KR101479858B1

KR101479858B1 - Fullerene nanogel prodrug for anticancer therapy

Info

Publication number: KR101479858B1
Application number: KR20130108683A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 이동진; 김솔
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-01-09

Abstract

The present invention relates to a fullerene nanogel aggregate for photodynamic therapy and a method for preparing the same, wherein, for the use as a photosensitive prodrug, an acid-active fullerene nanogel prodrug is used for a cancer drug. More specifically, a photosensitive agent composed of dimethyl maleic acid, fullerene, and chitosan was prepared, and the synthesized fullerene conjugate is self-assembled in a water phase to form a nanogel, and a nanogel aggregate is formed by electrostatic interaction between nanogels at a neutral pH value. The nanogel aggregate generates reduced singlet oxygen outside the cell, but when the nanogel aggregate flows in the cell to be exposed to an acidic environment, it generates increased singlet oxygen, resulting in high phototoxicity. Therefore, the nanogel aggregate increases the photodynamic therapeutic effect at a target site, thereby solving the problems of conventional photosensitive agents.

Description

Fullerene nanogel prodrug for anticancer therapy < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 광역학 치료에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 광민감성 프로드러그로 이용하기 위해 산-활성 풀러렌 나노겔 프로드러그를 암 치료제로 이용하는 것이다. 본 발명은 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비하여 현저히 우수한 종양 선택성과 높은 일중항 산소를 발생시킴으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 사용되는 신규화합물과 그 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to photodynamic therapy, and more particularly, to the use of acid-activated fullerene nanogel prodrugs as cancer therapeutic agents for use as photosensitivity prodrugs. The present invention relates to a novel compound for use in photodynamic therapy for malignant tumors by generating significantly higher tumor selectivity and higher singlet oxygen than the conventional porphyrin-based photosensitizer, and a method for producing the same.

광역학 치료(photodynamic therapy, PDT)는 빛과 광민감제(photosensitizers, PS)의 조합을 이용한 의학적 치료로서, 작용기전은 크게 광민감제의 종양 선택적 축적에 대한 분자적 기전과 광감작제와 빛의 상호작용에 따른 종양 파괴 기전으로 나눌 수 있다. 각 인자는 그 자체로 해롭지 않으나, 산소와 결합하였을 때, 이들은 종양 세포를 비활성화하는 치사의 세포독성 작용제를 생산할 수 있다. 또한 광감작제 또는 광민감제(photosensitizer)는 광역학 치료법(photodynamic therapy)에 사용되는 물질로서 종래의 암치료법인 수술이나 방사선 요법, 약물요법의 부작용 및 암치료 이후의 후유증 문제를 해결할 수 있는 치료법으로서 관심을 얻고 있다.Photodynamic therapy (PDT) is a medical treatment using a combination of light and photosensitizers (PS). The mechanism of action is largely divided into the molecular mechanism of tumor selective accumulation of photosensitizer and the interaction of photosensitizer and light The mechanism of tumor destruction according to the action can be divided into. Each factor is not harmful by itself, but when combined with oxygen, they can produce a lethal cytotoxic agent that inactivates tumor cells. In addition, photosensitizers or photosensitizers are materials used in photodynamic therapy, which can solve the conventional cancer treatment methods such as surgery, radiation therapy, side effects of drug therapy, and aftereffects after cancer treatment Interest is gaining.

악성종양에 대한 광역학치료법(이하 PDT)은 현재 광범위하게 임상에 적용되고 있다. PDT의 효율성을 규정하는 중요한 요소 중의 하나는 표적성 또는 선택성(selectivity)으로서 종양조직과 정상조직에 있어 종양조직에만 광민감제를 선택적으로 축적시키는 정도를 나타낸다. 표적성이 높으면 PDT의 효과성이 높아져 치료시간을 단축시킬 수 있으며, 또한 체내에 주입된 약물의 부작용도 줄일 수 있게 된다. 특정 파장을 지닌 빛으로 광민감제를 활성화시키면 활성산소종의 일종인 일중항 산소(singlet oxygen)와 라디칼 종(radical species)을 발생시키게 되는데, 이를 통해 직접적으로 종양세포를 죽이게 되며, 면역염증반응을 일으키고 또한 종양의 미소혈관계에 손상을 입히게 된다. 종래 광민감제들의 대부분이 종양에 일정 정도는 선택적으로 축적이 되었지만, 피부를 포함한 정상조직에도 축적이 된 것으로 나타났다.Photodynamic therapy (PDT) for malignant tumors is now widely applied in clinical practice. One of the important factors that define the efficiency of PDT is selectivity or selectivity, which indicates the degree of selective accumulation of photosensitizer in tumor tissue and normal tissue only in tumor tissue. The higher the target specificity, the higher the efficacy of PDT can shorten the treatment time and also reduce the side effects of drugs injected into the body. Activation of photosensitizers with light of a certain wavelength causes singlet oxygen and radical species, which are reactive oxygen species, to directly kill tumor cells and cause immune inflammation reaction Causing damage to the microvasculature of the tumor. In the past, most of the minerals were accumulating selectively in the tumor, but accumulated in the normal tissues including the skin.

광민감제의 표적화 전달로 이러한 문제들을 해결할 수 있을 것이다. 이는 종양세포에 대한 선택적 축적정도를 개선시켜 광독성을 강화함으로써 가능할 수 있다. 표적화란 광활성화 물질을 종양추적(특정적)분자와 직접적으로 또는 캐리어를 이용해서 결합시키는 것을 의미한다. 이미 몇 가지 광민감제들이 종양-관련 항원(antigen)에 대한 항체와 결합된 바 있다. 저밀도 지단백(lipoprotein), 인슐린, 스테로이드, 트랜스페린, 상피세포성장인자(EGF)와 같은 리간드들 모두가, 이러한 리간드의 수용체를 과발현하는 세포로의 리간드-기반 광민감제의 표적화를 위하여 논의되어왔다These problems can be solved by the targeting transfer of the mining appeal. This may be possible by enhancing phototoxicity by improving the degree of selective accumulation in tumor cells. Targeting means combining a photoactive material with a tumor-specific (specific) molecule either directly or through a carrier. Already several photosensitizers have been associated with antibodies to tumor-associated antigens. All of the ligands such as low-density lipoprotein, insulin, steroids, transferrin, epithelial growth factor (EGF) have been discussed for the targeting of ligand-based photosensitizers to cells that overexpress receptors of such ligands

종양 부위에 바로 광을 조사하여 앞서 종양부위로 전달된 광민감성 약물로부터 고농도의 활성 산소 종 (예 : 일중항 산소) 의 발생을 유도할 수 있다는 치료적 이점 때문에, 광역학 치료는 항암 분야에서 많은 관심을 받고 있으며, 항암 치료에 있어서 이러한 외부 광원을 이용한 치료방법은 정상 조직에서 약물 부작용이 개선된 양상을 보여줄 수 있다. 그러나 광역학 치료에 사용되는 대부분 광민감성 약물은 위와 같은 기대를 충족시키지 못했고, 기능성의 부족으로 개선된 치료 효과를 보이지 못해 임상 이용에 제한을 겪었고 있어, 이러한 목적을 충족시키기 위한 이상적인 광민감성 약물의 도입은 앞서 언급한 문제를 극복할 수 있는 수단이 될 수 있다.Because of the therapeutic advantage of direct irradiation of the tumor site to induce the generation of high concentrations of reactive oxygen species (e.g. singlet oxygen) from the photosensitized drug previously delivered to the tumor site, photodynamic therapy Such an external light source treatment method for chemotherapy can show improved side effects in normal tissues. However, most photosensitized drugs used in photodynamic therapy do not meet the above expectations, and because of lack of functionalities, they have not been able to show the improved therapeutic effect and have been limited in clinical use. Therefore, the ideal photosensitizer drug The introduction can be a means to overcome the problems mentioned above.

현재 암치료에 사용되는 1세대 광민감제인 포토프린(Photofrin)의 경우 두 가지의 큰 단점을 갖는다. 첫번째는 630nm 파장에서 1,170 M^-1cm^-1의 낮은 몰 흡광계수를 갖는다는 점이고, 두번째는 피부 광민감성(skin photosensitivity) 부작용이 6주 이상 지속된다는 점이다. 피부 광민감성 부작용은 광민감제 투여후 투여된 광민감제가 피부나 눈 등의 정상세포에 비특이적으로 축적 및 잔존하여, 환자가 광에 노출되는 경우 피부 또는 눈의 정상세포를 죽이는 부작용을 말한다. 포토프린의 경우 소수성을 가져 피부나 눈의 세포에 비특이적으로 축적되는 것이 용이하므로, 피부 광민감성 부작용의 지속시간이 긴 것으로 알려졌다.Photofrin, the first - generation photosensitizer used to treat cancer, has two major drawbacks. The first is that it has a low molar extinction coefficient of 1,170 M ^-1 cm ^-1 at a wavelength of 630 nm and the second is that the side effects of skin photosensitivity last for more than 6 weeks. The skin photosensitivity side effect is a side effect of killing the normal cells of the skin or eyes when the patient is exposed to light due to nonspecific accumulation and remnant of the photosensitizer administered after the administration of the photosensitizer to the normal cells such as skin or eyes. It is known that photoprin has a long duration of skin photosensitivity side effects because it has hydrophobicity and can accumulate nonspecifically in the skin or eye cells.

포토프린의 단점을 해결하기 위해, 2세대 광민감제로서 포스칸(Foscan)이 개발되었다. 포스칸은 652nm에서의 30,000 M^-1cm^-1의 높은 몰흡광계수를 나타내어, 포토프린에 비하여 200배 향상된 광역학 치료효과를 보였다. 그러나 포스칸 역시 소수성을 가지므로, 피부 광민감성 부작용을 크게 감소시키지 못했다.In order to solve the disadvantages of photoprin, Foscan was developed as a second-generation photo-sensitizer. Phoskan exhibited a high molar extinction coefficient of 30,000 M ^-1 cm ^-1 at 652 nm and showed a photodynamic effect of 200 times higher than photoprin. However, since foscan also has hydrophobicity, it has not significantly reduced skin photosensitivity side effects.

