280 285 Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln 290 295 300 Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln 305 310 315 320 Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val 325 330 335 Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe 340 345 350 Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp 355 360 365 Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser 370 375 380 Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu 385 390 395 400 Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn 405 410 415 Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn 420 425 430 Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu 435 440 445 Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser 450 455 460 Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro 465 470 475 480 Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp 485 490 495 Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu 500 505 510 Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val 515 520 525 Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr 530 535 540 Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu 545 550 555 560 Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser 565 570 575 Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser 580 585 590 Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln 595 600 605 Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu 610 615 620 Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala 625 630 635 640 Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser 645 650 655 Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala 660 665 670 Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro 675 680 685 Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu 690 695 700 Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg 705 710 715 720 Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr 725 730 735 Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp 740 745 750 Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln 755 760 765 Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly 770 775 780 Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys 785 790 795 800 Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu 805 810 815 Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn 820 825 <210> 2 <211> 2481 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(2481) <400> 2 atggagggcg ccggcggcgc gaacgacaag aaaaagataa gttctgaacg tcgaaaagaa 60 aagtctcgag atgcagccag atctcggcga agtaaagaat ctgaagtttt ttatgagctt 120 gctcatcagt tgccacttcc acataatgtg agttcgcatc ttgataaggc ctctgtgatg 180 aggcttacca tcagctattt gcgtgtgagg aaacttctgg atgctggtga tttggatatt 240 gaagatgaca tgaaagcaca gatgaattgc ttttatttga aagccttgga tggttttgtt 300 atggttctca cagatgatgg tgacatgatt tacatttctg ataatgtgaa caaatacatg 360 ggattaactc agtttgaact aactggacac agtgtgtttg attttactca tccatgtgac 420 catgaggaaa tgagagaaat gcttacacac agaaatggcc ttgtgaaaaa gggtaaagaa 480 caaaacacac agcgaagctt ttttctcaga atgaagtgta ccctaactag ccgaggaaga 540 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gtagtgctga ccctgcactc aatcaagaag ttgcattaaa attagaacca 1440 aatccagagt cactggaact ttcttttacc atgccccaga ttcaggatca gacacctagt 1500 ccttccgatg gaagcactag acaaagttca cctgagccta atagtcccag tgaatattgt 1560 ttttatgtgg atagtgatat ggtcaatgaa ttcaagttgg aattggtaga aaaacttttt 1620 gctgaagaca cagaagcaaa gaacccattt tctactcagg acacagattt agacttggag 1680 atgttagctc cctatatccc aatggatgat gacttccagt tacgttcctt cgatcagttg 1740 tcaccattag aaagcagttc cgcaagccct gaaagcgcaa gtcctcaaag cacagttaca 1800 gtattccagc agactcaaat acaagaacct actgctaatg ccaccactac cactgccacc 1860 actgatgaat taaaaacagt gacaaaagac cgtatggaag acattaaaat attgattgca 1920 tctccatctc ctacccacat acataaagaa actactagtg ccacatcatc accatataga 1980 gatactcaaa gtcggacagc ctcaccaaac agagcaggaa aaggagtcat agaacagaca 2040 gaaaaatctc atccaagaag ccctaacgtg ttatctgtcg ctttgagtca aagaactaca 2100 gttcctgagg aagaactaaa tccaaagata ctagctttgc agaatgctca gagaaagcga 2160 aaaatggaac atgatggttc actttttcaa gcagtaggaa ttggaacatt attacagcag 2220 ccagacgatc 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Claims (7)

1. HIF1(hypoxia-inducible factor-1)-α단백질 및 SET7/9 단백질을 제공하는 단계로,
   상기 HIF1-α단백질은 서열번호 1의 서열을 기준으로 30번째 잔기가 알지닌에서 글루타민 또는 아스파라진 잔기로 치환된 것이고,
   상기 HIF1-α단백질 및 SET7/9 단백질의 복합체에 상기 SET7/9을 활성화시킬 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 SET7/9의 활성화는 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 메틸화로 측정되고,
   상기 32번째 잔기에서의 메틸화를 검출하는 단계; 및
   상기 메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질로 처리된 경우, 상기 32번 잔기에 메틸화가 증가한 경우, 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 혈관신생억제제 스크리닝 방법.
   
2. HIF1-α단백질 및 LSD1 (Lysin Specific demethylase 1) 단백질을 제공하는 단계로, 상기 HIF1-α단백질은 서열번호 1을 기준으로 32번째 라이신 잔기에 메틸화가 되어 있으며,
   상기 HIF1-α단백질 및 LSD1 단백질 복합체에 상기 LSD1의 활성을 억제할 것으로 기대되는 시험물질을 처리하는 단계로, 상기 LSD1의 활성화는 상기 HIF1-α단백질에서 서열번호 1의 서열을 기준으로 32번째 잔기의 탈메틸화로 측정되고,
   상기 32번째 잔기에서의 탈메틸화를 검출하는 단계; 및
   상기 탈메틸화 검출결과, 시험물질로 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 시험물질 물질로 처리된 경우, 상기 32번째 잔기의 탈메틸화가 감소된 경우 상기 시험물질을 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 혈관신생억제제 스크리닝 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 HIF1-α단백질의 30번째 잔기는 알지닌에서 글루타민 또는 아스파라진 잔기로 치환된 것인, 혈관신생억제제 스크리닝 방법.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 HIF1-α단백질, SET7/9 단백질, 또는 LSD1 단백질은 상기 단백질을 발현하는 세포 또는 인간을 제외한 동물의 형태로 제공되는 것인, 방법.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 세포는 HEK-293T (human embryonic kidney cell), HeLa (human cervical cancer cell) 또는 MDA-MB231 (human breast cancer cell) 인, 방법.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 메틸화는 상기 HIF1-α단백질의 하이드록실화 및 상기 HIF1-α단백질의 VHL에의 결합에 비의존적인 것인, 방법.
   
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 혈관신생억제제는 망막증 또는 암 치료제로 사용되는 것인, 방법.

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