KR101871244B1 - Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof - Google Patents

Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof Download PDF

Info

Publication number
KR101871244B1
KR101871244B1 KR1020170080604A KR20170080604A KR101871244B1 KR 101871244 B1 KR101871244 B1 KR 101871244B1 KR 1020170080604 A KR1020170080604 A KR 1020170080604A KR 20170080604 A KR20170080604 A KR 20170080604A KR 101871244 B1 KR101871244 B1 KR 101871244B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
photosensitizer
polyethylene glycol
cell
antibody
Prior art date
Application number
KR1020170080604A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20170078572A (en
Inventor
나건
김경섭
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Publication of KR20170078572A publication Critical patent/KR20170078572A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101871244B1 publication Critical patent/KR101871244B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0061—5-aminolevulinic acid-based PDT: 5-ALA-PDT involving porphyrins or precursors of protoporphyrins generated in vivo from 5-ALA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2884—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD44
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
    • C08G65/33331—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen containing imide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes

Abstract

본 발명은 빛에 의해 일항산소를 생성할 수 있는 광감작제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제들을 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 세포를 제공하며, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a cell containing a photosensitizer capable of generating oxygen by light, a method for producing the same, and a use thereof, and more particularly, to a method for producing a cell, which comprises chemically combining photosensitizers with macrophages or mesenchymal stem cells, The present invention provides a cell containing a photosensitizing agent that is conjugated or encapsulated in a cell by a method such as antibody binding or cell internalization, wherein the cell containing the photosensitizing agent accumulates in the cancerous area during intravenous injection, , The macrophage or mesenchymal stem cell can be killed and the local immune response can be promoted and the cancer cell can be killed, thus being useful as a cancer immunotherapeutic agent.

Description

광감각제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도{Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof}Cells containing a photosensitizer, methods of producing the same, and uses thereof Photosensitizer labeled cells, preparation method thereof and use thereof

본 발명은 빛에 의해 일항산소를 생성할 수 있는 광감작제를 함유하는 세포, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제들을 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 대식세포 또는 간엽줄기세포를 제공하며, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a cell containing a photosensitizer capable of generating oxygen by light, a method for producing the same, and a use thereof, and more particularly, to a method for producing a cell, which comprises chemically combining photosensitizers with macrophages or mesenchymal stem cells, The present invention provides a macrophage or mesenchymal stem cell comprising a photosensitizer which is conjugated or enclosed in a cell by a method such as antibody binding or cell internalization, And when irradiated with light of a specific wavelength, macrophages or mesenchymal stem cells can be killed and the local immune response can be promoted and cancer cells can be killed, so that they can be usefully used as cancer immunotherapeutic agents.

현재 임상학적으로 사용되고 있는 암의 3대 치료 방법은 수술, 방사선 요법, 및 화학요법 등으로 암의 성질에 따라 단독 또는 복합적으로 사용되고 있으나 아직 이러한 치료방법에 의해 암을 완치하지 못하고 환자에게 심한 부작용과 고통을 수반하고 있는 실정이다. 최근 면역학적 방법에 의하여 암을 치료하려는 새로운 시도가 주로 동물 실험을 통해 활발히 진행되고 있는데 이를 총칭하여 암백신 또는 면역학적 치료법(cancer immunotherapy)이라 한다. 암의 면역학적 치료법은 기존의 바이러스 및 박테리아 백신과 유사하게 특정 암 항원에 대한 면역반응 특히 암특이 killer T 세포를 유도하여 암세포를 제거하는 것으로 최근 암 치료의 4대 요법으로 자리 잡아 가고 있다.Currently, three major treatments for cancer are surgery, radiotherapy, and chemotherapy, depending on the nature of the cancer. However, these treatments do not cure the cancer, It is accompanied by pain. Recently, new attempts to treat cancer by immunological methods have been actively conducted through animal experiments, collectively referred to as cancer vaccination or cancer immunotherapy. Immunological treatment of cancer is similar to existing viral and bacterial vaccines, and induces immune responses to specific cancer antigens, especially cancer specific killer T cells, to remove cancer cells.

면역학적 암 치료 방법은 암 특이 killer T 세포를 유도시켜 이들로 하여금 암세포를 공격하여 제거하는 기술로 수술 등에 의해 제거할 수 없는 micro-metastasis된 암세포들도 찾아가서 제거하는 것과 암세포 선택적인 치료를 통해 다른 조직에 대한 부작용을 주지 않는다는 장점이 있다. 또한, 기억 CD8+ T 세포는 수년에서 수십 년까지 생체 내에서 살 수 있어 기억 세포를 유도해 놓으면 완치의 가능성 뿐 아니라 재발 억제의 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.  Immunological cancer therapy is a technique to induce cancer-specific killer T cells to attack and remove cancer cells, and it is necessary to search for and remove micro-metastasis cancer cells that can not be removed by surgery, and to treat cancer cells selectively It has the advantage of not giving side effects to other tissues. In addition, memory CD8 + T cells can survive in vivo for many years to several decades. Inducing memory cells may result in the potential for recurrence as well as cure.

하지만, 지금까지 암의 면역 치료법은 종양 세포 자체가 면역 억제 사이토카인을 분비하거나 종양세포를 공격하는 림프구를 죽이는 방법 또는 종양세포를 인지할 때 사용되는 분자들의 발현을 종양세포 자신이 낮추거나 세포 내로 감추어 면역반응을 회피한다는 단점이 있어 현재 임상적용시 뛰어난 효과를 나타내지 못하고 있다.However, up until now, immunotherapy of cancer has shown that tumor cells themselves secrete immunocompromised cytokines, kill lymphocytes that attack tumor cells, or suppress the expression of molecules used to recognize tumor cells, It has a disadvantage of avoiding immune reaction and does not show excellent effect in clinical application.

한국공개특허 제10-2013-0030229호 (2013.03.26)Korean Patent Publication No. 10-2013-0030229 (March 23, 2013)

본 발명의 목적은 정맥내 투여 시 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포나 간엽줄기세포에 광감각제를 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화와 같은 방법에 의해 접합시키거나 또는 세포 내부에 봉입시킨 광감각제를 함유하는 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.It is an object of the present invention to provide a method for treating a tumor, which comprises administering a photodynamic agent to a macrophage or mesenchymal stem cell having an ability of locating a tumor site by intravenous administration by chemical binding, antigen-antibody binding or intracellularization, A cell containing the photosensitizer encapsulated therein, and a method for producing the same.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 광감각제를 함유하는 세포가 암 부위에 축적되고 종양 부위에 광원 조사시 대식세포 또는 간엽줄기세포가 사멸하면서 사이토카인을 생성하여 killer T세포를 종양 부위로 불러들여 암 치료를 할 수 있는 암 면역치료제를 제공하는 데에 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a cytokine, which causes cytotoxicity and cytotoxicity of a tumor cell, And to provide cancer immunotherapy that can treat cancer.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a cell containing a photosensitizer.

보다 상세하게는, 본 발명은 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 세포와 결합하거나 세포 내 봉입된, 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.More particularly, the present invention provides a cell containing a photosensitizer, wherein the photosensitizer is bound to or enclosed in a cell by any one of chemical bonding, antigen-antibody binding or intracellularization.

또한, 본 발명은 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 세포와 결합하거나 세포 내 봉입된, 광감각제를 함유하는 세포 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a cell containing a photosensitizer, wherein the photosensitizer is bound to or enclosed in a cell by any one of chemical bonding, antigen-antibody binding, or cell internalization.

또한, 본 발명은 상기 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for cancer immunotherapy comprising cells containing the photosensitizer as an active ingredient.