피부 광민감성 부작용의 개선을 위해 현재 임상 3상 시험중인 2세대 친수성 광감민제인 모노-L-아스파틸 클로린 e6(mono-L-aspartyl chlorine e6, NPe6)가 개발되었다. 모노-L-아스파틸 클로린 e6는 4개의 카르복실기가 도입된 광민감제로서, 이는 카르복실기로 인해 친수성을 가져 피부 광민감성 부작용이 1주일로 크게 감소되었다.To improve the skin's photosensitivity side effects, a second-generation hydrophilic photosensitizer, mono-L-aspartyl chlorine e6 (NPe6), currently under clinical trials, has been developed. Mono-L-aspartylchlorin e6 was a photosensitizer with four carboxyl groups introduced, which was hydrophilic due to its carboxyl group, resulting in a significant reduction in skin-light-sensitive side effects by one week.

그러나, 카르복실기는 혈액 내에서 음전하를 띠어 이를 가진 광감민제는 암조직에 도달하여도 세포 내로 흡수되기(uptake) 힘들다. 또한 친수성 카르복실기를 가진 광민감제는 소변을 통해 체외로 빠르게 배출될 수 있다. 따라서 암조직에서 광민감제가 적절한 농도로 축적되기 위해서는 소수성 광민감제에 비해 높은 용량을 투여하여야 한다. 그 결과, 정상조직에 비특이적으로 축적되는 광민감제의 양이 만족할만한 수준으로 감소되지 못하고, 이에 따라 2세대 친수성 광민감제에서 여전히 피부 광민감성 부작용이 문제되고 있다.However, the carboxyl group is negatively charged in the blood, so that it is difficult for the photosensitizer having the carboxyl group to uptake into the cell even if it reaches cancer tissue. Also, a photosensitizer with a hydrophilic carboxyl group can be rapidly excreted through the urine. Therefore, in order to accumulate photosensitizers at appropriate concentrations in cancer tissues, a higher dose should be administered compared with hydrophobic photosensitizers. As a result, the amount of the photosensitizing agent that accumulates nonspecifically in the normal tissue is not reduced to a satisfactory level, and thus the skin photosensitivity side effect is still a problem in the second generation hydrophilic photosensitizer.

한국등록특허 10-1141410 호Korean Patent No. 10-1141410

이에 본 발명에서는 피부광민감성 또는 정상세포에 대한 피해 같은 문제점을 해결하기 위해서, 본 발명자들은 다이메틸말레산과 풀러렌 및 키토산으로 이루어진 광민감제를 제조하여 암세포만을 효율적으로 사멸시킬 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, in order to solve problems such as skin photosensitivity or damage to normal cells, the inventors of the present invention have found that by producing a photosensitizer composed of dimethylmaleic acid, fullerene and chitosan, only cancer cells can be efficiently killed, .

또한 본 발명의 발명자들은 다이메틸말레산 (dimethylmaleic acid : DMA) 및 풀러렌 (fullerene :C₆₀)으로 이루어진 군 중에서 선택되어지는 어느 하나 이상을 글리콜 키토산 (glycol chitosan : GC)에 결합시킨 광민감제(photosensitizer)를 제공하는 것이다.The inventors of the present invention have also found that when at least one selected from the group consisting of dimethylmaleic acid (DMA) and fullerene (C ₆₀ ) is combined with glycol chitosan (GC) ).

또한 본 발명의 발명자들은 상기 광민감제를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 또는 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The present inventors also intend to provide a composition for cancer treatment or diagnosis for use in photodynamic therapy comprising the aforementioned photosensitiser as an active ingredient.

또한 본 발명의 발명자들은 상기 광민감제를 유효성분으로 포함하는 조성물; 및 파장이 550 nm 내지 800 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.The present invention also provides a composition comprising the above-mentioned photosensitizer as an active ingredient; And a light source for irradiating a light beam having a wavelength in the range of 550 nm to 800 nm. The present invention also provides a kit for cancer therapy for use in photodynamic therapy.

또한 본 발명의 발명자들은 클리콜키토산과 다이메틸말레무수물을 혼합하여 GC 결합체 (GC-g-DMA)를 합성하는 단계; 및 GC 결합체 (GC-g-DMA)과 풀러렌 (fullerene :C₆₀)을 결합시키는 단계를 포함하는 GC-g-DMA-g-C₆₀ (GCDF)의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The inventors of the present invention have also found that a process for synthesizing a GC complex (GC-g-DMA) by mixing a glycol chitosan and a dimethyl maleic anhydride; And GC conjugate (GC-g-DMA) and fullerene: an object of the present invention to provide a method for producing _{(fullerene C 60) GC-g} -DMA-gC 60 (GCDF) , comprising the step of combining.

또한 본 발명의 발명자들은 상기 광민감제를 생체로부터 분리한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포를 사멸 또는 생장을 저해시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the inventors of the present invention aim to provide a method for inhibiting the killing or growth of cancer cells, which comprises treating the cells with the photosensitizing agent separated from the living body.

또한 본 발명의 발명자들은 상기 광민감제를 생체로부터 분리한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, the inventors of the present invention aim to provide a method for diagnosing cancer comprising the step of treating the above-mentioned photosensitizer with cells isolated from a living body.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다이메틸말레산 (dimethylmaleic acid : DMA) 및 풀러렌 (fullerene :C₆₀)으로 이루어진 군 중에서 선택되어지는 어느 하나 이상을 글리콜 키토산 (glycol chitosan : GC)에 결합시킨 광민감제(photosensitizer)을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a process for producing a poly (ethylene terephthalate) copolymer, which comprises combining at least one selected from the group consisting of dimethylmaleic acid (DMA) and fullerene (C ₆₀ ) into glycol chitosan (Photosensitizer).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광민감제는 나노겔일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizing agent may be a nano-gel.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 결합은 그라프트중합(Graft polymerization)일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the bonding may be graft polymerization.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광민감제는 GC-g-DMA-g-C₆₀(GCDF) 또는 GC-g-C₆₀(GCF)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be GC-g-DMA-gC ₆₀ (GCDF) or GC-gC ₆₀ (GCF).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광민감제는 550 nm 내지 800 nm 범위의 광선에 대하여 생체 외 또는 생체 내에서 광활성화 되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the photosensitizer may be photoactivated in vitro or in vivo for light rays in the range of 550 nm to 800 nm.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 광민감제를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a composition for the treatment or diagnosis of cancer for use in photodynamic therapy comprising the photosensitizer as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cancer may be selected from the group consisting of skin, digestive, urinary, reproductive, respiratory, circulatory, brain and nervous system cancers.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectum cancer, gastric cancer, Cancer, endometrioid cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, uterine cancer, endometrial carcinoma, endometrial cancer, uterine cancer, vulvar carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, (CNS) tumors, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumors, brain stem glioma, and pituitary gland tumors, such as cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureteral cancer, kidney cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, May be selected from the group consisting of adenomas.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절내 주사, 및 구강내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여되는 것일 수 있다. In one embodiment of the invention, the composition is administered by intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intracranial injection, intratumoral injection, intraepithelial injection, skin penetration delivery, esophageal administration, , &Lt; / RTI > and oral administration.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 광민감제를 유효성분으로 포함하는 조성물; 및 파장이 550 nm 내지 800 nm 범위인 광선을 조사하기 위한 광원을 포함하는, 광역학 치료에 사용하기 위한 암 치료용 키트를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition comprising the above photosensitizing agent as an active ingredient; And a light source for irradiating a light beam having a wavelength in the range of 550 nm to 800 nm, in a kit for cancer therapy for use in photodynamic therapy.

본 발명의 또 다른 목적은 클리콜키토산과 다이메틸말레무수물을 혼합하여 GC 결합체 (GC-g-DMA)를 합성하는 단계; 및 GC 결합체 (GC-g-DMA)과 풀러렌 (fullerene :C₆₀)을 결합시키는 단계를 포함하는 GC-g-DMA-g-C₆₀ (GCDF)의 제조방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for producing a chitosan-based chitosan, which comprises: synthesizing a GC conjugate (GC-g-DMA) by mixing glycol chitosan and dimethyl maleic anhydride; And GC conjugate (GC-g-DMA) and fullerene: to provide a method for producing (fullerene C ₆₀₎ Step _{GC-g-DMA-gC 60} (GCDF) including a coupling a.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 광민감제를 생체로부터 분리한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암세포를 사멸 또는 생장을 저해시키는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for inhibiting the killing or growth of cancer cells comprising treating the cells with the photosensitizing agent separated from the living body.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 광민감제를 생체로부터 분리한 세포에 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for diagnosing cancer, which comprises treating the cell with the photosensitizer separated from a living body.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진단방법은 형광이미지일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the diagnostic method may be a fluorescence image.

본 발명에 따른 항암치료용 조성물에 의한 경우 기존 발명과 다르게 풀러렌의 난용성을 개선하였을 뿐만 아니라 풀러렌나노겔이 정전기 상호작용으로 인해 한데 뭉쳐 나노겔 응집체를 형성함으로써 세포 내로 유입되었을 때만 광민감성을 띄게 하여 질병부위에서만 선택적으로 광역학 치료를 할 수 있다. The composition for chemotherapy according to the present invention not only improves the poor solubility of fullerene but also forms a nanogel aggregate due to static interaction due to the electrostatic interaction, Therefore, photodynamic therapy can be selectively performed only in the diseased area.

또한 나노겔 응집체의 광반응 특성에 의해 pH 환경에 따라 전혀 다른 일항 산소 생성 결과를 나타냄으로써 형성된 나노겔 응집체는 산성환경에서 일항산소 발생이 증가되므로 광민감성 부작용을 최소화 할 수 있으며, 또한 종양조직에 특이적으로 작용하여 종양조직만을 효과적으로 파괴할 수 있으므로 암 치료를 위한 단일 약제로서 유용하게 사용될 수 있다.In addition, because of the photoreaction characteristics of the nano-gel aggregates, the nano-gel aggregates formed as a result of completely different anoxic production depending on the pH environment can minimize the light-sensitive side effects by increasing the generation of oxygen in the acidic environment, And thus can be effectively used as a single agent for treating cancer since it can effectively destroy tumor tissue.

도 1은 GC-g-DMA-g-C₆₀ 결합체의 화학 구조를 도시한 것이다.
도 2는 GC-g-DMA-g-C₆₀ 결합체의 개념을 모식화한 것이다.
도 3은 GC-g-DMA-g-C₆₀ 결합체의 ¹H-NMR 피크를 나타낸 것이다.
도 4는 GCDF 나노겔의 (a) 입자 크기 분포와 (b) FE-SEM 이미지 (c) PBS 용액 (150mM, pH 7.4, 2 mg/ml)에 분산된 C₆₀, GCF 나노겔, GCDF 나노겔의 광학 이미지를 도시한 것이다.
도 5는 (a) pH 변화에 따른 GCDF 나노겔 (1 mg/ml) 의 입자 크기 변화 (n=3). (b) 각 pH 용액에서의 GCDF 또는 GCF 나노겔의 상대적인 투과도 변화 (n=3). (c) 다른 pH 환경에 노출된 GCDF 나노겔의 제타 준위 변화 (n=3)를 나타낸 것이다.
도 6은 다른 pH 환경에 노출 되었을 때의 (a) GCDF 나노겔, (b) GCF 나노겔, (c) C60 (C60 농도 1 mg/ml) 의 일항 산소 발생을 측정한 것이다.
도 7은 (a) GCDF 나노겔, GCF 나노겔, C₆₀ (C₆₀ 농도 0.1 - 10 ㎍/ml)을 처리한 KB 세포에 광을 조사했을 때의 광독성을 CCK-8 assay를 이용하여 평가하여 나타낸 것이다. (n = 7). (b) GCDF 나노겔, GCF 나노겔, C₆₀ (C₆₀ 농도 1 - 50 ㎍/ml)을 KB 세포에 광 조사 없이 24시간 처리했을 때의 세포 생존율 (n = 7)을 나타낸 것이다.
도 8은 (a) pH 7.4 또는 pH 5.0에서 30분 간 처리한 뒤 광을 조사했을 때의 GCDF 또는 GCF 나노겔의 산-활성 광독성 (n = 7). (b) 37 ℃ 에서 KB 종양 세포에 GCDF 나노겔 (C₆₀ 농도 10 ㎍/ml) 을 6시간 처리했을 때의 TEM 이미지 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 9는 (a) PBS (150 nm, pH 7.4) 용액에 분산된 GCDF 나노겔의 근적외선 형광 이미지 (λex 635 nm, λem 720 nm). (b) KB 종양이 유발된 누드 쥐의 In vivo 비침습 형광 이미징. GCDF (C60 농도 10 mg/kg body) 는 누드 쥐의 꼬리 정맥으로 주사되었고, 주입 후 2시간 (좌측), 8시간 (우측) 후에 형광 이미지를 나타낸 것으로서 종양 위치는 하얀색 화살표로 나타내었다. Figure 1 shows the chemical structure of GC-g-DMA-gC ₆₀ conjugate.
Figure 2 schematically illustrating the concept of a GC-g-DMA-gC ₆₀ conjugate.
Figure 3 shows the ¹ H-NMR peak of the GC-g-DMA-gC ₆₀ conjugate.
4 is GCDF nano-gel (a) particle size distribution and (b) FE-SEM image of (c) PBS solution (150mM, pH 7.4, 2 mg / ml) dispersed C _60, GCF nanogels, GCDF nanogels in Fig.
Figure 5 shows (a) the particle size change (n = 3) of GCDF nanogel (1 mg / ml) with pH change. (b) Relative permeability change (n = 3) of GCDF or GCF nanogels at each pH solution. (c) Zeta level changes (n = 3) of GCDF nanogels exposed to different pH environments.
FIG. 6 is a graph showing the measurement of unilateral oxygen evolution of (a) GCDF nanogel, (b) GCF nanogel and (c) C60 (C60 concentration 1 mg / ml) when exposed to different pH environments.
FIG. 7 is a graph showing the phototoxicity of KB cells treated with GCDF nanogels, GCF nanogels, and C ₆₀ (C ₆₀ concentration 0.1-10 .mu.g / ml) by using the CCK-8 assay . (n = 7). (b) Cell viability (n = 7) when GCDF nanogels, GCF nanogels, and C ₆₀ (C ₆₀ concentration 1 - 50 ㎍ / ml) were treated with KB cells for 24 hours without light irradiation.
Figure 8 shows (a) the acid-active phototoxicity (n = 7) of GCDF or GCF nanogels after light treatment for 30 minutes at pH 7.4 or pH 5.0. (b) TEM image analysis of KB tumor cells treated with GCDF nanogel (C ₆₀ concentration 10 ㎍ / ml) for 6 hours at 37 ° C.
9 shows (a) a near-infrared fluorescence image (λex 635 nm, λem 720 nm) of a GCDF nanogel dispersed in a solution of PBS (150 nm, pH 7.4). (b) In vivo noninvasive fluorescence imaging of nude mice induced with KB tumors. GCDF (C60 concentration 10 mg / kg body) was injected into the tail vein of nude mice and fluorescence images were obtained after 2 hours (left) and 8 hours (right) after injection. The tumor location was indicated by a white arrow.

풀러렌(fullerene)은 주로 탄소 원소 60개가 축구공 모양으로 결합하여 생긴 탄소의 크러스터 C60을 말한다. 12개의 5원환(員環)과 20개의 6원환으로 이루어져 있으며, 각각의 5원환에는 5개의 6원환이 인접해 있다. 또한 풀러렌 분자는 새장처럼 아주 작은 물질을 가두어 가둘 수 있으며 강하면서도 미끄러운 성질이 있고, 또한 다른 물질을 넣고 삽입할 수 있게 열려지기도 하고 튜브처럼 이어질 수도 있다.Fullerene is a carbon black cluster C60 mainly composed of 60 carbon elements combined with a soccer ball. It consists of twelve 5-member rings and 20 six-member rings, each of which has five six-member rings adjacent to each other. In addition, fullerene molecules can trap very small substances, such as cages, and have a strong, slippery nature, and they can be opened to insert and insert other materials, or they can be tethered.

광민감성 화합물 중 하나인 fullerene (C₆₀) 은 670 nm 파장의 광을 흡수하여 산소 분자로 쉽게 여기에너지를 전달할 수 있고 그 결과 많은 일항 산소를 발생시키며, 광민감성 풀러렌 약물 설계에 대한 몇몇의 연구에서는 합성 고분자나, 펩타이드/단백질, 항체를 이용하여 exohedral 풀러렌 유도체화 방법을 활용하였다. 그러나 몇몇 exohedral 풀러렌 조차 항암 치료에서 부족한 기능 때문에 의약품으로의 발전에 제약이 있었다.One of the photosensitizing compounds, fullerene (C ₆₀ ), absorbs light at a wavelength of 670 nm and can easily transfer excitation energy to oxygen molecules, resulting in a great deal of oxygen, and some studies on photosensitized fullerene drug design We used exohedral fullerene derivatization method using synthetic polymers, peptides / proteins, and antibodies. However, even some exohedral fullerenes were limited in their development into pharmaceuticals due to their lack of function in chemotherapy.

키토산은 불규칙적으로 분산되어있는 β-(1-4)-linked D-glucosamine (deacetylated unit)과, N-acetylD-glucosamine (acetylated unit)으로 구성된 선형 다당류이다. 키토산은 상업적으로 또한 바이오메디컬 분야에서 다양하게 사용되고 있거나 사용될 수 있다.Chitosan is a linear polysaccharide composed of irregularly dispersed β- (1-4) -linked D-glucosamine (deacetylated unit) and N-acetylD-glucosamine (acetylated unit). Chitosan can be used or used in a variety of commercial and biomedical fields.

나노겔(nanogel)이란 나노사이즈의 입자로서 고분자가 나노사이즈의 크기를 유지하며 젤 내지 입자의 형태를 하고 있는 것을 의미한다.Nanogel is a nano-sized particle, meaning that the polymer is in the form of a gel or a particle while maintaining the nanosize size.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 풀러렌과 키토산이 결합된 형태의 화합물로서 다양한 매질에서 일중항 산소를 효과적으로 생성하고 종래 포르피린 계열의 광민감제에 비해 현저히 우수한 종양 선택성을 가짐으로써 악성종양에 대한 광역학치료에 유용한 특징을 가진 신규 화합물인 풀러렌-키토산 결합 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 광역학적으로 고형암을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have found that fullerene and chitosan are combined with each other to effectively produce singlet oxygen in various media and have remarkably excellent tumor selectivity compared to the conventional porphyrin-based photosensitizer, The present invention has been accomplished by providing a pharmaceutical composition for the treatment of photodynamic therapy of solid tumors containing a fullerene-chitosan binding compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is a novel compound having a feature useful for photodynamic therapy.

본 발명은 광민감성 프로드러그로 이용하기 위해 2,3-다이메틸말레산 (2,3-dimethylmaleic acid : DMA)과 풀러렌 (fullerene :C₆₀) 을 글리콜 키토산 (glycol chitosan : GC) 에 접합시킨 글리콜 키토산 결합체 (GC-g-DMA-g-C₆₀)에 대한 것이다. GC의 자유 아민기에는 DMA가, GC-g-DMA의 수산기에는 C₆₀의 π-π 탄소 결합이 접합하는 간단한 두 단계의 화학적 접합반응을 거쳐 GC-g-DMA-g-C₆₀을 준비하였으며, 이 결합체는 자가조립을 통해 친수성 블록(GC, DMA)과 소수성 블록(C₆₀)으로 구성된 다당류 나노겔을 형성하였다. 또한 pH 7.4에서 GC-g-DMA-g-C₆₀은 DMA의 카복시기와 GC의 잔여 자유 아민기 사이의 정전기 상호작용으로 인해 멀티 나노겔 응집체를 형성하였다.The present invention relates to a process for preparing a glycol (2,3-dimethylmaleic acid (DMA) and fullerene (C ₆₀ ) conjugated to glycol chitosan (GC) It relates to a conjugate of chitosan (GC-g-DMA-gC 60). GC-g-DMA-gC ₆₀ was prepared by a simple two-step chemical bonding reaction in which DMA was attached to the free amine group of GC and π-π carbon bond of C ₆₀ was attached to the hydroxyl group of GC-g-DMA. The assemblies were self - assembled to form polysaccharide nanogels composed of hydrophilic blocks (GC, DMA) and hydrophobic blocks (C ₆₀ ). Also at pH 7.4, GC-g-DMA-gC ₆₀ formed multi-nanogel aggregates due to the electrostatic interaction between the carboxy group of DMA and the residual free amine group of GC.