본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 정맥 주사 시 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 의해 암 부위에 축적되며 특정 파장의 광원을 조사 시 광감각제가 생성하는 일항산소에 의해 간엽줄기세포를 사멸시키며 일항산소에 의해 사멸되는 세포가 IL-6, IL-8, 열충격단백질 70(hsp 70)과 같은 사이토카인을 생성함으로써 국소적인 면역반응을 촉진시켜 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 면역치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.The cells containing the photosensitizer according to the present invention are accumulated in the cancerous region by macrophages or mesenchymal stem cells capable of locating the tumor site by intravenous injection, and when the light source of a specific wavelength is irradiated, , And the cells killed by the oxygen species can produce cytokines such as IL-6, IL-8, and heat shock protein 70 (hsp 70), thereby killing the cancer cells by promoting the local immune response And thus can be usefully used as a cancer immunotherapeutic agent.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PPIX의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 4은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포 표면에 아자이드(azide) 부여 여부를 공초점 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 5은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포와 DBCO-PEG-PheoA의 접합 효율에 대한 유세포분석 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 9은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 사전 활성화된 PEG-Ce6의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-Hpp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포와 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp의 접합 여부를 레이저 주사 현미경 사진으로 나타내는 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 Hpp의 양을 형광분광광도계로 측정하여 나타내는 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 인간 간엽줄기세포에 내재화된 광감각제의 시간에 따른 양 변화를 유세포분석기로 측정하여 나타내는 것이다.
도 14는 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 15는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 16은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 17은 발명의 일실시예에 따른 Hpp를 내재화하는 인간 간엽줄기세포의 레이저 조사 후 자체 세포독성을 나타내는 것이다.
도 18은 발명의 일실시예에 따른 DBCO-PEG-PheoA를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 19는 발명의 일실시예에 따른 사전 활성화된 PEG-Ce6를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 20은 발명의 일실시예에 따른 CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp, CD105-PEG-Hpp를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 사멸과정 중 생성하는 cytokine을 나타내는 것이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암세포에 대한 광역학치료 효과를 나타내는 것이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포가 암부위에 축적되는 것을 형광 영상 장치 사진으로 나타내는 것이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 나노입자, 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포의 주사 후 장기별 분포를 형광 영상 장치 사진으로 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 암 동물모델(Balb/c nude mice)에서 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 주사 후 암 조직에 존재하는 인간 간엽줄기세포를 항체로 염색하여 공초점 형광현미경으로 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 다양한 개체수의 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하여 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 26은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 레이저 조사유무에 따른 암과 비장조직에서의 면역인자변화를 ELISA 방법으로 나타내는 것이다.
도 27은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 28은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 29는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여 시 나타나는 암 치료효과를 나타내는 것이다. 화살표는 레이저 조사 시기를 나타내는 것이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 31은 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(Balb/c nude mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.
도 32는 본 발명의 일실시예에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암 동물모델(CB17 SCID mice)에 주사하고 광원 부여시 나타나는 암 치료효과를 암 크기변화 사진과 암 조직염색법을 통해 나타내는 것이다.1 is a 1 H-NMR spectrum of DBCO-PEG-PheoA according to an embodiment of the present invention.
2 is a 1 H-NMR spectrum of DBCO-PEG-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
3 is a 1 H-NMR spectrum of DBCO-PEG-PPIX according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a photograph of a confocal laser scanning microscope photograph showing whether or not azide is added to the surface of macrophages, mice, and human mesenchymal stem cells according to an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a laser scanning microscope photograph showing whether macrophage, mouse and human mesenchymal stem cells and DBCO-PEG-PheoA are conjugated according to an embodiment of the present invention.
6 is a flow cytometric analysis result of the efficiency of conjugation of macrophage, mouse and human mesenchymal stem cells and DBCO-PEG-PheoA according to an embodiment of the present invention.
7 shows a 1 H-NMR spectrum of PEG-Ce6 according to an embodiment of the present invention.
Figure 8 shows the 1 H-NMR spectrum of pre-activated PEG-Ce6 according to one embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a laser scanning microscope photograph showing whether or not the pre-activated PEG-Ce6 is conjugated to human mesenchymal stem cells according to an embodiment of the present invention.
10 shows a 1 H-NMR spectrum of PEG-Hpp according to an embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a laser scanning microscope photograph showing the binding of human mesenchymal stem cells to CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp and CD105-PEG-Hpp according to an embodiment of the present invention.
FIG. 12 shows the amount of Hpp internalized in human mesenchymal stem cells according to an embodiment of the present invention measured by a fluorescence spectrophotometer.
FIG. 13 is a graph showing a change in the amount of the photosensitizer, which is internalized in human mesenchymal stem cells, over time according to an embodiment of the present invention, using a flow cytometer.
FIG. 14 shows self-cytotoxicity of macrophage, mouse, and human mesenchymal stem cells containing DBCO-PEG-PheoA according to an embodiment of the present invention after laser irradiation.
Fig. 15 shows the self-cytotoxicity after laser irradiation of human mesenchymal stem cells containing pre-activated PEG-Ce6 according to an embodiment of the invention.
FIG. 16 shows self-cytotoxicity after laser irradiation of human mesenchymal stem cells containing CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp and CD105-PEG-Hpp according to an embodiment of the present invention.
FIG. 17 shows self-cytotoxicity after laser irradiation of human mesenchymal stem cells that internalize Hpp according to an embodiment of the present invention.
FIG. 18 shows the cytokine produced during the death of human mesenchymal stem cells containing DBCO-PEG-PheoA according to an embodiment of the present invention.
FIG. 19 shows cytokines produced during the death of human mesenchymal stem cells containing pre-activated PEG-Ce6 according to an embodiment of the invention.
FIG. 20 shows cytokines produced during the death of human mesenchymal stem cells containing CD44-PEG-Hpp, CD90-PEG-Hpp and CD105-PEG-Hpp according to an embodiment of the present invention.
FIG. 21 shows photodynamic therapy effects of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer according to an embodiment of the present invention on cancer cells.
22 is a graph showing the accumulation of nanoparticles, macrophages, mice, and human mesenchymal stem cells containing photosensitizer in cancer sites in a Balb / c nude mice according to an embodiment of the present invention. It is a photograph.
FIG. 23 is a graph showing the distribution of the nanoparticles, macrophages, mouse, and human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer after injection in a cancer animal model (Balb / c nude mice) according to an embodiment of the present invention, As shown in the photograph.
FIG. 24 is a graph showing the results of immunohistochemical staining of human mesenchymal stem cells present in cancer tissues after injection of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer in a cancer animal model (Balb / c nude mice) according to an embodiment of the present invention. Focus fluorescence microscope.
FIG. 25 is a graph showing changes in immunological factors in cancer and spleen tissues by injecting human mesenchymal stem cells containing various numbers of photosensitizers according to an embodiment of the present invention into cancer animal models (Balb / c mice) by ELISA .
FIG. 26 is a graph showing changes in immunological factors in cancer and spleen tissues with and without laser irradiation by injecting human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer according to an embodiment of the present invention into a female animal model (Balb / c mice) .
FIG. 27 shows the effect of injecting human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer into a cancer animal model (Balb / c mice) and showing a cancer treatment effect upon application of a light source according to an embodiment of the present invention. The arrow indicates the laser irradiation time.
FIG. 28 shows the effect of injecting human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer into Balb / c nude mice and showing the effect of cancer treatment upon application of a light source according to an embodiment of the present invention. The arrow indicates the laser irradiation time.
FIG. 29 shows the effect of injecting human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer into a cancer animal model (CB17 SCID mice) and showing the cancer treatment effect upon application of a light source according to an embodiment of the present invention. The arrow indicates the laser irradiation time.
FIG. 30 is a graph showing the effect of irradiation of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer according to an embodiment of the present invention in a cancer animal model (Balb / c mice) .
FIG. 31 is a graph showing the effect of irradiation of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer according to an embodiment of the present invention on cancer animal models (Balb / c nude mice) It is expressed through staining method.
FIG. 32 is a graph showing the effect of injecting human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer according to an embodiment of the present invention into a cancer animal model (CB17 SCID mice) .

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명자들은 종양치료를 위해 종양 부위를 스스로 찾아가는 능력을 가지는 대식세포 또는 간엽줄기세포를 기반으로 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제를 함유시키고 빛을 부여해주면 광감각제가 생성하는 일항산소에 의해 대식세포 또는 간엽줄기세포를 사멸시키며 일항산소에 의해 사멸되는 세포가 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 열충격 단백질 70(hsp 70)과 같은 사이토카인을 생성하여 암 면역치료제로서 활용할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성한 것이다.The present inventors have found that when a macrophage or mesenchymal stem cell contains a photosensitizer based on a macrophage or mesenchymal stem cell capable of locating a tumor site by itself for tumor treatment, Cells killed by macrophages or mesenchymal stem cells kill macrophages or mesenchymal stem cells to produce cytokines such as IL-6, IL-8, and hsp 70, And the present invention can be utilized as an immunotherapeutic agent.

이에, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a cell containing a photosensitizer.

상기 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The cells may be macrophages or mesenchymal stem cells, but are not limited thereto.

상기 광감각제는 빛에 의해 일항산소를 생성하며, 일례로서 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 보다 상세하게는 친수성 물질과 접합을 통해 용해도를 증가시킬 수 있는 카르복실기를 갖는 페오포르바이드(pheophorbide a), 클로린(chlorin e6) 및 포르피린(protoporphyrin IX)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The photosensitizer generates unidirectional oxygen by light, and examples thereof include a phorphyrins compound, a chlorins compound, a bacteriochlorins compound, a phthalocyanines compound, a naphthalocyanines (naphthalocyanines) ) Compounds and 5-aminolevuline esters compounds. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a pheophorbide having a carboxyl group capable of increasing solubility through conjugation with a hydrophilic substance, a, chlorin e6, and protoporphyrin IX. However, the present invention is not limited thereto.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112017061081761-pat00001
Figure 112017061081761-pat00001

본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 광감각제가 화학적 결합, 항원-항체 결합 또는 세포내재화 중 어느 하나의 방법으로 대식세포 또는 간엽줄기세포와 결합하거나 대식세포 또는 간엽줄기세포 내 봉입될 수 있다.The cells containing the photosensitizer according to the present invention can be used to bind macrophages or mesenchymal stem cells or be encapsulated in macrophages or mesenchymal stem cells by any one of chemical bonding, antigen-antibody binding or cell internalization have.

상기 화학적 결합 또는 항원-항체 결합 중 어느 하나의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 폴리에틸렌글리콜을 더 포함할 수 있다.The cell containing the photosensitizer in any one of the above chemical binding or antigen-antibody binding may further comprise polyethylene glycol.

상기 폴리에틸렌글리콜은 1차 아민기(-NH2), 하이드록시기(-OH) 및 카르복실기(-COOH)로 이루어진 군에서 선택된 동종 또는 이종의 관능기를 둘 이상 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 2개의 1차 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 2개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 1차 아민기(-NH2)와 1개의 카르복실기(-COOH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 카르복실기(-COOH)와 1개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 1개의 하이드록실기(-OH)와 1개의 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 유연하게 조절이 가능하며, 일례로서 중량평균분자량(Mw)이 2,000 내지 10,000일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The polyethylene glycol may include two or more kinds of the same or different functional groups selected from the group consisting of a primary amine group (-NH 2 ), a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH), more preferably 2 Polyethylene glycol having primary amine groups (-NH 2 ); Polyethylene glycol having two hydroxyl groups (-OH); Polyethylene glycol having one primary amine group (-NH 2 ) and one carboxyl group (-COOH); Polyethylene glycol having one carboxyl group (-COOH) and one hydroxyl group (-OH); And polyethylene glycol having one hydroxyl group (-OH) and one amine group (-NH 2 ). The molecular weight of the polyethylene glycol can be controlled flexibly, And may have a weight average molecular weight (Mw) of 2,000 to 10,000, but is not limited thereto.

상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 접합체가 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면에 존재하는 아민기와 아마이드 결합을 통해 결합할 수 있다.The cells containing the photosensitizer by the method of chemical binding are those in which macrophages or mesenchymal stem cells bind to a photosensitizer and a conjugate to which polyethylene glycol is bound, and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (N, N- dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS), the activated conjugate can be bound to the amphiphilic or mesenchymal stem cell via an amide bond with an amine group.

상기 화학적 결합의 방법으로 광감각제를 포함하는 세포는 디벤조사이클로옥텐을 더 포함할 수 있으며, 상기 디벤조사이클로옥텐은 1차 아민기(-NH2) 또는 카르복실기(-COOH) 중 어느 하나의 관능기를 포함할 수 있다.The cells containing the photosensitizer in the method of chemical bonding may further include dibenzocyclooctene, and the dibenzocyclooctene may be any one of a primary amine group (-NH 2 ) or a carboxyl group (-COOH) Functional groups.

상기 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 광감각제, 폴리에틸렌글리콜 및 디벤조사이클로옥텐이 결합된 접합체와 결합하며, 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면에 존재하는 글리칸을 아자이드로 개질한 후 디벤조사이클로옥텐의 관능기와 결합할 수 있다.The cells containing the photosensitizing agent bind macrophages or mesenchymal stem cells with a photosensitizer, polyethylene glycol and dibenzocyclooctene conjugate, and the glycans present on the surface of macrophages or mesenchymal stem cells are called azide After the modification, the functional group of the dibenzocyclooctene can be bonded.