본 발명의 나노겔 응집체는 pH 5.0에서 DMA 블록이 제거되면서 정전기 상호작용이 환원되어 붕괴될 수 있으며, 670 nm 파장 이상의 빛에서 나노겔 응집체의 광반응 특성은 pH 환경에 따라 전혀 다른 일중항 산소 생성 결과를 나타낸다. pH 7.4에서는 나노겔 응집체 안에 밀집한 C₆₀ 분자들 사이에 증가된 광 간섭 효과로 인해 일중항 산소 발생이 감소한다. 하지만 pH 5.0에서는 나노겔 응집체가 붕괴되어 일중항 산소 발생이 증가하며, pH 5.0에 반응하는 GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔 응집체는 엔도솜 pH 표적화와 다양한 악성 종양 세포의 in vivo 광역학 치료에 사용될 수 있어 본 발명은 암치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.The nanogel aggregates of the present invention can be collapsed due to the reduction of electrostatic interaction when the DMA block is removed at a pH of 5.0 and the photoreaction characteristics of the nanogel aggregates in the light having a wavelength of 670 nm or more are different from each other depending on the pH environment, Results are shown. At pH 7.4, singlet oxygen evolution is reduced due to increased optical interference effects between the dense C ₆₀ molecules in the nanogel aggregates. However, at pH 5.0, nanogel aggregates collapsed resulting in increased singlet oxygen production. GC-g-DMA-gC ₆₀ nanogel aggregates responding to pH 5.0 exhibited endo- som pH targeting and in vivo photodynamic therapy of various malignant tumor cells The present invention aims to provide a composition for treating cancer.

상기 암 치료용 조성물은 광역학 치료에 사용될 수 있으며, 상기 암은 피부, 소화기, 비뇨기, 생식기, 호흡기, 순환기, 뇌 및 신경계의 암으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.The composition for treating cancer may be used for photodynamic therapy and the cancer may be selected from the group consisting of skin, digestive, urinary, reproductive, respiratory, circulatory, brain and nervous system cancer. More specifically, Cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal carcinoma, lung cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, osteoma, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectum cancer, Cancer of the urethra, cancer of the prostate, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, pancreatic cancer, malignant cancer, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, Renal or ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary adenoma It may be selected from, but is not limited thereto.

본 발명의 암 치료용 조성물은 정맥 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 두개 내 주사, 종양 내 주사, 상피내 주사, 피부관통전달, 식도 투여, 복부 투여, 동맥 주사, 관절내 주사, 및 구강내 투여로 이루어진 군 중에서 선택된 경로로 투여될 수 있다.The composition for treating cancer of the present invention can be administered orally or parenterally by intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intracranial injection, intratumoral injection, intraepithelial injection, skin penetration delivery, esophageal administration, abdominal administration, &Lt; RTI ID = 0.0 > and / or < / RTI >

본 발명에 따른 조성물은 통상의 방법에 따라 멸균 수용액, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼 또는 유제 등의 형태의 비경구 투여를 위한 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우 보통 사용하는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.The composition according to the present invention may be formulated into a formulation for parenteral administration in the form of a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion or an emulsion according to a conventional method. When formulating, it may be prepared using a diluent or an excipient such as a surfactant usually used. Examples of the non-aqueous solution and suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.

본 발명에 따른 접합체의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 접합체는 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001~100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
The preferred dosage of the conjugate according to the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the conjugate of the present invention may be administered in an amount of 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 100 mg / kg, once or several times a day.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. Also, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications referred to herein are incorporated herein by reference.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are intended to further illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

< 재료 및 기구 ><Materials and apparatus>

본 발명에 사용한 풀러렌 (fullerene : C₆₀)은 NanoLab Inc (Waltham, MA, USA)에서 구입하였으며, 글리콜 키토산 (Glycol chitosan : GC, Mw = 500 kDa), 2,3-다이메틸말레무수물 (2,3-dimethylmaleic anhydride : DMA), 다이메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide : DMSO), 트리에틸아민 (triethylamine : TEA), 9,10-다이메틸안트라센 (9,10-dimethylanthracene), 수산화리튬 (lithium hydroxide : LiOH), 피리딘 (pyridine), 소듐보레이트 (sodium borate : Na2B4O7), 톨루엔 (toluene)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서 구입하였다. RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin과 streptomycin은 Welgene, Inc (Seoul, South Korea)에서 구입하였으며, Cell Counting Kit-8 (CCK-8 assay) 은 Dojindo Molecular Technologies Inc (Kumamoto, Japan)에서 구입하여 사용하였다.
The fullerene (C ₆₀ ) used in the present invention was purchased from NanoLab Inc (Waltham, MA, USA), and the glycol chitosan (GC, Mw = 500 kDa), 2,3-dimethyl maleic anhydride 3-dimethylmaleic anhydride (DMA), dimethylsulfoxide (DMSO), triethylamine (TEA), 9,10-dimethylanthracene, lithium hydroxide (LiOH) , Pyridine, sodium borate (Na2B4O7), and toluene were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., USA). Cell counting Kit-8 (CCK-8 assay) was purchased from Dojindo Molecular Technologies Inc (Kumamoto, Japan). The cell counts were determined using the RPMI-1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin and streptomycin from Welgene, Inc Were purchased and used.

< < 실시예Example 1> 1>

<1-1>. <1-1>. GCGC -g--g- DMADMA -g--g- CC ₆₀₆₀ 의 제조Manufacturing

본 발명에서 따른 GC-DMA-Fullerene에서 일실시예인 GC-g-DMA-g-C₆₀을 제조하기 위해서 1.2 ml의 트리에틸아민 (triethylamine : TEA)과 1.2 ml의 pyridine을 포함한 DMSO (dimethylsulfoxide. 20 ml) 용매상에서 GC (Glycol chitosan. 300 mg)를 564 mg의 2,3-다이메틸말레무수물 (2,3-dimethylmaleic anhydride : DMA)와 실온에서 3일 동안 반응시켜 2,3-다이메틸말레산 (2,3-dimethylmaleic acid) 이 접합된 GC 결합체(GC-g-DMA)를 합성하였으며, 이때 g는 graft결합을 의미한다. 다음으로 23mg의 수산화리튬(Lithium hydroxide : LiOH)를 포함한 toluene(50ml)/DMSO(20ml)의 공용매(co-solvent) 상에서 GC 결합체(GC-g-DMA) 또는 GC (200 mg) 를 C₆₀ (143mg) 와 실온에서 7일 동안 반응시켜 GC-g-DMA-g-C₆₀ (이하 “GCDF”라 한다) 또는 GC-g-C₆₀ (이하 “GCF” 라 한다)를 합성하였다. 반응 후 로터리이배퍼레이터(rotary evaporator)를 이용하여 톨루엔(toluene)을 제거하고, 반응하지 않은 화합물을 제거하기 위해 얻어진 용액을 미리 불려놓은 투석막 튜브 (Spectra/Por MWCO 15K, Spectrum Lab. Inc., Rancho Dominguez, USA) 에 옮겨 담아 Na2B4O7 완충 용액 (pH 7.4) 상에서 투석하였다. 투석막 튜브에서 얻어진 용액은 2일 동안 동결건조 하였다.
To prepare GC-g-DMA-gC ₆₀ , which is an embodiment of GC-DMA-Fullerene according to the present invention, DMSO (dimethylsulfoxide, 20 ml) containing 1.2 ml of triethylamine (TEA) GC (Glycol chitosan, 300 mg) was reacted with 564 mg of 2,3-dimethylmaleic anhydride (DMA) in a solvent for 3 days at room temperature to obtain 2,3-dimethyl maleic acid (2 , 3-dimethylmaleic acid) was synthesized, where g represents graft binding. And then with lithium hydroxide of 23mg: the GC conjugate (GC-g-DMA) or GC (200 mg) on a co-solvent (co-solvent) in toluene (50ml) / DMSO (20ml ) containing (Lithium hydroxide LiOH) C ₆₀ GC-gC ₆₀ (hereinafter referred to as "GCDF") or GC-gC ₆₀ (hereinafter referred to as "GCF") was synthesized by reacting the above compound (143 mg) at room temperature for 7 days. After the reaction, toluene was removed using a rotary evaporator and the solution obtained to remove unreacted compounds was dissolved in a dialysis membrane tube (Spectra / Por MWCO 15K, Spectrum Lab. Inc., Rancho Dominguez, USA) and dialyzed against Na2B4O7 buffer (pH 7.4). The solution obtained from the dialysis tube was lyophilized for 2 days.

<1-2>. <1-2>. 나노겔Nano gel 합성 synthesis

GCDF 또는 GCF (10 mg)를 DMSO (2 ml) 에 용해시킨 용액을 미리 불린 투석막 튜브 (Spectra/Por MWCO 15K)에 옮기고 150 mM 인산완충용액 (phosphate buffer saline : PBS, pH 7.4) 상에서 24시간동안 투석하였으며, 외부 상에 3시간마다 신선한 PBS 용액으로 갈아주었다. 그 후, 얻어진 용액은 2일간 동결건조 하였다.
A solution of GCDF or GCF (10 mg) dissolved in DMSO (2 ml) was transferred to a previously dialyzed dialysis tube (Spectra / Por MWCO 15K) and incubated in 150 mM phosphate buffer (PBS, pH 7.4) Dialyzed and replaced with fresh PBS solution every 3 hours on the external surface. Thereafter, the obtained solution was lyophilized for 2 days.

<< 실험예Experimental Example 1> 1>

GCGC -g--g- DMADMA -g--g- CC ₆₀₆₀ 나노겔의Nano-gel 특성 characteristic

<1-1>. 입자 크기 분포<1-1>. Particle size distribution

본 발명자들은 GC-g-DMA-g-C₆₀(GCDF) 또는 GC-g-C₆₀(GCF) 나노겔을 제조하였으며, GCDF 또는 GCF 나노겔의 특성을 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.We prepared GC-g-DMA-gC ₆₀ (GCDF) or GC-gC ₆₀ (GCF) nanogels and performed the following experiments to characterize GCDF or GCF nanogels.

각각 다른 pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) 에서 GCDF 또는 GCF (1 mg/ml)의 입자 크기 분포에 대해서 제타사이저 3000 (Malvern Instruments, Westborough, MA, USA)을 이용해 측정하였으며, 측정 전에 각각 다른 pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) 에 GCDF 또는 GCF 나노겔을 노출시켜 4시간동안 실온에서 안정화시켰다. GCDF 또는 GCF 나노겔의 형태는 주사전자현미경 (FE-SEM, Hitachi s-4800, Tokyo, Japan)을 통해 확인하였다.The particle size distribution of GCDF or GCF (1 mg / ml) was measured at different pHs (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) using Zetasizer 3000 (Malvern Instruments, Westborough, Mass., USA) GCDF or GCF nanogels were exposed to different pHs (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) for 4 hours at room temperature. The morphology of GCDF or GCF nanogels was confirmed by scanning electron microscopy (FE-SEM, Hitachi s-4800, Tokyo, Japan).

GC-g-DMA는 GC의 자유 아민 그룹에 DMA의 접합 화학 반응을 통해 합성되었고, GC-g-DMA-g-C₆₀은 촉매인 LiOH 존재 하에 C₆₀의 탄소 이중결합과 GC-g-DMA의 수산기 사이의 화학적 반응을 통해서 제조되었다. GC에 접합된 DMA는 ¹H-NMR (TMS를 포함한 DMSO-d6 용매상) 결과에서 δ 1.88 ppm (DMA-의 CH₃) 과 δ 3.30 ppm (GC의 - CH₂) 의 피크 비교를 통하여 계산하였다(도 3 참조). GC-g-DMA was synthesized through the bonding reaction of DMA to the free amine group of GC, GC-g-DMA- gC 60 is a hydroxyl group in the C ₆₀ carbon-carbon double bond and GC-g-DMA of a catalyst of LiOH presence &Lt; / RTI > The GC-coupled DMA was calculated from the peak comparison of δ 1.88 ppm (CH _{3 of} DMA-) and δ 3.30 ppm (GC-CH ₂ ) in ¹ H-NMR (DMSO-d6 solvent phase with TMS) (See FIG. 3).

분석결과 표 1과 도 3에 나타난 바와 같이 GC 단량체 한 분자당 접합된 DMA 분자수는 0.57 (GCDF) 로 계산되었으며 (표 1 참조), GC에 접합된 C₆₀은 ¹H-NMR (TMS를 포함한 DMSO-d6 용매상) 결과에서 δ 6.55 ppm (C₆₀의 -CH)과 δ 3.30 ppm (GC의 - CH₂)을 피크 비교를 통하여 확인하였다(도 3 참조). GC 단량체 한 분자당 접합된 C₆₀ 분자수는 0.11 (GCDF) 또는 0.09 (GCF)a,b GC에 대한 C₆₀ 또는 DMA의 접합 비율은 ¹H-NMR (TMS를 포함한 DMSO-d6 용매상) 피크를 이용해 계산하였다.
As a result of the analysis, as shown in Table 1 and FIG. 3, the number of DMA molecules conjugated per molecule of GC monomer was calculated to be 0.57 (GCDF) (see Table 1), and C ₆₀ bonded to GC was analyzed by ¹ H-NMR (DMSO -d6 solvent phase), 隆 6.55 ppm (-CH of C ₆₀ ) and 隆 3.30 ppm (-CH _{2 of} GC) were confirmed by peak comparison (see FIG. 3). The C ₆₀ molecules bonded per GC monomer molecule to 0.11 (GCDF) or 0.09 (GCF) a, C ₆₀ or bonding ratio of DMA to b GC is (a DMSO-d6 solvent containing TMS) ¹ H-NMR peak Respectively.

표 1 GC-g-DMA-g-C60의 특성Table 1 Characteristics of GC-g-DMA-g-C60

2,3-다이메틸말레산 (2,3-dimethylmaleic acid : DMA), 풀러렌 (fullerene :C₆₀) 과 접합시킨 글리콜 키토산 (glycol chitosan : GC) 결합체 (GC-g-DMA-g-C₆₀)는 GC의 자유 아민기에는 DMA가, GC-g-DMA의 수산기에는 C₆₀의 π-π 탄소 결합이 접합하는 간단한 두 단계의 화학적 접합반응을 거쳐 합성된다(도 1 참조). 또한 물상에서 자가조립된 GC-g-DMA-g-C₆₀이 pH 7.4에서 DMA의 카복시기와 GC의 잔여 자유 아민기 사이의 정전기 상호작용으로 인해 멀티 나노겔 응집체을 형성되며 이러한 나노겔 응집체는 pH 5.0에서 DMA 블록이 제거되면서 정전기 상호작용이 환원되어 각각의 단일 나노겔로 분해되며 이러한 물리화학적 성질의 변화는 종양세포의 엔도솜 pH (~pH 5.0) 표적화에 있어서 GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔 응집체의 가능성을 뒷받침 한다.A glycol chitosan (GC) conjugate (GC-g-DMA-gC ₆₀ ) conjugated with 2,3-dimethylmaleic acid (DMA) and fullerene (C ₆₀ ) DMA in the free amine group, and a π-π carbon bond in C ₆₀ in the hydroxyl group of GC-g-DMA (see FIG. 1). In addition, GC-g-DMA-gC ₆₀ self-assembled on the water forms multi-nanogel aggregates due to the electrostatic interaction between the carboxy group of DMA and the residual free amine group of DMA at pH 7.4, the electrostatic interaction is reduced as the block is removed and digested with each of the single nano-gel such changes in physical-chemical properties are endosomal pH (~ pH 5.0) GC- g -DMA- g -C 60 in the targeting of tumor cells Supporting the possibility of nanogel aggregates.

또한 분석결과 도 4a에서 나타난 바와 같이 GC-g-DMA-g-C₆₀ (GCDF) 나노겔의 평균 입자 크기는 약 283 nm이고, 이는 DMA블록이 없는 GC-g-C₆₀(GCF) 나노겔의 평균 입자 크기인 약 46nm 와 비교되며, 이러한 입자 크기의 차이점은 GCDF의 복잡한 나노구조의 형성과 관계가 있다. In addition, GC-g-DMA-gC _60, as shown in Figure 4a results (GCDF) average particle nano-gel size is about 283 nm, which average particle of GC-gC ₆₀ (GCF) nanogels no DMA block size , And the difference in particle size is related to the formation of complex nanostructures of GCDF.

추가적으로 도 4b에 나타난 것과 같이 FE-SEM으로부터 얻어진 결과는 GCDF 나노겔이 GCF 나노겔과 유사한 대부분 구형으로 나타났으며, GCDF 또는 GCF 나노겔은 PBS 용액에서 고르게 분산되어 있었다(도 4c 참조).In addition, as shown in FIG. 4B, the results obtained from the FE-SEM show that the GCDF nanogels are mostly spherical similar to the GCF nanogels and the GCDF or GCF nanogels are evenly dispersed in the PBS solution (see FIG. 4C).

또한 GCDF 또는 GCF 나노겔은 2주 동안의 입자 크기의 변화는 무시할 정도로 어떤 침전 현상 없이 안정적으로 분산되어 있었으나, 도 5a에서 나타난 것과 같이 GCDF 나노겔의 평균 입자 크기는 pH에 감소함에 따라 283 nm (pH 7.4) 에서 221 nm (pH 6.8), 133 nm (pH 6.0), 54 nm (pH 5.0) 로 변한 반면 GCF 나노겔의 pH 감소에 따른 입자 크기의 변화는 거의 없었다.
In addition, the GCDF or GCF nanogels were stably dispersed without any precipitation phenomenon, but the average particle size of GCDF nanogels decreased to 283 nm (Fig. 5 (pH 6.4), 133 nm (pH 6.0) and 54 nm (pH 5.0), respectively, while the particle size of the GCF nanogels decreased with decreasing pH.

<1-2>. 빛 투과도<1-2>. Light transmittance

본 발명자들은 GC-g-DMA-g-C60(GCDF) 또는 GC-g-C60(GCF) 나노겔을 제조하였으며, GCDF 또는 GCF 빛 투과도를 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.The present inventors prepared GC-g-DMA-g-C60 (GCDF) or GC-g-C60 (GCF) nanogels and conducted the following experiments to analyze the GCDF or GCF light transmittance.

용액의 빛 투과도는 UV/visible 분광광도계 (UV/visible spectrophotometer, Labantech Co., USA)를 이용하여 측정하였으며, 측정 전에 각각 다른 pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) 에 GCDF 또는 GCF 나노겔을 노출시켜 4시간동안 실온에서 안정화시켰음. GCDF 또는 GCF 나노겔 용액의 상대적인 투과도는 pH 7.4에서의 투과도에 대한 선택된 pH 범위 내에서 측정하였다.The light transmittance of the solution was measured using a UV / visible spectrophotometer (Labantech Co., USA). Before measurement, GCDF or GCF nanogel was added to each of the different pHs (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) Exposed and stabilized at room temperature for 4 hours. Relative permeabilities of GCDF or GCF nanogel solutions were measured within a selected pH range for permeability at pH 7.4.

GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔은 투석과정을 통해 GC와 DMA블록은 친수성 껍질로 C₆₀블록은 소수성 핵으로 자가조립 됨으로써 쉽게 준비되었으며, 여기서 GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔은 DMA의 카복시기와 GC의 잔여 자유 아민기 사이의 정전기 상호작용으로 인해 멀티 나노겔 응집체를 형성할 수 있다. GC-g-DMA-gC ₆₀ nanogels were readily prepared by dialysis, GC and DMA blocks being hydrophilic shells and C ₆₀ blocks being self-assembled as hydrophobic nuclei where GC-g-DMA-gC ₆₀ nano gels were DMA Nanoparticle aggregates due to the electrostatic interaction between the carboxy group of the free amine group of GC and the residual free amine group of GC.

분석결과 도. 5b는 pH 변화에 따른 나노겔 용액의 투과도 변화를 측정한 것으로서 pH가 감소함에 따라 GCDF 나노겔의 크기가 감소하는 것과 일치하여 GCDF 나노겔 용액의 상대적인 투과도 변화는 증가하였다(도 5a 참조). GCF 나노겔의 경우 모든 pH에서 상대적인 투과도는 거의 변화가 없었다는 것을 알 수 있었다.
The results of the analysis also. 5b is a measurement of the change in permeability of the nanogel solution according to the pH change. As the pH decreased, the relative permeability change of the GCDF nanogel solution increased corresponding to the decrease in the size of the GCDF nanogel (refer to FIG. 5a). It was found that the relative permeability of GCF nanogels remained almost unchanged at all pH values.

<1-3>. 제타 준위 (<1-3>. Zeta level ( ZetaZeta potentialpotential ))

본 발명자들은 Trial formulation 제조시간을 감소시키며, 장기적인 안정성의 예측을 위해 제타준위분석을 수행하였으며, 제타 준위는 현탁액(suspension) 내의 모든 입자를 나타내는 물리적 물성으로서 suspension 과 emulsion 의 거동을 명확히 보여줄 수 있다. The present inventors have carried out a zeta level analysis to reduce the preparation time of the trial formulation and to predict the long-term stability. The zeta level can clearly show the behavior of suspension and emulsion as physical properties representing all the particles in the suspension.

본 실험에서는 각각 다른 pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) 에서 4시간동안 안정화시킨 각 샘플 (1 mg/ml)을 제타사이저 3000을 이용하여 측정하였다.In this experiment, each sample (1 mg / ml) stabilized at different pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) for 4 hours was measured using Zetasizer 3000.

분석결과 도. 5c는 pH에 따른 zeta potential의 변화를 나타내며 pH 7.4에서 5.0까지 감소에 따른 GCDF 나노겔의 zeta potentials 변화는 -19.5 mV에서 +9 mV 였으나, GCF 나노겔의 zeta potentials 변화는 미미했다. DMA가 접합된 일차아민은 약한 산성 환경에서 DMA의 빠른 가수분해로 인해 자유 아민기로 변하며, GCDF 나노겔 제타 준위의 변화는 DMA 블록으로 인한 음극 상태가 pH 5.0에서 DMA 블록이 제거되면서 GC 자유 아민의 양전하의 노출로 인해 상쇄됨으로써 양전하의 노출로 인해 상쇄됨으로써 양극상태를 나타내는 것을 알 수 있었다.The results of the analysis also. The change in zeta potentials of GCDF nanogels from pH 7.4 to 5.0 was +9 mV at -19.5 mV, but the change in zeta potentials of GCF nanogels was insignificant. The primary amines to which the DMA was conjugated were converted to free amine groups due to the rapid hydrolysis of DMA in a weak acidic environment and the change of the GCDF nano gel zeta state resulted in the removal of the DMA block at pH 5.0, It is shown that the anode state is canceled due to the exposure of the positive charge due to the cancellation of the positive charge.

또한 종합적으로 pH 7.4에서 pH 5.0으로 감소되었을 때, GCDF의 물리 화학적 특성 변화는 나노겔 응집체 (283 nm)가 pH 5.0에서 음이온 DMA블록이 제거되면서 나노겔 사이 정전기적 상호작용이 환원되어 독립된 나노겔 (54 nm, GCF 나노겔과 유사한 크기)로 분열되었다는 것을 나타내므로(도 4 참조), C₆₀에 접합한 C₆₀에 GC-g-DMA이 C₆₀의 물리화학적 특성에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
In addition, when the pH of the solution was decreased from pH 7.4 to pH 5.0, the change of physicochemical properties of GCDF was observed when the anionic DMA block was removed at pH 5.0 from the nanogel aggregates (283 nm), and the electrostatic interactions between the nanogels were reduced, it is indicated that the division in (54 nm, GCF similar size and nano-gel) (see Fig. 4), a C ₆₀ bonded to C ₆₀ GC-g-DMA is seen that a significant impact on the physical and chemical properties of the C ₆₀ I could.

<< 실험예Experimental Example 2> 2>

일중항Sunshine 산소의 발생 및 측정 Generation and measurement of oxygen

본 발명자들은 GCDF 또는 GCF 나노겔의 암치료효과를 확인하기 위해 일중항산소의 발생 정도를 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.The present inventors conducted the following experiments to analyze the degree of singlet oxygen production in order to confirm the cancer treatment effect of GCDF or GCF nanogels.

GCDF 또는 GCF 나노겔으로 부터의 일중항 산소 발생은 9,10-다이메틸안트라센을 이용하여 확인하였다. 먼저, 각각 다른 pH (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) 에서 4시간동안 안정화시킨 GCDF, GCF 나노겔과 C₆₀ (C₆₀ 농도 1 mg/ml)을 준비한 후, 각 샘플을 PBS (150 mM, pH 7.4) 용액상에 분산시킨 9,10-다이메틸안트라센 (20 mmol) 과 섞고 670nm 파장, 100 mW/cm² 세기의 레이저를 이용해 10분 동안 광을 조사하였다. The singlet oxygen evolution from GCDF or GCF nanogels was confirmed using 9,10-dimethyl anthracene. First, GCDF, GCF nanogels and C ₆₀ (C ₆₀ concentration 1 mg / ml) stabilized at different pHs (pH 7.4-5.0, PBS 150 mM) for 4 hours were prepared, pH 7.4) solution, and then irradiated with light for 10 minutes using a laser of 670 nm wavelength and 100 mW / cm ² intensity.

형광을 내는 물질인 9,10-다이메틸안트라센은 일항 산소와 선택적으로 반응하여 그 결과로 형광 세기가 감소된다. 각 샘플에서 9,10-다이메틸안트라센의 형광 세기 변화는 분광형광계 (Shimadzu RF-5301PC spectrofluorometer, λex 360 nm, λem 380-550 nm) 를 이용하여 측정하였으며, 1시간 후 9,10-다이메틸안트라센 형광 세기가 안정기에 들면 일중항산소 발생 전 가장 높은 9,10-다이메틸안트라센 형광 세기(F_f) 에서 일중항산소 발생 후 안정된 9,10-다이메틸안트라센 형광 세기 (F_s) 를 빼주어 9,10-다이메틸안트라센 형광 세기의 변화 (F_f-F_s) 를 측정하였다. 또한 모든 자료는 5 nm에서 분광형광계의 여기-방출 틈새너비를 이용하여 측정하였다.9,10-Dimethylanthracene, a fluorescent substance, selectively reacts with univalent oxygen, resulting in a decrease in fluorescence intensity. The fluorescence intensity of 9,10-dimethylanthracene in each sample was measured using a spectrophotometer (Shimadzu RF-5301PC spectrofluorometer, λex 360 nm, λem 380-550 nm). After 1 hour, 9,10-dimethyl anthracene When the fluorescence intensity is stabilized, the 9,10-dimethylanthracene fluorescence intensity (F _s ) after the generation of singlet oxygen is subtracted from the highest 9,10-dimethyl anthracene fluorescence intensity (F _f ) , And the change in fluorescence intensity (F _f -F _s ) of 10-dimethyl anthracene was measured. All data were also measured at 5 nm using the excitation-emission gap width of the spectrophotometer.

분석결과 도 6은 광을 조사 (670nm 파장, 100 mW/cm² 세기의 레이저)하는 동안 GCDF, GCF 또는 C₆₀에서의 일항 산소 발생을 나타내며, 나노겔 또는 C₆₀에서의 일중항 산소 발생은 9,10-다이메틸안트라센의 형광 세기 변화 (F_f-F_s)로 나타난다. GCDF 나노겔은 pH 7.4 - 6.8에서는 나노겔 응집체 안에 밀집한 C₆₀ 분자들 사이에 광 간섭 효과가 증가되어 감소된 일중항 산소 발생을 보여주었지만, pH 5.0에서는 나노겔 응집체의 붕괴가 일어나기 때문에 일중항 산소 발생이 회복되었으며, 이러한 결과는 pH 비의존적인 일중항 산소 발생 (도 6b 참조) 을 보여준 GCF 나노겔, 그리고 물에 대한 낮은 용해도 때문에 낮은 일중항 산소 발생을 보였던 C₆₀ 분자와 비교된다(도 6c 참조). 6 shows the generation of singlet oxygen at GCDF, GCF, or C ₆₀ during light irradiation (laser at 670 nm wavelength, 100 mW / cm ² intensity), singlet oxygen generation at nano-gel or C ₆₀ is 9 , Fluorescence intensity change (F _f -F _s ) of 10-dimethyl anthracene. GCDF nanogels exhibited decreased singlet oxygen evolution due to increased optical interference effect between C ₆₀ molecules in nanogel aggregates at pH 7.4 - 6.8, but at pH 5.0, collapse of nanogel aggregates occurred, Oxygen evolution was restored, and this result is compared to GCF nanogels showing pH-independent singlet oxygen evolution (see Figure 6b) and to C ₆₀ molecules that showed low singlet oxygen evolution due to low solubility in water (Figure 6c Reference).