또한, 상기 항원-항체 결합의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포가 항체, 광감각제 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 접합체와 결합하며, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 항체에 존재하는 아민기와 결합한 항체-광감각제-폴리에틸렌글리콜 접합체가 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면 항원과 결합할 수 있다.The cells containing the photosensitizer by the method of antigen-antibody binding described above may be prepared by combining macrophages or mesenchymal stem cells with a conjugate to which an antibody, a photosensitizer and polyethylene glycol are bound, and N, N-dicyclohexylcarbodi A photosensitizer-polyethylene glycol conjugate activated by reacting with N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) is reacted with an amine- - Polyethylene glycol conjugates can bind macrophages or mesenchymal stem cell surface antigens.

상기 항체는 CD44, CD54, CD90, CD105, CD106 및 CD166로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The antibody may be selected from the group consisting of CD44, CD54, CD90, CD105, CD106 and CD166, but is not limited thereto.

또한, 상기 세포내재화의 방법으로 광감각제를 함유하는 세포는 대식세포 또는 간엽줄기세포에 광감각제를 처리한 후 세포 배양하여 대식세포 또는 간엽줄기세포 내부에 광감각제를 봉입시킬 수 있다.In addition, the cells containing the photosensitizer by the cell internalization method can encapsulate the photosensitizer in macrophages or mesenchymal stem cells by treating macrophages or mesenchymal stem cells with a photosensitizer and culturing the cells.

본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 디벤조사이클로옥텐과 반응시키는 단계(제2단계); 세포 표면의 글리칸에 아자이드(azide)를 부여하는 단계(제3단계); 및 상기 제2단계에서 얻은 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광각감제 접합체를 상기 아자이드가 부여된 세포와 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 간엽줄기세포의 제조방법을 제공한다.The present invention relates to a process for producing a poly (ethylene glycol), comprising the steps of: (1) reacting polyethylene glycol with a photosensitizer; Reacting the polyethyleneglycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step with dibenzocyclooctene (second step); A step of adding azide to the glycan of the cell surface (step 3); And a step of binding the dibenzocyclooctene-polyethylene glycol-wide-angle impression conjugate obtained in the second step to the azide-impregnated cell (step 4). The method for producing mesenchymal stem cells .

상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.Before the first step, the photo-sensitizer is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) And a second step.

상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.After the first step, the method may further include a step of separating and purifying only one to one equivalent reaction product of the polyethylene glycol and the photosensitizer among the polyethylene glycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step.

상기 제2단계 이전에, 상기 디벤조사이클로옥텐을 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.Before the second step, the dibenzocyclooctene is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) And may further comprise an activated step.

상기 제3단계는 4개의 아세틸기를 갖는 만노스(AC4ManNAz)를 세포와 함께 배양하여 세포 표면의 글리칸에 아자이드를 부여할 수 있다.In the third step, mannose (AC 4 ManNAz) having four acetyl groups may be co-cultured with cells to give azide to the glycans on the cell surface.

또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계); 및 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 접합시키는 단계(제3단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing a photoresist composition comprising the steps of: (1) reacting a polyethylene glycol with a photosensitizer; The polyethyleneglycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (Second step); And a step of binding the activated polyethylene glycol-photosensitizer conjugate to the cell (third step).

상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.Before the first step, the photo-sensitizer is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) And a second step.

상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.After the first step, the method may further include a step of separating and purifying only one to one equivalent reaction product of the polyethylene glycol and the photosensitizer among the polyethylene glycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step.

또한, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계); 상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계); 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 항체와 접합시키는 단계(제3단계); 및 상기 제3단계에서 얻은 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 세포와 항원-항체 결합을 통해 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing a photoresist composition comprising the steps of: (1) reacting a polyethylene glycol with a photosensitizer; The polyethyleneglycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (Second step); (Step 3) of binding the activated polyethylene glycol-photosensitizer conjugate to the antibody; And a step of binding the antibody-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate obtained in the third step to the cells through antigen-antibody binding (fourth step).

상기 제1단계 이전에, 상기 광감각제를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계를 더 포함할 수 있다.Before the first step, the photo-sensitizer is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) And a second step.

상기 제1단계 이후에, 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 중 폴리에틸렌글리콜과 광감각제의 1 대 1 당량 반응산물만을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다.After the first step, the method may further include a step of separating and purifying only one to one equivalent reaction product of the polyethylene glycol and the photosensitizer among the polyethylene glycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step.

또한, 본 발명은 세포를 배양하는 단계(제1단계); 및 상기 배양된 세포에 광감각제를 처리한 후 배양하여 광감각제가 봉입된 세포를 얻는 단계(제2단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 세포의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for culturing a cell, comprising the steps of: (1) culturing a cell; And culturing the cultured cells with a photosensitizer followed by culturing to obtain cells encapsulating the photosensitizer (second step). The present invention also provides a method for producing a cell containing the photosensitizer.

일 실시예를 근거로 본 발명을 보다 상세하게 설명하면, 다양한 관능기를 갖는 폴리에틸렌글리콜은 촉매 사용 시 1개 이상의 카르복실산을 가지는 페오포르바이드, 클로린 또는 포르피린과 같은 광감각제와 화학적 결합이 가능하여 광감각제의 난용성 문제를 해결해 줄 수 있고, 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체 제조 이후 디벤조사이클로옥텐 또는 항체를 접합시켜야 하므로 화학식 2 또는 3과 같이 2개의 반응기(하이드록실기, 1차 아민, 카르복실산)를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 사용할 수 있다.The present invention will now be described in more detail with reference to the following examples. Polyethylene glycol having various functional groups can be chemically bonded with a photosensitizer such as perofollid, chlorine or porphyrin having at least one carboxylic acid when the catalyst is used Since the dibenzocyclooctene or antibody must be conjugated after the preparation of the polyethylene glycol-photosensitizer conjugate, two reactors (a hydroxyl group, a primary amine , Carboxylic acid) can be used.

[화학식 2](2)

Figure 112017061081761-pat00002
Figure 112017061081761-pat00002

[화학식 3](3)

Figure 112017061081761-pat00003
Figure 112017061081761-pat00003

하지만, 이러한 2개의 반응기를 가지는 폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 간의 1 대 1 당량의 접합뿐만 아니라 1 대 2 당량의 접합이 될 수 있으므로 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 간의 1 대 1 당량의 접합비율을 가지는 산물만을 소수성 크로마토그래피를 이용하여 소수성 차이에 의해 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 1 대 1 당량의 접합산물을 분리 및 정제할 수 있다. However, since polyethylene glycol having these two reactors can be a one to two equivalents bond as well as a one to one equivalence bond between polyethylene glycol and a photosensitizer, a one-to-one equivalent ratio between polyethylene glycol and a photosensitizer Can be separated and purified by using a hydrophobic difference between the polyethylene glycol and the light sense agent 1 to 1 equivalent of the conjugate product only by using hydrophobic chromatography.

상기 제조된 1개의 1차 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체와 1개의 카르복실기를 갖는 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne-acid)을 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)를 촉매로 사용하여 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(하기 화학식 4 참조)를 제조할 수 있고, 1개의 카르복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체의 카르복실기를 DCC 및 nhs를 촉매로 사용하여 사전 활성화 시키고 분말로 회수한 후, CD44, CD90, CD105과 같은 항체와 결합시킨 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(하기 화학식 5 참조)를 각각 제조할 수 있다.The prepared polyethylene glycol-photosensitizer conjugate having one primary amine group and dibenzocyclo- otyne-acid having one carboxyl group were reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (N, N-dicyclohexylcarbodiimide; Polyethylene glycol-photosensitizer conjugate (see Chemical Formula 4 below) can be prepared by using N-hydroxysuccinimide (DCS) and N-hydroxysuccinimide (NHS) , The carboxyl group of the polyethylene glycol-photosensitizer conjugate having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was preactivated using DCC and nhs as a catalyst, recovered as a powder, and the antibody-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate conjugated with an antibody such as CD44, CD90, CD105 (See Chemical Formula 5).

[화학식 4][Chemical Formula 4]

Figure 112017061081761-pat00004
Figure 112017061081761-pat00004

[화학식 5][Chemical Formula 5]

Figure 112017061081761-pat00005
Figure 112017061081761-pat00005

상기 과정들을 통해 제조된 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체와 대식세포 또는 간엽줄기세포 간의 접합을 위해 대식세포 또는 간엽줄기세포에 4개의 아세틸기를 가지는 만노스(AC4ManNAz)를 처리하고 3일간 배양하여 대식세포 또는 간엽줄기세포 표면의 화학적 변형(azide)을 유도할 수 있다(하기 화학식 6 참조). For adhesion between the dibenzocyclooctene-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate prepared above and macrophages or mesenchymal stem cells, mannose (AC 4 ManNAz) having four acetyl groups was treated in macrophages or mesenchymal stem cells For 3 days to induce the chemical modification (azide) of the surface of macrophages or mesenchymal stem cells (see Chemical Formula 6 below).

[화학식 6][Chemical Formula 6]

Figure 112017061081761-pat00006
Figure 112017061081761-pat00006

따라서, 대식세포 또는 간엽줄기세포에 상기 과정들을 통해 제조된 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 촉매에 의해 사전 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체, 광감각제를 각각 처리해주어 최종적으로 광감각제를 함유하는 세포를 제조할 수 있다(하기 화학식 7 참조).Thus, macrophage or mesenchymal stem cells can be treated with a dibenzocyclooctene-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate, an antibody-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate, a pre-activated polyethylene glycol-photosensitizer conjugate, And the photosensitizer, respectively, to finally produce cells containing the photosensitizer (see Chemical Formula 7 below).

[화학식 7](7)

Figure 112017061081761-pat00007
Figure 112017061081761-pat00007

본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포는 암 면역치료를 위한 면역치료제로 이용될 수 있으며, 대식세포 또는 간엽줄기세포의 귀소성 특성에 따라 특정 부위의 암에 한정되지 않으며 다양한 암 치료에 광범위하게 적용할 수 있다.The cell containing the photosensitizer according to the present invention can be used as an immunotherapeutic for cancer immunotherapy and is not limited to cancer of a specific site according to the characteristics of the macrophage or mesenchymal stem cell, Can be applied.

이에, 본 발명은 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 면역치료용 약학조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for cancer immunotherapy comprising a cell containing a photosensitizer as an active ingredient.

상기 광감각제를 함유하는 세포는 암 부위에 선택적으로 축적되어, 광원 조사시 상기 대식세포 또는 간엽줄기세포의 선택적 사멸을 유도함으로써, 사이토카인 생성을 증가시키고 살생 T 세포(killer T cell)를 모집(recruit)하는 면역반응에 의해 항암 효과를 나타낼 수 있다.Cells containing the photosensitizer are selectively accumulated in the cancerous area to induce selective death of the macrophages or mesenchymal stem cells upon irradiation with light, thereby increasing cytokine production and recruiting killer T cells and may exhibit anticancer effects by an immune response that recruits.

상기 암으로는 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The cancer may be a brain tumor, a benign astrocytoma, a malignant astrocytoma, a pituitary adenoma, a neuroendocrine tumor, a brain lymphoma, a neoplasm, Cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, cancer of the gallbladder, gallbladder cancer, Can be selected from the group consisting of small bowel cancer, colorectal cancer, anal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, testicular cancer, uterine cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, uterine sarcoma, squamous cell cancer and skin cancer But is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 광역학 항암 치료용 약학조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for photodynamic cancer therapy comprising cells containing the photosensitizer as an active ingredient.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학적으로 유효한 양의 광감각제를 함유하는 간엽줄기세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.The pharmaceutical compositions according to the present invention may comprise mesenchymal stem cells containing a pharmaceutically effective amount of a photosensitizer alone or may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.

본 발명에 따른 광감각제를 함유하는 세포의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.The pharmaceutically effective amount of the cell containing the photosensitizer according to the present invention may be 0.01 to 100 mg / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the severity of the disease symptoms, the age, body weight, health condition, sex, administration route and treatment period of the patient.

또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to humans.

상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent and an antiseptic agent.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.In addition, the pharmaceutical compositions according to the present invention can be formulated using methods known in the art so as to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the mammal. The formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatine capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered orally or parenterally, depending on the intended method. The dosage can be varied depending on the body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, The severity of the disease, and the like.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 약학조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 이때, "비경구"란 근육내, 복막내,복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로 본 발명의 광감각제를 함유하는 간엽줄기세포를 포함하는 약학조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered by injecting or otherwise administering to a person or other mammal having a disease state or symptom effective for treatment according to a desired method (for example, transplantation, body cavity, , Coating the tissue surface of the body with a coating or coating the surface of an implantable device), but it is particularly preferred that the pharmaceutical composition is delivered parenterally. Herein, "parenteral" means intramuscular, intraperitoneal, intravesical, subcutaneous, intravenous, and intraarterial. Therefore, the pharmaceutical composition comprising mesenchymal stem cells containing the photosensitizer of the present invention can be formulated into injection form representatively.

본 발명의 주사가능한 약학조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간 내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체 내임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.The injectable pharmaceutical compositions of the present invention may be injected or injected into the body of a human or other mammal by any suitable method, preferably by injection through a hypodermic needle. For example, it can be administered by intravenous, intravenous, genitourinary, subcutaneous, intramuscular, subcutaneous, intracranial, intrathecal, intrapleural, or other bodily fluids or possible space by injection or other means. Diagnosis, or surgery, through the catheter or syringe, into the joint, for example, into the joint during arthroscopy, into the urogenital tract, into the pulmonary, into the lining or into the pleura, or into any cavity or space within the body It can be introduced during the intervention procedure.

이하, 본 발명의 구성 요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 구성요소의 기술적 범위를 실시예들에 예시한 것들로 한정하고자 하는 것은 아니다. 더욱이, 상기 기술의 당업자들은 본 발명의 근본적인 개념과 그 실행을 쉽게 수정하거나 변경할 수 있을 것이다.Hereinafter, the components and technical features of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. It should be understood, however, that there is no intention to limit the technical scope of the components of the present invention to those illustrated in the embodiments. Furthermore, those skilled in the art will readily be able to modify or alter the principles of the invention and its practice.

<< 실시예Example 1> 세포 표면  1> Cell surface 글리칸의Glycan 아자이드Azide 생성을 통한 화학적 결합방법에 따른 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조 Production of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizing agent according to the chemical bonding method through production

<1-1> <1-1> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 페오포르바이드Peforbide 접합체( Junction DBCODBCO -PEG-PheoA)의 제조-PEG-PheoA) &lt; / RTI &gt;

<1-1-1> 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA)의 제조&Lt; 1-1-1 > Preparation of Polyethylene Glycol-Peroformate Conjugate (PEG-PheoA)

폴리에틸렌글리콜과 페오포르바이드 접합에 앞서 페오포르바이드의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 페오포르바이드(pheophorbide a, PheoA, 0.146g)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 페오포르바이드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한 후, 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.(PheoA, 0.146 g) and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.0695 g) were added in order to increase the reactivity of the carboxyl group of the perovalbide with a catalyst before the polyethylene glycol and the perovalbide- g) and N-hydroxysuccinimide (nhs, 0.0385 g) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 25 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours reaction, polyethylene glycol-bisamine (PEG, 1 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 25 ml) and added to the above-mentioned peroforbide solvent and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, mol. Wt. Cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product was dried by freeze drying, and the results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR).

<1-1-2> 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA)의 분리정제<1-1-2> Separation and purification of polyethyleneglycol-peroforbide conjugate (PEG-PheoA)

상기 실시예 <1-1-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively separate and purify only the conjugated product of polyethylene glycol-peroformate prepared in Example <1-1-1>. The polyethylene glycol-perovaludate conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 5 mg / ml, and methanol containing a polyethylene glycol-peroforbide conjugate was injected into hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) The ratio was varied from 5: 5 to 1: 9, and the yield was recovered at 1 minute intervals. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was removed by using a rotary evaporator and recovered through lyophilization.

<1-1-3> <1-1-3> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 페오포르바이드Peforbide 접합체( Junction DBCODBCO -PEG-PheoA)의 제조-PEG-PheoA) &lt; / RTI &gt;

상기 실시예 <1-1-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석한다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한다. 결과는 도 1과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.In order to increase the reactivity of the carboxyl group of dibenzocyclooctene (Sigma aldrich, USA) with a catalyst prior to the dibenzocyclooctene conjugation with the polyethyleneglycol-peroforbide conjugate separated and purified in Example <1-1-2> N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.002 g) and N-hydroxysuccinimide (nhs, 0.001 g) were dissolved in dimethylsulfoxide (DME) sulfoxide, DMSO, 2 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After the reaction for 6 hours, the polyethylene glycol-perovalite conjugate (PEG-PheoA, 0.030 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 3 ml) and added to the above dibenzocyclooctene solvent and reacted at room temperature for 24 hours. After filtration, the reaction mixture was dialyzed against primary dimethylsulfoxide and deionized water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: mol.wt. cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product is dried by freeze drying. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) as shown in Fig.

<1-2> <1-2> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 클로린Chlorine 접합체( Junction DBCODBCO -PEG--PEG- Ce6Ce6 )의 제조)

<1-2-1> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 제조<1-2-1> Preparation of Polyethylene Glycol-Chlorine Conjugate (PEG-Ce6)

폴리에틸렌글리콜과 클로린 접합에 앞서 클로린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 클로린(Chlorin e6, Ce6, 0.146g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 클로린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다.(Chlorin e6, Ce6, 0.146 g) and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.0695 g) and N-hydroxycarboxylic acid Roxysuccinimide (nhs, 0.0385 g) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 25 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours reaction, polyethylene glycol-bisamine (PEG, 1 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 25 ml), added to the chlorine solvent, and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, mol. Wt. Cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product was recovered through lyophilization.

<1-2-2> 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)의 분리정제<1-2-2> Separation and purification of polyethyleneglycol-chlorine conjugate (PEG-Ce6)

상기 실시예 <1-2-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively separate and purify only the conjugated products of polyethylene glycol-choline 1 to 1 equivalent prepared in Example <1-2-1>. After the polyethylene glycol-chlorine conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 5 mg / ml, methanol containing the polyethylene glycol-chlorine conjugate was injected into hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) and the ratio of water to methanol was 5 5 at a ratio of 1 to 9, and the yield was recovered at intervals of 1 minute. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was removed by using a rotary evaporator and recovered through lyophilization.

<1-2-3> <1-2-3> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 클로린Chlorine 접합체( Junction DBCODBCO -PEG--PEG- Ce6Ce6 )의 제조)

상기 실시예 <1-2-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 회수하였다. 결과는 도 2과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.In order to increase the reactivity of the carboxyl group of the dibenzocyclooctene (Sigma aldrich, USA) before the polyethylene glycol-chlorine conjugate and the dibenzocyclooctene conjugate separated and purified in the above Example <1-2-2> N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.002 g) and N-hydroxysuccinimide (nhs, 0.001 g) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DME) DMSO, 2 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours of reaction, the polyethylene glycol-chlorine conjugate (PEG-Ce6, 0.030 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 3 ml), added to the dibenzocyclooctene solvent, and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, mol. Wt. Cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product was recovered by drying through freeze drying. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) as shown in FIG.

<1-3> <1-3> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -포르피린 접합체(- porphyrin conjugate ( DBCODBCO -PEG-PPIX)의 제조-PEG-PPIX) &lt; / RTI &gt;

<1-3-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX)의 제조<1-3-1> Preparation of Polyethylene Glycol-Porphyrin Conjugate (PEG-PPIX)

폴리에틸렌글리콜과 포르피린 접합에 앞서 포르피린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 포르피린(protoporphyrin IX, PPIX, 0.146g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0695g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 포르피린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다.(Protoporphyrin IX, PPIX, 0.146 g), N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.0695 g) and N-hydroxystearylmethacrylate were used in order to increase the reactivity of the carboxyl group of porphyrin with the polyethylene glycol and porphyrin, Roxysuccinimide (nhs, 0.0385 g) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 25 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours of reaction, polyethylene glycol-bisamine (PEG, 1 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 25 ml) and added to the porphyrin solvent. The reaction was carried out at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por: mol.wt. cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product was recovered through lyophilization.

<1-3-2> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX)의 분리정제<1-3-2> Separation and purification of polyethyleneglycol-porphyrin conjugate (PEG-PPIX)

상기 실시예 <1-3-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 1대1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다. Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively separate and purify only the conjugated product of polyethylene glycol-porphyrin per 1 equivalent of the prepared product of Example <1-3-1>. After the polyethylene glycol-porphyrin conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 5 mg / ml, methanol containing polyethylene glycol-porphyrin conjugate was injected into hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) and the ratio of water to methanol was 5 5 at a ratio of 1 to 9, and the yield was recovered at intervals of 1 minute. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was removed by using a rotary evaporator and recovered through lyophilization.