이러한 결과로 인해 GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔이 pH 5.0(엔도솜과 유사한 pH) 환경에 반응할 수 있고 광을 조사하였을 때 선택적으로 일중항 산소가 발생한다는 것을 확인할 수 있으므로 나노겔은 엔도솜 pH 표적화와 광역학 항암 치료에 있어 효율적인 치료법이 될 수 있다는 것을 확인하였다.
These results indicate that GC-g-DMA-gC ₆₀ nano-gel can respond to pH 5.0 (pH similar to endosomes) environment and singlet oxygen is selectively generated when light is irradiated. Therefore, Endosomes can be an effective treatment for pH targeting and photodynamic chemotherapy.

<< 실험예Experimental Example 3> 3>

InIn vitrovitro 에서 광 독성 분석Photo toxicity analysis

본 발명자들은 GC-g-DMA-g-C₆₀(GCDF) 또는 GC-g-C₆₀(GCF) 나노겔을 제조하였고, GCDF 또는 GCF 나노겔의 세포에서 광독성을 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였으며, GCDF, GCF, C₆₀의 광역학세포 사멸은 사람 비인두표피세포암종 KB 종양세포을 이용하여 평가하였다. RPMI-1640 배양액에 분산시킨 GCDF 또는 GCF 나노겔과 C₆₀ (C₆₀ 농도 0.1 - 10 ㎍/ml) 을 세포에 처리하고 12시간 동안 세포를 배양하였으며, 이 시간 동안 나노겔은 세포 내로 유입되어 KB 종양 세포 안의 산성 구획인 엔도솜에 위치하게 된다.The present inventors have carried out the following experiment to analyze the _{GC-g-DMA-gC 60} (GCDF) or GC-gC ₆₀ (GCF) was prepared nanogels, phototoxicity in GCDF or GCF cells nanogels, GCDF , GCF and C ₆₀ were assessed using human parietal epithelial cell carcinoma KB tumor cells. Cells were treated with GCDF or GCF nanogels and C ₆₀ (C ₆₀ concentration 0.1-10 μg / ml) dispersed in RPMI-1640 culture medium and cultured for 12 hours. During this time, It is located in the endosome, an acidic compartment in the tumor cell.

사람 비인두표피세포암종 KB 종양세포를 2 mM L-glutamine, 1% penicillin- streptomycin, 10% FBS를 첨가한 folate-free RPMI 1640 배지에서 5% CO₂ 농도, 37 ℃ 조건으로 배양하였으며, 실험 전에 0.25% (w/v) trypsin/0.03% (w/v) EDTA 농도의 수용액을 이용해 단층상태의 세포들을 배지에서 분리하고 RPMI-1640 배지를 이용해 1 X 10⁵ cells/ml의 농도로 희석시켰다. 또한 RPMI 1640배지에 분산된 KB 세포를 96 well 배지에 분주하고 24시간동안 배양한 뒤에 실험에 사용하였다. Human pituitary epithelial cell carcinoma KB tumor cells were cultured in folate-free RPMI 1640 medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin, and 10% FBS at 5% CO ₂ and 37 ° C. Cells in the monolayer state were separated from the medium using an aqueous solution of 0.25% (w / v) trypsin / 0.03% (w / v) EDTA and diluted to 1 × 10 ⁵ cells / ml using RPMI-1640 medium. In addition, KB cells dispersed in RPMI 1640 medium were dispensed into 96-well culture plates and cultured for 24 hours before use in the experiment.

광 조사 후의 GCDF, GCF 나노겔 또는 C₆₀ (C₆₀ 농도 0.1-10 ㎍/ml)를 RPMI-1640 배지에 분산시킨 용액을 세포가 있는 96 well 배지에 투여하였다. 각 샘플 용액 상에서 세포를 12시간동안 배양한 후 PBS (150 mM, pH 7.4) 용액으로 3번 씻어주었으며 신선한 RPMI-1640 배지상태의 세포들에 670 nm 파장, 100 mW/cm2 세기의 레이저를 이용해 5분 동안 광을 조사한 후 12시간 동안 더 배양한 다음 CCK-8 assay를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다.After irradiation with GCDF, GCF nanogels or C ₆₀ (C ₆₀ concentration 0.1-10 / / ml) was dispersed in RPMI-1640 medium in a 96-well culture medium containing cells. Cells were washed 3 times with PBS (150 mM, pH 7.4) solution in each sample solution for 12 hours. Cells in fresh RPMI-1640 medium were irradiated with 670 nm wavelength and 100 mW / Min for 12 hours, and then cell viability was evaluated using the CCK-8 assay.

추가적으로, 각 샘플의 본래 독성을 확인하기 위해 GCDF, GCF 나노겔 또는 C₆₀ (C₆₀ 농도 1 - 50 ㎍/ml)를 KB에 처리하고 광을 조사하지 않은 상태에서 24시간동안 배양하여 세포 생존율을 평가하였다.In addition, in order to confirm the original toxicity of each sample, the cells were treated with GCDF, GCF nanogels or C ₆₀ (C ₆₀ concentration 1 - 50 ㎍ / ml) in KB and incubated for 24 h without light irradiation to determine cell viability Respectively.

분석결과 도 7은 in vitro 세포실험에서는 GCDF 나노겔의 항암 치료 효과를 보여주며, 7 shows the effect of the GCDF nanogel in the in vitro cell experiments,

세포 내 유입 과정 중에 엔도솜(pH 5.0 이하) 내 GCDF는 광 조사에 대해 활성을 띄게 된 결과 670 nm 파장 100 mW/cm² 세기의 레이저를 5분간 조사하였을 때 GCDF, GCF 나노겔은 상대적으로 높은 KB 종양세포 사멸을 나타내었으나 C₆₀은 매우 낮은 광독성을 보였다. 추가적인 실험결과 광 조사 전의 GCDF, GCF와 C₆₀은 세포 독성이 없었다(도 7b 참조).
GCDF in the endosomes (below pH 5.0) became active during light irradiation, and GCDF and GCF nanogels were relatively high when irradiated with laser at 670 nm wavelength and 100 mW / cm ² intensity for 5 minutes KB tumor cell death, but C ₆₀ showed very low phototoxicity. Additional experiments showed that GCDF, GCF and C ₆₀ before light irradiation were not cytotoxic (see FIG. 7b).

<< 실험예Experimental Example 4> 4>

pHpH -활성 광 독성- active light toxicity

본 발명자들은 GC-g-DMA-g-C₆₀(GCDF) 또는 GC-g-C₆₀(GCF) 나노겔을 제조하였으며, 항암 치료를 위한 광민감제 약물로서 GCDF의 가능성을 평가하기 위한 시도로서 GCDF 또는 GCF 나노겔의 pH변화에 따른 광독성을 분석하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.The present inventors prepared GC-g-DMA-gC ₆₀ (GCDF) or GC-gC ₆₀ (GCF) nanogels and tried to evaluate the possibility of GCDF as a photosensitizer drug for chemotherapy. The following experiment was carried out to analyze the phototoxicity according to pH change.

사전에 0.1 M HCl 또는 0.1 M NaOH를 사용하여 RPMI-1640 배지를 pH 7.4 및 5.0으로 조정하였으며, GCDF 또는 GCF 나노겔(C₆₀ 농도 10 ㎍/ml) 을 RPMI-1640 배지에 분산시킨 용액을 KB 세포에 30분 동안 처리한 다음 670nm 파장, 100 mW/cm² 세기의 레이저를 이용해 5분 동안 광을 조사하고 신선한 150 mM PBS (pH 7.4) 용액으로 세척한 후 세포를 신선한 RPMI-1640 배지에서 12시간동안 더 배양하였으며, 세포 생존율은 CCK-8 assay를 이용하여 평가하였다.The RPMI-1640 medium was adjusted to pH 7.4 and 5.0 using 0.1 M HCl or 0.1 M NaOH in advance, and a solution in which GCDF or GCF nanogel (C ₆₀ concentration 10 ㎍ / ml) was dispersed in RPMI-1640 medium was treated with KB Cells were treated for 30 minutes and then irradiated with light at a wavelength of 670 nm, 100 mW / cm ² intensity for 5 minutes, washed with fresh 150 mM PBS (pH 7.4), and the cells were cultured in fresh RPMI-1640 medium The cell viability was assessed using the CCK-8 assay.

이는 pH 7.4 또는 5.0에서 GCDF과 GCF 나노겔 (C₆₀ 농도 10 ㎍/ml) 을 KB 종양세포에 처리하였으며, 상대적으로 짧은 시간 (30 min) 동안 처리하여 나노겔의 세포 내 흡수를 제한하기 위함이었다. 또한 670 nm 파장, 10 mW/cm² 세기의 레이저를 세포에 5 분간 조사하고 나노겔의 광독성을 평가하였다.This was done to treat the KB tumor cells with GCDF and GCF nanogels (C ₆₀ concentration 10 μg / ml) at pH 7.4 or 5.0 and to treat them for a relatively short time (30 min) to limit the intracellular uptake of nanogels . The cells were irradiated with 670 nm wavelength and 10 mW / cm ² intensity laser for 5 minutes to evaluate the phototoxicity of the nanogels.

분석결과 도 8a에 나타낸 것처럼 pH 7.4에서 응집되어 자가 소멸을 일으킨 GCDF는 KB 종양세포에서 상대적으로 낮은 광독성을 나타낸 반면에 pH 5.0에서 응집체가 분해된 GCDF는 상대적으로 높은 KB 세포사멸을 나타내었다. 이러한 결과는 GCF 나노겔이 모든 pH에서 높은 광독성을 나타낸 것과 비교된다. 따라서 상기 실험결과 GCF 나노겔과 비교할 때 GCDF는 암세포에 특이적인 세포사멸 활성을 나타낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 8a, the GCDF aggregated at pH 7.4 and self-extinguishing showed relatively low phototoxicity in KB tumor cells, whereas the GCDF agglomerated at pH 5.0 showed relatively high KB cell death. These results are compared with the GCF nanogels exhibiting high phototoxicity at all pH. As a result, it was confirmed that GCDF can exhibit cytotoxic activity specific to cancer cells when compared with GCF nanogels.