<1-3-3> <1-3-3> 디벤조사이클로옥텐Dibenzocyclooctene -- 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -포르피린 접합체(- porphyrin conjugate ( DBCODBCO -PEG-PPIX)의 제조-PEG-PPIX) &lt; / RTI &gt;

상기 실시예 <1-3-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체와 디벤조사이클로옥텐 접합에 앞서 디벤조사이클로옥텐(Sigma aldrich, USA)의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 디벤조사이클로옥텐(Dibenzocyclootyne aicd, DBCO, 0.002g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.002g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 2ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-PPIX, 0.030g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 3ml)에 녹인 후 앞선 디벤조사이클로옥텐 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 회수하였다. 결과는 도 3과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.In order to increase the reactivity of the carboxyl group of the dibenzocyclooctene (Sigma aldrich, USA) with a catalyst prior to the polyethyleneglycol-porphyrin conjugate and the dibenzocyclooctene junction separated and purified in the above Example <1-3-2> N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.002 g) and N-hydroxysuccinimide (nhs, 0.001 g) were dissolved in dimethyl sulfoxide (DME) DMSO, 2 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours of reaction, polyethylene glycol-porphyrin conjugate (PEG-PPIX, 0.030 g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 3 ml), added to the above dibenzocyclooctene solvent, and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, mol. Wt. Cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After dialysis, the final reaction product was recovered through lyophilization. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR) as shown in FIG.

<1-4> 다양한 세포 표면의 글리칸 변형<1-4> Glycan modification on various cell surfaces

인간 간엽줄기세포(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD)는 α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서, 마우스 간엽줄기세포(mMSCs, Cyagen Biosciences, Sunnyvale, CA)는 Eagle’minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서, 대식세포는(RAW264.7, ATCC, TIB-71)는 RPMI 1640 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 간엽줄기세포를 포함한 다양한 세포 표면의 글리칸에 아자이드(azide)를 부여하기 위하여 4개의 아세틸기를 가지는 만노스(AC4ManNAz, Thermoscientific, korea) 50μM를 대식세포, 인간 및 마우스 간엽줄기세포 배지에 추가한 후 3일간 배양하였다. 표면의 글리칸 변형 유무는 Dibenzocyclooctyne-cy5(sigma aldrich, USA)와 결합여부를 도 4와 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.Human mesenchymal stem cells (hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) were cultured in mouse mesenchymal stem cells (mMSCs, Cyagen Biosciences, USA) in α-minimal essential medium (10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin) (RAW264.7, ATCC, TIB-71) were cultured in RPMI 1640 medium (10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin and 100 g / mL streptomycin) 10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100 g / mL streptomycin) and incubated at 37 ° C in 5% CO 2 . 50 μM of mannose (AC 4 ManNAz, Thermoscientific, korea) having four acetyl groups was added to macrophage, human and mouse mesenchymal stem cell medium to give azide to glycans on various cell surfaces including mesenchymal stem cells And cultured for 3 days. The presence or absence of glycan modification on the surface was confirmed by Confocal laser scattering microscopy, as shown in FIG. 4, in association with Dibenzocyclooctyne-cy5 (Sigma Aldrich, USA).

<1-5> 광감각제를 함유하는 다양한 세포 제조<1-5> Production of various cells containing photosensitizer

상기 <실시예 1-4>에서 세포 표면의 글리칸을 변형시킨 다양한 세포 배지에 [실시예 1-1]에서 제조한 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 처리하여 4℃ 환경에서 1시간 동안 배양하였으며, Cooper-free click reaction에 의해 최종적으로 인간 간엽줄기세포와 페오포르바이드 접합체를 제조하였다. 대식세포(PheoA-RAW264.7), 마우스(PheoA-mMSCs) 및 인간(PheoA-hMSCs) 간엽줄기세포-페오포르바이드 접합체의 결합여부는 1시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 디벤조사이클로옥텐-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체를 모두 제거한 후, 도 5과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다. 또한, 다양한 세포들에 페오포르바이드 접합체의 접합효율을 도 6과 같이 유세포분석기(flow cytometry analysis)를 이용하여 확인하였다.The dibenzocyclooctene-polyethylene glycol-peroforbide conjugate prepared in [Example 1-1] was treated in various cell media in which the glycan of the cell surface was modified in the above <Example 1-4> And cultured for 1 hour. Finally, human mesenchymal stem cells and a perofollade conjugate were prepared by Cooper-free click reaction. The binding of the mesenchymal stem cell-peoporvide conjugate to the macrophage (PheoA-RAW 264.7), mouse (PheoA-mMSCs) and human (PheoA-hMSCs) mesenchymal stem cells was measured 1 hour later using DPBS buffer After removing all of the polyethylene glycol-perofolide conjugate, the result was confirmed by confocal laser scattering microscopy as shown in FIG. In addition, the binding efficiency of the perofollade conjugate to various cells was confirmed by flow cytometry analysis as shown in FIG.

<< 실시예Example 2> 반응기 사전 활성화를 통해  2> Through preactivation of the reactor 광감각제를Optic 함유하는 인간  Human 간엽줄기세포Mesenchymal stem cell 제조 Produce

<2-1> <2-1> 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 클로린Chlorine 접합체(PEG- The conjugate (PEG- Ce6Ce6 )의 제조)

폴리에틸렌글리콜과 클로린 접합에 앞서 클로린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 클로린(Cholorin e6, Ce6, 0.0597g)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0309g), 4-Dimethylaminopyridine(DMAP, 0.0183g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 10ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 활성화하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(Hydroxyl polyethylene glycol carboxyl, PEG, 0.3g)을 디메틸설폭시드(DMSO, 10ml)에 녹인 후 앞선 클로린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조한 후, 결과는 도 7과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.(Cholorin e6, Ce6, 0.0597g) and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.0309g), 4-Dimethylaminopyridine (N-dicyclohexylcarbodiimide) were used to increase the reactivity of the carboxyl group of the chlorine with the polyethylene glycol and chlorine, (DMAP, 0.0183 g) was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, 10 ml) and activated at room temperature for 6 hours. After 6 hours of reaction, polyethylene glycol (PEG, 0.3g) was dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, 10ml) and added to the previous chlorine solvent, and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction product was filtered and then dialyzed against dimethylsulfoxide and using a distilled water for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por, mol. Wt. Cutoff size, 3,500) to remove the catalyst used in the reaction. After the dialysis, the final reaction product was dried by freeze drying, and the results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR spectroscopy) as shown in FIG.

<2-2> <2-2> 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -- 클로린Chlorine 접합체(PEG- The conjugate (PEG- Ce6Ce6 )의 사전 활성화) Activation

폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6)를 세포에 처리하기에 앞서 사전 활성화를 실시하였다. 상기 <실시예 2-1>의 과정을 통해 제조한 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체(PEG-Ce6, 0.02g)를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.00012g), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 0.001g)을 디메틸포름아마이드(N,N-Dimethylmethanamide(DMF, 25ml)에 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물에서 생긴 비수용성의 디사이클로헥실우레아를 제거하기 위해 필터링 한 후 투석막(Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였다. 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하여 사전 활성화된 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 수득하였다. 결과는 도 8과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.Pre-activation was performed prior to treatment of the cells with the polyethylene glycol-chlorine conjugate (PEG-Ce6). The polyethyleneglycol-chlorine conjugate (PEG-Ce6, 0.02 g) prepared in the procedure of Example 2-1 was dissolved in N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 0.00012 g), N- The imide (nhs, 0.001 g) was dissolved in dimethylformamide (DMF, 25 ml) and reacted at room temperature for 24 hours. To remove the water-insoluble dicyclohexylurea from the reaction, After dialyzing, the final reaction product was dried by freeze-drying to obtain a pre-activated polyethylene glycol-chlorine (PEG) solution, which was then dialyzed for 3 days using a dialysis membrane (Spectra / Por The result was confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR spectroscopy) as shown in FIG.

<2-3> <2-3> 광감각제를Optic 함유하는 인간  Human 간엽줄기세포Mesenchymal stem cell 제조 Produce

인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 인간 간엽줄기세포 표면에 있는 아민기와 상기 <실시예 2-2>와 같이 사전 활성화시킨 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 아마이드 결합(Amide bond)을 통해서 결합시켜 주었다. 인간 간엽줄기세포-클로린 접합체의 결합여부는 1시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 폴리에틸렌 글리콜-클로린 접합체를 모두 제거한 후, 도 9과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.Human mesenchymal stem cells (hMSCs, Lonza, Walkersville, MD ) α-minimum essential medium medium was incubated at (10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100g / mL streptomycin) at 37 ℃, 5% CO 2 environment Lt; / RTI &gt; Amine groups on the surface of human mesenchymal stem cells were bound to the pre-activated polyethyleneglycol-chlorine conjugate as described in Example 2-2 through an amide bond. After 1 hour, the untethered polyethylene glycol-chlorine conjugate was removed using DPBS buffer, and then confocal laser scattering microscopy (Confocal Laser Scanning Microscopy) as shown in FIG. 9 was carried out to confirm the binding of human mesenchymal stem cell- Respectively.

<실시예 3> 항체접합을 통해 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 제조Example 3: Preparation of human mesenchymal stem cells containing photosensitizer through antibody conjugation

<3-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-protoporphyrin IX)의 제조<3-1> Preparation of polyethylene glycol-porphyrin conjugate (PEG-protoporphyrin IX)

<3-1-1> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체 (PEG-Hpp)의 제조<3-1-1> Preparation of Polyethylene Glycol-Porphyrin Conjugate (PEG-Hpp)

폴리에틸렌글리콜과 포르피린 접합에 앞서 포르피린 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 포르피린 (hematoporphyrin, Hpp, 43.2mg)와 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 17.8mg), 4-Dimethylaminopyridine (DMAP, 10.5mg)를 디메틸포름아마이드(Dimethylformamide, DMF, 20ml)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이후 폴리에틸렌글리콜(hydroxyl polyethylene glycol carboxyl, PEG, 0.6g)을 디메틸포름아마이드(DMF, 6ml)에 녹인 후 앞선 포르피린 용매에 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 이 반응물을 과량의 차가운 에테르에 침전시켜 디메틸포름아마이드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하였고, 용매를 모두 증발시키기 위해 진공건조(vacuum dry)를 실시하였다. In order to increase the reactivity of the porphyrin carboxyl group with polyethylene glycol and porphyrin bond, porphyrin (Hpp, 43.2 mg), N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 17.8 mg) and 4-dimethylaminopyridine , 10.5 mg) was dissolved in dimethylformamide (DMF, 20 ml) and reacted at room temperature for 6 hours. After 6 hours reaction, hydroxyl polyethylene glycol carboxyl (PEG, 0.6g) was dissolved in dimethylformamide (DMF, 6ml) and added to the above porphyrin solvent and reacted at room temperature for 24 hours. The reaction was precipitated in excess cold ether to remove the dimethylformamide and the catalyst used in the reaction, and vacuum drying was performed to evaporate all of the solvent.

<3-1-2> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-Hpp)의 분리정제&Lt; 3-1-2 > Separation and purification of polyethyleneglycol-porphyrin conjugate (PEG-Hpp)

상기 실시예 <3-1-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 1 대 1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5의 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였다. 메탄올을 증발시킨 수득물을 메틸클로라이드(Methylene chloride, MC)에 녹여 과량의 차가운 에테르에서 침전시키고 진공건조(vacuum dry)를 통해 최종반응물을 회수하였다. 결과는 도 10과 같이 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR spectroscopy)을 통하여 확인하였다.Hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was performed to selectively isolate and purify only the conjugated product of polyethylene glycol-porphyrin in the amount of 1: 1 equivalent prepared in Example <3-1-1>. After the polyethylene glycol-porphyrin conjugate was dissolved in methanol at a concentration of 5 mg / ml, methanol containing polyethylene glycol-porphyrin conjugate was injected into hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) and the ratio of water to methanol was 5 5 at a ratio of 1 to 9, and the yield was recovered at intervals of 1 minute. The product obtained by hydrophobic chromatography (sephadex LH-20) was subjected to methanol removal using a rotary evaporator. The methanol evaporated yield was dissolved in methylene chloride (MC), precipitated in excess cold ether and the final reaction was recovered via vacuum drying. The results were confirmed by nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H-NMR spectroscopy) as shown in FIG.

<3-1-3> 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(PEG-Hpp)의 사전 활성화<3-1-3> Pre-activation of polyethyleneglycol-porphyrin conjugate (PEG-Hpp)

상기 실시예 <3-1-2>에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체와 CD44 항체 접합에 앞서 폴리에틸렌글리콜-포르피린의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 폴리에틸렌글리콜-포르피린(PEG-Hpp, 0.5g)과 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC, 11.5mg), N-하이드록시숙신이미드(nhs, 6.5mg)를 메틸클로라이드(Methylene chloride, MC, 10mL)에 녹인 후 상온에서 6시간 동안 반응하였다. 6시간 반응 이 후 과량의 차가운 에테르에 침전시켜 메틸클로라이드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하였고, 용매를 모두 증발시키기 위해 진공건조(vacuum dry)를 통해 최종반응물을 회수하였다.In order to increase the reactivity of the carboxyl group of the polyethylene glycol-porphyrin with the catalyst prior to the conjugation of the polyethylene glycol-porphyrin conjugate separated and purified in the above Example <3-1-2> with the CD44 antibody, polyethylene glycol-porphyrin (PEG-Hpp, 0.5 was dissolved in methylene chloride (MC, 10 mL), and N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 11.5 mg) and N-hydroxysuccinimide (nhs, Lt; / RTI &gt; The 6 hour reaction was then precipitated in excess cold ether to remove the methyl chloride and the catalyst used in the reaction, and the final reaction was recovered by vacuum drying to evaporate all of the solvent.

<3-2> 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(항체-PEG-Hpp)의 제조<3-2> Preparation of antibody-polyethylene glycol-porphyrin conjugate (antibody-PEG-Hpp)

<3-2-1> Anti-human CD44 항체-&Lt; 3-2-1 > Anti-human CD44 antibody - 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -포르피린 접합체(CD44-PEG-Hpp)의 제조- Preparation of porphyrin conjugate (CD44-PEG-Hpp)

상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD44 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 Purified anti-human CD44 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다. The activated carboxyl group of the polyethylene glycol-porphyrin conjugate prepared in Example <3-1-3> was dissolved in 1 ml of 1X phosphate-buffered saline (PBS) in order to conjugate the large amount of the activated carboxyl group to the purified anti-human CD44 antibody to the primary amine group After dissolving the polyethylene glycol-porphyrin conjugate (2 mg), Purified anti-human CD44 antibody (20 μg) was added to this solvent and reacted at room temperature for 24 hours.

<3-2-2> Anti-human CD90 항체-&Lt; 3-2-2 > Anti-human CD90 antibody - 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -포르피린 접합체(CD90-PEG-Hpp)의 제조- Preparation of porphyrin conjugate (CD90-PEG-Hpp)

상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD90 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 purified anti-human CD90 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다.The activated carboxyl group of the polyethylene glycol-porphyrin conjugate prepared in Example <3-1-3> was dissolved in 1 ml of 1X Phosphate-buffered saline (PBS) in order to conjugate the large amount of the activated carboxyl group to the purified anti-human CD90 antibody to the primary amine group After dissolving the polyethylene glycol-porphyrin conjugate (2 mg), purified anti-human CD90 antibody (20 μg) was added to this solvent and reacted at room temperature for 24 hours.

<3-2-3> Anti-human CD105 항체-&Lt; 3-2-3 > Anti-human CD105 antibody - 폴리에틸렌글리콜Polyethylene glycol -포르피린 접합체(CD105-PEG-Hpp)의 제조- Preparation of porphyrin conjugate (CD105-PEG-Hpp)

상기 실시예 <3-1-3>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체의 활성화된 카르복실기를 정제 anti-human CD105 항체에 다량 존재하는 1차 아민기에 접합시키기 위해 1X Phosphate-buffered saline(PBS) 1ml에 폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체(2mg)를 녹인 후 이 용매에 정제 anti-human CD105 항체(20 ㎍)를 첨가하고 상온에서 24시간 동안 반응하였다.The activated carboxyl group of the polyethylene glycol-porphyrin conjugate prepared in Example <3-1-3> was dissolved in 1 ml of 1X phosphate-buffered saline (PBS) in order to conjugate the large amount of primary amino groups present in the purified anti-human CD105 antibody After dissolving the polyethylene glycol-porphyrin conjugate (2 mg), purified anti-human CD105 antibody (20 μg) was added to this solvent and reacted at room temperature for 24 hours.

<3-3> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포 제조<3-3> Production of human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer

인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 상기 <실시예 3-2>에서 제조한 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 다양한 농도별로 처리하여 4시간 동안 배양하였으며, 항원-항체 반응에 의해 최종적으로 인간 간엽줄기세포 표면의 항원과의 접합체를 제조하였다. 인간 간엽줄기세포-포르피린 접합체의 결합여부는 4시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 모두 제거한 후, 도 11과 같이 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인하였다.Human mesenchymal stem cells (hMSCs, Lonza, Walkersville, MD ) α-minimum essential medium medium was incubated at (10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100g / mL streptomycin) at 37 ℃, 5% CO 2 environment Lt; / RTI &gt; The antibody-polyethylene glycol-porphyrin conjugate prepared in the above <Example 3-2> was treated at various concentrations and cultured for 4 hours. Finally, a conjugate with an antigen on the surface of human mesenchymal stem cells was prepared by an antigen-antibody reaction Respectively. After 4 hours, the unbound antibody-polyethylene glycol-porphyrin conjugate was removed using DPBS buffer, and then confocal laser scattering microscopy was performed as shown in FIG. 11, to confirm the binding of human mesenchymal stem cell-porphyrin conjugate. Respectively.

<실시예 4> 광감각제를 내재화하는 인간 간엽줄기세포의 제조Example 4 Production of Human Mesenchymal Stem Cells Internalizing Photosensitizer

인간 간엽줄기세포는(hMSCs, Lonza, Walkersville, MD) α-minimum essential medium 배지(10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin, 100g/mL streptomycin)에서 배양하였으며 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 포르피린을 다양한 농도별로 처리하여 4시간 동안 배양하였으며, 포르피린이 가지는 소수성으로 인해 인간 간엽줄기세포 내부에 포르피린이 존재하는 인간 간엽줄기세포를 제조하였다. 인간 간엽줄기세포-포르피린 접합체의 결합여부는 4시간 후, DPBS buffer를 이용해 접합되지 않은 항체-폴리에틸렌글리콜-포르피린 접합체를 모두 제거한 후, 도 12과 같이 인간 간엽줄기세포 내부에 존재하는 광감각제를 정량하여 확인하였다.Human mesenchymal stem cells (hMSCs, Lonza, Walkersville, MD ) α-minimum essential medium medium was incubated at (10% fetal bovine serum, 100 U / mL penicillin, 100g / mL streptomycin) at 37 ℃, 5% CO 2 environment Lt; / RTI &gt; Porphyrin was treated at various concentrations and incubated for 4 hours. Human mesenchymal stem cells with porphyrin in human mesenchymal stem cells were prepared due to the hydrophobicity of porphyrin. After 4 hours, it was determined whether or not the human mesenchymal stem cell-porphyrin conjugate was bound by removing the unbound antibody-polyethylene glycol-porphyrin conjugate using DPBS buffer, and then, as shown in FIG. 12, Respectively.

<< 실험예Experimental Example 1> 시간변화에 따른 인간  1> Human changes with time 간엽줄기세포에On mesenchymal stem cells 함유된  Contained 광감각제Photo sensation agent 정량 평가 Quantitative evaluation

상기 [실시예 1-5]와 [실시예 4]와 같은 방법으로 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 시간 변화에 따라 함유하는 광감각제의 양의 변화 유무를 평가하기 위하여 상기 [실시예 1-5]와 [실시예 4]에서 제조한 인간 간엽줄기세포를 도 13와 같이 유세포분석기(flow cytometry analysis)를 이용하여 분석하였다. In order to evaluate the change in the amount of the photosensitizer contained in the human mesenchymal stem cells containing the photosensitizer over time in the same manner as in [Examples 1-5] and [Example 4] The human mesenchymal stem cells prepared in Example 1-5 and Example 4 were analyzed by flow cytometry analysis as shown in FIG.