<< 실험예Experimental Example 5> 5>

투과전자현미경 (Transmission electron microscope ( TEMTEM ) 분석) analysis

본 발명자들은 GCDF가 세포내에서 광 조사에 의해 광독성이 발휘되는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.The present inventors conducted the following experiment to determine whether GCDF is phototoxic by light irradiation in cells.

37 ℃에서 6시간 동안 GCDF 또는 GCF 나노겔 (C₆₀ 농도 10 ㎍/ml)을 처리한 KB cell을 신선한 150 mM PBS (pH 7.4)로 3번 씻어준 후 4 % 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) /2.5 % 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 을 첨가한 0.1 M PBS 용액로 하루 동안 전고정 시켰다. 고정시킨 표본을 0.1 M PBS 용액으로 씻은 후, PBS 용액에서 1 % 4산화 오스뮴 (osmium tetroxide)을 1시간 동안 처리하여 후 고정 시켰다. 그 다음 깨끗한 에탄올으로 탈수시키고 Epon 812로 포매(包埋)시켰으며, Epon 812는 60℃ 에서 3일 동안 중합한 것을 사용하였다. 마이크로톰 (ultra-microtome, Leica Ultracut UCT, Germany)을 이용해 포매가 끝난 표본으로부터 Ultra-thin sections (60-70 nm)을 얻었으며, 탄소 코팅한 구리 그리드에 Ultra-thin sections을 고정시키고 60 kV에서 작동하는 투과전자현미경 (TEM, JEM 1010, Japan) 과 CCD 카메라 (SC1000 Orion, USA)를 이용해 결과를 확인하였다. KB cells treated with GCDF or GCF nanogels (C ₆₀ concentration 10 μg / ml) for 6 hours at 37 ° C were washed 3 times with fresh 150 mM PBS (pH 7.4), and then washed with 4% paraformaldehyde / % Glutaraldehyde in 0.1 M PBS solution for one day. The immobilized specimen was washed with 0.1 M PBS solution and then treated with 1% osmium tetroxide in PBS solution for 1 hour. It was then dehydrated in clean ethanol and embedded in Epon 812, and Epon 812 was used which was polymerized at 60 ° C for 3 days. Ultra-thin sections (60-70 nm) were obtained from the preformed specimens using a microtome (Leica Ultracut UCT, Germany), and ultra-thin sections were fixed in a carbon-coated copper grid and run at 60 kV (TEM, JEM 1010, Japan) and a CCD camera (SC1000 Orion, USA).

분석결과 도 8b에 나타낸 것처럼 TEM 이미지는 세포 내로 유입된 GCDF 응집체가 독립된 나노겔로 효과적으로 분해된 것을 나타내며 이러한 결과는 GCDF가 엔도솜 내에서 광 조사 하에 높은 광독성을 발휘할 수 있다는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 8B, the TEM image shows that the GCDF aggregates introduced into the cells were effectively decomposed into independent nanogels. These results confirmed that GCDF can exhibit high phototoxicity under light irradiation in endosomes.

< < 실험예Experimental Example 6> 6>

InIn vivovivo 형광 Neon 이미징Imaging

In vivo 동물실험은 4-6주령 암컷 누드쥐 (BALB/c, nu/nu mice, Institute of Medical Science, Tokyo, Japan)를 이용해 진행되었다. 쥐들은 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인된 가이드라인에 따라 사육되었다.In vivo animal experiments were carried out in 4-6 week-old female nude mice (BALB / c, nu / nu mice, Institute of Medical Science, Tokyo, Japan). The rats were raised according to guidelines approved by the Catholic University Animal Experimental Ethics Committee.

동물실험을 위해 KB 종양세포를 1 X 10⁵ cells/ml 의 농도로 PBS (ionic strength= 0.15, pH 7.4) 용액에 분산시킨 후 쥐에 피하주사 하였다. 암 크기가 50mm³까지 커졌을 때, 나노겔 (C₆₀ 농도 10 mg/kg body)을 꼬리정맥 주사를 통하여 쥐의 꼬리로 정맥주사 하였다. 쥐의 형광 이미징을 하기 위해 장파장 C-mount 렌즈와 방출 필터 (600-700 nm; Omega Optical, Brattleboro, VT, USA)와 함께 12-bit CCD (Image Station 4000 MM; Kodak, Rochester, NY, USA) 카메라를 사용하였다. For animal experiments, KB tumor cells were dispersed in PBS (ionic strength = 0.15, pH 7.4) at a concentration of 1 × 10 ⁵ cells / ml and injected subcutaneously into rats. When the cancer size was increased to 50 mm ³ , the nano gel (C ₆₀ concentration 10 mg / kg body) was intravenously injected into the tail of the rats via the tail vein injection. A 12-bit CCD (Image Station 4000 MM, Kodak, Rochester, NY, USA) was used with a long wavelength C-mount lens and emission filter (600-700 nm; Omega Optical, Brattleboro, VT, USA) Camera was used.

추가적으로 PBS (150 mM, pH 7.4) 용액에 분산된 GCDF 나노겔 (C₆₀ 농도 10 - 100 ㎍/ml) 의 형광 이미지는 KODAK image station (λex 635 nm, λem 720 nm)을 이용하여 측정하였다.In addition, fluorescent images of GCDF nanogels (C ₆₀ concentration 10 - 100 ㎍ / ml) dispersed in PBS (150 mM, pH 7.4) solution were measured using a KODAK image station (λex 635 nm, λem 720 nm).

분석결과는 도. 9에 나타낸 것과 같이 광 조사시 나노겔의 형광사진을 통해 확인할 수 있으며 촉매인 LiOH를 사용하여 C₆₀의 π-π 탄소 결합을 깨고 수산기를 접합시키는 것은 C₆₀의 전자 방출 상태에 영향을 주고 결과적으로 강한 근적외선 (near-infrared : NIR) 형광 세기를 나타내며, C₆₀ 결합체는 다른 형광물질이나 동위원소 라벨링 없이 형광 이미징이 가능하다. The results of the analysis are shown in Fig. As it is shown in the 9 available via the fluorescence photo nano gel upon irradiation, and consequently give it impact on the electron-emitting state of the C ₆₀ to break the π-π-carbon bond in the C ₆₀ bonded to a hydroxyl group by using the catalyst of LiOH (NIR) fluorescence intensity, and the C ₆₀ conjugate is capable of fluorescence imaging without any other fluorescent or isotopic labeling.

KB 종양이 유발된 누드 쥐에 GCDF와 GCF를 꼬리정맥주사 한 후 얻은 in vivo 형광 이미지에 나타난 것과 같이 Enhanced permeability and retention (EPR) 효과로 인한 종양 혈관으로부터 나노겔의 관외 유출 때문에 GCDF 나노겔은 주사한지 8시간 후 종양 부위에서 높은 해상도의 형광 세기를 보인다(도 9b 참조).GCDF nanogels were injected into tumor necrosis due to extracorporeal outgrowth of nanogels from tumor vessels due to enhanced permeability and retention (EPR) effects, as shown in the in vivo fluorescence image obtained after tail vein injection of GCDF and GCF into KB tumor- And high resolution fluorescence intensity is observed in the tumor area 8 hours after Hanji (see Fig. 9B).

이러한 결과로 인해 pH 반응성 GC-g-DMA-g-C₆₀ 나노겔이 다양한 악성 종양 세포들의 in vivo 광역학 치료와 함께 in vivo 형광 이미징에 적용될 수 있으므로 악성종양의 진단에 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.
These results indicate that the pH-responsive GC-g-DMA-gC ₆₀ nano-gel can be used for in vivo fluorescence imaging along with in vivo photodynamic therapy of various malignant tumor cells and thus can be used for the diagnosis of malignant tumors.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims

A photosensitizer combined with dimethylmaleic acid (DMA), fullerene (F) and glycol chitosan (GC)
The bond is graft polymerization,
Wherein the photosensitizer is GC-g-DMA-g-Fullerene (GCDF).

The method according to claim 1,
Wherein the photosensitizer is in the form of a nanogel.

delete

The method according to claim 1,
Wherein the photosensitizer exhibits photosensitization of the light beam in the range of 550 nm to 800 nm.

A composition for the treatment or diagnosis of cancer for use in photodynamic therapy comprising the photosensitizing agent according to any one of claims 1, 2, and 5 as an active ingredient.

The method according to claim 6,
Wherein said photosensitizer is photoactivated in vitro or in vivo against light rays in the range of 550 nm to 800 nm.

The method according to claim 6,
Wherein the cancer is selected from the group consisting of skin, digestive, urinary, reproductive, respiratory, circulatory, brain and nervous system cancers.

9. The method of claim 8,
Wherein the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, osteocarcinoma, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, gastric cancer, perianal cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, Cancer of the prostate, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, endometrial carcinoma, endometrioid carcinoma, thyroid cancer, pituitary cancer, adenocarcinoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, (CNS), primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, and pituitary adenoma, which is characterized in that it is selected from the group consisting of: .

The method according to claim 6,
The composition may be administered to a mammal in need of treatment, such as intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, intracranial injection, intratumoral injection, intraperitoneal injection, skin penetration delivery, esophageal administration, abdominal administration, intraarterial injection, &Lt; / RTI > is administered in a selected route.

A composition comprising the photosensitizers of any one of claims 1, 2, and 5 as an active ingredient; And a light source for irradiating a light beam having a wavelength in the range of 550 nm to 800 nm, for use in photodynamic therapy.

12. The method of claim 11,
Wherein the cancer is selected from the group consisting of skin, digestive, urinary, reproductive, respiratory, circulatory, brain and nervous system cancers.

Synthesizing a GC conjugate (GC-g-DMA) by mixing the glycol chitosan and dimethyl maleic anhydride; G-Fullerene (GCDF), comprising the steps of: (a) combining a fullerene with a fullerene, and combining the fullerene with a fullerene.

A method for inhibiting the death or growth of cancer cells, comprising treating the cell with the photosensitizing agent of any one of claims 1, 2, and 5 isolated from the living body.

A method for diagnosing cancer, which comprises treating a cell isolated from a living body with the photosensitizing agent of any one of claims 1, 2, and 5.

16. The method of claim 15,
Wherein the diagnostic method is a fluorescence image.