<실험예 2> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 자체 세포독성 확인Experimental Example 2 Confirmation of self cytotoxicity of human mesenchymal stem cells containing photosensitizer

상기 실시예 1 내지 4에서 각각 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 다양한 광원세기에 따라 인간 간엽줄기세포에 나타나는 독성을 확인하기 위하여 세포독성 시험을 시행하였다. 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포(1x104 cell/well, 96well)에 670nm 파장의 광원을 0~9J/cm2로 다양한 세기의 광원을 부여하고 24시간 동안 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT assay, sigma aldrich, USA)를 이용해 인간 간엽줄기세포의 독성을 도 14 내지 17과 같이 확인하였다.To determine the toxicity of human mesenchymal stem cells containing the photosensitizer prepared in each of Examples 1 to 4 to human mesenchymal stem cells according to various light source intensities, a cytotoxicity test was performed. A light source of 670 nm wavelength was irradiated with 0 to 9 J / cm 2 light source of various intensities to human mesenchymal stem cells (1 × 10 4 cell / well, 96 well) containing a photosensitizer and cultured for 24 hours. 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT assay, Sigma aldrich, USA). The toxicity of human mesenchymal stem cells was confirmed as shown in FIGS.

<< 실험예Experimental Example 3>  3> 광감각제를Optic 함유하는 인간  Human 간엽줄기세포의Mesenchymal 면역인자Immune factor 생성 유무 확인 Check for creation

상기 [실험예 2]에서 인간 간엽줄기세포에 함유된 광감각제가 광원 부여시 인간 간엽줄기세포에 독성효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 인간 간엽줄기세포 사멸 과정에서 면역반응을 촉진시키는 사이토카인(cytokine)을 발생하는지 확인하기 위해서 인터루킨-6(IL-6)와 인터루킨-8(IL-8), 열충격단백질 70(hsp70)을 Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)를 통해 도 18 내지 20과 같이 확인하였다. In the above Experimental Example 2, by confirming that the photosensitizer contained in human mesenchymal stem cells exhibit a toxic effect on human mesenchymal stem cells upon application of a light source, the cytokine promoting immune response in human mesenchymal stem cell death process, Interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and heat shock protein 70 (hsp70) were confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) as shown in FIGS. 18 to 20.

<< 실험예Experimental Example 4>  4> 광감각제를Optic 함유하는 인간  Human 간엽줄기세포의Mesenchymal 암세포  Cancer cells 광역학치료Photodynamic therapy 효과 확인 Check the effect

상기 <실시예 1>에서 제조한 광각작제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 암세포에 처리한 후, 광원 부여시 암세포에 광역학치료 효과를 보이는지 알아보기 위하여 세포독성 시험을 시행하였다. 다양한 암에서 효과를 확인하기 위하여 K1735 세포(murine melanoma, 한국세포주은행 구매)와 UV2237 세포(murine fibrosarcoma, adriamycin resistance, 한국세포주은행 구매), MDA-MB-231 세포(human breast carcinoma, ATCC 구매) 각각을 1x106 cell/well (6well)로 배지에 분주하고 실시예 1 내지 5]에서 제조한 광각작제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 각 well에 103~105 cell씩 처리 한 후, 670nm파장을 가지는 광원을 2J/cm2세기로 부여하였으며, MTT assay를 이용해 암세포 광역학치료 효과를 도 21와 같이 확인하였다. The human mesenchymatous stem cell-containing human mesenchymal stem cells prepared in Example 1 were treated with a cytotoxicity test to determine whether the cancer cells exhibited a photodynamic therapeutic effect upon irradiation of the cancer cells. In order to confirm the efficacy in various cancers, K1735 cells (purchased from Korean Cell Line Bank), UV2237 cells (purchased from Korean Cell Line Bank) and MDA-MB-231 cells (purchased from Korean Cell Line Bank) Were dispensed into the medium at 1 × 10 6 cells / well ( 6 well), and human mesenchymal stem cells containing the wide-angle construct prepared in Examples 1 to 5 were treated with 10 3 to 10 5 cells in each well, The light source of the light source was given 2 J / cm 2 intensity, and the effect of the cancer cell photodynamic therapy was confirmed using the MTT assay as shown in FIG.

<실험예 5> 광감각제를 함유하는 다양한 세포의 암 특이적 축적효과 확인Experimental Example 5: Identification of cancer-specific accumulation effects of various cells containing photosensitizer

상기 <실시예 1>에서 제조한 광각작제를 함유하는 대식세포, 마우스 및 인간 간엽줄기세포가 동물모델에서 암 특이적 축적효과가 있는지 여부를 확인하기 위해서 K1735세포를 Balb/c nude 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 제작하였다. 동물모델에 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 정맥주사(5x104 cell/mice)하고 시간이 지남에 따라 다양한 세포가 암 부위에 축적되는 것을 도 22 내지 24과 같이 확인하였다.K1735 cells were transplanted into Balb / c nude mice in order to confirm whether cancer-specific accumulation effect was observed in animal models of macrophage, mouse and human mesenchymal stem cells containing the wide-angle preparation prepared in Example 1 above Animal disease models were constructed. Human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer were intravenously injected (5 x 10 4 cells / mouse) in animal models, and various cells were accumulated in cancer sites over time as shown in FIGS. 22 to 24.

<< 실험예Experimental Example 6>  6> 광감각제를Optic 함유하는 인간  Human 간엽줄기세포의Mesenchymal 체내  Body 면역인자Immune factor 생성 유무 확인 Check for creation

상기 <실험예 5>에서 나타난 암 특이적 축적효과를 근거로 암 부위에 670nm 파장의 레이저 조사 후, 암 부위에서의 면역인사 생성 유무를 확인하기 위하여 K1735세포를 Balb/c 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 제작하였다. 동물 질병모델에 상기 <실시예 1>에서 제조한 페오포르바이드가 접합된 인간 간엽줄기세포를 각각 0 ~ 1x105 cell/mice로 세포 수 또는 광감각제가 없는 인간 간엽줄기세포(hMSCs), 광감각제를 함유하지만 레이저 조사 유(Light(+))ㆍ무(Light(-))차이를 비교하여 확인하였다. 정맥주사하고 24시간 뒤, 암 부위에 670nm파장을 가지는 광원을 100J/cm2세기로 부여하였으며, 광원 조사 24시간 뒤 암과 비장을 각각 적출하여 도 25 및 도 26와 같이 면역인자를 생성하는지 확인(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)하였다.Based on the cancer-specific accumulation effect in Experiment 5, K1735 cells were transplanted into Balb / c mice to detect the presence of immunological personnel formation in the cancer site after laser irradiation of 670 nm wavelength to the cancer site, The model was constructed. The human mesenchymal stem cells to which the perofollade-conjugated cells prepared in Example 1 were added to the animal disease model were cultured in 0-1 × 10 5 cells / mice, respectively, in the presence of human mesenchymal stem cells (hMSCs) (Light (+)) and no (Light (-)). 24 hours after the intravenous injection, a light source having a wavelength of 670 nm was applied to the cancer site at a dose of 100 J / cm 2. After 24 hours of light irradiation, the cancer and the spleen were separately extracted to determine whether they produced immune factors as shown in FIGS. 25 and 26 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA).

<실험예 7> 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 암성장 억제효과 확인<Experimental Example 7> Confirmation of cancer growth inhibitory effect of human mesenchymal stem cells containing photosensitizer

상기 실시예 1에서 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포가 동물모델에서 암성장 억제효과가 있는지 여부를 확인하기 위해서 K1735 세포를 Balb/c, Balb/c nude, CB17SCID 마우스에 이식하여 동물 질병모델을 각각 제작하였다. 실시예 1에서 제조한 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포의 정확한 암성장 억제효과 확인을 위해서 PBS와 광감각제를 함유하지 않는 인간 간엽줄기세포 각각을 대조군으로 사용하였으며 빛에 민감하게 반응하는 여부를 확인하기 위하여 빛을 조사한 군(light(+))과 빛을 조사하지 않은 군(light(-))으로 구분하여 실험을 진행하였다. 동물모델에 광감각제를 함유하는 인간 간엽줄기세포를 정맥주사(1x105 cell/mice)하고 24시간 뒤 암 부위에 670nm파장을 가지는 광원을 100J/cm2세기로 부여하였으며, 도 27 내지 도 29과 같이 총 14일간 암 크기를 측정하여 암성장 억제효과를 확인하였다. 페오포르바이드가 접합된 인간 간엽줄기세포를 정맥주사하고 14일 뒤, 암 조직을 적출하여 Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL)방법과 Hematoxylin and eosin stain(H&E)방법을 이용하여 암세포 사멸여부를 도 30 내지 도 32과 같이 확인하였다.K1735 cells were transplanted into Balb / c, Balb / c nude and CB17SCID mice to determine whether the human mesenchymal stem cells containing the photosensitizer prepared in Example 1 had an inhibitory effect on cancer growth in animal models, Respectively. In order to confirm the inhibitory effect of human mesenchymal stem cells containing the photosensitizer prepared in Example 1 on cancer growth precisely, PBS and each of human mesenchymal stem cells not containing a photosensitizer were used as a control group, (Light (+)) and light (-) light (-) in order to confirm whether the light was irradiated or not. Human mesenchymal stem cells containing a photosensitizer were intravenously injected (1 x 10 5 cells / mice) into the animal model. After 24 hours, a light source having a wavelength of 670 nm was applied to the cancer site at 100 J / cm 2 intensity. And the tumor size was measured for a total of 14 days. After 14 days of intravenous injection of human mesenchymal stem cells conjugated with perofibrate, cancer tissues were extracted and analyzed for cancer cell death using terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) and hematoxylin and eosin stain (H & E) 30 to 32 as shown in Fig.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in various other forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (16)

항체, 폴리에틸렌글리콜 및 광감각제로 이루어진 접합체; 및
사람으로부터 분리된 간엽줄기세포를 포함하며,
상기 접합체의 항체와 상기 세포의 표면 항원 간의 결합을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.A conjugate consisting of an antibody, polyethylene glycol and a photosensitizer; And
Mesenchymal stem cells isolated from a human,
A cell containing a photosensitizing agent, characterized by a binding between the antibody of said conjugate and the surface antigen of said cell. 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 빛에 의해 일항산소를 생성하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The cell according to claim 1, wherein the photosensitizer produces unidirectional oxygen by light. 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phthalocyanines) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminolevuline esters) 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The method of claim 1, wherein the photosensitizer is selected from the group consisting of a phorphyrins compound, a chlorins compound, a bacteriochlorins compound, a phthalocyanines compound, a naphthalocyanines compound, (5-aminolevuline esters) compound. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 5. &lt; / RTI &gt; 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 페오포르바이드(pheophorbide a), 클로린(chlorin e6) 및 포르피린(protoporphyrin IX)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The cell according to claim 1, wherein the photosensitizer is selected from the group consisting of pheophorbide a, chlorin e6 and protoporphyrin IX. 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 1차 아민기(-NH2), 하이드록시기(-OH) 및 카르복실기(-COOH)로 이루어진 군에서 선택된 동종 또는 이종의 관능기를 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The polyethylene glycol according to claim 1, wherein the polyethylene glycol comprises two or more kinds of the same or different functional groups selected from the group consisting of a primary amine group (-NH 2 ), a hydroxyl group (-OH) and a carboxyl group (-COOH) A cell containing a photosensitizer. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 2개의 1차 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 2개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 1차 아민기(-NH2)와 1개의 카르복실기(-COOH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 1개의 카르복실기(-COOH)와 1개의 하이드록실기(-OH)를 갖는 폴리에틸렌글리콜; 및 1개의 하이드록실기(-OH)와 1개의 아민기(-NH2)를 갖는 폴리에틸렌글리콜;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The method of claim 1, wherein the polyethylene glycol is a polyethylene glycol having two primary amine groups (-NH 2 ); Polyethylene glycol having two hydroxyl groups (-OH); Polyethylene glycol having one primary amine group (-NH 2 ) and one carboxyl group (-COOH); Polyethylene glycol having one carboxyl group (-COOH) and one hydroxyl group (-OH); And a polyethylene glycol having one hydroxyl group (-OH) and one amine group (-NH 2 ). 청구항 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 중량평균분자량이 2,000 내지 10,000인 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The cell according to claim 1, wherein the polyethylene glycol has a weight average molecular weight of 2,000 to 10,000. 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체가 항체에 존재하는 아민기와 결합한 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체가 세포의 표면 항원과 결합하는 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.The method of claim 1, wherein the cell containing the photosensitizer is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) Wherein the polyethyleneglycol-photosensitizer conjugate conjugated with an amine group present in the antibody binds to the surface antigen of the cell. 청구항 10에 있어서, 상기 항체는 항-CD44 항체, 항-CD54 항체, 항-CD90 항체, 항-CD105 항체, 항-CD106 항체 및 항-CD166 항체로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 광감각제를 함유하는 세포.11. The method of claim 10, wherein the antibody is selected from the group consisting of an anti-CD44 antibody, an anti-CD54 antibody, an anti-CD90 antibody, an anti-CD105 antibody, an anti-CD106 antibody, &Lt; / RTI &gt; 폴리에틸렌글리콜과 광감각제를 반응시키는 단계(제1단계);
상기 제1단계에서 얻은 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide; DCC) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; nhs)와 반응시켜 활성화 시킨 단계(제2단계);
상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 항체와 접합시키는 단계(제3단계); 및
상기 제3단계에서 얻은 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체를 사람으로 부터 분리된 간엽줄기세포와 항원-항체 결합을 통해 접합시키는 단계(제4단계)를 포함하는 광감각제를 함유한 시험관에서(in vitor) 세포를 제조하는 방법.Reacting the polyethylene glycol with the photosensitizer (first step);
The polyethyleneglycol-photosensitizer conjugate obtained in the first step is reacted with N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) (Second step);
(Step 3) of binding the activated polyethylene glycol-photosensitizer conjugate to the antibody; And
(Step 4) of binding an antibody-polyethylene glycol-photosensitizer conjugate obtained in the third step to an mesenchymal stem cell isolated from a human through antigen-antibody binding (step 4) lt; / RTI &gt; cells. 청구항 1, 청구항 3 내지 청구항 5, 청구항 7 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 기재된 광감각제를 함유하는 세포 또는 청구항 12의 방법으로 제조된 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암 치료를 위한 면역증강용 약학조성물.A cell containing the photosensitising agent according to any one of claims 1 to 13 or a cell containing a photosensitizer produced by the method of claim 12 as an active ingredient, &Lt; / RTI &gt; 청구항 13에 있어서, 상기 광감각제를 함유하는 세포는 암 부위에 선택적으로 축적되어, 광원 조사시 상기 세포의 선택적 사멸을 유도함으로써, 사이토카인 생성을 증가시키고 살생 T 세포(killer T cell)를 모집(recruit)하는 면역반응에 의해 항암 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 면역증강용 약학조성물.[Claim 14] The method according to claim 13, wherein the cell containing the photosensitizer is selectively accumulated in a cancer site to induce selective killing of the cell upon irradiation with light, thereby increasing cytokine production and recruiting killer T cells wherein the composition exhibits an anti-cancer effect by an immune reaction that recruits the drug. 청구항 13에 있어서, 상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료를 위한 면역증강용 약학조성물.The method of claim 13, wherein the cancer is selected from the group consisting of a brain tumor, a benign astrocytoma, a malignant astrocytoma, a pituitary adenoma, a neuroendocrine tumor, a brain tumor, a neuroendocrine tumor, a brain tumor, Nasopharyngeal cancer, mediastinal tumor, esophageal cancer, breast cancer, male breast cancer, abdominal tumor, stomach cancer, hepatic cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, cholangiocarcinoma, cholangiocarcinoma, cholangiocarcinoma Wherein the cancer is selected from the group consisting of cancer, pancreatic cancer, small bowel cancer, colon cancer, anal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, testicular cancer, uterine cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, uterine sarcoma, squamous cell carcinoma and skin cancer And a pharmaceutically acceptable carrier. 청구항 1, 청구항 3 내지 청구항 5, 청구항 7 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 기재된 광감각제를 함유하는 세포를 유효성분으로 포함하며, 상기 광감각제를 함유하는 세포가 암 부위에 선택적으로 축적되어, 광원 조사시 상기 세포의 선택적 사멸을 유도함으로써, 사이토카인 생성을 증가시키고 살생 T 세포(killer T cell)를 모집(recruit)하는 면역반응에 의해 항암 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 광역학 항암 치료용 약학조성물.Claims 1. A cell comprising a photosensitizer according to claim 1, claim 3, claim 5 or claim 7 as an active ingredient, wherein cells containing the photosensitizer are selectively accumulated in a cancer site , Which selectively induces the death of the cell upon irradiation with light, thereby increasing cytokine production and exhibiting an anti-cancer effect by an immune response that recruits killer T cells. A pharmaceutical composition.
KR1020170080604A 2015-03-31 2017-06-26 Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof KR101871244B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150045479 2015-03-31
KR20150045479 2015-03-31

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160034579A Division KR101871243B1 (en) 2015-03-31 2016-03-23 Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170078572A KR20170078572A (en) 2017-07-07
KR101871244B1 true KR101871244B1 (en) 2018-08-02

Family

ID=57146405

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160034579A KR101871243B1 (en) 2015-03-31 2016-03-23 Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof
KR1020170080604A KR101871244B1 (en) 2015-03-31 2017-06-26 Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160034579A KR101871243B1 (en) 2015-03-31 2016-03-23 Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof

Country Status (1)

Country Link
KR (2) KR101871243B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230159299A (en) 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 Polymer comprising polypropylene oxide-based conjugate for improving therapeutic effect of antibody for use in the treatment of autoimmune disease
KR20230159217A (en) 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 Antibody-poloxamer-photosensitizer composition having stem cell interaction property for use in the treatment of intractable disease

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101419124B1 (en) 2011-09-16 2014-07-11 가톨릭대학교 산학협력단 poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) copolymer and Photosensitizer Covalent Complex for Photodynamic Therapy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioanalysis. 2013,5(9):1099-1114.*
Biomaterials. 2014,36:90-97.*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230159299A (en) 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 Polymer comprising polypropylene oxide-based conjugate for improving therapeutic effect of antibody for use in the treatment of autoimmune disease
KR20230159217A (en) 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 Antibody-poloxamer-photosensitizer composition having stem cell interaction property for use in the treatment of intractable disease
KR20230159256A (en) 2022-05-12 2023-11-21 가톨릭대학교 산학협력단 Antibody-block copolymer containing polypropylene oxide-photosensitizer composition having stem cell interaction property for use in the treatment of intractable disease

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160117212A (en) 2016-10-10
KR20170078572A (en) 2017-07-07
KR101871243B1 (en) 2018-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nuhn et al. Potent anti-viral vaccine adjuvant based on pH-degradable nanogels with covalently linked small molecule imidazoquinoline TLR7/8 agonist
RU2675830C2 (en) Conjugate of photosensitiser and chitosan and uses thereof
JPWO2005095494A1 (en) Novel water-soluble fullerene, process for producing the same and active oxygen generator containing the same
KR101419124B1 (en) poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) copolymer and Photosensitizer Covalent Complex for Photodynamic Therapy
WO2012118136A1 (en) Switching-type fluorescent nanoparticle probe, and fluorescent molecular imaging method using same
KR101188979B1 (en) Conjugate of biocompatible polymer and photosensitizer for photodynamic diagnosis or therapy and process of preparation thereof
KR102321385B1 (en) Magnetic nanoparticles functionalized with cathecol, production and use thereof
Mirakabad et al. Peptide dendrimers as valuable biomaterials in medical sciences
KR102265446B1 (en) Helicobacter pylori selective polymer complex and composition for photodynamic treatment comprising the same
KR101871244B1 (en) Photosensitizer labeled cell, preparation method thereof and use thereof
KR101165760B1 (en) Polymeric pharmaceutical agent for treatment of cancer and process for production of the same
KR20130127232A (en) Glycol chitosan and fullerenes conjugate as photosensitizer for photodynamic therapy, method for preparing the same, and photodynamic therapy using the same
CN111087465B (en) Antibody coupling drug for claudin 6 and application thereof
US10561730B2 (en) Plant virus particles for delivery of photosensitive agents
US20210346518A1 (en) Cyanine-based telodendrimers and uses for treating cancer
KR101903847B1 (en) Nanocomplex for cancer treatment
CN113967256A (en) Nanoparticle with photothermal-chemotherapy-immune function and preparation method and application thereof
KR101493168B1 (en) pH sensitive conjugates for photodynamic therapy having nano-pin structure and method thereof
KR101578267B1 (en) Dendrimers for photodynamic therapy in the form of water-soluble Polyamino acid-based photosensitizer made and preparing method thereof
KR101479858B1 (en) Fullerene nanogel prodrug for anticancer therapy
CN113244175B (en) Immune vesicle maytansine conjugate as well as preparation method and application thereof
KR102578025B1 (en) Immune checkpoint inhibitor conjugated with sonosensitizer and use thereof
WO2022083694A1 (en) Use of folic acid and folic acid-modified b cell lymphoma inducing b cell immune tolerance and targeting migm positive expression
KR20230159217A (en) Antibody-poloxamer-photosensitizer composition having stem cell interaction property for use in the treatment of intractable disease
CN117100857A (en) Antibody gold nano-cage medicine carrying system, preparation method and application

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
GRNT Written decision to grant
X701 Decision to grant (after re-examination)